Verfahren zum Nachweis sekundärer Botenstoffe mit fluoreszenzbasierten Sensorproteinen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

Die Erfindung betrifft ein hochsensitives Messverfahren zur quantitativen Konzentrationsbestimmung sekundärer Botenstoffe mit fluoreszenzbasierten Sensorproteinen und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Stand der Technik Cyclisches Adenosin-3',5'-monophosphat (cAMP) ist ein bedeutender sekundärer Botenstoff und ist in viele zelluläre Signalprozesse eingebunden. Das cAMP wird von Adenylatzyklasen aus ATP synthetisiert. Die Aktivität der Adenylatzyklasen kann über Zelloberflächenrezeptoren stimuliert aber auch inhibiert werden. Nachfolgend steigt bzw. sinkt die intrazelluläre cAMP Konzentration. Um cAMP Stoffmengen zu quantifizieren, stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung.

Ein erstes Verfahren zur Auftrennung und Quantifizierung des Analyten (hier cAMP) betrifft die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (kurz: HPLC). Mit Messzeiten von ca. 20 Min. je Probe ist die HPLC für Probenzahlen, wie sie in Mittel- und Hochdurchsatzexperimenten anfallen, nur bedingt geeignet. Um zuverlässige Aussagen zur Wirkungsweise eines Liganden treffen zu können, sind Mehrfachbestimmungen, mindestens 4-fach, notwendig und dies über einen Konzentrationsbereich des Liganden der mehrere Größenordnungen (z. B. 0, 1 nM - 0,1 mM) abdecken muss. Typische Probenzahlen, die je Messreihe anfallen, liegen zwischen 100 bis 200. Rechnerisch ergibt sich hieraus bei Verwendung einer HPLC Anlage eine reine Messzeit ohne Probenvorbereitung zwischen 33 und 67 h. Dies ist für die meisten Fragestellungen in diesem Bereich inakzeptabel.

Alternativ stehen kommerziell erhältliche Komplettsysteme zur Verfügung. Die cAMP Bestimmungen werden entweder als Radio Immunoassays (RIA) oder als Enzyme- linked Immunoassays (EIA) durchgeführt. Bei diesen Verfahren konkurriert radioaktiv markiertes (RIA) oder Fluorophor- bzw. Enzym-markiertes cAMP (EIA) mit nicht- markiertem cAMP aus der Probe um Bindungsstellen an spezifischen cAMP Bindungsproteinen. Für die Signaldetektion werden entweder Flüssigkeit Szintillations- detektoren oder Fluoreszenzlesegeräte benötigt. Diese Assays ermöglichen den Nachweis von cAMP Stoffmengen zwischen ca. 0,2 und > 200 pmol. Die Nutzung radioaktiv markierter Verbindungen stellt nachteilig hohe Anforderungen an die Laborstandards, in denen die Experimente durchgeführt werden sollen. Dazu gehören Umgangsgenehmigungen für die jeweiligen Nuklide, spezifische bauliche und sicherheitsrelevante Anforderungen an die Laborräume, spezielle Apparaturen zur Detektion der radioaktiv markierten Verbindungen, sowie spezifische Kontroll- und Schutzmaßnahmen für die Mitarbeiter, die die Experimente durchführen. In den letzten 10 Jahren ist zudem ein deutlicher Rückgang in Bezug auf den kommerziellen Vertrieb von Radioimmuno (RIA)-Assays zu verzeichnen, sodass es mittelfristig notwendig sein wird auf Alternativverfahren umzustellen.

Eine Reihe der in den zurückliegenden Jahrzehnten verwendeten RIA-Assays sind inzwischen durch Enzyme-Iinked Immunoassays (EIA) abgelöst worden. Ein zentraler Bestandteil dieser Messverfahren ist der Einsatz hochspezifischer Antikörper, die den Analyten (hier cAMP) binden können. Weiterhin sind fluoreszenzmarkierte oder enzymgekoppelte Liganden notwendig, die mit dem cAMP, das in einer Probe nachgewiesen werden soll, um die Bindestelle an dem Antikörper konkurrieren (Kompe- titor). Sowohl die Herstellung, Reinigung und Qualitätssicherung der Antikörper als auch der jeweiligen Kompetitoren ist sehr aufwändig. Ähnlich wie bereits für die HPLC-basierten Nachweisverfahren beschrieben, gilt sowohl für die RIA- als auch die EIA-Verfahren, dass die Inkubationsschritte bis zur finalen Bestimmung der Ana- lytkonzentration sehr zeitintensiv sind. Bei RIA-Assays kann der Zeitaufwand bis zu 24 Std. betragen, bei EIA-Assays sind in der Regel zwischen 4 - 5 Std. erforderlich.

Zellen registrieren Signale aus ihrer Umgebung überwiegend mithilfe von Zelloberflächenrezeptoren. Diese Rezeptoren übertragen die spezifische Erkennung eines Signals mittels einer Konformationsänderung auf die intrazelluläre Seite und aktivieren dort weitere Proteine, die z.B. die Aktivität von Enzymen oder lonenkanälen mo- dulieren. An der intrazellulären Signalübertragung sind häufig kleine sekundäre Bo- tenstoffmoleküle beteiligt, deren Konzentration dynamisch über die Rezeptoraktivität reguliert werden kann. Für das detaillierte Verständnis zellulärer Signalverarbeitungsprozesse ist es wichtig, die Änderungen der Botenstoffkonzentrationen zu quantifizieren, um sie mit dem Ausgangssignal zu korrelieren.

Aufgabe der Erfindung Aufgabe der Erfindung ist es, ein schnelles, robustes, hochsensitives Verfahren zum Nachweis sekundärer Botenstoffe mit fluoreszenzbasierten Sensorproteinen sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens bereit zu stellen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur quantitativen Konzentrationsbestimmung sekundärer Botenstoffe mit fluoreszenzbasierten Sensorproteinen und eine entsprechende Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens bereit zu stellen.

Lösung der Aufgabe

Die Aufgabe wird gelöst mit dem Verfahren nach Patentanspruch 1 und der Vorrichtung bzw. dem Kit gemäß den Nebenansprüchen. Vorteilhafte Ausgestaltungen hier- zu ergeben sich jeweils aus den hierauf rückbezogenen Patentansprüchen.

Beschreibung der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis sekundärer Botenstoffe weist die nachfolgenden Schritte auf:

- Zugabe eines fluoreszenzbasierten Sensorproteins in ein Behältnis, vor- zugsweise in die Vertiefungen einer Multiwellschale,

- Messung der Grundfluoreszenz ohne den sekundären Botenstoff,

- Zugabe des sekundären Botenstoffs zum Behältnis, vorzugsweise in die Vertiefungen einer Multiwellschale,

- Messung der Fluoreszenzänderung zum Nachweis des sekundären Boten- Stoffs.

Das Verfahren gewährleistet den Nachweis und die Quantifizierung der Botenstoffkonzentrationen, um sie mit einem Ausgangssignal zu korrelieren. Dies stellt daher ein Verfahren dar, mit dem ein detailliertes Verständnis zellulärer Signalverarbeitungsprozesse gewährleistet werden kann.

Das Verfahren wird insbesondere außerhalb der Zelle angewendet.

Das Verfahren ist in einer Ausgestaltung der Erfindung gekennzeichnet durch die Wahl eines fluoreszenzbasierten Sensorproteins, welches durch Klonierung und Bereitstellen der für das fluoreszenzbasierte Sensorprotein kodierenden DNA mit einem tag, z. B. einem Histidin tag in einen Expressionsvektor erhalten wurde.

Es wird Epad-camps genannt. Epad-camps ist ein genetisch kodierter Förster- Resonanzenergietransfer (FRET)-Sensor, der aus zwei Fluoreszenzproteinen (eCFP und eYFP) besteht, die über ein cAMP Bindemodul (Epad ) miteinander verbunden sind. In Abwesenheit von cAMP befinden sich eCFP und eYFP räumlich dicht beieinander. Wird eCFP mit Licht bei 436 nm angeregt, kann ein Teil der Energie strahlungslos auf eYFP übertragen werden und das eYFP fluoresziert (525 nm). In Anwesenheit von cAMP entfernen sich das eCFP und eYFP voneinander. Bei Belichtung des eCFP wird daher weniger Energie auf das eYFP übertragen. Die eYFP Fluoreszenz nimmt folglich ab und gleichzeitig steigt die eCFP Fluoreszenz.

Dadurch kann das aus Nikolaev et al., J. Biol. Chem., 279, 36, 37215 (2004) bekannte fluoreszenzbasierte Sensorprotein Epad-camps (AF103905) erstmalig für die direkte Quantifizierung von cAMP genutzt werden. Das Verfahren kann in einer Ausgestaltung der Erfindung durch die Wahl eines fluoreszenzbasierten Sensorproteins, welches durch die Expression in einem Bakterium erhalten wurde, gekennzeichnet sein.

Das Verfahren kann im Übrigen durch die Wahl eines fluoreszenzbasierten Sensorproteins gekennzeichnet sein, welches durch eine Reinigung durch eine Affinitäts- Chromatographie und eine Größenausschlusschromatographie erhalten wurde. Hierdurch wird das fluoreszenzbasierte Sensorprotein bereitgestellt. Als Affinitätschromatographie wird vorzugsweise eine Ni-NTA-Affinitätschromatographie durchgeführt.

Die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens umfasst in seiner einfachsten Ausprägung ein Behältnis und am besten eine Multiwellschale mit in den Vertiefun- gen vorliegendem fluoreszenzbasiertem Sensorprotein, insbesondere getrocknetem und/oder immobilisiertem fluoreszenzbasiertem Sensorprotein. Das Epad-camps- His Protein als fluoreszenzbasiertes Sensorprotein ist besonders interessant, da es zum quantitativen Nachweis des cAMP außerhalb einer Zelle genutzt werden kann. Die Erfindung ist hierauf noch nicht beschränkt. Vielmehr ist der Gegenstand der vorliegenden Patentanmeldung auch ein Kit umfassend,

- ein Behältnis, wie z. B. eine Multiwellschale mit in den Vertiefungen vorliegendem fluoreszenzbasiertem Sensorprotein, insbesondere getrocknetem und/oder immobilisiertem Epac1-camps-His Protein als fluoreszenzbasiertes Sensorprotein;

- einem sekundären Botenstoff, insbesondere cAMP.

Zur Immobilisierung kann Avidin und/oder Streptavidin verwendet werden.

In Bezug auf die Multiwellschale kann der Fachmann frei aus den aus dem Stand der Technik bekannten Varianten, Materialien und Farben auswählen. Das Material der Multiwellschale kann z. B. aus Kunststoff oder auch aus Glas oder einem anderen Material bestehen. Die Farbcodierung ist dabei nicht erheblich und beeinflusst die Messung und das durchgeführte Verfahren nicht.

Der Epad-camps Sensor ist bisher in lebenden Zellen, in akuten Gewebeschnitten sowie in lebenden Organismen zur Beobachtung der cAMP Dynamik als optogeneti- scher Sensor benutzt worden. Erfindungsgemäß wurde daher auch ein cAMP Nachweisverfahren entwickelt, das das„Exchange Protein directly activated by cAMP 1" nutzt. Dadurch wurde ein quantitatives cAMP Nachweisverfahren entwickelt, das das „Exchange Protein directly activated by cAMP 1" nutzt.

In der vorliegenden Patentanmeldung wird das fluoreszenzbasierte Sensorprotein entsprechend vorzugsweise in Multiwellschalen bereitgestellt.

Es wurde festgestellt, dass das Protein Epac1 -camps-His in Multiwellschalen lang- zeitstabil ist, und seine Aktivität auch nach langer Lagerdauer beispielweise von mehreren Wochen gegenüber cAMP nicht verliert. Dieser Befund ist insofern überra- sehend, da es nicht zu erwarten war, dass Epac1-camps-His Protein in Multiwell- schalen ohne jegliche weitere Modifikationen des Lagerungspuffers, z. B. mit Glyce- rol, vorgelegt und zur weiteren Verwendung gelagert werden kann. Es ist also möglich, Epac1-camps-His Protein in das Behältnis vorzulegen und zu trocknen um eine erfindungsgemäße Vorrichtung zu erhalten.

Da es möglich ist, dass auch andere zyklische Nukleotide durch fluoreszenzbasierte Sensorproteine nachgewiesen werden können, handelt es sich bei der vorliegenden Erfindung einerseits um schnelle, hochsensitive Messverfahren zur quantitativen Konzentrationsbestimmung sekundärer Botenstoffe mit fluoreszenzbasierten Sen- sorproteinen und andererseits auch um entsprechende Vorrichtungen zur Durchführung der Verfahren, insbesondere für den Nachweis von cAMP und cGMP.

Für den Nachweis von cGMP kann beispielhaft das fluoreszenzbasierte Sensorprotein cGES-DE5 (Nikolaev et al., Nature Methods 3 (1), 23 (2006) verwendet werden. Für den Nachweis von Inosital 1 ,4,5-trisphosphat (IP3) kann beispielhaft das fluores- zenzbasierte Sensorprotein LIBRAvIll (Tanimura et al., J. Biol. Chem 279, 38095 (2004) sowie (Tanimura et al., J. Biol. Chem 284, 89 0 (2009) verwendet werden.

Es war das primäre Ziel der Erfindung, den Epad-camps Sensor zur zellfreien Bestimmung von cAMP Stoffmengen nutzbar zu machen. Dazu wurde das Protein bakteriell überexprimiert und biochemisch sowohl affinitäts- als auch größenausschluss- chromatographisch aufgereinigt.

Das gereinigte fluoreszenzbasierte Sensorprotein wird in definierter Konzentration in das Behältnis, insbesondere die Multiwellschalen vorgelegt. Das gereinigte Protein wird in Puffer auf eine definierte Konzentration eingestellt. Als notwendig und hinreichend haben sich Konzentrationen zwischen 0,01 - 0,75 mg/ml, vorzugsweise 0,025 - 0,075 mg/ml und insbesondere 0,05 mg/ml erwiesen. Das Protein ist sofort einsatzbereit. Es kann aber vorteilhaft im Behältnis und insbesondere der Vertiefung der Multiwellschale getrocknet werden.

Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass es vorteilhaft möglich ist, fluoreszenzbasiertes Sensorprotein, und zwar insbesondere das Epac1-camps-His Protein, ohne Funktionsverlust im Behältnis bzw. in der Vertiefung der Multiwellschale einzu- trocknen, zu einem späteren Zeitpunkt mit Puffer zu rekonstituieren und erst dann für cAMP Bestimmungen einzusetzen.

Vorteilhaft ist das Verfahren gut geeignet, mit dem Epad-camps Sensor cAMP Mengen auch aus Zell- oder Gewebeextrakten zu bestimmen. Die Änderung der Fluoreszenzsignale in den einzelnen Vertiefungen einer Multiwell- schale (96er MWP) kann vorteilhaft mit einem Fluoreszenzlesegerät aufgezeichnet werden.

Mithilfe einer gleichzeitig durchgeführten Kalibrierung mit einer bekannten Menge cAMP werden dann die Stoffmengen der Proben korrekt quantifiziert. Besonders vorteilhaft ist das Verfahren geeignet, cAMP über vier Größenordnungen von ca. 0,15 bis 1000 pmol cAMP hinweg nachzuweisen. Damit wird erstmals ein hochsensitives, preiswertes, robustes und schnelles Verfahren zum Nachweis von cAMP bereitgestellt.

Neben der Sensitivität des Verfahrens ist ein weiterer wesentlicher Vorteil, dass die Bestimmung bereits ca. 30 Min. nach der Zugabe einer Probe zu der Epad-camps Lösung in der Multiwellschale erfolgen kann. Damit entfallen vorteilhaft zeitaufwendige Inkubations- und Waschschritte.

Das Verfahren und das erfindungsgemäße Kit in der hier beschriebenen Form benötigen daher vorteilhaft lediglich zwei Komponenten: (1 ) das gereinigte Sensorprotein im Behältnis und

(2) den Analyt.

Dabei ist es nicht zwingend erforderlich, dass das Sensorprotein in Lösung vorliegt, es kann ebenso im Behältnis an einen Träger bzw. in den Vertiefungen einer Multiwellschale getrocknet vorliegen oder hieran kovalent gekoppelt sein. Dabei sollte gewährleistet sein, dass die Gesamtbeweglichkeit des Proteins nicht beeinträchtigt ist, um die Vergrößerung des Abstands zwischen den Fluoreszenzproteinen CFP und YFP zu erreichen, der für die Änderung der Fluoreszenzemissionssignale entscheidend ist. Das beschriebene Verfahren zur Bestimmung von cAMP Stoffmengen mittels Epad - camps lässt sich prinzipiell auf die Bestimmung anderer Botenstoffe übertragen.

So sind fluoreszenzbasierte Sensorproteine bekannt, die zyklisches Guanosin-3',5'- monophosphat (cGMP) oder lnositol-1 ,4,5,trisphosphat (IP3) spezifisch binden. Die- se Sensorproteine werden in derselben Weise produziert und gereinigt, wie das Epad -camps, wodurch auch die Botenstoffe cGMP und IP3 mit hoher Sensitivität und relativ geringem zeitlichen Aufwand quantifiziert werden können.

Die Quantifizierung der Konzentration von sekundären Botenstoffen in Zelllysaten ist ein weiterer Vorteil des Verfahrens. Das vorgestellte, bakteriell exprimierte und bio- chemisch gereinigte fluoreszenzbasierte Sensorprotein ist vorteilhaft geeignet, um die Konzentration zellulärer Botenstoffe in einem zellfreien System zu bestimmen. Dabei wurde die bakterielle Überexpression der Sensorproteine optimiert, wobei verschiedene Parameter, z.B. Bakterienstamm, Expressionsvektor und Expressionsbedingungen verglichen wurden. Besonders vorteilhaft kann eine Inkubation von E. coli BL21 (DE3)-Codon Plus-RIL mit pET1 1a vector Übernacht bei 30°C erfolgen.

Proteine wurden vorzugsweise mittels zwei aufeinanderfolgenden chromatographischen Methoden, hier insbesondere der Nickel-NTA-Affinitätschromatographie in Bezug auf HIS-tag und einer Größenausschlusschromatographie, gereinigt. Die Zugabe definierter Konzentrationen (10 ^~8 bis 10 ^"3 M) cAMP zu dem gereinigten Protein in Multiwellschalen führte zu einer zuverlässigen konzentrationsabhängigen und saturierbaren Abnahme des FRET-Signals. Die cAMP-Stoffmengen liegen im Bereich der Werte, die bei zellulärer Signaltransduktion erreicht werden. Die Optimierung der Expression und der Reinigung von FRET-basierten cGMP bzw. IP3 Sensoren ist in analoger Weise möglich.

Der Sensor kann insbesondere genutzt werden, um cAMP Konzentrationen zu bestimmen, die nach der Stimulierung definierter Signalketten in eukaryotischen Zelllinien produziert wurden.

Die hier etablierten Expressions- und Reinigungsverfahren liefern zuverlässig hohe Ausbeuten an intaktem und funktionellem Protein. Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung auch ein Herstellungsverfahren für fluoreszenzbasierte Sensorproteine, wie z. B. das Epac1-camps-His Protein und das auf diese Weise hergestellte fluoreszenzbasierte Sensorprotein selbst, insbesondere das Epad -camps-His Protein. Das Verfahren zur Herstellung von fluoreszenzbasierten Sensorproteinen, insbesondere Epad -camps-His Protein, ist dabei gekennzeichnet durch die Schritte:

- Klonierung und Bereitstellen der für das fluoreszenzbasierte Sensorprotein kodierenden DNA mit tag, insbesondere hexa-Histidin tag, in einen Expressionsvektor, - Expression des fluoreszenzbasierten Sensorproteins, insbesondere des E- pac1-camps-His Protein in einem Bakterium,

- Reinigung durch Affinitätschromatographie, insbesondere durch eine Ni- NTA Affinitätschromatographie,

- Optional weitere Reinigung durch Größenausschlusschromatographie. Hierdurch wird das fluoreszenzbasierte Sensorprotein bereitgestellt, insbesondere das Epad-camps-His Protein.

Das Protein kann überraschend über viele Wochen stabil z. B. bei 4°C gelagert werden. Das fluoreszenzbasierte Sensorprotein kann getrocknet oder in Lagerungspuffer ohne eine Modifikation des Puffers z. B. mit Glycerol oder anderen Stoffen gelagert werden.

Das Epad-camps-His Protein zeigt bei einer Zugabe von cAMP eine konzentrationsabhängige und saturierbare Abnahme des FRET-Signals. Die Änderung der optischen Eigenschaften kann in Küvettenmessungen oder auch in Fluoreszenzlesegeräten in Multiwellschalen registriert werden. Grundsätzlich kann aber jedes geeig- nete und auslesbare Behältnis gewählt werden.

Es wurde festgestellt, dass das auf diese Weise hergestellte Epad-camps-His Protein unterschiedliche Pufferbedingungen problemlos toleriert. Verschiedene Salz- und pH-Bedingungen beeinflussen die Messergebnisse nicht. Die dargestellte Sensi- tivität und Zuverlässigkeit des erfindungsgemäßen Messverfahrens kann dabei mit kommerziell erhältlichen, fluoreszenzbasierten cAMP Bestimmungskits uneingeschränkt konkurrieren.

Damit wird erstmals ein kostengünstiges, schnell durchführbares, zuverlässiges, unkompliziertes, hochsensitives und aus wenigen Komponenten bestehendes Verfahren und eine entsprechende Vorrichtung bereit gestellt, das bzw. die gegenüber verfügbaren kommerziell erhältlichen Verfahren und Vorrichtungen hinsichtlich der Kosten, der Schnelligkeit, der Robustheit und der Nutzerfreundlichkeit überlegen sind und hinsichtlich der Sensitivität uneingeschränkt konkurrenzfähig oder sogar besser sind.

Ausführungsbeispiele

Im Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen und der beigefügten Figuren näher erläutert, ohne dass es hierdurch zu einer Beschränkung der Erfindung auf cAMP als sekundärer Botenstoff und Epac1-camps-His Protein als fluoreszenzbasiertes Sensorprotein kommen soll.

Es zeigen:

Figur 1 : SDS-PAGE des über Ni-NTA gereinigten Epad -camps-His Proteins. Das bakteriell überexprimierte Protein wurde mittels Ni-NTA Affinitätschromatographie angereichert. Aliquots von je 8 μΙ einzelner Fraktionen wurden auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel (SDS-PAGE; 12.5%) aufgetrennt und die Proteine mit Coomassie Brilliant Blau angefärbt. Die Größen der Referenzproteine des Markers sind links angegeben. CE = Rohextrakt; FT = Durchlauf; W = Waschfraktion; E = Eluat

Figur 2A: Absorptionsprofil der Größenausschlusschromatographie des Epad - camps-His Proteins bei 280 nm. Die Eluatfraktionen sind nummeriert und das Elutionsvolumen ist angeben (ml). Die Absorption ist auf der y-Achse angegeben (mAU).

Figur 2B: SDS-PAGE ausgewählter Fraktionen der größenausschlusschromatogra- phischen Reinigung des Epad -camps-His Proteins. Spur 1 :„PageRuler Plus Prestained"; Spur 2: Fraktion 6; Spur 3: Fraktion 20; Spur 4: Fraktion 22; Spur 5: Fraktion 24; Spur 6: Fraktion 26; Spur 7: Fraktion 28; Spur 8: Fraktion 30; Spur 9: Fraktion 32; Spur 10: Fraktion 34; Spur 1 1 :„Pa- geRuler Plus Prestained"; Spur 2: Fraktion 36; Spur 3: Fraktion 38; Spur 14: Fraktion 40; Spur 15: Fraktion 42; Spur 16: Fraktion 44; Spur 17: Fraktion 55; Spur 18: Fraktion 77

Figur 3: Erstellung einer Konzentrations-Wirkungskurve zur Kalibrierung des

Messverfahrens mit Epad-camps-His und definierten Konzentrationen von cAMP.

Figur 4: Erstellung einer Konzentrations-Wirkungskurve für die Octopamin- abhängige Aktivierung des DmOctßRI in einer Zelllinie, die das Rezeptorprotein konstitutiv exprimiert. Die Aktivierung des Rezeptors mit Octopa- min führt G-Protein-vermittelt zur Stimulierung zelleigener Adenylyl Zykla- sen (AC), die aus ATP den sekundären Botenstoff cAMP synthetisieren. Es wurden Zellextrakte hergestellt und das darin enthaltene cAMP wurde in einer 96er Multiwellschale mit vorgelegtem Epad-camps-His bestimmt. Für die Auswertung wurde die in der Figur 3 gezeigte Kalibrierung verwendet. Der EC50 Wert für Octopamin von 2.475 10 ^"8 M stimmt sehr gut mit den Werten überein, die bei Verwendung kommerzieller cAMP Detek- tionsassays erhalten werden.

Figur 5: Schematischer Mechanismus des cAMP Stoffwechsels (Erzeugung und

Abbau) in Zellen und Anwendungen des Verfahrens.

Für die Durchführung der Experimente wurden mehrere molekularbiologische und biochemische Verfahren durchgeführt.

1 ) Klonierung und Bereitstellung der für Epad-camps kodierenden DNA in einem bakteriellen Expressionsvektor

Die DNA, die für das Sensorprotein (AF103905) kodiert plus der entsprechenden Sequenzen für die fluoreszenzbasierten Anteile für eCFP und eYFP, wurde zunächst in den bakteriellen Expressionsvektor pET11 a (Novagen, Merck/Millipore) kloniert. Hierzu wurde die cDNA in zwei Schritten mittels PCR amplifiziert. An das 3' Ende des Konstrukts wurde eine Sequenz angefügt, die für sechs Histidine (6 x His) kodiert, über die das Protein aufgereinigt werden kann. Die PCR Produkte wurden mit den Restriktionsenzymen Ndel und Xbal sowie Xbal und BamHI geschnitten, gereinigt und dann in den Ndel und BamHI geschnittenen pET1 1a Vektor ligiert. Nach der Aufreinigung der Plasmid DNA wurde die Nukleinsäuresequenz auf Vollständigkeit und Richtigkeit durch Sequenzierung überprüft.

2) Expression des Epad-camps-His Proteins in Bakterien

Die Expression des Sensorproteins wurde hinsichtlich der Ausbeute und Stabilität in verschiedenen Bakterienstämmen, bei verschiedenen Wachstumsbedingungen (Temperatur, Zeit) sowie Induktionsbedingungen (Konzentration des IPTG; induziert die Expression des Gens) optimiert. Die besten Ergebnisse wurden mit folgenden Konditionen erzielt:

Expression in E.coli BL21 (DE3)-CodonPlusRIL (Stratagene), Anzucht bis zu einer OD von 0,4 - 0,6 bei 37°C, Induktion der Genexpression mit 1 mM Isopropyl-ß-D- thiogalactopyranosid (IPTG), fortführen der Inkubation bei 30°C über Nacht (ca. 20 Std.).

3) Reinigung des Epad-camps-His Proteins mittels Ni-NTA Affinitätschromatographie

Die Bakterien wurden nach der über Nacht Inkubation, siehe 2), geerntet. Das E. coli- Zellpellet wurde in 15 ml Lysis- und Äquilibrierungspuffer (Puffer A; 50 mM Na ₂ PO ₄ , 300 mM NaCI, 20 mM Imidazol) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in 12 ml Puffer A resuspendiert. Die Bakteriensuspension wurde mit 1 mg/ml Lysozym versetzt und für 30 Min. auf Eis inkubiert. Die Suspension wurde sonifiziert (18 x 20 s, Sonifier W-450 D, Branson Sonic Power Company) und dann zentrifugiert (3-16K, Sigma, 5.500 x g, 4 °C, -60 Min). Der Überstand enthielt das rekombinante Protein.

Zur Isolierung des Fusionsproteins wurde Ni-NTA Agarose verwendet (Macherey und Nagel, Düren). Die Histidine (6 x His), die an das Epad -camps-His Protein angefügt sind, können stabile Chelat-Komplexe mit den an der Matrix immobilisierten Ni ²⁺ - lonen bilden. Dadurch wird das Zielprotein durch die Ni-NTA Agarose zurückgehal- ten. Das Protein wurde sodann im Batch-Verfahren angereichert: 1 ml Ni-NTA Agarose wurde hierzu in einem 50 ml Reaktionsgefäß zwei Mal mit 10 Säulenvolumen (SV) Puffer A äquilibriert. Die Matrix wurde durch Zentrifugation pelletiert (3-16K, Sigma, 500 x g, 4 °C, 5 min). Anschließend wurde das Zelllysat zu der Agarose gegeben, vorsichtig gemischt und für 30 - 60 min bei 4 °C geschwenkt (Mini Rocker-Shaker, Biosan, Riga, Lettland). Nachdem der Überstand von der Matrix getrennt wurde (3- 16K, Sigma, 500 x g, 4 °C, 5 min), wurde das an die Ni-NTA Agarose gebundene Protein zwei Mal mit jeweils 20 SV Waschpuffer (Puffer B; 50 mM Na2P04, 300 mM NaCI, 30 mM Imidazol) gewaschen. Nach dem zweiten Waschschritt wurde die Mat- rix in 5 ml Puffer B resuspendiert und in eine Einmalsäule (Poly-Prep® Chromato- graphy Columns, Biorad, München) überführt. Das rekombinante Protein wurde schließlich mit Elutionspuffer (Puffer E; 50 mM Na ₂ P0 ₄ , 300 mM NaCI, 150 mM Imidazol) in 500 μΙ Schritten eluiert. Die Anreicherung des Proteins wurde dokumentiert, indem Aliquots einzelner Fraktionen in einem denaturierenden Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) aufgetrennt und die Proteine anschließend mit Coomassie Brilliant Blau angefärbt wurden (Figur 1). Fraktionen, die die größte Menge des eluierten Proteins enthielten wurden vereinigt und über ein 1 ml Amicon Ultra Zentrifugationsfilter (Merck/Millipore; cut off 50.000) nach Herstellerangaben aufkonzentriert.

4) Größenausschlusschromatoqraphie Die affinitätschromatographisch (Ni-NTA) und aufkonzentrierten Proteine wurden durch eine Größenausschlusschromatographie (ÄKTA) ihrer Größe nach aufgetrennt. Hierzu wurde eine HiLoad 16/600 Superdex 200 Säule (GE Healthcare) und ein ÄKTA Chromatographiesystem (GE Healthcare) benutzt. Vor der Chromatographie wurde die Säule mit zwei SV H20 gewaschen und anschließend mit 2 SV Laufpuffer (LP; 150 mM NaCI, 50 mM Tris/HCI pH 7,4) äquilibriert. Die Chromatographie der Proteine erfolgte bei einer Flussrate von 1 ml/Min. Es wurden Fraktionen von 1 ml gesammelt. Aliquots einzelner Fraktionen wurden in einem denaturierenden Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) aufgetrennt und die Proteine anschließend mit Coomassie Brilliant Blau angefärbt (Figur 2). Fraktionen, die das gewünschte monomere Protein enthielten, wurden vereinigt und wie unter 3) beschrieben aufkonzentriert. Einzelne Aliquots wurden in N ₂ flüssig schockgefroren und bis zur ihrer Verwendung bei -80°C gelagert.

5) Verwendung des gereinigten Epad -camps-His Proteins in Multiwellschalen als Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, insbesondere der Quantifizierung von cAMP Stoff mengen

Die Fluoreszenzänderung des Sensorproteins nach Zugabe des sekundären Botenstoffs cAMP wurde mit einem Fluoreszenzlesegerät (Fluostar Omega; BMG

LABTECH, Ortenberg) gemessen. Die gereinigten Proteine wurden in IC-Puffer (135 mM Kaliumgluconat, 12 mM NaHC0 ₃ , 4 mM KCl, 0,8 mM MgCI ₂ , pH 7,4) auf eine definierte Konzentration von 0,05 mg/ml verdünnt. Von der Lösung wurden je 90 μΙ in die einzelnen Vertiefungen einer 96er Multiwellschale pipettiert. Zunächst wurde die Grundfluoreszenz in den einzelnen Vertiefungen gemessen. Anschließend wurde eine Verdünnungsreihe des Botenstoffs cAMP erstellt und die Proteinlösungen mit jeweils 10 μΙ dieser cAMP Lösungen versetzt. Das Epad -camps-His Protein wurde mit einer Wellenlänge von 430 nm angeregt und die Emission bei 475 nm (CFP) und 530 nm (YFP) gemessen. Jede Messung bestand aus fünf bis fünfzehn Zyklen. Das Verhältnis der Emissionswerte YFP/CFP (R) in jeder Vertiefung wurde auf das Verhältnis der Basalfluoreszenz (R0) normiert und gegen die verwendete cAMP Kon- zentration aufgetragen. Es resultiert eine Konzentrations-Wirkungskurve aus der der Wert für die halbmaximale Antwort (EC50) bestimmt werden kann. Die Auswertung und graphische Darstellung wurde mit dem Programm GraphPad Prism 5.04

(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Eine Messung, wie sie hier beschrieben ist, wurde als Referenzmessung verwendet, um eine Kalibrierung zu erstellen (Figur 3), wenn Proben aus Zell- oder Gewebelysaten eingesetzt wurden, um darin die cAMP Stoffmengen zu bestimmen.

Das oben beschriebene Messverfahren wurde an Proben validiert, bei denen die intrazelluläre cAMP Konzentration durch die Aktivierung von Membranrezeptoren mit Konzentrationsreihen spezifischer Liganden gezielt erhöht wurde.

Es wurde eine Zelllinie verwendet, in der ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) von Drosophila melanogaster (DmOA2; heute DmOctßRI ) konstitutiv expri- miert wird (Balfanz et al., 2005). Dieser Rezeptor wird durch das biogene Amin Oc- topamin' spezifisch aktiviert und löst intrazellulär eine Reaktionskaskade aus, an deren Ende cAMP produziert wird. Zellen dieser Zelllinie wurden in 24er Multiwell- schalen ausgesät und bis zu einer Dichte von ca. 240.000 vermehrt. Die Zellen wur- den zwei Mal mit PBS-Puffer gewaschen, der 100 μΜ Isopropyl-ß-D- thiogalactopyranosid (IPTG) enthielt. Die Inkubation mit verschiedenen Octopamin Konzentrationen wurde in PBS/IBMX Puffer für 30 Min bei 37°C durchgeführt. Die Inkubationslösung wurde abgenommen und die Zellen durch Zugabe von 200 μΙ eiskaltem Ethanol lysiert. Die Zelllysate wurden im Vakuum getrocknet und bis zur ihrer Verwendung bei -20°C aufbewahrt. Die getrockneten Proben wurden mit IC

Puffer solubilisiert und zu dem in der Multiwellschale vorgelegten Epad-camps-His Protein pipettiert. Nach ca. 20 Minuten wurde die Fluoreszenzänderung des Sensors im Fluoreszenzlesegerät gemessen und die Konzentrations-Wirkungskurve berechnet (Figur 4). Es wird deutlich, dass damit ein kostengünstiges und schnell durchführbares, zuverlässiges, unkompliziertes, hochsensitives und aus wenigen Komponenten bestehendes Messverfahren und eine entsprechende Vorrichtung erstmals bereitgestellt wird. Diese sind gegenüber verfügbaren kommerziell erhältlichen Verfahren hinsichtlich der Kosten, Schnelligkeit, Robustheit und Nutzerfreundlichkeit überlegen und hin- sichtlich der Sensitivität uneingeschränkt konkurrenzfähig.

Das Messverfahren ist dabei universell für alle zell- sowie gewebebasierten Proben geeignet, bei denen die intrazelluläre cAMP Konzentration verändert wird, wie Auszugsweise in der Figur 5 dargestellt wird.

Diese ermöglichen neben Octopamin Rezeptoren viele weitere GPCR, die durch biogene Amine, wie z.B. Dopamin, Serotonin, Adrenalin, Noradrenalin und Histamin oder auch Peptide stimuliert werden. Eine Erhöhung der intrazellulären cAMP Konzentration kann aber auch über die direkte Stimulierung zelleigener sowie zusätzlich in die Zellen eingebrachter Adenylyl Zyklasen z.B. über Forskolin sowie über die Inhibition zelleigener sowie zusätzlich in die Zellen eingebrachter Phosphodiestera- sen (PDE), die das cAMP zu AMP hydrolysieren, z.B. durch IBMX erfolgen. Das Messverfahren ist weiterhin dazu geeignet, die Abnahme der intrazellulären cAMP Konzentration zu detektieren, die entweder durch die Stimulierung spezifischer GPCR erfolgt, die zelleigene sowie zusätzlich in die Zellen eingebrachte Adenylyl Zyklasen inhibieren oder aber Substanzen, die zu einer Erhöhung der PDE Aktivität führen. Das Verfahren ist somit geeignet cAMP Mengen zu quantifizieren, die beispielhaft durch die Stimulierung von Rezeptoren (GPCR la) erzeugt werden, welche ihrerseits Adenylyl Zyklasen (AC; II) aktivieren. Es resultiert ein Anstieg der cAMP Konzentration.

Das Verfahren ist nicht auf diesen Signalweg beschränkt. Auch die Abnahme der intrazellulären cAMP Konzentration kann erfasst werden, wie sie beispielhaft nach der Aktivierung von GPCR (Ib) erfolgt, die Adenylyl Zyklasen (AC; II) inhibieren und zu einer Abnahme der cAMP Konzentration führen.

Weiterhin können Änderungen der cAMP Konzentration quantifiziert werden, die beispielhaft aus einer direkten Aktivierung (= Zunahme des cAMP) oder Inaktivierung (= Abnahme des cAMP) von Adenylyl Zyklasen (AC; II) resultieren oder auch solche Änderungen, die beispielhaft aus einer direkten Aktivierung (= Abnahme des cAMP) oder Inaktivierung (= Zunahme des cAMP) von Phosphodiesterasen (PDE; III) resultieren.

Es ist denkbar, das erfindungsgemäße Nachweisverfahren in umgekehrter Reihen- folge durchzuführen. Dann werden zuerst der sekundäre Botenstoff und sodann das fluoreszenzbasierte Sensorprotein in definierter Konzentration zum Behältnis hinzugegeben.

L i t e r a t u r

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