METHODE DE DETECTION DE CELLULES MITOTIQUES

La présente invention a pour objet une nouvelle méthode de détection de cellules mitotiques et son utilisation.

L'évaluation de l'index mitotique (mitotic cell index) est un paramètre essentiel pour connaître l'état de prolifération d'une population cellulaire et permet également de mesurer les effets de nouveaux composés pharmacologiques sur des cellules en prolifération. Les premiers anticorps contre des cellules mitotiques ont été produits il y a environ une vingtaine d'année par immunisation par des extraits de cellules mitotiques HeLa (Davis FM, Tsao TY, Fowler SK, Rao PN. Monoclonal antibodies to mitotic cells. Proc Natl Acad Sci USA (1983) ; 80 : 2926-30). Les anticorps monoclonaux MPM- 1 et MPM-2 ainsi obtenus marquent de manière spécifique les cellules mitotiques et reconnaissent un large éventail de phosphoprotéines qui ont été identifiées plus tard

(Matsumoto-Taniura N, Pirollet F, Monroe R, Gerace L, Westendorf JM. Identification of novel M phase phosphoproteins by expression cloning. Mol. Biol. Cell. (1996) ; 7(9) : 1455-69 ; Westendorf JM, Konstantinov KN, Wormsley S, et al. M phase phosphoprotein 10 is a human U3 small nucleolar ribonucleoprotein component. Mol Biol Cell (1998) ; 9(2):437-49 ; Westendorf JM, Rao PN, Gerace L. Cloning of cDNAs for M-phase phosphoproteins recognized by the MPM2 monoclonal antibody and détermination of the phosphorylated epitope. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A (1994) ; 91(2) : 714-8 ; Kuang J, Ashorn CL, Gonzalez-Kuyvenhoven M, Penkala JE. cdc25 is one of the MPM-2 antigens involved in the activation of maturation-promoting factor. Mol. Biol. Cell (1994) ; 5(2): 135-45 ; Wells NJ, Watanabe N, Tokusumi T, Jiang W,

Verdecia MA, Hunter T. The C-terminal domain of the Cdc2 inhibitory kinase Mytl interacts with Cdc2 complexes and is required for inhibition of G(2)/M progression. J. Cell Sci. (1999) ; 112 (Pt 19) : 3361-71). Plus récemment des anticorps dirigés contre une forme phosphorylée de l'histone H3 ont été produits. Ces anticorps polyclonaux et monoclonaux détectent spécifiquement l'histone H3 qui est phosphorylée sur la serine

10 ou la serine 28 au moment de la mitose (Goto H, Tomono Y, Ajiro K, et al. Identification of a novel phosphorylation site on histone H3 coupled with mitotic chromosome condensation. J. Biol. Chem. 1999 ; 274 (36) : 25543-9 ; Hirata A, Inada K, Tsukamoto T, et al. Characterization of a monoclonal antibody, HTA28, recognizing

a histone H3 phosphorylation site as a useful marker of M-phase cells. J. Histochem. Cytochem. (2004) ; 52(1 1) : 1503-9). Ces anticorps marquent la chromatine et l'intensité du marquage est bien corrélée avec la mitose : le marquage apparaît au début de la mitose et disparaît en fin de mitose (Hendzel MJ, Wei Y, Mancini MA, et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiâtes primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma (1997) ; 106(6):348- 60).

Tant les MPM que les anticorps dirigés contre l' histone H3 phosphorylée se sont révélés des agents extrêmement intéressants pour détecter des cellules mitotiques et sont largement utilisés dans un grand nombre de techniques : immunofluorescence, cytomètrie de flux et immunochimie.

Les mécanismes qui contrôlent la division des cellules mettent en jeu de nombreux acteurs dont les activités sont régulées par des réactions de phosphorylation et de déphosphorylation, impliquant des kinases et des phosphatases. Des dérégulations de ces mécanismes ont été identifiées dans de nombreux cancers. Leur identification et leur caractérisation ouvrent aujourd'hui de nouvelles perspectives pour le diagnostic et le traitement de la maladie cancéreuse.

CDC25B est une phosphatase régulatrice du cycle cellulaire essentielle pour le contrôle de l'entrée en mitose et de la progression de la mitose. Elle appartient à une famille qui compte trois membres codés par des gènes différents (CDC25A, B et C) chez les mammifères. La protéine CDC25B est exprimée et active en fin de phase G2 du cycle cellulaire (Baldin, V., Cans, C, Superti-Furga, G. & Ducommun, B. Alternative splicing of the human CDC25B tyrosine phosphatase. Possible implications for growth control. Oncogene, (1997) ; 14 : 2485-2495 ; Gabrielli et al., Cytoplasmic accumulation of CDC25B phosphatase in mitosis triggers centrosomal microtubule nucleation in HeLa cells, J. CeIl. Science, (1996) 109 : 1081-1093). Sa localisation intracellulaire est régulée par des séquences NES et NLS (Davezac et al., Régulation of CDC25B phosphatases subcellular localization, Oncogene, (2000) ; 19 : 2179-85) et par son interaction avec les protéines 14-3-3 (Mils et al., Spécifie interaction between 14.3.3 isoforms and the human CDC25B phosphatase, Oncogene, (2000) ; 19 : 1257-1265 ; Forrest et al., Cdc25B activity is regulated by 14-3-3, Oncogene, (2001) ; 20 : 4393- 401). Il a été suggéré que CDC25B puisse agir comme un "starter" des événements mitotiques précoces (Nilsson et al., CeIl cycle régulation by the Cdc25 phosphatase

family, Prog CeIl Cycle Res, (2000) 4 : 107-14). Elle pourrait jouer un rôle dans l'activation initiale d'une population de CDC2/cycline B au niveau du centrosome avant sa translocation nucléaire (Kumagai et al., Régulation of the cdc25 protein during the cell cycle in Xenopus extracts, CeIl, (1992) 70 : 139-151 ; Hoffmann, L., Clarke, P., Marcote, M. J., Karsenti, E.& Draetta, G. Phosphorylation and activation of human cdc25-C by cdc2-cyclin B and its involvement in the self amplification of MPF at mitosis, EMBO J, (1993) ; 12, 53-63). CDC25B active les complexes CDK/cycline qui induisent les remaniements architecturaux et biochimiques qui sont nécessaires pour permettre le processus de division cellulaire. Son activité est régulée par les variations de son expression, par son association à des partenaires régulateurs et par des événements de phosphorylation. Ainsi, une cascade de signalisation conduit à la modulation de l'activité catalytique de CDC25B participant à la régulation de l'entrée en mitose.

Dans la demande WO2006/024796 les inventeurs décrivent une nouvelle séquence peptidique phosphorylée de la phosphatase CDC25B humaine, ainsi que des anticorps dirigés contre l'épitope phosphorylé de la phosphatase CDC25B humaine phosphorylée. Cette séquence comprend ou est constituée par la séquence SEQ ID NO : 1 suivante :

MEVEELSpPLALGR SEQ ID NO : 1 dans laquelle le résidu serine en position 7 est phosphorylé.

Les inventeurs décrivent également des anticorps polyclonaux et des anticorps monoclonaux spécifiquement dirigés contre l'épitope phosphorylé de la séquence SEQ

ID NO : 1 et leur utilisation pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection in vitro de cellules mitotiques, exprimant une séquence protéique telle que définie ci-dessus, parmi des cellules en culture ou des coupes de tissus sains ou tumoraux.

Au cours de leurs travaux ultérieurs sur les épitopes phosphorylés des protéines régulatrices du cycle cellulaire, les Inventeurs ont découvert que des anticorps polyclonaux et des anticorps monoclonaux dirigés contre la séquence SEQ ID NO : 1 ne sont en fait pas seulement spécifiques de la protéine CDC25B humaine phosphorylée (SEQ ID NO 1) mais capables de reconnaître spécifiquement toutes les cellules mitotiques mais pas les cellules en interphase et cela même lorsque ces cellules mitotiques n'expriment pas la protéine CDC25B humaine phosphorylée (par exemple dans des cellules où l'expression de la protéine CDC25B humaine a été inactivée) .

Aussi la présente invention a-telle pour objet, une méthode pour détecter dans un échantillon biologique des cellules mitotiques exprimant des protéines qui partagent au moins un des épitopes phosphorylés de la séquence peptidique comprenant ou constituée par un fragment contenant 2 à 13 acides aminés contigus issus de la séquence SEQ ID NO : 1 suivante :

MEVEELSpPLALGR dans laquelle le résidu serine en position 7 est phosphorylé, ledit fragment susmentionné contenant ledit résidu serine phosphorylé, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : - la mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps qui reconnaît lesdites protéines qui partagent au moins un des épitopes phosphorylés de la séquence peptidique comprenant ou constituée par un fragment contenant de 2 à 13 acides aminés contigus issus de la séquence SEQ ID NO : 1 suivante :

MEVEELSpPLALGR SEQ ID NO : 1 dans laquelle le résidu serine en position 7 est phosphorylé, ledit fragment susmentionné contenant ledit résidu serine phosphorylé et

- la détection du complexe.

Dans un mode avantageux de réalisation de l'invention, le fragment comprend entre 3 et 6 acides aminés contigus issus de la séquence SEQ ID NO : 1, encore plus avantageusement entre 7 et 13 acides aminés contigus issus de la séquence

SEQ ID NO : 1.

Au sens de la présente invention, le terme « SEQ ID NO : 1 et ses fragments » couvre également les séquences et les fragments qui différent par une ou plusieurs substitutions conservatives d'acides aminés à savoir : I. Résidus courts aliphatiques non polaires ou légèrement polaires : A, S, T, P,

G;

II. Résidus polaires chargés négativement et leurs amides : D, N, E, Q ;

III. Résidus polaires chargés positivement : H, R, K;

IV. Résidus longs aliphatiques non polaires : M L, I, V, C V. Résidus aromatiques longs : F, Y, W

La méthode selon l'invention permet de détecter toutes les cellules mitotiques :

- d'origine humaine qui expriment des protéines différentes de la protéine CDC25B lesdites protéines partageant au moins un des épitopes phosphorylés de la séquence peptidique mentionnée précédemment y compris les cellules mitotiques

humaines dans lesquelles l'expression de la protéine CDC25B a été inactivée, et

- d'origine non humaine qui expriment des protéines différentes de la protéine CDC25B, lesdites protéines partageant au moins un des épitopes phosphorylés de la séquence peptidique susmentionnée. Au sens de la présente invention on entend par anticorps un anticorps polyclonal, un anticorps monoclonal ou un fragment comme les fragments Fab, F(ab')2 et Fv.

Les anticorps polyclonaux utilisés dans la méthode selon l'invention sont générés par toute méthode connue de l'homme du métier. Typiquement ils peuvent être obtenus en immunisant des lapins avec SEQ ID NO : 1 , éventuellement couplée de façon covalente avec une protéine porteuse telle que l'hémocyanine, la sérum albumine de bœuf (BSA) ou l'ovalbumine. Les lapins sont alors immunisés pendant 3 mois (4 injections au total) et la saignée finale permet la récupération d'environ 50 ml de sérum. Le sérum est ensuite doublement purifié par affinité sur une colonne de peptide phosphorylé puis sur une colonne de peptide non phosphorylé. Les anticorps monoclonaux utilisés dans la méthode selon l'invention sont également générés par toute méthode connue de l'homme du métier. Typiquement ils résultent de la sélection d'un hybridome sécrétant un anticorps dirigé contre la séquence peptidique telle que définie ci-dessus.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, notamment dirigé contre la séquence peptidique SEQ ID NO : 1 telle que définie ci-dessus, comprend les étapes suivantes :

- la fusion entre des splénocytes d'un animal immunisé, notamment d'un animal non humain préalablement immunisé, par injection de la séquence peptidique telle que définie ci-dessus et des myélomes d'un animal, notamment d'un animal non humain, afin d'obtenir des hybridomes,

- la mise en culture des hybridomes ainsi obtenus,

- la récupération et purification par clonage d'un hybridome, choisi parmi ceux obtenus à l'étape précédente et sécrétant un anticorps dirigé contre la séquence peptidique telle que définie ci-dessus. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'animal utilisé pour l'étape d'immunisation est notamment une souris, les myélomes utilisés pour la fusion proviennent notamment d'une souris et les splénocytes utilisés pour la fusion proviennent d'un animal de la même espèce que celle dont provient les myélomes, à savoir notamment d'une souris.

Les hybridomes sélectionnés sont ceux qui sécrètent les anticorps contre la séquence peptidique SEQ ID NO : 1 sur la base de la production d'anticorps capables de reconnaître dans un test ELISA le peptide phosphorylé utilisé pour l'immunisation mais pas le peptide non phosphorylé. Dans un mode avantageux de réalisation de l'invention, la méthode met en œuvre l'anticorps monoclonal 3-12-1-22 produit par l'hybridome déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) à L'Institut Pasteur 25 rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 France sous le no CNCM 1-3861. Cet anticorps est une IgGl . L'invention a également pour objet l'hybridome déposé sous le no CNCM 1-3861 et l'anticorps 3-12-1-22 produit par ledit hybridome.

Les cancers sont caractérisés par une croissance cellulaire incontrôlée. En conséquence la méthode selon l'invention peut être utilisée pour détecter la prolifération des cellules cancéreurses. Elle peut être utilisée pour analyser des prélèvements ou des tissus issus de biopsie (la détermination du nombre de cellules mitotiques peut apporter des informations essentielle pour le diagnostic ou le pronostic).

Elle peut également être utilisée pour mesurer l'index mitotique dans des études pharmacologiques.

L'anticorps monoclonal 3-12-1-22 selon l'invention reconnaît un ou plusieurs épitopes phosphorylés indépendamment de la séquence environnante et de la protéine qui la porte ; il permet de détecter toutes les cellules mitotiques, qu'elles expriment ou non la protéine CDC25B humaine non seulement chez les mammifères, humain ou animal, mais également chez les oiseaux, comme par exemple chez le poulet.

Il représente ainsi un outil d'intérêt majeur comme marqueur de cellules mitotiques en recherche, dans des activités de diagnostic ou dans des tests de criblage à haut débit.

Les figures 1 à 6 et l'exemple qui suivent illustrent l'invention.

LéGENDE DES FIGURES

La figure 1 illustre la spécificité de l'anticorps polyclonal SE94 obtenu selon l'exemple 1 pour les cellules mitotiques. IA peptide immunogène SEQ ID NO : 1 ;

IB et IC : des cellules HeLa sont fixées et un double marquage immunofiuorescent est réalisé avec SE94 (contre SEQ ID NO : 1) et un anticorps monoclonal anti lamine A ( :

B) ou un anticorps anti alpha tubuline (IC). Les cellules sont aussi marquées par le 4'-6

diamino-2-phenylindole (DAPI). Les microphotographies montrent des cellules à des stades représentatifs de la mitose.

La figure 2 illustre la détection de cellules mitotiques par immunofluorescence avec l'anticorps monoclonal 3-12-1-22 obtenu selon l'exemple ; 2A Marquage par immunofluorescence avec l'anticorps monoclonal 3-12-1-22 sur des cellules HeLa...

2B Marquage par immunofluorescence de cellules U2OS avec l'anticorps monoclonal 3-12-1-22 et par un anticorps polyclonal dirigé contre la serine 10 phosphorylée de l'histone H3 ; les cellules sont aussi marquées par le 4'-6 diamino-2-phenylindole (DAPI). Les microphotographies montrent des cellules à des stades représentatifs de la mitose.

La figure 3 illustre la mesure d'une population de cellules mitotiques par cytomètrie de flux ; 3A quantité d'ADN mesurée par l'iodure de propidium dans des cellules HeLa ou U2OS enrichies en cellules mitotiques respectivement par « mitotic shake-off» et traitement au nocodonazole ; 3B quantité d'ADN mesurée par l'iodure de propidium dans des cellules HeLa marquées par l'anticorps monoclonal 3-12-1-22 et par l'anticorps polyclonal dirigé contre l'histone H3 phosphorylée.

La figure 4 illustre la détection de cellules mitotiques par immunofluorescence.

4A : dans le tube neural d'embryon de poulet ; 4B : dans des sphéroïdes multicellulaires préparés à partir de cellules d'adénocarcinome de colon HCTl 16. La figure 5 illustre la mesure par cytomètrie de flux de l'utilisation comparative de l'anticorps 3-12-1-22 et de l'anticorps contre l'histone H3 phosphorylée dans différents types cellulaires : les cellules Cos-7, les cellules CHO, les cellules NIH-3T3, les cellules

Ratl, les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), les lignées de LAM : U937 et

KGIa, les cellules U2OS, les cellules HeLa, les cellules HCTl 16, les cellules RPEl , les cellules S2 de drosophile, les fibroblastes primaires de poulet. M indique le pourcentage calculé après fenêtrage de cellules mitotiques.

La figure 6 illustre l'immunoréactivité pour les cellules mitotiques de différents types cellulaires et organismes telle que mesurée par immuno-fluorescence. Figure 6 première ligne ChEF, deuxième ligne CHO, troisième ligne COS 7, quatrième ligne MEF, cinquième ligne NIH3T3, sisième ligne RATl ; figure 6(suite) première ligne

HCT-1 16, deuxième ligne HeLa, troisième ligne U2OS, quatrième ligne RPE-I

La figure 7 illustre l'immunoréactivité de l'anticorps monoclonal A) sur des cellules embryonnaires de souris de type sauvage (WT) et B) invalidées (KO) par recombinaison homologue pour le gène de la phosphatase CDC25B. ^'

La figure 8 illustre l'utilisation de l'anticorps 3-12-1-22 sur des coupes de tissus congelées de cellules HCTl 16 sphéroides.

Exemple 1. Matériel et méthodes

1.1. Conditions de culture

Les cellules HeLa et les cellules U2OS ont été cultivées comme décrit dans la publication de Schmitt E, Boutros R, Froment C, Monsarrat B, Ducommun B, Dozier C. CHKl phosphorylates CDC25B during the cell cycle in the absence of DNA damage.

J CeIl Sci 2006; 119:4269-75.

1.2. Autres tissus

Les coupes de tube neural ont été obtenues comme décrit dans la publication de Benazeraf B, Chen Q, Peco E, Lobjois V, Medevielle F, Ducommun B, Pituello F.

Identification of an unexpected link between the Shh pathway and a G2/M regulator, the phosphatase CDC25B. Dev Biol 2006; 294:133-47.

Les sphéroïdes ont été obtenus comme décrit dans la publication de Del Duca, D., Werbowetski, T. & Del Maestro, R.F. Spheroid préparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro Oncol 67, 295-303 (2004).

Les cellules Cos-7, les cellules CHO, les cellules NIH-3T3, les cellules Ratl, les lignées de LAM : U937 et KGIa, les cellules U2OS, les cellules HeLa, les cellules HCTl 16, les cellules RPEl, les cellules S2 de drosophile ont été obtenues auprès de l'ATCC. Les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) et les fibroblastes primaires de poulet sont préparés à partir d'embryons selon les techniques classiques.

1.3. Préparation des anticorps 1.3.1. Anticorps polyclonaux Le peptide de séquence MEVEELS (p)PL ALGR (SEQ ID NO : 1), où (p) désigne la serine phosphorylée (figure IA), a été utilisé pour l'immunisation de lapins. Après sacrifice des animaux, le sérum a été purifié par chromatographie en deux étapes : la

première sur une colonne de peptide phosphorylé pour retenir les anticorps spécifiques, puis la deuxième sur une colonne du même peptide non phosphorylé de séquence MEVEELSPLALGR (SEQ ID NO : 2), de manière à purifier dans l'éluat les anticorps spécifiques de la forme phosphorylée. La reconnaissance du peptide phosphorylé par les anticorps a été validée dans un test ELISA. Ces anticorps sont désignés sous le nom de

SE94.

1.3.2. Anticorps monoclonaux

L'anticorps monoclonal 3-12-1-22 a été obtenu par immunisation d'une souris avec le peptide de séquence MEVEEL(p)SPLALGR dont la serine en position 7 est phosphorylée. Les hybridomes ont été obtenus selon les règles de l'art. Les hybridomes ont été sélectionnés dans un premier temps sur la base de la production d'anticorps monoclonaux reconnaissant le peptide immunogène phosphorylé et pas le peptide non- phosphorylé par la technique d'ELISA. Les hybridomes retenus ont été évalués par immuno fluorescence indirecte sur des cellules humaines (HeLa) pour leur capacité à détecter les cellules mitotiques et à ne pas reconnaître les cellules interphasique.

L'anticorps produit par le clone 3-12-1-22 est une IgGl .

1.4. Microscopie par immunofluorescence 1.4.1 Sur des cellules

Des cellules HeLa sont ensemencées sur des lamelles de verre, fixées au méthanol à -20°C pendant 6 minutes et perméabilisées après 18 ou 24 heures. L'ADN est visualisé en utilisant du DAPI (4'-6-di Amino Phénylindole). SE94 est utilisé à une dilution de 1/1000 et l'incubation est réalisée pendant une nuit à 4 ⁰ C. . L'anticorps secondaire conjugué à l'Alexa 488 utilisé au 1/800 ème. Aux grossissements x200 et x400 les cellules mitotiques sont aisément détectées par le marquage vert. Les noyaux fluorescents apparaissent en bleu.

L'anticorps 3-12-1-22 purifié est utilisé à la dilution de 0,lμg/ml sur des cellules fixées au paraformaldéhyde et de l μg/ml sur des cellules fixées au méthanol à -20°C.

La lamine de souris antihumaine (Santa-Cruz, SC-7292), l'anti alpha-tubuline (Sigma T5168), l'anti gamma-tubuline (Sigma T6557) et l'histone H3 antiphosphorylée

(Euromedex 05-598) sont utilisées respectivement aux dilutions suivantes : 1/2000, 1/2000, 1/150 et 1/50. Des anticorps secondaires marqués par Alexa 488 ou Alexa 594 (Molecular Probes) sont utilisés au 1/800 pendant 1 heure à la température ambiante.

Les images sont obtenues par un microscope DMRXA2 ou DMIRE2 (Leica) utilisant des caméras CCD et traitées par le logiciel Metamorph ou Qfluoro.

1.4.1 Sur des coupes de tissu

Les échantillons ont été fixés au formaldéhyde 3,7% pendant Ih à 4°C. Les coupes de 12 μm ont été réalisées au cryostat. L'incubation avec l'anticorps 3-12-1-22 à la dilution de 5 μg/ml est réalisée pendant 12 heures à température ambiante dans du

PBS 1% BSA, 0,5% Triton X100. L'anticorps 2aire Alexa 488-labeled est utilisé au l/800 ^ème , Ih.

1.5. Cytomètrie de flux On utilise des échantillons de cellules HeLa enrichis en cellules mitotiques par

« mitotic shake-off » et des échantillons des autres types de cellules enrichis par traitement au nocodazole. Les cellules HeLa ont été enrichies en mitose puis fixées à l'éthanol 70% pendant 1 heure à -20°C, puis perméabilisées avec du Tritron X100 pendant 6 minutes à 4°C. L'anticorps à la dilution de 5 μg/ml a été incubé 1 heure puis l'anticorps secondaire couplé à l' Alexa 488 au 1/800 ème pendant 40 minutes à température ambiante. L'iodure de propidium est utilisé pour marquer le contenu en ADN. Les cellules U2OS ont été bloquées en mitose par du nocodazole puis soumises au même traitement

On mesure simultanément le contenu en ADN et la quantité de cellules mitotiques.

2. Résultats

2.1. Marquage par les anticorps polyclonaux SE94

Les résultats sont donnés dans la figure 1. Les anticorps polyclonaux sont ceux préparés selon l'exemple 1.3.1. Les cellules en interphases ne sont pas marquées par SE94 (figure IB - SE94).

Le co-marquage avec un anticorps anti-lamine A montre que le marquage par SE94 apparaît quand la lamina nucléaire commence à se détacher, reste visible pendant

la mitose et disparaît quand les cellules ont terminé leur division en deux cellules filles (figure IB ; Lamin A).

Le co-marquage avec des anticorps contre l'alpha-tubuline montre que le marquage est fortement associé avec le fuseau mitotique (Figure IC).

2.2. Evaluation du marquage par les anticorps monoclonaux en immunofluoresccnce

Les résultats sont donnés dans les figures 2, 4 et 6

La figure 2 montre le marquage par immunofluorescence avec l'anticorps 3-12-1- 22 préparé selon l'exemple 1.2 et le marquage du noyau par DAPI sur des cellules HeLa et U2OS en croissance (figure 2A). Le cytoplasme de toutes ces cellules mitotiques est très fortement marqué alors que les cellules en interphase mises en évidences par DAPI ne sont pas marquées par l'anticorps 3-12-1-22 (figure 2B merge + DAPI).

Le co-marquage dans des cellules HeLa permet de comparer le marquage obtenu avec l'anticorps 3-12-1-22 avec celui obtenu avec un anticorps polyclonal contre l'histone H3 phosphorylée en position SlO. On observe un fort marquage de l'histone

H3 phosphorylée associée à la chromatine très tôt au moment de la prophase quand les chromosomes commencent à se condenser ; ce marquage est détectable jusqu'à l'anaphase (figure 2B H3p). Au contraire l'anticorps 3-12-1-22 marque le cytoplasme des cellules mitotiques et augmente légèrement plus tard dans la prophase et la pro- métaphase. On observe un marquage maximum dans des cellules métaphasiques. Le marquage par l'anticorps 3-12-1-22 reste détectable pendant la télophase et disparaît progressivement quand les cellules entrent en phase Gl (figure 2B 3-12-1-22).

Des cellules mitotiques sont détectées sur des coupes congelées de tube neural d'embryons de poulets âgés de 2 jours de 12 microns d'épaisseur avec un faible bruit de fond sur les cellules en interphase (figure 4A).

Des cellules mitotiques sont également détectées sur des coupes congelées de sphéroïdes obtenus à partir de cellules d'adénocarcinome du colon HCTl 16 (figure 4B). Des cellules mitotiques sont détectées dans différents types de cellules (Figure 6).

2.3. Evaluation du marquage par les anticorps monoclonaux en cytomètrie de flux

Les résultats sont donnés dans les figures 3 et 5.

Comme indiqué sur la figure 3A, les cellules mitotiques HeLa et les cellules mitotiques U2OS forment une population d'ADN 2C fortement marquée par l'anticorps 3-12-1-22 (région en haut à droite) qui se distingue facilement du reste de la population.

Dans les cellules UO2S après double marquage, on observe un recouvrement entre les populations mitotiques marquées par l'anticorps 3-12-1-22 et par l'histone H3 phosphorylée. Comme indiqué à la figure 3B, (panneau de gauche et panneau du milieu), le pourcentage de cellules mitotiques détectées avec ces deux anticorps est quasiment identique (44,7 % pour l'anticorps 3-12-1-22 et 45,6 % pour l'histone H3 phosphorylée).

Sur les différents types de cellules utilisée le pourcentage de cellules mitotiques détectées avec ces deux anticorps est quasiment identique (Figure 5). Le seul type cellulaire où le 3-12-1-22 n'est pas capable de détecter les cellules mitotiques est la lignée de drosophile S2. Dans ce modèle l'anticorps anti-H3P donne des résultats modérés.

L'anticorps 3-12-1-22 se positionne ici en alternative valide, par exemple dans les situations où l'activité des kinases Aurora responsable de la phosphorylation de l'histone H3 pourrait être inhibée.

2.4. Indépendance du marquage par l'anticorps 3-12-1-22 vis-à-vis de Ia présence de la CDC25B

Les résultats sont donnés dans la figure 7.

L'anticorps 3-12-1-22 marque les cellules mitotiques dans les fibroblastes murins sauvages et de manière identique dans les fibroblates où la phosphatase CDC25B a été invalidée par recombinaison homologue.

Le marquage par l'anticorps 3-12-1-22 est donc indépendant de la présence de la phosphatase CDC25B.

2.5. Utilisation de l'anticorps 3-12-1-22 sur des coupes de tissus

Les résultats sont donnés dans la figure 8.

L'étude de l'immunoréactivité avec l'anticorps 3-12-1-22 a été réalisée sur des coupes de sphéroïdes préparés par cryofixation (HCTl 16) ou fixés et inclus en paraffine (MCF7). L'analyse de ces résultats par immunofluorescence et par immunocytochimie,

respectivement, montre que cet anticorps détecte efficacement et avec un excellent rapport signal/bruit les cellules mitotiques dans ces deux approches.

L'ensemble des résultats donnés montre que le marquage observé avec 3-12-1- 22est spécifique des cellules mitotiques humaines ou animales. Il n'est pas spécifique de la protéine phosphorylée CDC25B humaine puisqu'on observe un marquage après invalidation des ARN interférents et également dans des cellules dans lesquelles

CDC25B humaine a été invalidée par recombinaison homologue.

En outre, puisque ces anticorps ne marquent pas les chromosomes et que la cinétique d'apparition et de disparition du marquage à la mitose sont différentes de celles du marquage par l'histone H3 phosphorylée, ces anticorps sont un nouvel outil qui vient compléter les outils déjà disponibles.