L'invention concerne la détection ex vivo et le suivi de l'évolution de maladies chroniques prolifératives chez l'homme ou l'animal.

La prolifération excessive de cellules humaines ou animales contribue à la pathogenèse de plusieurs maladies chroniques que l'on appelle maladies prolifératives, telles que les cancers, lymphomes, myélomes et leucémies. Ces pathologies impliquent une transformation cellulaire à laquelle est associée généralement des processus inflammatoires et le passage de composants bactériens, viraux et d'endotoxines à travers les muqueuses. En plus de présenter la caractéristique d'être proliférative, il peut se développer au cours de l'évolution de la maladie des processus dégénératifs et/ou auto-immuns. On parle alors de comorbidité qui correspond au résultat de l'association entre maladie proliférative et auto immune et /ou dégénérative.

Les solutions thérapeutiques apportées aux maladies prolifératives sont souvent des traitements immunosuppresseurs comme la chimiothérapie ou la radiothérapie qui ne sont pas assez spécifiques, ou des immuno régulateurs (anticorps monoclonaux) qui ont une efficacité limitée dans le temps et limitée un certain nombre de patients seulement. En plus, de l'inefficacité de certains de ces traitements, ils sont généralement toxiques et présentent des effets secondaires importants.

Par ailleurs, les traitements sont souvent inefficaces dans les cas très fréquents où les maladies prolifératives sont diagnostiquées tardivement. En effet, s'il existe plusieurs tests de diagnostiques, ceux-ci sont souvent chers, compliqués à mettre en oeuvre et pas toujours fiables.

De plus, ces pathologies étant chroniques, elles nécessitent un suivi régulier de l'évolution de la maladie et il n'existe pas aujourd'hui de solution simple et fiable qui permette un tel suivi. L'objectif de l'invention est de pallier les inconvénients de l'art antérieur en proposant un procédé à la fois de détection et de suivi de l'évolution d'une maladie chronique proliférative chez l'homme ou l'animal, simple à mettre en oeuvre, peu invasif, rapide, efficace et fiable.

A cet effet l'invention a pour objet un procédé ex vivo de détection ou de suivi de l'évolution d'une maladie chronique proliférative, dans un échantillon de fluide biologique humain ou animal, préférentiellement de plasma et/ou sérum humain ou animal, par dosage immunologique de la présence d'anticorps dans l'échantillon dont au moins un anticorps dirigé contre le benzo(a)pyrène.

En plus du dosage au moins un anticorps dirigé contre le benzo(a)pyrène, le procédé selon l'invention peut également comprendre le dosage immunologique de la présence d'au moins un autre anticorps. Il peut s'agir notamment d'au moins un anticorps dirigé contre le phosphatidyl inositol et/ou d'au moins un anticorps dirigé(s) contre l'acide azélaïque.

Avantageusement, ce procédé est simple à réaliser puisqu'il est effectué sur un échantillon de fluide biologique et qu'il met en oeuvre des techniques classiques de dosages immunologiques. Le procédé de dosage immunologique mime ex vivo ce qui se passe in vivo où des antigènes sont liés à des immunoglobulines (antigènes).

Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre à l'aide d'un kit qui constitue un autre objet de l'invention.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description en détails qui va suivre.

Description des Figures

La Figure 1 représente les résultats de la détection des anticorps circulants dirigés contre le Benzo[a]pyrène (BAP) en IgA, le dibenz[a,c]anthracène (DBA) en IgA, le 7, 12- dimethylbenza[a]anthracène (DMBA) en IgA, le 1,2-benzanthracène (BA) en IgA, le benzo(ghi)perylène (B(ghi)P en IgA et le contrôle négatif N-acétylcystéine (NAC) en IgA, au cours de l'évolution d'un cancer, sous forme d'une distribution d'une population de patients atteints de cancers, le point médian représente 50% de la population.

La Figure 2 représente les résultats de la détection et de l'évolution des anticorps circulants dirigés contre le le Benzo[a]pyrène (BAP) en IgA, le dibenz[a,c]anthracène (DBA) en IgA, le 7, 12-dimethylbenza[a]anthracène (DMBA) en IgA, le 1,2-benzanthracène (BA) en IgA, le benzo(ghi)perylène (B(ghi)P en IgA et le contrôle négatif N-acétylcystéine (NAC) en IgA, au cours de l'évolution d'un cancer.

Définitions

Par « anticorps circulants » au sens de l'invention, on entend des anticorps que l'on retrouve dans les fluides biologiques humains ou animaux, en particulier dans le sang, le sérum et/ou le plasma d'êtres humains ou d'animaux.

Par « blanc réactif » au sens de l'invention, on entend une solution ou un mélange contenant l'ensemble des réactifs utilisés au cours du procédé selon l'invention, mais qui ne contient pas l'échantillon à analyser. Il permet d'apporter une correction de base aux résultats du dosage. Il définit le bruit de fond du procédé de dosage.

Par « fluide biologique » au sens de l'invention, on entend fluide du corps d'un être humain ou d'un animal, en particulier le sang, le sérum et/ou le plasma, le liquide céphalo rachidien, les liquides pleuraux et intra péritonéaux, les liquides intra articulaires, la salive ou l'urine. Par « maladie proliférative » au sens de l'invention on entend une maladie caractérisée par une prolifération cellulaire anormale et anarchique.

Description détaillée de l'invention

L'invention a donc pour objet un procédé ex vivo de détection ou de suivi de l'évolution d'une maladie chronique proliférative.

La maladie peut être toute maladie chronique proliférative, et en particulier il peut s'agir d'un cancer, notamment d'un lymphome, d'un myélome ou d'une leucémie.

Le procédé est réalisé ex vivo, en dehors du corps humain ou animal, dans un échantillon de fluide biologique humain ou animal, préférentiellement de sérum ou de plasma humain ou animal, qui a été prélevé avant la mise en oeuvre du procédé. L'échantillon de fluide biologique est un échantillon qui a été prélevé et conservé selon les normes habituelles et connues de l'homme du métier.

Le procédé selon l'invention est réalisé par dosage immunologique de la présence dans l'échantillon d'anticorps circulants dirigés contre des antigènes spécifiques des maladies chroniques prolifératives.

Le procédé peut être tout type de procédé de dosage immunologique. Il peut s'agir en particulier d'un dosage ELISA, de tests bandelettes, de tests réalisés à l'aide de billes magnétiques, de latex ou de silice ou encore de test Western Blot. La mise en oeuvre de ces tests peut être réalisée selon les connaissances de l'homme du métier.

Dans la mise en oeuvre du procédé selon l'invention :

- Les antigènes utilisés pour la mise en oeuvre du procédé sont préférentiellement des antigènes synthétisés ex vivo ;

- Les antigènes utilisés sont préférentiellement couplés (conjugués) à une protéine, telle que la Sérum Albumine Bovine par exemple, pour faciliter la fixaméthode de dosage) ; ainsi un anticorps dirigé contre un antigène au sens de la présente invention peut signifier (hors bactéries) anticorps dirigé contre un antigène conjugué que l'expression « conjugué » après l'antigène soit indiquée ou non. - Les anticorps secondaires, dits anti-isotypes, sont préférentiellement conjugués à une enzyme telle que la peroxidase ou la phophatase alcaline sont dilués en fonction de leur isotypie, dans un tampon diluant, dit de conservation, contenant des protéines stabilisatrices. Ces anticorps sont préférentiellement des anticorps connus et qui peuvent être achetés.

Le procédé selon l'invention comporte préférentiellement un test immuno enzymatique basé sur la méthode Elisa. Le procédé de dosage immunologique peut comprendre les étapes suivantes :

- les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps que l'on cherche à détecter dans l'échantillon, sont adsorbés (et éventuellement séchés) sur des plaques de micro-titration ; cette étape consiste à sensibiliser des plaques de micro-titration avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l'échantillon.

Les plaques sont ensuite soit directement utilisées pour la mise en oeuvre du procédé, soit séchées et conservées en atmosphère sèche, préférentiellement à 4°C et à l'abri de la lumière.

- l'échantillon à tester est ensuite préférentiellement dilué ; cette dilution peut être comprise entre 125 et 1000 fois, notamment 150 à 1000 fois ;

- de même, de façon préférée, des sérums ou plasmas tests, appelés étalons internes, qui sont des fluides biologiques de sujets sains, préférentiellement des sérums ou plasma de sujets sains (population représentative et appariée avec celle des malades au moins pour le sexe et l'âge), sont utilisés et préférentiellement dilués ; cette dilution peut être comprise entre 125 et 1000 fois, notamment 150 à 1000 fois ;

- l'échantillon, un blanc réactif et préférentiellement également les étalons internes, sont répartis, de façon préférée en duplicate, dans des puits d'au moins une plaque de micro titration sensibilisée,

- préférentiellement la ou les plaques sont incubées ; selon un mode de réalisation particulièrement adapté elles sont incubées entre lh30 et 2h00, préférentiellement entre lh45 et 2h00, à une température de 35 à 39°C,

- préférentiellement la ou les plaques sont lavées, c'est-à-dire rincées, préférentiellement plusieurs fois, dans l'objectif d'éliminer toutes les protéines et immunoglobulines non spécifiques ;

- on ajoute ensuite des anticorps anti immunoglobulines humaines ou animales dit anticorps secondaires, dirigés contre des isotypes A, M ou G pour l'homme, A, M, G ou E chez l'animal ; ces anticorps secondaires sont des anticorps dirigés contre les immunoglobulines liées aux antigènes présents dans les puits des plaques de micro-titration ; les anticorps secondaires sont préférentiellement couplés à une enzyme, et de façon préférée à la peroxydase ou phosphatase alcaline , pour permettre de faire une réaction colorimétrique,

- préférentiellement les plaques sont de nouveau incubées pendant 1 heure à 2 heures à une température comprise entre 35 et 39°C,

- préférentiellement les plaques sont ensuite de nouveau lavées, c'est-à-dire que l'on procède à plusieurs rinçages de façon à éliminer ce qui n'a pas été spécifiquement reconnu,

- préférentiellement on applique ensuite un substrat de l'enzyme (H2O2 pour la peroxydase ou pour la phosphatase alcaline) avec un chromogène, cette étape a pour objectif de visualiser les réactions immunologiques. Le chromogène peut être par exemple le tétra- méthyl-benzédine (TMB) ou Diamino benzedine (DAB); une réaction colorimétrique apparaît ; celle-ci est d'autant plus intense qu'il y a d'immunoglobulines humaines ou animales fixées sur les antigènes présents dans les puits ;

- éventuellement incuber de nouveau entre 10 et 30 minutes à une température comprise entre 18 et 20°C, préférentiellement à l'abri de la lumière ; la réaction est ensuite stoppée très préférentiellement en solution acide ;

- la densité optique de chaque puit des plaques de micro-titration est ensuite lue, préférentiellement à l'aide d'un spectrophotomètre ; la lecture se fait préférentiellement à 450 nm avec un alpha de correction à 620 nm ou à 650 nm ; ces densités optiques sont ensuite préférentiellement enregistrées dans un logiciel.

Suivant un algorithme spécifique, les valeurs des DO du sérum de patient (humain ou animal) de l'ensemble des marqueurs spécifiques définissant son profil immunologique est confronté à la distribution d'une population de patients atteints d'une pathologie chronique proliférative versus la distribution d'une population de contrôles sains. Ces distributions de population dépendent d'un test U Mann et Whitney avec une probabilité associée à un test U de Mann et Whitney (P value) seuil de 0.01, sur une répartition par centiles. Il est ainsi possible de détecter si l'être humain ou l'animal à qui appartient le sérum et/ou le plasma testé est atteint d'une maladie proliférative ou non.

De plus le procédé selon l'invention permet également de suivre l'évolution de la maladie. La variation de la valeur DO pour le ou les anticorps recherchés permet de vérifier la variation, l'évolution de la maladie, définie par la P value du test U de Mann et Whitney : - Si la P value est inférieure à 0.01 définie par le test U de Mann et Whitney, de la distribution de la population de patients (humaine ou animale) par rapport à la distribution de population des contrôles sains, alors le taux d'anticorps circulants sériques dirigés contre un antigène bactérien et/ou un néo-antigènes est significativement différent du taux d'anticorps circulants sériques d'une population de contrôles sains.

- Si la P value est supérieure à 0.01 définie par le test U de Mann et Whitney, de la distribution de la population de patients (humaine ou animale) par rapport à la distribution de population des contrôles sains, alors le taux d'anticorps circulants sériques dirigés contre un antigène bactérien et/ou un néo-antigènes est identique au taux d'anticorps circulants sériques d'une population de contrôles sains. La et/ou les DO obtenue(s) du patient ou de l'animal se répartissent par centile selon la distribution choisie par l'algorithme conçu.

Dans le cas de cancers, si les DO se répartissent sur la distribution par centiles de la population des patients, alors pour les anticorps recherchés selon l'invention, cela signifie qu'il s'agit d'un cancer et/ou tout autre pathologie chronique proliférative.

Le dosage d'un ou plusieurs anticorps spécifique(s) permet également de proposer un traitement adapté en fonction du ou des anticorps testés présents dans l'échantillon.

Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend au moins la mise en oeuvre des étapes suivantes :

- fabriquer au moins une plaque de micro titration sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l'échantillon, ou utiliser au moins une plaque de micro titration déjà sensibilisée avec ces antigènes,

- répartir sur la plaque le même volume (c'est-à-dire la même quantité) d'étalons internes, d'échantillon et de blanc réactif,

- ajouter le ou les anticorps secondaires couplé(s) à une enzyme,

- ajouter un substrat de l'enzyme et un chromogène, attendre la coloration des puits,

- stopper la réaction de coloration,

- lire la densité optique des puits à l'aide d'un spectrophotomètre une longueur d'onde appropriée.

Notamment, un mode de réalisation particulièrement adapté de l'invention est un procédé qui comprend au moins la mise en oeuvre des étapes suivantes : - fabriquer au moins une plaque de micro titration sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l'échantillon, ou utiliser au moins une plaque de micro titration déjà sensibilisée avec ces anticorps,

- diluer l'échantillon à tester et des étalons internes,

- répartir en duplicate sur la plaque le même volume d'étalons internes dilués, d'échantillon dilué et de blanc réactif,

- incuber,

- laver,

- ajouter le ou les anticorps secondaires couplés à la peroxydase ou phosphatase alcaline,

- incuber,

- laver,

- ajouter un substrat et un chromogène,

- stopper la réaction en solution acide

- lire à 450nm avec un alpha de correction à 620 nm ou 650 nm.

Les anticorps recherchés dans le cadre du procédé selon l'invention, quelques soient les antigènes contre lesquels ils sont dirigés, peuvent être des IgM (immunoglobulines d'isotype M), des IgA (immunoglobulines d'isotype A), ou des IgG (immunoglobulines d'isotype G) et chez l'animal uniquement des IgE (immunoglobulines d'isotype E) :

- les anticorps IgA : sont le résultat d'une activation immunitaire mucosale (intestinale, orl, peau, vésicale)

- les anticorps IgM: sont le résultat d'une activation du système immunitaire actuel,

- les anticorps IgG : sont le résultat d'une activation du système immunitaire ancien (immunité mémoire)

- les anticorps IgE (chez l'animal uniquement) sont le résultat de la stimulation des mastocytes qui libèrent de l'histamine, c'est-à-dire qu'ils sont le résultat d'un contact avec des antigènes allergisants.

Le procédé selon l'invention est donc réalisé par dosage immunologique de la présence d'anticorps dans l'échantillon dont au moins un anticorps dirigé contre le benzo(a)pyrène.

En effet, selon l'invention, la présence d'anticorps dirigé(s) contre le benzo(a)pyrène dans un fluide biologique humain ou animal, indique la présence d'une maladie chronique proliférative. Selon l'invention ces anticorps sont impliqués dans les mécanismes physiologiques à l'origine de toutes les maladies chroniques prolifératives. Le benzo(a)pyrene est un carcinogène chimique qui se lie à un récepteur intracyto plasmique appelé AhRmi et le benzo(a)pyrène est représentatif de tous les ligands qui se lient à ce récepteur pour l'activer et entraîner la dérépression de gènes qui provoquent une prolifération. La présence de benzo(a)pyrene indique une activation du système immunitaire par des constituants cellulaires.

Selon l'invention, la présence dans le fluide biologique, en particulier dans le sérum et/ou dans le plasma, d'anticorps dirigé(s) contre le benzo(a)pyrene, préférentiellement IgA et/ou IgG, signifie obligatoirement que la personne ou l'animal concerné est atteint par une maladie proliférative chronique.

Le procédé selon l'invention peut également comprendre le dosage immunologique de la présence d'autres anticorps dans l'échantillon en plus de la présence d'anticorps dirigé(s) contre le benzo(a)pyrène. En particulier le procédé selon l'invention peut également comprendre le dosage immunologique de la présence dans l'échantillon d'autres anticorps dont au moins un anticorps choisi parmi :

- les anticorps dirigé(s) contre le phosphatidyl inositol,

- les anticorps dirigé(s) contre l'acide azélaique.

L'acide azélaique est un produit de la dégradation des acides gras insaturés. La présence d'acide azélaique chez l'homme ou l'animal provoque une activation du système immunitaire par ce produit de la lipopéroxydation. En effet la présence d'acide azélaique chez l'homme ou l'animal est le résultat d'une oxydation et l'intervention de radicaux libres OH, O2, NO et NO2. Cela signifie notamment qu'il y a une destruction membranaire ou une liaison anarchique à d'autres constituants du soi et par conséquent il devient immunogénique.

Selon l'invention, la présence dans le fluide biologique d'anticorps dirigés contre l'acide azélaique, en particulier d'IgA et/ou d'IgM et/ou d'IgG, peut signifier que la personne ou l'animal concerné est atteint par une maladie proliférative chronique en particulier lorsque cette présence est combinée à celle du benzo(a)pyrene.

La présence de phosphatidyl inositol indique une activation du système immunitaire par des constituants cellulaires.

Le phosphatidyl inositol est un médiateur intracellulaire qui entraîne une cascade d'évènements métaboliques lors de la transformation cellulaire. Ce métabolite est augmenté de façon excessive (jusqu'à 200 fois). Selon l'invention, la présence dans le fluide biologique d'anticorps dirigé(s) contre le phosphatidyl inositol, préférentiellement IgA et/ou IgM et/ou IgG, peut signifier que la personne ou l'animal concerné est atteint par une maladie proliférative chronique en particulier lorsque cette présence est combinée à celle du benzo(a)pyrene.

Préférentiellement, le procédé selon l'invention comprend le dosage immunologique de la présence d'anticorps dans l'échantillon dont au moins un des anticorps suivants :

- IgM et/ou IgG et/ou IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le benzo(a)pyrène.

Il suffit que l'un de ces anticorps soit présent dans l'échantillon de fluide biologique testé, en particulier dans le sérum et/ou le plasma testé, c'est-à-dire que le test soit positif pour au moins un de ces anticorps, pour que la personne soit atteinte d'une maladie proliférative chronique.

Selon un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend le dosage immunologique de la présence d'autres anticorps dans l'échantillon, dont au moins un anticorps choisi parmi les anticorps suivants :

- IgM et/ou IgG et/ou IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le phosphatidyl inositol,

- IgM et/ou IgG et/ou IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l'acide azélaïque.

Selon une variante, le procédé selon l'invention comprend le dosage immunologique de la présence d'anticorps dans l'échantillon dont au moins les anticorps suivants :

- IgM, IgG et IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le benzo(a)pyrène, et

- IgM, IgG et IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le phosphatidyl inositol, et

- IgM, IgG et IgA (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l'acide azélaïque.

Le procédé selon l'invention, en plus (soit en même temps, soit dans un test séparé) du dosage immunologique de la présence dans l'échantillon d'au moins un anticorps dirigé contre le benzo(a)pyrène, et éventuellement d'au moins un anticorps dirigé contre le phosphatidyl inositol et éventuellement d'au moins un anticorps dirigé contre l'acide azélaïque, peut comprendre également le dosage immunologique de la présence dans l'échantillon d'un ou plusieurs autres anticorps.

Il peut s'agir préférentiellement :

- d'anticorps dirigé(s) contre des néo-antigènes qui sont des cofacteurs à l'origine des maladies chroniques prolifératives, et qui permettent de confirmer ou d'affiner le diagnostic et/ou qui permettent de suivre l'évolution de la maladie et/ou qui permettent de proposer un traitement ciblé dirigé contre le ou les antigènes concernés, et/ou - d'anticorps dirigé(s) contre des néo-antigènes qui sont des conséquences de maladies chroniques prolifératives, et qui permettent de suivre l'évolution de la maladie et/ou qui permettent de proposer un traitement ciblé dirigé contre le ou les antigènes concernés. Selon un mode particulier de réalisation, le procédé selon l'invention comprend également le dosage immunologique de la présence dans l'échantillon d'au moins un anticorps dirigé contre un néo-antigène qui est un cofacteur à l'origine d'une maladie chronique proliférative, et notamment d'au moins un des anticorps suivants :

- anticorps dirigé(s) contre l'acide palmitique,

- anticorps dirigé(s) contre l'acide oléique,

- anticorps dirigé(s) contre l'acide myristique,

- anticorps dirigé(s) contre le malondialdéhyde.

Le procédé selon l'invention comprend préférentiellement le dosage immunologique de la présence dans l'échantillon d'au moins deux ou d'au moins trois ou d'au moins quatre des anticorps suivants ou de tous les anticorps suivants :

- anticorps dirigé(s) contre l'acide palmitique,

- anticorps dirigé(s) contre l'acide oléique,

- anticorps dirigé(s) contre l'acide myristique,

- anticorps dirigé(s) contre le malondialdéhyde.

L'acide palmitique, l'acide oléique et l'acide myristique sont des agents acylants de protéines membranaires et cytoplasmiques. Ces composés ne sont pas naturellement immunogéniques. Mis à part l'acide oléique, ce sont des acides gras saturés qui peuvent donner des composés insaturés décomposables lors des mécanismes de lipopéroxydation. Ils le deviennent en cas de déstructuration membranaire liée à l'intervention de radicaux libres. La présence d'un ou plusieurs anticorps circulants dirigé(s) contre l'un de ces acides signifie donc qu'il y a eu une modification de la structure membranaire des protéines et/ou des mécanismes de lipopéroxydation.

Le malondialdéhyde (ou aldéhyde malonique), est la conséquence du stress oxydant. Il est issu notamment de l'action des dérivés réactifs de l'oxygène, du NO sur des acides gras. Il réagit avec la désoxyadénosine et la désoxyguanosine pour former des adducs à l'ADN. Comme l'acide azélaïque, il est le résultat de l'oxydation et de l'intervention de radicaux libres sur les acides gras. Il est donc également un marqueur de la destruction membranaire. Préférentiellement, le procédé selon l'invention comprend le dosage immunologique de la présence d'anticorps dans l'échantillon dont au moins un des anticorps suivants :

- IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l'acide palmitique,

- IgA, IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l'acide oléique,

- IgA, IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l'acide myristique,

- IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le malondialdéhyde,

Selon une variante particulièrement adaptée, le procédé selon l'invention comprend le dosage immunologique de la présence d'anticorps dans l'échantillon dont au moins les anticorps suivants :

-IgA, IgM et IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l'acide palmitique, et

- IgA, IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l'acide oléique, et

- IgA, IgM (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre l'acide myristique, et

- IgA, IgM et IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le malondialdéhyde,

Selon un autre mode particulier de réalisation, le procédé selon l'invention comprend également le dosage immunologique de la présence dans l'échantillon d'au moins un anticorps dirigé contre un antigène qui est une conséquence d'une maladie chronique proliférative, et notamment d'au moins un anticorps choisi parmi les anticorps suivants :

- anticorps dirigé(s) contre le 1.2-benzanthracène

- anticorps dirigé(s) contre le dibenz[a,c]anthracène,

- anticorps dirigé(s) contre le 7,12-dimethylbenza[a]anthracène

- anticorps dirigé(s) contre le benzo(ghi)perylène,

- anticorps dirigé(s) contre la cadavèrine,

- anticorps dirigé(s) contre la putrescine- anticorps dirigé(s) contre Mycobacterium tuberculosis.

Le procédé selon l'invention comprend préférentiellement le dosage immunologique de la présence dans l'échantillon d'au moins deux ou de tous les anticorps suivants :

- anticorps dirigé(s) contre le 1.2-benzanthracène

- anticorps dirigé(s) contre le dibenz[a,c]anthracène,- anticorps dirigé(s) contre le 7,12- dimethylbenza[a]anthracène

- anticorps dirigé(s) contre le benzo(ghi)perylène,

- anticorps dirigé(s) contre la cadavèrine,

- anticorps dirigé(s) contre la putrescine, - anticorps dirigé(s) contre Mycobacterium tuberculosis.

Le 1.2-benzanthracène, le dibenz[a,c]anthracène, le 7,12-dimethylbenza[a]anthracène et le benzo(ghi)perylène sont des composés aromatiques polycycliques cancérigènes qui reconnaissent le récepteur AhR et des polluants environnementaux. Ce sont des molécules capables d'induire des tumeurs.

La cadaverine et la putrescine sont des marqueurs, c'est-à-dire une conséquence, de l'hyper production de polyamines. Ils ont une influence négative sur les patients.

Mycobacterium tuberculosis est une bactérie pathogène à Gram positif responsable de la tuberculose. Elle intervient également chez des patients atteints d'autres maladies tels que des personnes ou animaux atteints de certaines pathologies prolifératives. Elle ne produit pas de toxine et doit son pouvoir pathogène à sa capacité à se multiplier. La lyse des bactéries libère des constituants antigèniques qui suscitent une réaction immunitaire induisant un état d'hypersensibilité.

Préférentiellement, le procédé selon l'invention comprend le dosage immunologique de la présence d'anticorps dans l'échantillon dont au moins un des anticorps suivants :

- IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le 1,2-benzanthracène,

- IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le dibenz[a,c]anthracène,

- IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le 7,12- dimethylbenza[a]anthracène,

- IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le benzo(ghi)perylène, ,

- IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la cadavérine,

- IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la putrescine,

- IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre Mycobacterium tuberculosis. Selon une variante particulièrement adaptée, le procédé selon l'invention comprend le dosage immunologique de la présence d'anticorps dans l'échantillon dont au moins les anticorps suivants :

- IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le 1,2-benzanthracène,

- IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le dibenz[a,c]anthracène,

- IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le 7,12 dimethylbenza[a]anthracène,

- IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre le benzo(ghi)perylène, ,

- IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la cadavérine , - IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre la putrescine,

- IgA, IgM et/ou IgG (et/ou IgE pour les animaux) dirigé(s) contre Mycobacterium tuberculosis. Pour mettre en oeuvre le procédé, l'invention a également pour objet des kits de diagnostic. En particulier, l'invention a pour objet un kit pour son utilisation dans la détection ou le suivi de l'évolution d'une maladie chronique proliférative, dans un échantillon de fluide biologique, en particulier dans un échantillon de fluide biologique humain ou animal comprenant au moins le ou les antigènes contre lesquels est (sont) dirigé(s) les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l'échantillon, à savoir :

- au moins le benzo(a)pyrène ,

- éventuellement au moins un des antigènes suivants : l'acide palmitique, le malondialdéhyde , l'acide oléique, l'acide myristique, le 1,2-benzanthracène, le dibenz[a,c]anthracène, le 7,12-dimethylbenza[a]anthracène, le benzo(ghi)perylène, cadaverine, putrescine, Mycobacterium tuberculosis, et/ou le phosphatidyl inositol et/ou l'acide azélaïque.

Préférentiellement, le kit selon l'invention comprend au moins :

- le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l'échantillon, préférentiellement couplés à une protéine lorsqu'il ne s'agit pas de bactéries, et une plaque de micro titration destinée à être sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l'échantillon, ou une plaque de micro titration déjà sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l'échantillon, ou une bandelette ou barrette déjà sensibilisée avec le ou les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps dont on cherche à détecter la présence dans l'échantillon, et

- les étalons permettant d'évaluer la qualité du test et la distribution de la population contrôle, et/ou

- des tampons et des solutions adaptés à la réalisation d'un test ELISA, et/ou

- le ou les anticorps secondaire(s) en solution, lesdits anticorps secondaire(s) correspondant aux isotypies des anticorps primaires dont on cherche à détecter la présence dans l'échantillon, et/ou

- des tampons de dilution et de lavage, et/ou

- des tampons de révélation, et/ou - une solution d'arrêt.

L'invention est à présent illustrée par des exemples et des résultats de mise en oeuvre de procédés selon l'invention.

Pour chaque exemple et résultats associés, le protocole a été le suivant :

- prélèvement du plasma du patient

- mise en oeuvre du procédé selon l'invention

- résumé des résultats obtenus dans un tableau pour visualiser la détection des anticorps circulants et suivre leur évolution

Chaque exemple permet de faire le lien entre la distribution de la population touchée par une pathologie chronique proliférative par rapport à la distribution d'une population contrôle.

Exemples

Exemple 1 : Résultats de la mise en oeuyre d'un procédé selon l'invention sur une personne atteinte d'un cancer

Les résultats de la détection des anticorps circulants dirigés contre le Benzo[a]pyrène (BAP) en IgA, le dibenz[a,c]anthracène (DBA) en IgA, le 7, 12-dimethylbenza[a]anthracène (DMBA) en IgA, le 1,2-benzanthracène (BA) en IgA, le benzo(ghi)perylène (B(ghi)P en IgA et le contrôle négatif N-acétylcystéine (NAC) en IgA, au cours de l'évolution de la maladie sont présentés sur la Figure 1, sous forme d'une distribution d'une population de patients atteints de cancers, le point médian représente 50% de la population.

Exemple 2 : Résultats de la mise en oeuyre d'un procédé selon l'invention sur une personne atteinte d'un cancer

Les résultats de la détection et de l'évolution des anticorps circulants dirigés contre le le Benzo[a]pyrène (BAP) en IgA, le dibenz[a,c]anthracène (DBA) en IgA, le 7, 12- dimethylbenza[a]anthracène (DMBA) en IgA, le 1,2-benzanthracène (BA) en IgA, le benzo(ghi)perylène (B(ghi)P en IgA et le contrôle négatif N-acétylcystéine (NAC) en IgA, au cours de l'évolution de la maladie sont présentés sur la Figure 2.

Ces différents exemples montrent notamment que les populations atteintes de maladies chroniques prolifératives présentent toujours des anticorps circulants dirigés contre au moins un ou plusieurs anticorps dirigé(s) contre le Benzo(a)pyrène.

Le procédé selon l'invention permet également de suivre l'évolution de la maladie.