Verfahren zum Nachweis einer neurologischen, demenziellen Erkrankung, die mit einer Verschlechterung des Kurz-oder Langzeitgedächtnis einhergeht, zugehörige proSAAS-Peptide und Nachweisreagenzien Erfindungsgebiet Die Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis, insbesondere zum labordiagnostischen Nachweis, neurologischer, demenzieller Erkrankungen, die mit einer Verschlechterung des Kurz-oder Langzeitgedächtnisses einhergehen oder einer Veranlagung für solche Erkrankungen oder Verfahren zur Prognose solcher Erkrankungen. Dazu wird die Konzentration bestimmter proSAAS- Peptide oder proSAAS-Nukleinsäuren in Proben eines Individuums, insbesondere in Körperflüssigkeiten, ermittelt, insbesondere innerhalb eines labortechnisch durchführbaren Verfahrens. Weiterhin betrifft die Erfindung Peptide und Nukleinsäuren, die zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit des zukünftigen Auftretens der Erkrankung, und/oder des Vorhandenseins und/oder der Prognose und/oder des Grades der neurologischen, demenziellen Erkra'nkung aufgefunden wurden.

Außerdem betrifft die Erfindung Nachweisreagenzien wie Antikörper und Nukleinsäuren und dergleichen, über die diese proSAAS-Peptide, bzw. die entsprechenden Nukleinsäuren nachgewiesen werden können. Weiterhin betrifft die Erfindung Zubereitungen, die proSAAS, proSAAS-Peptide wie z. B."little SAAS" (= proSAAS 42-59),"big SAAS (= proSAAS 34-59),"KEP" (= proSAAS 34-40),"PEN" (= proSAAS 221-242),"big PEN-LEN" (= proSAAS 221-260),"little PEN-LEN" (= proSAAS 221-254),"big LEN" (= proSAAS 245-260),"little LEN" (= proSAAS 245-254), proSAAS-Antikörper, proSAAS- Nukleinsäuren, oder proSAAS-Agonisten enthalten, zur Therapie, Diagnose, Prognose oder Prophylaxe von neurologischen, demenziellen Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer. Weiterhin betrifft die Erfindung Methoden zur Stratifizierung von Patienten oder Teilnehmern klinischer Studien.

Hintergrund der Erfindung Neurologische, demenzielle Erkrankungen stellen in den Industrieländern aufgrund der steigenden durchschnittlichen Lebenserwartung ein zunehmendes Problem dar. Diese Erkrankungen sind größtenteils nicht heilbar und machen eine langanhaltende, kostspielige Pflege der Erkrankten erforderlich. Es sind mehr als 60 demenzielle Erkrankungen bekannt, einschließlich solcher Erkrankungen, die demenzielle Erscheinungen mit sich bringen. Hiervon entfallen ca. 65 % auf Morbus Alzheimer (Alzheimersche Krankheit, Alzheimer's Disease, AD), deren Diagnose und Therapie deshalb ein hoher Stellenwert zukommt. Neben Morbus Alzheimer sind unter anderem folgende nicht- Alzheimer-Demenzen bekannt : die vaskuläre Demenz, die Lewy-Body-Demenz, die Binswanger-Demenz sowie demenzielle Erkrankungen, die als Begleiteffekt anderer Krankheiten, wie Parkinsonscher Krankheit, Huntington-Disease, Pick's- Disease, Gerstmann-Sträussler-Scheinger-Krankheit, Creuzfeldt-Jakob- Krankheit, Depression usw. vorkommen.

Morbus Alzheimer ist eine neurodegenerative Erkrankung, die sich insbesondere durch ein stark eingeschränktes Kurzzeitgedächtnis auszeichnet. Morphologisch kommt es zu Veränderungen im Gehirn, die sich u. a. in Form von Amyloidablagerungen und degenerierten Nervenzellen äußern. Die morphologischen Veränderungen können nach dem Tode des Patienten histologisch diagnostiziert werden und sind bis heute der einzige sichere Nachweis der Erkrankung. Diese histopathologischen Diagnosen beruhen auf Kriterien, die das"Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease" (CERAD) festgelegt hat. Zur Diagnose von Morbus Alzheimer werden derzeit folgende kriterienbasierte Diagnosesysteme verwendet : Die"International Classification of Diseases, 10th revision" (ICD-10), das"Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition" (DSM-IV) der "American Psychiatric Association", und die vom"National Institute of Neurological and

Communicative Disorders and Stroke/Alzheimer's Disease and Related Disorders Association"NINCDS-ADRDA aufgestellten"Work Group crieria".

Diese Systeme verwenden eine Reihe von neuropsychologischen Tests, um eine Morbus-Alzheimer-Diagnose treffen zu können, nicht jedoch objektiv messbare klinische Parameter. Es ist von besonderem Interesse, die aktuelle Ausprägung des Schweregrads der Erkrankung zu erfassen, was z. B. durch Bestimmung des <BR> <BR> <BR> e, l lini-Mental Scores"erfolgen kann. Der"Mini-Mental Score"wird mit Hilfe einer"Mini-Mental State Examination" (MMSE), eines psychologischen Tests, ermittelt. Dadurch wird u. a. ermöglicht, den Verlauf der Erkrankung und die Wirksamkeit von Therapien zu beobachten. Clark et al. konnten jedoch zeigen, dass z. B. zur Ermittlung des Verlaufs von Morbus Alzheimer die Bestimmung des"Mini-Mental Scores"nur begrenzt aussagekräftig ist, da große Messungenauigkeiten und große Variationen in der Höhe des Scores auftreten [1]. Daher ist die Bereitstellung eines verlässlichen, klinisch messbaren Parameters, der die"Mini-Mental State Examination"oder andere bisher zur Diagnose von Erkrankungen wie Morbus Alzheimer verwendete neuropsychologische Tests ergänzen oder ersetzen kann, von großer medizinischer und wirtschaftlicher Bedeutung. Diese kognitiven Tests werden außerdem nur von spezialisierten Zentren durchgeführt. Ein biochemischer Test hätte den Vorteil, auch für nicht spezialisierte Ärzte leicht zugänglich zu sein.

Derzeit steht keine ursächliche Therapie zur Behandlung von Morbus Alzheimer zur Verfügung. Die Erkrankung wird lediglich symptomatisch z. B. durch die Gabe von Neurotransmittern wie Acetylcholin oder Acetylcholinesterase- lnhibitoren behandelt. Als weitere mögliche Therapiestrategien werden derzeit die Gabe von Antioxidantien, von Radikalfängern, von Calciumkanalblockern, von anti-inflammatorischen Substanzen, von Secretaseinhibitoren, von anti- Amyloid Antikörpern usw. sowie die Immunisierung gegen Amyloid-Peptide erprobt. Es ist bisher aber noch keine ursächliche Therapie dieser Erkrankung möglich.

Aus der WO 02/090974 ist bereits ein gattungsgemäßes Verfahren bekannt, bei dem das Vorhandensein und ggf. der Schweregrad einer chronisch- demenziellen Erkrankung durch ein Markerpeptid angezeigt wird. Weiterhin sind auch andere Marker aus der WO 02/082075 bekannt. Es besteht jedoch weiterhin ein großer Bedarf an zusätzlichen Marker-Substanzen für diesen Krankheits-Bereich, die u. a. zur Absicherung des Ergebnisses zusätzlich oder in Kombination mit schon bekannten Markern angewendet werden könnten, die evtl. andere Unterformen der Krankheit anzeigen könnten, die zusätzlich Aufschluss über die biochemischen Abläufe der Krankheit geben oder die eine Therapie durch Gabe oder Abfangen bestimmter Peptide ermöglichen.

Aufgabe der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, weitere Marker für die Morbus- Alzheimer-Diagnose zur Verfügung zu stellen, hierdurch die Diagnose neurologischer, demenzieller Erkrankungen, die mit einer Verschlechterung des Kurz-oder Langzeitgedächtnis einhergehen weiter zu verbessern, ein frühzeitig und zuverlässig anwendbares Verfahren zum Nachweis dieser Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer, zur Verfügung zu stellen, sowie Methoden zur Therapie dieser Erkrankungen bereit zu stellen.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass in Körperflüssigkeitsproben von an Morbus Alzheimer leidenden Patienten, insbesondere in Liquor cerebrospinalis, die Konzentration bestimmter von proSAAS abstammender Proteinfragmente relativ zu ihrer Konzentration in Kontrollproben vermindert ist und so einen z. B. labordiagnostischen Nachweis von Morbus Alzheimer ermöglicht.

Zur Lösung der Aufgabe umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer neurologischen, demenziellen Erkrankung, die mit einer Verschlechterung des Kurz-oder Langzeitgedächtnis einhergeht, insbesondere von Morbus Alzheimer oder einer Veranlagung für eine solche Erkrankung durch Bestimmung

von proSAAS und/oder eines oder mehrerer proSAAS-Fragmente, welche von der Sequenz mit der SwissProt Accession No. Q9UHG2 (= Seq.-ID 28) abgeleitet sind, in einer biologischen Probe eines Individuums. Dabei handelt es sich vorzugsweise um ein labortechnisches Verfahren, dessen Ergebnis von einem Arzt für die Diagnose verwendet werden kann. Da davon ausgegangen werden kann, dass die nachgewiesenen Stoffe mit der Erkrankung in einem ursächlichen Zusammenhang stehen, beinhaltet die vorliegende Erfindung auch ihre Gabe zur Therapie von Morbus Alzheimer oder verwandter neurologischer, demenzieller Erkrankungen.

Zur Lösung der Aufgabe gibt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis oder zur Prognose einer neurologischen, demenziellen Erkrankung, die mit einer Verschlechterung des Kurz-oder Langzeitgedächtnis einhergeht, insbesondere Morbus Alzheimer an. Bei diesem Verfahren wird wenigstens proSAAS oder proSAAS-Fragment in einer biologischen Probe eines Patienten bestimmt. Eine weitere Ausführungsform ist die Diagnose derartiger Erkrankungen bereits zu einem frühen Zeitpunkt, z. B. bei Diagnose von"Mild Cognitive Impairment" (MCI) oder die Diagnose neurologischer Erkrankungen die verschieden zu Morbus Alzheimer sind, wie z. B. Lewy-Body-Demenz, vaskuläre Demenz oder Depression.

Dazu sind verschiedene Lösungsansätze in der medizinischen Diagnostik möglich und üblich : Zum einen kann generell auf das Vorhandensein eines Peptids oder einer Nukleinsäure untersucht werden und die Abwesenheit, bzw. Anwesenheit dieses Stoffes ermöglicht dann eine Diagnose der Erkrankung. Dabei kann generell auf die Abwesenheit oder auf die Anwesenheit der Erkrankung getestet werden.

Bei einer anderen Diagnosestrategie werden zunächst die üblicherweise vorhandenen Konzentrationen dieser Stoffe bei Kontrollen und bei Patienten, die an der zu diagnostizierenden Erkrankung leiden, bestimmt und anhand dieser Messwerte ein Grenzwert, häufig auch"cut-off"Punkt genannt, ermittelt, der die Gruppe der als gesund betrachteten von der Gruppe der als krank betrachteten trennt. Der für jedes-Peptid oder jede Nukleinsäure individuell ermittelte Grenzwert ermöglicht eine eindeutige Unterscheidung von gesunden und kranken Personen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt per Definition eine Verminderung des Peptids oder der Nukleinsäure auch dann vor, wenn diese nicht nachweisbar sind, weil sie in der Probe nicht vorhanden sind, oder weil sie in einer Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze vorhanden sind.

Bei einer weiteren Diagnosestrategie wird eine für den jeweiligen Marker spezifische Konzentrationserhöhung oder Konzentrationsverminderung des Markers in einer Probe des Patienten relativ zu der Konzentration dieses Markers in der Kontrollprobe ermittelt und eine signifikante Konzentrationsänderung als positives Nachweisergebnis für die Erkrankung gewertet.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die Marker (proSAAS, proSAAS- Fragmente und proSAAS-Nukleinsäuren) bei vorliegen der neurologischen, demenziellen Erkrankung vermindert, unterhalb der Nachweisgrenze oder fehlen ganz in der biologischen Probe.

Bevorzugte Marker nach der Erfindung sind im Sequenzprotokoll angegeben und sind mit den Sequenzen entsprechend Seq.-ID 1 bis 35 und 37 bis 52 des Sequenzprotokolls benannt. Die Sequenzen der bevorzugten Peptide sind in Tabelle 1 und teilweise auch in Abbildung 1 dargestellt.

Vorzugsweise kann die Konzentration der proSAAS-Peptide oder proSAAS- Nukleinsäuren in der biologischen Probe, aber auch das charakteristische Muster des Auftretens mehrerer definierter Stoffe dieser Gruppe, mit dem Schweregrad, der Prognose oder der Wahrscheinlichkeit des Auftretens der Erkrankung korreliert werden. Diese neuen Marker ermöglichen daher die Entwicklung und die begleitende Kontrolle von Therapien zur Behandlung neurologischer, demenzieller Erkrankungen, die mit einer Verschlechterung des Kurz-oder Langzeitgedächtnis einhergehen, insbesondere von Morbus Alzheimer, da der Verlauf und ein eventuell aufgrund einer Therapie einsetzender Heilungserfolg oder ein vermindertes Fortschreiten der Erkrankung frühzeitig ermittelt werden können (Surrogatmarker). Eine effektive Therapie von Morbus Alzheimer, einer der häufigsten neurologischen Erkrankungen, ist derzeit nicht möglich, was die Dringlichkeit der Bereitstellung einer frühzeitigen, sensitiven labordiagnostischen Nachweismethode unterstreicht.

Der z. B. labordiagnostische Nachweis von proSAAS, proSAAS-Peptiden oder proSAAS-Nukleinsäuren ermöglicht außerdem die Stratifizierung von Patienten und von Teilnehmern klinischer Studien. Dadurch können auch Therapeutika und Diagnostika entwickelt und medizinisch eingesetzt werden, die nur in Sub- Gruppen von Patienten wirksam sind.

Bei Morbus-Alzheimer-Patienten sind die Konzentrationen von proSAAS- Fragmenten deutlich verringert, verglichen mit nicht an Morbus-Alzheimer erkrankten Personen. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist es daher, die verminderte Konzentrationen von proSAAS oder proSAAS-Fragmenten bei Morbus-Alzheimer-Patienten auf normale oder eventuell sogar erhöhte Konzentrationen zu bringen, relativ zu den Konzentrationen in nicht an Morbus- Alzheimer Erkrankten Personen. Dabei ist zu bedenken, dass es möglich ist, dass ein bestimmtes proSAAS-Fragment in seiner Konzentration vermindert ist, dass es zur Therapie aber unter Umständen sinnvoll ist das gesamte proSAAS- Protein oder ein anderes proSAAS-Fragment als Therapeutikum zu verabreichen

und nicht das aufgefundene, in seiner Konzentration verminderte proSAAS- Fragment. Der Grund hierfür ist, dass das zu Diagnosezwecken bestimmte proSAAS-Fragment ein definiertes Abbauprodukt von proSAAS oder eines anderen proSAAS-Fragments sein kann und daher nur indirekt anzeigt, we ! cher von proSAAS abgeleitete Stoff therapeutisch eingesetzt werden sollte. Dieses ändert nichts an der Spezifität der Diagnose, da in diesem Fall zukünftig nach Bestimmung eines z. B. zu niedrigen Konzentrationswertes für ein bestimmtes proSAAS-Fragment X ein ganz genau definiertes anderes proSAAS-Fragment Y oder das gesamte proSAAS therapeutisch verabreicht werden muss. Dieses Verfahren kann zur Therapie von Morbus Alzheimer oder verwandten neurologischen, demenziellen Erkrankungen eingesetzt werden. Liegt ein Mangel an proSAAS oder proSAAS-Fragmenten als Erkrankungsursache vor, so können therapeutische Gaben von proSAAS oder proSAAS-Fragmenten oder entsprechender Agonisten vorgenommen werden. Auch Substanzen, die die Prozessierung von proSAAS beeinflussen, können therapeutisch eingesetzt werden. Wie in Abbildung 1 zu sehen ist, sind z. B."PEN","little LEN"und "little PEN-LEN"von je zwei sogenannten di-basischen Aminosäure-Sequenzen flankiert (in diesen Fällen Arg-Arg bzw. Lys-Arg) und"big SAAS"entspricht der proSAAS-Aminosäuresequenz zwischen dem Ende der proSAAS-Signalsequenz und der ersten di-basischen Sequenz in proSAAS und"big PEN-LEN"und"big LEN"sind je von einer di-basischen Sequenz und dem Stop-Codon von proSAAS flankiert. Di-basischen Sequenzen sind häufig Angriffspunkte von Proteasen, die bei der Prozessierung von Proteinen zu biologisch aktiven Peptiden eine Rolle spielen. Für proSAAS ist bereits gezeigt worden, dass zumindest einige proSAAS-Fragmente durch Prohormonkonvertasen aus dem Muttermolekül proSAAS generiert werden können. Humanes proSAAS enthält insgesamt 6 solcher di-basischen Sequenzen, die potentiell von Prohormonkonvertasen erkannt werden können. Natürlich ist auch die Kombination von verschiedenen Therapiestrategien möglich und unter Umständen sinnvoll.

Die Erfindung umfasst daher auch die Verwendung von proSAAS, proSAAS- Fragmenten und proSAAS-Nukleinsäuren, insbesondere proSAAS-Fragmenten die durch Prozessierung durch Enzyme wie z. B. Prohormonkonvertasen wie PC- 1, PC-2, PC-5, PC-7, PACE4 oder Furin entstehen können, sowie entsprechende Peptidomimetika zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer. Alternativ zu den genannten Proteinen und Proteinfragmenten können auch Fusionsproteine dieser Proteine und Proteinfragmente Verwendung finden. Es können auch zwei oder mehr Proteine oder Proteinfragmente miteinander oder mit weiteren nicht-proSAAS-Sequenzen verknüpft werden. Diese Peptide können sowohl kovalent als auch nicht kovalent verknüpft werden, und es können sowohl lineare, als auch verzweigte oder zirkuläre Moleküle oder Kombinationen aus linearen, verzweigten oder zirkulären Molekülen aus diesen Proteinen oder Proteinfragmenten hergestellt werden. Ein Beispiel für eine nicht kovalente Verknüpfung wäre z. B. die Verknüpfung eines Biotin-markierten proSAAS mit einem Streptavidin- markierten Antikörper. Außerdem umfasst die Erfindung Agonisten, die die Konzentration oder Aktivität der genannten Proteine und Proteinfragmente verstärken. Beispiele für solche Agonisten wären Prohormonkonvertasen, durch die z. B. bestimmte proSAAS-Fragmente verstärkt gebildet werden und so die Konzentration dieser proSAAS-Fragmente erhöht wird.

Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist die galenische Formulierung oder chemische Modifizierung von proSAAS, proSAAS-Fragmenten und proSAAS-Nukleinsäuren in einer Art und Weise, die es ihnen ermöglicht, die Blut-Hirn-Schranke und/oder die Blut-Liquor-Schranke effizienter zu passieren oder die es ermöglicht, dass sie effizienter ins Zellinnere gelangen können.

Dadurch eignen sich diese derart modifizierten Stoffe dann besonders zur therapeutischen Anwendung. Um dieses zu erreichen, können z. B. proSAAS, proSAAS-Fragmenten, proSAAS-Nukleinsäuren, proSAAS-Agonisten, usw. derart modifiziert werden, dass sie z. B. lipophiler werden, was den Übertritt in den Subarachnoidalraum begünstigt. Dieses kann durch Einfügung von

hydrophoben Molekülbestandteilen wie z. B. Kohlenwasserstoff-Ketten oder auch durch die"Verpackung"der Stoffe in hydrophobe Agentien, z. B.

Liposomen, erreicht werden. Außerdem können z. B. proSAAS-fremde Peptidsequenzen verwendet werden, die den Eintritt von proSAAS, proSAAS- Fragmenten, proSAAS-Nukleinsäuren, proSAAS-Agonisten, usw. in den Subarachnoidalraum begünstigen, bzw. umgekehrt den Austritt aus dem Subarachnoidalraum heraus erschweren oder die den Transport dieser Stoffe durch die Zellmembran erleichtern oder fördern, was z. B. die HlV-Tat-Sequenz, die Antennapedia-Sequenz oder die VP22-Sequenz bewirken kann.

Die Erfindung umfasst auch die Verabreichung der genannten Stoffe über verschieden Wege, wie z. B. als intravenöse Injektion, als oral applizierbare Substanz, als inhalierbares Gas oder Aerosol, als topische Anwendung oder die Verabreichung in Form von direkten Injektionen in den Subarachnoidalraum, oder in Gewebe wie z. B. Muskel, Fettgewebe, Gehirn usw. Dadurch kann eine erhöhte biologische Verfügbarkeit und Wirksamkeit, sowie eine erhöhte lokale Konzentration dieser Stoffe erreicht werden. Zum Beispiel können Proteine oder Proteinfragmente, die oral verabreicht werden, durch säureresistente Kapseln vor proteolytischem Abbau im Magen geschützt werden. Stark hydrophobe Substanzen können durch geeignete galenische Aufbereitungen hydrophiler und somit besser geeignet für z. B. intravenöse Injektionen werden. Dazu können diese Stoffe z. B. mit Polymeren wie z. B. Polyethylenglykol verknüpft, das heißt pegyliert werden. Pegylierte Stoffe sind oft besser löslich, weniger immunogen und weisen eine längere In-vivo-Halbwertszeit auf. Weitere mögliche Darreichungsformen sind unter anderem die Verpackung der Wirkstoffe in Polymere oder Gele (Atrix Labs, Fort Collins, CO, USA, Andrx Pharmaceuticals, Davie, FL USA) usw. wodurch ihre kontinuierliche und kontrollierte Freisetzung über einen längeren Zeitraum erreicht werden kann.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von proSAAS, proSAAS-Fragmenten, proSAAS-Nukleinsäuren oder proSAAS-Agonisten in

Screeningverfahren, um Diagnostika oder Therapeutika gegen neurologisch Erkrankungen zu identifizieren. Durch solche Screeningverfahren können z. B.

Moleküle aufgefunden werden, die proSAAS oder proSAAS-Fragmente binden (z. B. Rezeptoren) oder die diese Moleküle aktivieren oder in ihren Konzentrationen erhöhen (z. B. Prohormonkonvertasen). Auf diese Weise identifizierte Rezeptoren können durch Gabe von Agonisten oder Antagonisten moduliert werden, was zur Therapie von neurologischen Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer, zweckmäßig ist.

Definitionen : Peptid Unter Peptid versteht man zumindest 2 Aminosäuren, die über eine Peptidbindung kovalent miteinander verknüpft sind, vorzugsweise zumindest 4, 6,8, 10,12, 15,20, vorzugsweise zumindest mehr als 50 Aminosäuren. Es gibt dabei keine Limitierung hinsichtlich der Anzahl der maximal möglichen Aminosäuren, und ein Protein ist daher grundsätzlich auch ein Peptid. proSAAS Mit proSAAS sind Peptide oder Nukleinsäuren gemeint, die der gesamten Sequenz eines in der Natur vorkommenden proSAAS entsprechen, vorzugsweise humanem proSAAS, vorzugsweise der humanen proSAAS- Aminosäuresequenz entsprechend Seq.-ID 28 bzw. der humanen proSAAS Nukleinsäuresequenz entsprechend Seq.-) D 36 entsprechen. Darin eingeschlossen sind alle Arten von proSAAS, die in der Natur vorkommen, unabhängig von welcher Spezies sie stammen.

Fragmente von proSAAS Fragmente von proSAAS oder proSAAS-Nukleinsäuren sind Teilsequenzen der jeweiligen Aminosäure-oder Nukleinsäuresequenzen. Diese Fragmente sind im Falle von Aminosäuresequenzen mindestens 8 Aminosäuren, insbesondere

mindestens 9,10, 12,14, 20,30, 50, insbesondere mindestens 100 Aminosäuren lang und im Falle von Nukleinsäuresequenzen vorzugsweise mindestens 15,18, 21 24,30, 45, 60,90, 120, insbesondere mindestens 250 Nukleotide, lang. proS-Peptid Mit proSAAS-Peptide sind alle Aminosäuresequenzen von proSAAS oder proSAAS-Fragmenten gemeint.

Homologe Sequenzen Homologe proSAAS-Aminosäuresequenzen weisen vorzugsweise eine Homologie von mindestens 70 %, 80 %, 90 %, 95 % vorzugsweise mindestens 99 % auf. Homologe proSAAS-Nukleinsäuren weisen vorzugsweise eine Homologie von 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, vorzugsweise mindestens 99 % auf. Der %-Anteil kann wie nachfolgend noch beschrieben wird, in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise berechnet werden.

Komplementäre Sequenzen Unter einer komplementären Sequenz versteht man eine Nukleinsäuresequenz, die in der Lage ist mit der Sequenz, zu der sie komplementär ist, zu hybridisieren. Dazu treten jeweils Adenin und Thymidin, bzw. Uracil oder Guanin und Cytosin miteinander in Wechselwirkung. Diese Wechselwirkung wird auch als hybridisieren bezeichnet. Unter spezifisch hybridisieren versteht man, das nicht zufällige Nukleinsäuresequenzen miteinander in Wechselwirkung treten, sondern Nukleinsäuren bei denen die komplementäre Nukleinsäuresequenz der einen Nukleinsäure eine ausreichende Homologie, vorzugsweise mindestens 60 % Homologie, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, vorzugsweise mindestens 99 % zur anderen Nukleinsäuresequenz aufweist.

Entsprechende Protokolle zur Durchführung einer spezifischen Hybridisierung sind dem Fachmann bekannt und werden nachfolgend noch exemplarisch beschrieben.

Degenerierte Nukleinsäuren Unter degenerierten Nukleinsäuren versteht man Nukleinsäuren, deren Nukleinsäuresequenzen unterschiedlich zueinander sind, die aber für identische Aminosäuresequenzen kodieren.

Derivate von Peptiden und Nukleinsäuren Unter einem Derivat eines Peptids oder einer Nukleinsäure versteht man alle Arten von Veränderungen einer Aminosäure-bzw. Nukleinsäuresequenz, solange die Sequenz dabei ihre Funktion und/oder Struktur behält. Derivate von Peptiden sind unter anderem Peptide mit postranslationalen, Modifikationen, die durch Enzyme wie z. B. Kinase, Phosphatasen, Glykosidasen, usw. entstehen.

Ein Derivat eines proSAAS-Peptids ist auch eine proSAAS-Aminosäuresequenz, an der am N-oder C-Terminus oder intern in der proSAAS-Sequenz andere Aminosäuresequenzen angefügt oder eingefügt sind, die nicht proSAAS- Sequenzen entsprechen. Solche Peptide werden im Stand der Technik auch als Fusionspeptide oder Fusionsproteine bezeichnet. Derivate von proSAAS- Peptiden sind auch solche Peptide, bei denen verschiedene Aminosäuresequenzbereiche von proSAAS-Peptiden zusammengefügt werden, wobei auch chimäre proSAAS-Peptide eingeschlossen sind, d. h. Peptide, die aus z. B. proSAAS-Sequenzbereichen von proSAAS-Peptiden, die aus verschiedenen Spezies stammen, zusammengefügt sind. Ferner beinhalten Derivate von Peptiden und Nukleinsäuren lineare, zirkuläre, und verzweigte Sequenzen aus Aminosäuren oder Nukleinsäuren.

Derivate von proSAAS-Peptiden oder proSAAS-Nukleinsäuren können auch durch chemische oder enzymatisch Behandlungen wie z. B. Biotin-Markierung, Ubiquitin-Markierung, Reduktion, Oxidation, Markierung mit Radionukliden, Farbstoffen oder Fluorphoren usw. entstehen. Eingeschlossen sind auch Peptide die Aminosäuren beinhalten, die nicht in dem genetisch kodierten Standard-Set der 20 Aminosäuren enthalten sind, D-und L-Aminosäuren, oder auch Strukturen, die zwar die räumliche Struktur einer Aminosäurekette aufweisen,

aber ganz oder Teilweise aus anderen Bausteinen aufgebaut sind (auch Mimetika oder Peptidomimetika genannt). Zur Markierung geeignet sind zum Beispiel Radionuklide wie Phospohr-32 oder-33, Schwefel-35, lod-125, Tritium, Kohlenstoff-14, Calcium-45, Chrom-51, usw., Farbstoffe oder andere organische, anorganische oder biologische Strukturen wie Digoxigenin, Biotin, Fluorophore wie Fluorescein, Rhodamin, Texas-Red, BODIPY, usw.

Die vorstehend genannten Derivatisierungen von Peptiden oder Nukleinsäuren können auch in Kombinationen von zwei oder mehr Derivatisierungen vorhanden sein, sie können das gesamte Moleküle oder Teile davon, insbesondere maximal 1,2, 4,6, 8,10, 20,30, 50,100, oder mehr als 100 Bausteine dieser Moleküle (Aminosäuren oder Nukleotide) betreffen und sie können natürlich in der Natur vorkommen, oder künstlich durch z. B. durch chemische Synthese oder molekularbiologische Methoden hergestellt werden.

Homologie von Sequenzen Zur Bestimmung der Homologie zwischen Sequenzen können Computerprogramme wie z. B. das GCG Programmpaket (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl, USA), einschließlich GAP [2], BLASTP, BLASTN, FASTA [3] oder der bekannte Smith-Waterman-Algorithmus zur Bestimmung der Homologien verwendet werden. Dabei wird generell nach größtmöglicher Sequenzübereinstimmung gesucht. Bevorzugte Parameter für den Aminosäuresequenz-Vergleich umfassen den Algorithmus von Needleman und Wunsch [4], die Vergleichsmatrix BLOSUM 62 [5], ein Lücken-Wert (Gap Penalty) von 12, ein Lückenlängen-Wert (Gap Length Penalty) von 4 und ein Homologie-Schwellenwert (Threshold of Similarity) von 0. Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Die vorstehenden Parameter sind die Fehler-Parameter (default parameters) für Aminosäuresequenz-Vergleiche, wobei Lücken an den Enden den Homologie- Wert nicht verringern. Bei sehr kurzen Sequenzen im Vergleich zur Referenz- Sequenz kann es weiterhin notwendig sein, den Erwartungswert auf bis zu

100000 (expectation value) zu erhöhen und gegebenenfalls die Wortlänge (word size) auf bis zu 2 zu verkleinern. Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Öffnungs-Werte (gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm- Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genannten, können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich abhängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei GAP oder der Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen Sequenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird. Eine mit dem oben genannten Algorithmus ermittelte Übereinstimmung von 70 % wird im Rahmen dieser Anmeldung als 70 % Homologie bezeichnet. Entsprechendes gilt für höhere oder geringere Homologie-Grade. Der %-Wert für die Homologie bezieht sich auf die jeweils kürzere Sequenz, das heißt ein 70 % homologes proSAAS-Fragment von 100 Aminosäuren Länge muss zumindest in 70 seiner Aminosäuren homolog zur Sequenz von proSAAS sein.

Chemisch oder posttranslational modifizierte Peptide Chemisch oder posttranslational modifiziertes proSAAS oder proSAAS- Fragmente können sowohl aus D-als auch aus L-Aminosäuren, sowie aus Kombinationen von D-und L-Aminosäuren bestehen und können sowohl natürlich vorkommen, rekombinant oder enzymatisch hergestellt oder chemisch synthetisiert werden. Außerdem können ungewöhnliche Aminosäuren, d. h.

Aminosäuren, die nicht zu den 20 Standardaminosäuren gehören, enthalten sein. Zahlreiche Beispiele für ungewöhnliche Aminosäuren und postranslationale Modifikationen wie z. B. Phosphor-und Sulfatgruppen, Glykosilierungen, Amidierungen, Deamidierungen, Pyroglutamat-Modifizierungen usw. sind in der Literatur und in Datenbanken beschrieben [6]. Zum Beispiel konnten wir ein proSAAS-Fragment mit der ungewöhnlichen Aminosäure Hydroxyprolin identifizieren. Modifikationen, wie z. B. Phosphorylierungen und Sulfatierungen sind für proSAAS aus der Literatur bekannt. Weitere häufig bei Peptiden

auftretende Modifizierungen sind Pyroglutamat-Modifizierungen, sowie oxidierte oder amidierte Peptide.

Nukleinsäuren Als proSAAS-Nukleinsäuren werden DNA, RNA und DNA-RNA-Hybridmoleküle sowohl natürlichen Ursprungs, als auch synthetisch, enzymatisch oder rekombinant hergestellte Nukleinsäuren angesehen, die für proSAASoder für proSAAS-Fragmente kodieren. Für proSAASoder für proSAAS-Fragmente kodierende Nukleinsäuren können auch ein Bestandteil von Vektoren, insbesondere von Plasmiden, Cosmiden, Phagenpartikeln, künstlichen Chromosomen, viralen Vektoren, Retroviren, Adenoviren, adenoähnlichen Viren, Bacculoviren, usw. sein. Ferner können diese Nukleinsäuren und Vektoren eine lineare oder zirkuläre Struktur aufweisen und einzel-oder doppelsträngig vorliegen. Eingeschlossen sind auch Nukleinsäuren und Vektoren, die ganz oder in Teilen aus modifizierten Nukleotiden aufgebaut sind, bei denen z. B. im Basen- Anteil, im Zucker-Anteil oder im Phosphat-Anteil Modifizierungen vorliegen.

Diese modifizierten Nukleinsäuren können in der Natur vorkommen oder synthetisch hergestellt werden. Beispiele für modifizierte Nukleinsäuren sind PNAs (Peptide-Nucleic-Acids), 2'-o-methoxyethyl-Nukleinsäuren, 2'-fluoro- Nukleinsäuren, arabino-Nukleinsäuren und sogenannte"locked nucleic acids" oder Nukleinsäuren, die Phosphothioate, N3', P5'-Phosphoramidate, Morpholino- Phosphoramidate, usw. enthalten. Nukleinsäuren können im Sinne der Erfindung z. B. als Primer für Polymerase-Ketten-Reaktionen (PCR) verwendet werden oder als Target-Sequenz auf DNA-Chips (= DNA-Arrays = DNA-Mikroarrays) gebunden sein, wobei die Länge der Sequenzen vorzugsweise 8-60 Nukleotide, vorzugsweise 8-60, 8-50, 8-40, vorzugsweise 8-30 Nukleotide beträgt. Die Nukleinsäuresequenzen auf DNA-Chips können aber auch erheblich länger sein, insbesondere wenn sie nicht direkt auf der Chip-Oberfläche synthetisiert werden. Sequenzlängen von vorzugsweise 100 bis 10000, 100 bis 5000, 100 bis 3000,100 bis 1000, insbesondere 100 bis 300 Nukleotiden sind möglich.

Nukleinsäuren können im Sinne der Erfindung auch als Sonden zur Detektion

von proSAAS-Nukleinsäuresequnezen verwendet werden, z. B. bei Northern oder Southern-Blots, oder bei in situ Hybridisierungen, oder auf DNA-Chips, wobei diese Sonden vorzugsweise bis zu 30, bis zu 40,50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 800 Nukleotiden oder eine Länge von mehr als 800 Nukleotiden aufweisen. ProSAAS Nukleinsäuren können außerdem weitere Sequenzen N- terminal, C-terminal und/oder intern beinhalten, die nicht proSAAS-Sequenzen entsprechen, sondern z. B. für bestimmte Strukturelemente kodieren, die dem von der Nukleinsäure kodiertem Peptid neue Eigenschaften verleihen. Solche Sequenzen können z. B. für sogenannte Tag-Sequenzen, die eine Isolierung oder die Detektion des Peptids ermöglichen, z. B. His-tag, HA-tag, GST-tag, fluoreszierende Proteine wie GFP (green flourescent protein), Enzyme wie Peroxidase, Alkalische Phosphatase, Luciferase oder für Toxine, usw.

Mutanten Unter Mutanten von Nukleinsäuren oder Peptiden im Sinne der Erfindung versteht man Sequenzen die durch Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen entstanden. Bei Nukleinsäuren können diese Mutationen sowohl kodierende als auch nicht kodierende Bereiche der Sequenz, z. B. Promotoren, Introns, 3'-oder 5'-untranslatierte RNA-Bereiche usw. betreffen. Mutationen in Nukleinsäuren können sowohl konservativ, d. h. nicht die Aminosäuresequenz verändernd, als auch nicht konservativ sein, d. h. zur Veränderung der Aminosäuresequenz führen. Die resultierenden Mutanten der proSAAS-Peptide können sowohl funktionelle, als auch eingeschränkt funktionelle oder inaktive proSAAS-Peptide sein. Insbesondere sind auch proSAAS-Peptide eingeschlossen, die aufgrund von neurologischen Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer auftreten. Eingeschlossen sind sowohl proSAAS-Peptide mit als auch ohne Signalsequenz, Pro-Formen von proSAAS, die noch nicht prozessiert sind, sowie bereits prozessiertes proSAAS, lösliche proSAAS- Peptide und membranständige proSAAS-Peptide.

Sensitivität Als Sensitivität wird der Anteil an erkrankten Patienten definiert, die bei einer Diagnose auf die Erkrankung ein positives Diagnoseergebnis erhalten, d. h. die Diagnose zeigt die Erkrankung korrekt an.

Spezifität Als Spezifität wird der Anteil an gesunden Patienten definiert, die bei einer Diagnose auf die Erkrankung ein negatives Diagnoseergebnis erhalten, d. h. die Diagnose zeigt korrekt an, dass keine Erkrankung vorliegt.

ProSAAS-Biologischer Hintergrund ProSAAS ist auch unter dem Namen"Granin-like neuroendocrine peptide precursor"in der Literatur beschrieben. Der Name proSAAS leitet sich von einer Aminosäuresequenz Serin-Alanin-Alanin-Serin ab, die im N-Terminus vom proSAAS vorhanden ist [7]. Bisher sind in der Protein-Datenbank"SwissProt" die Sequenzen von humanem (Accession-Nr. : Q9UHG2), murinem (Accession- Nr. : Q9QXV0) und von proSAAS aus der Ratte (Accession-Nr. : Q9QXU9) vorhanden. Das murine proSAAS ist auch unter dem Namen PC3KIN (Accession-Nr. : Q91W26) in der Literatur beschrieben, wobei es sich bei diesem proSAAS um eine proSAAS-Mutante handelt, die eine Punktmutation aufweist. In der Maus wurde außerdem das mit proSAAS aufgrund seiner Aminosäuresequenz eng verwandtes Protein IA4 (Accession-Nr. : Q9ESU4) identifiziert.

Wie der Name andeutet, weist das proSAAS auf funktioneller Ebene gewisse Ähnlichkeiten mit Graninen auf und wird in neuroendokrinen Zellen expremiert.

Eine BLAST-Suche ergibt jedoch, das proSAAS zumindest aufgrund seiner Aminosäuresequenz nicht mit den Graninen verwandt ist. Die vermutliche biologische Funktion von proSAAS ist die Inhibierung der Prohormonkonvertase 1 (PC1). Daher ist proSAAS funktionell mit 7B2 verwandt, das die

Prohormonkonvertase 2 (PC2) inhibiert. Beide Proteine, proSAAS und 7B2, weisen eine Reihe sogenannter di-basische Sequenzen auf (Arginin-Arginin oder Lysin-Arginin) die von z. B. Prohormonkonvertasen C-terminal gespalten werden können. Durch solche proteolytischen Aktivitäten werden von proSAAS und 7B2 unter anderem C-terminale Peptide abgespalten (CT-Peptide), die spezifische und effiziente Inhibitoren von PC1 bzw. PC2 sind [8, 9]. Sowohl das komplette proSAAS-Protein als auch das komplette 7B2-Protein wirken auch direkt inhibitorisch. ProSAAS und 7B2 weisen eine prolinreiche Domäne auf.

Es sind verschiedene Fragmente vom proSAAS in der Literatur beschieben.

Diese Fragmente wurden z. B. aus murinem Gewebeextrakten gewonnen, und es stellte sich bei vielen dieser Fragmente heraus, dass sie aus Prozessierungs- Vorgängen, an denen vermutlich Prohormonkonvertasen beteiligt sind, hervorgegangen sind [10]. Unter anderem sind proSAAS-Fragmente beschrieben, die der proSAAS-Aminosäuresequenz von Aminosäure 42 bis 59 ("little SAAS"), 221 bis 254 ("little PEN-LEN"), 245 bis 254 ("little LEN") und 245 bis 260 ("big LEN") entsprechen [10]. Für"little SAAS"und"big LEN" gibt es Anhaltspunkte, dass sie von stimulierten Zellen sezerniert werden, so dass es daher möglich ist, dass diese Fragmente von proSAAS als z. B.

Neurotransmitter wirken könnten [11]. In anderen Studien wurde beim Durchsuchen einer Peptid-Bibliothek ein Hexapeptid (Leu-Leu-Arg-Val-Lys-Arg) identifiziert, das der proSAAS-Sequenz von Aminosäure 239 bis 244 entspricht und ein starker Inhibitor von PC1 ist [12]. Dieses Peptid ist ein Teil des little PEN-LEN Peptids. In einer weiteren Studie wurde Liquor cerebrospinalis (CSF) von Patienten, die an frontotemporaler Demenz (FTD) leiden, mit den Ergebnissen von CSF-Untersuchungen gesunder Probanden verglichen. Bei diesen Untersuchungen zeigte sich, dass proSAAS eines von sechs verschiedenen Proteinen ist, das bei Patienten mit frontotemporaler Demenz im CSF in verminderten Konzentration vorhanden ist [13]. Die gleiche Arbeitsgruppe hat in einer anderen Studie CSF von Morbus Alzheimer Patienten untersucht und dort, wie sie selbst ausdrücklich betonen, keine veränderten

proSAAS-Konzentrationen festgestellt [14]. Daher steht nach dem bisherigen Stand der Technik proSAAS nicht im Zusammenhang mit neurologischen, demenziellen Erkrankungen, die mit einer Verschlechterung des Kurz-oder Langzeitgedächtnis einhergehen, insbesondere mit Morbus Alzheimer.

Frontotemporale Demenz ist eine Erkrankung, die primär mit Verhaltensstörungen einher geht und weniger mit kognitiven Beeinträchtigungen, während Morbus Alzheimer durch Gedächtnisstörungen, insbesondere des Kurzzeitgedächtnis, sowie durch Ablagerungen im Gehirn (Senile Plaques) charakterisiert ist. Solche Ablagerungen treten bei frontotemporaler Demenz nicht auf [13,14]. Die für andere neurologische Erkrankungen charakteristischen strukturellen Veränderungen des Gehirns wie amyloide Ablagerungen und Lewy-Bodies"treten bei frontotemporaler Demenz nicht auf. Auch treten bei frontotemporaler Demenz nur im frontotemporalen Gehirnbereichen Synapsenverluste von ca. 50 % auf, während diese bei z. B.

Morbus Alzheimer in allen Gehirnregionen auftreten [15-17]. Beim Durchsuchen einer Peptid-Bank nach PC1-Inhibitoren wurde das Hexapeptid (Leu-Leu-Arg-Val- Lys-Arg) identifiziert, das eine Teilsequenz des little PEN-LEN Peptids darstellt [12]. Dieses proSAAS-Fragment ist jedoch nicht so PC2-spezifisch wie proSAAS, da es auch PC1 und Furin inhibiert. In weiteren Studien konnte gezeigt werden, dass das Peptid Val-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Lys-Arg-Leu- Glu (= proSAAS 235-244) der wirksamste PC1-Inhibitor ist, wobei die beiden Aminosäuren Leu-Glu am C-Terminus dieses Peptids für die PC1-Spezifität von besonderer Bedeutung sind [18].

In dem nachveröffentlichten Stand der Technik (US 2004/0002460 A1) konnten Averback et al. zeigen, das sogenannte"dense microspheres", d. h. kleine Protein-Partikel im Gehirn gesunder, als auch im Gehirn an demenziellen Erkrankungen leidender Personen auftreten. Wenn die auch Spherons genannten Partikel, die aus Gehirngewebe isoliert wurden, zerplatzen, setzen sie unter anderem proSAAS Fragmente frei. Averback et al. spekuliert, dass diese durch Freisetzung erhöhte Menge an proSAAS Fragmenten für ein Fortschreiten der

cerebralen Amyloidose verantwortlich ist und schlägt Antagonisten dieser Moleküle als Therapeutika in der Behandlung von cerebraler Amyloidose vor.

Vorzugsweise Ausführungsformen der Erfindung Vorzugsweise ist die durch das erfindungsgemäße Verfahren nachgewiesene Erkrankung eine neurologische, demenzielle Erkrankung, die mit einer <BR> <BR> <BR> <BR> Verschlechterung des Kurz-oder Langzeitgedächtnis einhergeht, wie z. B.

Morbus Alzheimer. Bislang konnte die Veränderung der Konzentration von erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente am Beispiel von Patienten, die an Morbus Alzheimer erkrankt waren, nachgewiesen werden. Hieraus kann geschlossen werden, dass die erfindungsgemäßen proSAAS-Peptide auch zum labordiagnostischen Nachweis und zur Therapie von Morbus Alzheimer und verwandten neurologischen Erkrankungen herangezogen werden können. Eine Ausführungsform dieses Verfahrens ist die Ermittlung neurologischer Erkrankungen bereits zu einem frühen Zeitpunkt, wie z. B. der labordiagnostische Nachweis von Mi) d Cognitive Impairment" (MCI).

Die Identifizierung konzentriert sich vorzugsweise auf bestimmte Fragmente von proSAAS mit der SwissProt ("Swiss Institute of Bioinformatics", Basel, Schweiz) Nummer Q9UHG2 (= Seq. ID 28), dass heißt auf Peptide, die Teilsequenzen von proSAAS darstellen und auf das komplette proSAAS-Protein (=proSAAS). Die entsprechende Nukleinsäuresequenz von proSAAS ist unter der Nummer AF181562 (= Seq. ID 36) in der Datenbank des"National Center for Biotechnology Information" (NCBI), Bethesda, MD, USA zu finden. Der Zusammenhang zwischen proSAAS und proSAAS-Fragmenten ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Sequenzen von beispielhaften proSAAS-Fragmenten sind im Sequenzprotokoll angegeben. Das von uns bestimmte proSAAS-Fragment mit den Seq.-ID 1 entsteht auf natürliche Weise in der Natur und wurde bisher in der Literatur nicht beschrieben. Dieses proSAAS-Fragment ist verschieden zu Proteinfragmenten, wie sie in der Literatur durch In-vitro-Proteolyse nach

Zugabe von Proteasen wie z. B. Trypsin oft beschrieben werden. Es stellt somit einen neuen, auf natürliche Weise in der Natur entstandenen, bisher unbekannten Stoff dar. Dieses proSAAS-Fragment ist ein nicht vom Menschen durch Manipulation von proSAAS hergestellter Stoff. Es wurde zunächst über Reverse-Phase-Chromatographie aus biologischen Proben angereichert und gereinigt und anschließend massenspektrometrisch von begleitenden anderen Stoffen getrennt, so dass es anschließend quantifiziert und sequenziert werden konnte. Dieses Peptid steht nicht ein beliebiges Fragment des proSAAS dar, sondern ist ein Fragment des proSAAS, das auf natürliche Weise entstanden ist. Unter dem Begriff"auf natürliche Weise entstanden"wird im Rahmen dieser Anmeldung verstanden, dass die proSAAS-Fragmente ohne Zugabe von Proteasen zu den Proben entstanden sind. Das heißt, sie entstehen entweder schon in vivo, oder sie entstehen im Verlauf der Gewinnung und Untersuchung der Proben, jedoch ohne dass der Probe z. B. Proteasen wie Trypsin zugesetzt werden. ProSAAS-Fragmente leiten sich von der eingangs genannten proSAAS- Sequenz Q9UHG2 (Seq.-ID 28) ab. Alternativ können sie jedoch auch von anderen Datenbank-Einträgen für proSAAS abgeleitet werden. Dabei ist es möglich, dass sich die proSAAS-Aminosäure-oder Nukleinsäure-Sequenzen eventuell von der Aminosäure-Sequenz des"SwissProt"-Eintrags mit der Nummer Q9UHG2 oder des NCBI-Eintrags der Nukleinsäure-Sequenz mit der Nummer AF181562 unterscheiden. Außerdem können proSAAS-Fragmente ein oder zwei punktmutierte, deletierte oder zusätzlich intern eingefügte Aminosäuren, sowie N-terminale und/oder C-terminale Verlängerungen beinhalten. Dabei müssen sie jedoch mindestens 8 Aminosäuren aus der proSAAS-Aminosäuresequenz beibehalten. Ausnahmen hiervon stellen die Peptide mit der Sequenz Ala-Arg-Pro-Val-Lys-Glu-Pro (KEP-Peptid) und mit der Sequenz Leu-Leu-Arg-Val-Lys-Arg (beschrieben von Apatalina et al. [12] ) dar, die nur sieben, bzw. sechs Aminosäuren lang sind, sowie die weiteren in der Tabelle 1 genannten Peptide, die weniger als 8 Aminosäuren umfassen. Als M- oder C-terminale Verlängerung von proSAAS-Fragmenten, die mit r-Resten in Tabelle 1 oder in Abb. 1 markiert sind kommen für den r-Rest nur solche

Aminosäuren in Frage, die in der proSAAS-Aminosäuresequenz an dieser Sequenzposition vorkommen. Zur Bestimmung, ob mindestens 8 Aminosäuren mit der proSAAS-Aminosäuresequenz übereinstimmen, werden die im vorstehenden Absatz"Homologie von Sequenzen"beschriebenen Verfahren angewendet, um Sequenz-Alignments herzustellen. Neben dem KEP-Peptid sind eine Reihe weiterer, definierter in der Natur"auf natürliche Weise entstandene" proSAAS-Fragmente in der Literatur beschrieben. Zu diesen gehören unter anderem die proSAAS-Fragmente big SAAS, little SAAS, big PEN-LEN, little PEN-LEN, PEN, big LEN und little LEN. Viele dieser Peptide entstehen aus proSAAS durch Spaltung von proSAAS an di-basischen Aminsäuresequenzen, die z. B. von Prohormonkonvertasen wie PC1, PC2, PC5, PC7, P ACE4 oder Furin erkannt und geschnitten werden. Diese Proteasen schneiden in der Regel direkt C-terminal an der di-basischen Sequenzposition. Anschließend werden in der Regel die C-terminal vorhandenen basischen Aminosäuren (Arginin und/oder Lysin) durch Endoproteasen wie z. B. Carboxypeptidase E oder Carboxypeptidase D entfernt. Daher ist davon auszugehen, dass alle proSAAS- Fragmente mit C-terminalen basischen Aminosäuren, ohne C-terminale basische Aminosäuren, oder mit einzelnen dieser C-terminalen basischen Aminosäuren vorkommen, auch wenn bisher noch nicht alle dieser proSAAS-Fragmente konkret identifiziert wurden. Bei der Benennung von Sequenzpositionen in der vorliegenden Patentanmeldung wird die Zählung der Aminosäuren immer ausgehend von der proSAAS-Aminosäuresequenz mit der Signalsequenz, also beginnend mit dem N-terminalen Methionin, begonnen. Das gesamte proSAAS einschließlich der Signalsequenz hat demnach 260 Aminosäuren. Dieses trifft auf proSAAS von Mensch, Maus und Ratte zu. In der Literatur sind verschiedene von proSAAS abstammende proSAAS-Fragmente beschrieben, die u. a. durch Prohormonkonvertasen wie PC2 oder Furin entstehen [10,11].

Konkret sind Fragmente mit den Aminosäuren 1-33 (Signa) sequenz), 34-40 (KEP), 42-59 (little SAAS), 34-59 (big SAAS), 221-242 (PEN), 245-260 (big LEN), 245-254 (little LEN), 221-260 (big PEN-LEN), 221-254 (little PEN-LEN), 34-260,34-232, 34-174 (murines proSAAS ; beschrieben in [11]), 34-61,62-

220,34-220, 34-244,34-260 (murines proSAAS ; beschrieben in [10]), 239- 244 (Maus/Ratte/Mensch proSAAS ; beschrieben in [12] ), 246-260,40-59, 186-218, 221-239 (PEN-19), 221-240 (PEN-20), (Maus/Ratte proSAAS ; beschrieben in [7]), sowie die Fragmente 66-77, 42-57, 91-104, 105-111, 78- 90, 221-241, 245-255, 202-216, 60-70, 105-120, 121-138, 136-152, 153- 173, 174-186, 187-200 und 235-246, beschrieben in (US 2004/0002460 A1) und 221-238 (ein neues, erstmals in dieser Patentanmeldung beschriebenes, proSAAS-Fragment) in der Literatur und in dem vorliegenden Patent beschrieben. Außerdem haben Sayah et al. mit In-vitro-Experimenten unter Verwendung von rekombinantem proSAAS und rekombinantem Furin oder Prohormonkonvertase 2 eine zusätzliche Schnittstelle zwischen Aminosäure 90 und 91 ermittelt [10]. Daraus ergeben sich zumindest 2 weitere proSAAS- Fragmente die vermutlich den proSAAS-Fragmenten 62-90 und 91-220 entsprechen.

Die Sequenzen der SAAS-Peptide im Einbuchstaben-Aminosäurecode sind wie folgt : Seq proSAA Name, Masse ID S Seq. (Zitat) (Da) Sequenz X13694 1 221-238 neu 1732, 8 AADHDVGSELPPEGVLGA und 1770, 8* 2 226-233 neu 826, 4 r1-VGSELPPE-r2**** ** 3 244-251 neu 2 5 r3-RLETPAPQ-r4 4 234-243 neu 1024, 7 r5-GVLGALLRVK-r6 5 39-46 neu 2 4 r7-EPRGLSAA-r8 6 73-80 neu 2 5 r9-QELARALA-r10 7 100-107 neu 899, 8 151-158 neu 765, 4 r13-AAQLVPAP-r14 9 198-205 neu > 5 r15-LLGRILAG-r16 10 221-260 big 4 AADHDVGSELPPEGVLGALLRVKRLETPA LEN [11] PQVPARRLLPP 11 221-254 little 9 AADHDVGSELPPEGVLGALLRVKRLETPA PEN-LEN [11] 12 221-242 PEN [11] 2214, 2 AADHDVGSELPPEGVLGALLRV 13 0 AADHDVGSELPPEGVLGALL [71 14 9 AADHDVGSELPPEGVLGAL [7] 15 239-244 [12] 783, 5 LLRVKR 16 235-244 [18] 1123, 8 VLGALLRVKR 17 245-260 big 1754, 0 LETPAPQVPARRLLPP [11] 18 246-260 [7] 1640, 9 ETPAPQVPARRLLPP 19 245-254 little 1021, 5 LETPAPQVPA LEN [11] 20 186-218 [7] 3548, 9 ETPDVDPELLRYLLGRILAGSADSEGVAAP RRL 21 1-33 Signal-3352, 9 MAGSPLLWGPRAGGVGLLVLLLLGLFRPP Seq. PALC 22 34-61 [10] 3042, 7 ARPVKEPRGLSAASPPLAETGAPRRFRR 23 34-59 big 2730, 5 ARPVKEPRGLSAASPPLAETGAPRRF SAAS [11] 24 34-40 KEP [11] 795, 5 ARPVKEP 25 40-59 [7] 2050, 1 PRGLSAASPPLAETGAPRRF 26 42-59 little 1797, 0 GLSAASPPLAETGAPRRF SAAS [11] 27 62-90 [10] 3126, 7 SVPRGEAAGAVQELARALAHLLEAERQER 28 1-260 proSAA 27354, 8 MAGSPLLWGPRAGGVGLLVLLLLGLFRPP S mit PALCARPVKEPRGLSAASPPLAETGAPRRF Signal-RRSVPRGEAAGAVQELARALAHLLEAERQ Seq. ERARAEAQEAEDQQARVLAQLLRVWGAP RNSDPALGLDDDPDAPAAQLARALLRARL DPAALAAQLVPAPVPAAALRPRPPVYDDG PAGPDAEEAGDETPDVDPELLRYLLGRILA GSADSEGVAAPRRLRRAADHDVGSELPPE GVLGALLRVKRLETPAPQVPARRLLPP 29 34-260 proSAA 24019, 9 ARPVKEPRGLSAASPPLAETGAPRRFRRSV S ohne PRGEAAGAVQELARALAHLLEAERQERAR Signal-AEAQEAEDQQARVLAQLLRVWGAPRNSD Seq. PALGLDDDPDAPAAQLARALLRARLDPAA [11] LAAQLVPAPVPAAALRPRPPVYDDGPAGP DAEEAGDETPDVDPELLRYLLGRILAGSAD SEGVAAPRRLRRAADHDVGSELPPEGVLG ALLRVKRLETPAPQVPARRLLPP 30 34-244 [10] 22283, ARPVKEPRGLSAASPPLAETGAPRRFRRSV PRGEAAGAVQELARALAHLLEAERQERAR AEAQEAEDQQARVLAQLLRVWGAPRNSD PALGLDDDPDAPAAQLARALLRARLDPAA LAAQLVPAPVPAAALRPRPPVYDDGPAGP DAEEAGDETPDVDPELLRYLLGRILAGSAD SEGVAAPRRLRRAADHDVGSELPPEGVLG ALLRVKR 31 34-232 [11] 20992, 0 ARPVKEPRGLSAASPPLAETGAPRRFRRSV PRGEAAGAVQELARALAH AEAQEAEDQQARVLAQLLRVWGAPRNSD PALGLDDDPDAPAAQLARALLRARLDPAA LAAQLVPAPVPAAALRPRPPVYDDGPAGP DAEEAGDETPDVDPELLRYLLGRILAGSAD SEGVAAPRRLRRAADHDVGSELPP 32 34-220 [10] 19803, ARPVKEPRGLSAASPPLAETGAPRRFRRSV PRGEAAGAVQELARALAHLLEAERQERAR AEAQEAEDQQARVLAQLLRVWGAPRNSD PALGLDDDPDAPAAQLARALLRARLDPAA LAAQLVPAPVPAAALRPRPPVYDDGPAGP DAEEAGDETPDVDPELLRYLLGRILAGSAD SEGVAAPRRLRR 33 34-174 [11] 14951, 0 ARPVKEPRGLSAASPPLAETGAPRRFRRSV PRGEAAGAVQELARALAHLLEAERQERAR AEAQEAEDQQARVLAQLLRVWGAPRNSD PALGLDDDPDAPAAQLARALLRARLDPAA LAAQLVPAPVPAAALRPRPPVYDDG 34 62-220 [10] 16778, 8 SVPRGEAAGAVQELARALAHLLEAERQER ARAEAQEAEDQQARVLAQLLRVWGAPRN SDPALGLDDDPDAPAAQLARALLRARLDP AALAAQLVPAPVPAAALRPRPPVYDDGP AGPDAEEAGDETPDVDPELLRYLLGRILAG SADSEGVAAPRRLRR 35 91-220 [101 13670, 2 ARAEAQEAEDQQARVLAQLLRVWGAPRN SDPALGLDDDPDAPAAQLARALLRARLDP AALAAQLVPAPVPAAALRPRPPVYDDGP AGPDAEEAGDETPDVDPELLRYLLGRILAG SADSEGVAAPRRLRR 36 Seq.-ID 36 entspricht der Nukleinsäuresequenz von proSAAS 37 66-77 [19] 1170, 6 GEAAGAVQELAR 38 42-57 [19] 1493, 8 GLSAASPPLAETGAPR 39 91-104 [19] 1571, 7 ARAEAQEAEDQQAR 40 105-111 [19] 811, 5 VLAQLLR 41 78-90 [19] 1534, 8 ALAHLLEAERQER 42 221-241 [19] 2115, 1 AADHDVGSELPPEGVLGALLR 43 245-255 [19] 1177, 6 LETPAPQVPAR 44 202-216 [19] 1412, 7 ILAGSADSEGVAAPR 45 60-70 [19] 1154, 6 RRSVPRGEAAG 46 105-120 1794, 0 VLAQLLRVWGAPRNSD 47 121-138 [19] 1804, 9 PALGLDDDPDAPAAQLAR 48 136-152 [19] 1761, 1 LARALLRARLDPAALAA 49 153-173 [19] 2241, 2 QLVPAPVPAAALRPRPPVYDD 50 174-186 [19] 1213, 5 GPAGPDAEEAGDE 51 187-200 [19] 1756, 0 TPDVDPELLRYLLGR 52 235-246 [19] 9 VLGALLRVKRLE

** Die Massen sind als monoisotopische, theoretische Massen berechnet und angegeben.

** Dieses Peptid ist in Form von zwei verschiedene Varianten identifiziert worden. Eine Variante ist das nicht modifizierte Peptid, während die andere

Variante an Position 231 anstatt eines Prolinrestes einen Hydroxyprolinrest aufweist und zusätzlich an Position 233 als Natrium-Addukt vorliegt. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Das Symbol 2 (grol3er gleich) zeigt an, dass die Masse dieses Peptia's mindestens dem angegebenen Wert aufweist, aber auch größer sein kann.

**** r1 repräsentiert eine Sequenz, die der Sequenz oder Teilen der Sequenz der humanen proSAAS-Aminosäuresequenz (Seq.-ID 28) von Aminosäure 221 bis 225 entspricht, wobei r1, ausgehend von Aminosäure 226 zwischen 0 und 5 Aminosäuren lang sein kann. Entsprechend stellt r2 die proSAAS- Aminosäuresequenz (Seq.-ID 28) von Aminosäure 234 bis 238 oder Teile davon dar, wobei r2, angefügt an Aminosäure 233 zwischen 0 und 5 Aminosäuren lang sein kann. Alle weiteren Aminosäuresequenzen r3 bis r16 sind entsprechend aufgebaut, wobei r3 maximal den Aminosäuren von 221-243, r4 maximal den Aminosäuren von 252-260, r5 maximal von 221-233, r6 maximal von 244-260, r7 maximal von 35-28, r8 maximal den Aminosäuren von 47-59, r9 maximal 62-72, r10 maximal den Aminosäuren von 81-220, r11 maximal den Aminosäuren von 62-99, r12 maximal den Aminosäuren von 108-220, r13 maximal den Aminosäuren von 62-150, r14 maximal den Aminosäuren von 159-220, r15 maximal den Aminosäuren von 62-197 und r16 maximal den Aminosäuren 206-220 von humanem proSAAS entspricht.

Geeignete Peptide Die Peptide können in posttranslationalen oder chemischen Modifikationsformen vorliegen, was sich u. a. auf ihre Massen und damit die massenspektrometrische Identifizierung und auch auf das Elutionsverhalten bei der Chromatographie, wie z. B. bei Reverse-Phase-Chromatographie auswirkt. Insbesondere können die Peptide mit Hydroxyprolin, phosphoryliert, sulfatiert, N-glykosiliert, O- glykosiliert, mit N-terminaler Pyroglutamat-Modifizierung oder oxidiert usw. in der zu untersuchenden Probe vorliegen.

Es ist davon auszugehen, dass die Konzentrationsverminderung der proSAAS- Peptide (proSAAS, proSAAS-Fragmente) mit dem Schweregrad der Erkrankung, der Prognose und dem Stadium der neurologischen, demenziellen Erkrankung, die mit einer Verschlechterung des Kurz-oder Langzeitgedächtnis einhergeht, insbesondere Morbus Alzheimer, korrelieren. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist daher die Bestimmung der proSAAS-Peptide auch zur Ermittlung des Schweregrades, der Prognose und zur Bestimmung des Stadiums der Erkrankung heranzuziehen, insbesondere als Ersatz oder als Ergänzung zur Durchführung einer"Mini-Mental State Examination"oder anderer neuropsychologischer Untersuchungen. In Weiterbildung der Erfindung ist außerdem vorgesehen, die Bestimmung der proSAAS-Peptide zur Ermittlung von Vorstufen neurologischer Erkrankungen, insbesondere von"Mild Cognitive Impairment" (MCI), oder zur Prognose des Verlaufs der Erkrankung heran zu ziehen.

Bei den eventuell verwendeten Kontrollproben kann es sich um eine Poolprobe aus verschiedenen Kontrollen handeln. Auch die zu untersuchende Probe kann eine Poolprobe sein, wobei bei positivem Ergebnis Einzeluntersuchungen angestellt werden.

Bei der Verminderung der Konzentration an proSAAS-Peptiden ist zumindest ein proSAAS-Peptid in seiner Konzentration, relativ zur Konzentration des selben proSAAS-Peptids in einer Kontrollprobe einer nicht an einer neurologischen, demenziellen Erkrankung leidenden Person vermindert, vorzugsweise um zumindest 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, zumindest um 90 %, weiter vorzugsweise um bis zu 100 % reduziert.

Geeignete biologische Proben Die biologische Probe kann vorzugsweise (humane) Liquor cerebrospinalis (Cerebrospinalflüssigkeit, CSF) sein oder eine Probe wie Serum, Plasma, Vollblut, Urin, Lymphe, Zellen, Gewebeproben, Stuhl, Tränenflüssigkeit,

Sputum, Salvia, Synovialflüssigkeit usw. Serum, Plasma, Vollblut, Urin, Stuhl, Tränenflüssigkeit und Saliva sind insbesondere daher von Interesse, da dieses Probenmaterial bei Standarduntersuchungen häufig und ohne großen Aufwand von Patienten gewonnen wird. Insbesondere flüssige biologische Proben sind geeignet.

Auch homogenisierte Gewebeproben, gewonnen z. B. aus Biopsiepräparaten, können verwendet werden. Daher ist in einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung vorgesehen, dass zur Vorbereitung der zu untersuchenden Probe Gewebehomogenate hergestellt werden, z. B. aus menschlichen Gewebeproben, die im Rahmen von Biopsien erhalten wurden. Diese Gewebe können z. B. mit manuellen Homogenisatoren, mit Ultraschall-Homogenisatoren oder mit elektrisch betriebenen Homogenisatoren wie z. B. Ultraturrax zerkleinert werden, und anschließend in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise in sauren, wässrigen Lösungen mit z. B. 0,1 bis 0,2 M Essigsäure für 10 Minuten gekocht werden. Anschließend werden die Extrakte dem jeweiligen labordiagnostischen Nachweisverfahren, z. B. einer massenspektrometrischen Untersuchung, unterzogen. Die Proben können in der üblichen Weise vorbereitet, z. B. gegebenenfalls verdünnt oder aufkonzentriert, und gelagert werden.

Verwendung von proSAAS und-proSAAS-Fragmenten zur Herstellung von Diagnostika Weiterhin umfasst die Erfindung die Verwendung wenigstens eines proSAAS- Peptids zur Diagnose von neurologischen, demenziellen Erkrankungen, die mit einer Verschlechterung des Kurz-oder Langzeitgedächtnis einhergehen, insbesondere von Morbus Alzheimer, sowie die Verwendung von proSAAS oder proSAAS-Fragmenten zur Gewinnung von Antikörpern oder von anderen Bindern, welche aufgrund ihrer spezifischen Bindungseigenschaften zur Entwicklung von Diagnosereagenzien zum labordiagnostischen Nachweis dieser Erkrankungen geeignet sind.

Labordiagnostische Nachweismethoden für proSAAS oder-proSAAS- Fragmente Im Rahmen der Erfindung können verschiedene Methoden zum labordiagnostischen Nachweis von proSAAS oder proSAAS-Fragmenten verwendet werden. Dazu sind alle Methoden geeignet, die es ermöglichen, diese Stoffe spezifisch in einer Probe eines Patienten nachzuweisen. Geeignete Methoden sind unter anderem physikalische Methoden wie z. B.

Massenspektrometrie oder Flüssigkeitschromatographie, molekularbiologische Methoden wie z. B. Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) oder immunologische Nachweistechniken, wie z. B."Enzyme-linked immunosorbent assays" (ELISA).

Physikalische Nachweismethoden Eine Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung physikalischer Methoden, welche die erfindungsgemäßen Stoffe qualitativ oder quantitativ anzeigen können. Zu diesen Methoden gehören unter anderem Methoden wie Flüssigkeitschromatographie, Dünnschichtchromatographie, Circulardichroismus (Circular dicroism, CD spectroscopy), Bio-Chip-Technologien oder verwandte Technologien, bei denen Stoffe auf Oberflächen detektiert werden unter Verwendung von Nukleinsäuren, Proteinen, Antikörpern usw., z. B."Surface Enhanced Laser Dsorption/lonisation" (SELDI)-Assays, Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA, USA [20] oder"Fiber-Optic Nucleic Acid" (FONA) -Assays, Virtek Vision International, Waterloo, Ontario, Kanada (US 6503711) usw. sowie zahlreiche verschiedene spektrometrische Methoden, die z. B. mit elektromagnetischer Strahlung in verschieden Wellenlängenbereichen arbeiten (z. B. Wellenlängen von 1 nm bis 1 m). Zu diesen Methoden zählen z. B.

Atomspektrometrie, Chemolumineszenzspektrometrie, Elektronenspektrometrie, Röntgenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, Fourier Transform IR- Spektrometrie, Ramanspektrometrie, Laserspektrometrie, Lochbrenn- spektrometrie, Lumineszenzspektrometrie, Plasmaspektrometrie, Magnetische Resonanzspektrometrie (NMR), Massenspektrometrie, Mikrowellen-

spektrometrie, Mössbauerspektrometrie, Fluoreszenzspektrometrie, UV/Visible- Spektrometrie, usw. Dabei werden quantitative Messergebnisse aus einer zu untersuchenden Probe mit den Messwerten, die bei einem Kollektiv an neurologischen, demenziellen Erkrankungen, die mit einer Verschlechterung des Kurz-oder Langzeitgedächtnis einhergehen, vorzugsweise Morbus Alzheimer, leidenden Patienten und einem Kontrollkollektiv gewonnen wurden, verglichen.

Aus diesen Ergebnissen kann das Vorliegen dieser Erkrankung und/oder ihr Schweregrad und/oder eine Prognose für diese Erkrankung abgeleitet werden.

Gemäß bevorzugter Ausführungsform dieser Erfindung werden die Stoffe in der Probe vor der Identifizierung chromatographisch getrennt, und zwar vorzugsweise mit Reverse-Phase-Chromatographie, besonders bevorzugt ist eine Trennung der Peptide in der Probe mit hochauflösender Reverse-Phase- High-Performance-Flüssigchromatografie (RP-HPLC). Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist die Durchführung von Fällungsreaktionen zur Fraktionierung der Probe unter Verwendung von Fällungsmitteln wie z. B.

Ammoniumsulfat, Polyethylenglykol, Trichloressigsäure, Aceton, Ethanol usw.

Auch andere Fällungsmethoden, wie z. B. Immunpräzipitationen mit Antikörpern oder Fällungsreaktionen ausgelöst durch z. B. Änderung physikalischer Faktoren wie Temperatur (Hitzefällung) können verwendet werden. Die so gewonnenen Fraktionen werden dann einzeln oder in Gruppen dem jeweiligen Nachweisverfahren unterzogen, z. B. der massenspektrometrischen Untersuchung. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von Extraktionsmethoden, wie z. B. Flüssigkeitsphasenextraktion. Dazu wird die Probe z. B. mit einem Gemisch aus einem organischen Lösungsmittel wie etwa Polyethylenglykol (PEG) und einer wässrigen Salzlösung gemischt. Aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften reichern sich dann bestimmte Inhaltsstoffe der Probe in der organischen und andere in der wässrigen Phase an und können so voneinander getrennt und anschließend weiter analysiert werden.

Reverse-Phase-Chromatographie Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung umfasst die Verwendung von Reverse-Phase-Chromatographie, insbesondere einer C18- <BR> <BR> <BR> <BR> P ; everse-Phase-Chromatographiesäule unter \/erwena'ung von Laufmitteln bestehend aus Trifluoressigsäure und Acetonitril, zur Trennung von Stoffen in humaner Liquorflüssigkeit. Es werden z. B. jeweils Fraktionen gesammelt, die je 1/96 des verwendeten Volumens an Laufmittel beinhalten.

Massenspektrometrie Die bei der Chromatographie gewonnenen Fraktionen werden mit Hilfe eines Massenspektrometers, vorzugsweise mit Hilfe eines MALDI- Massenspektrometers (Matrix-Assisted-Laser-Desorption-lonisation) unter Verwendung einer Matrixlösung, bestehend aus z. B. aus L (-) Fucose und alpha- Cyano-4-hydroxyzimtsäure, gelöst in einem Gemisch aus Acetonitril, Wasser, Trifluoressigsäure und Aceton, analysiert und so das Vorliegen bestimmter Massen festgestellt und die Signalintensität quantifiziert. Diese Massen entsprechen den Massen von proSAAS und proSAAS-Fragmenten. Gemäß weiterer bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung kann die Identifizierung des oder der Stoffe mit Hilfe einer massenspektrometrischen Bestimmung wie z. B. einer MALDI-TOF (Matrix-Assisted-Laser-Desorption-and-lonisation-Time- Of-Flight)-Massenspektrometrie oder einer ESI (Elektro-Spray-lonisation) - Massenspektrometrie vorgenommen werden. Dabei umfasst die massenspektrometrische Bestimmung vorzugsweise wenigstens eines der folgenden Massensignale, jeweils berechnet anhand der theoretischen monoisotopischen Masse des entsprechenden proSAAS-Peptids. Dabei können Abweichungen von der theoretischen, monoisotopischen Masse aufgrund einer geringen Messungsungenauigkeit des Massenspektrometers von maximal 500 ppm und der natürlichen Isotopenverteilung auftreten. Außerdem wird bei MALDI-Massenbestimmungen aufgrund der Messmethodik den Proteinen und Proteinfragmenten ein Proton hinzugefügt, wodurch sich die Masse um 1 Da erhöht. Folgende Massenangaben entsprechen den theoretischen

monoisotopischen Massen der von uns identifizierten Stoffe, sowie von proSAAS und weiteren proSAAS-Fragmenten, die mit dieser Methodik bestimmt werden können. Die Massen wurden berechnet mit geeigneter Software, hier GPMAW 4. 02, Lighthouse data, Odense, Dänemark. Die folgenden theoretischen, monoisotopischen Massen können einzeln, oder in Kombinationen in einer Probe auftreten : Seq.-ID 1 = 1732,8 oder 1770, 8 (mit Hydroxyprolin und Natrium-Addukt)/Seq.-ID 2 # 826,4 / Seq.-ID 3 2 910,5/ Seq.-ID 4 # 1024,7/ Seq.-ID 5 # 799,4/ Seq.-ID 6 # 870,5 / Seq.-ID 7 2 899, 5 /Seq.-ID 8 : 765, 4/Seq.-ID 9 # 811,5 / Seq.-ID 10 = 4234, 4/Seq.-ID 11 = 3501, 9/Seq.-ID 12 = 2214, 2 / Seq.-ID 13 = 1959, 0/Seq.-ID 14 = 1845, 9 /Seq.-ID 15 = 783, 5 / Seq.-ID 16 = 1123,8 / Seq.-ID 17 = 1754,0 / Seq.-ID 18 = 1640, 9/Seq.-ID 19 = 1021, 5/Seq.-ID 20 = 3548, 9 / Seq.-ID 21 = 3352, 9 / Seq.-ID 22 = 3042,7 / Seq.-ID 23 = 2730, 5 / Seq.-ID 24 = 795, 5/ Seq.-ID 25 = 2050, 1 / Seq.-ID 26 = 1797, 0 / Seq.-ID 27 = 3126, 7/Seq.-ID 28 = 27354, 8/Seq.-ID 29 = 24019, 9/Seq.-ID 30 = 22283, 9 / Seq.-ID 31 = 20992, 0/Seq.-ID 32 = 19803, 5 / Seq.-ID 33 = 14951, 0/Seq.-ID 34 = 16778, 8 / Seq.-ID 35 = 13670,2 / Seq.-ID 37 = 1170,6 / Seq.-ID 38 = 1493, 8 / Seq.-ID 39 = 1571, 7/Seq.-ID 40 = 811, 5 / Seq.-ID 41 = 1534,8/ Seq.-ID 42 = 2115, 1 / Seq.-ID 43 = 1177, 6 / Seq.-ID 44 = 1412, 7 / Seq.-ID 45 = 1154, 6/Seq.-ID 46 = 1794, 0 / Seq.-ID 47 = 1804, 9/Seq.-ID 48 = 1761, 1 / Seq.-ID 49 = 2241, 2 / Seq.ID 50 = 1213, 5/ Seq.-ID 51 = 1756, 0 und Seq.-ID 52 = 1365,9 Dalton. Liegen die proSAAS-Peptide in Form von in der Natur vorkommenden Derivaten vor, so verändert sich ihre Masse entsprechend und es wird die entsprechend veränderte Masse zum Nachweis verwendet.

Das Symbol 2 (ist größer oder gleich) ist bei den Massen-Angaben so zu verstehen, dass nicht beliebig größere Massen für die betroffenen proSAAS- Fragmente möglich sind, sondern lediglich die Massen, die sich aufgrund der r- Reste möglicherweise zusätzlich an den Enden dieser Fragmente befindlichen Aminosäuren ergeben. An den Enden dieser Stoffe können nicht beliebige

Aminosäuren zusätzlich vorhanden sein, sondern nur solche, die sich aufgrund der Sequenz von proSAAS an dieser Sequenzposition befinden können (Abbildung 1). Zusätzlich konnte das proSAAS-Fragment mit der Seq.-ID 1 (Masse = 1732, 8 Dalton) in Form eines Derivats, bei der der Prolinrest an Position 231 durch einen Hydroxyprolinrest ersetzt ist und bei dem an Position 233 ein Natrium-Addukt vorliegt, identifiziert werden (experimentell bestimmte Masse : 1770 Dalton). Es ist möglich, dass dieses proSAAS-Fragment mit nur einer der beiden genannten Modifizierungen vorhanden ist oder proSAAS- Fragmente auch in Form von anderen Derivaten vorkommen und daher mit jeweils entsprechend veränderten Massen bestimmt werden können.

Massenspektrometrische Bestimmung der Sequenz der Stoffe Bei der weiteren praktischen Anwendung dieser Ausführungsform ist eine weitere Absicherung des Nachweisergebnisses dadurch möglich und empfehlenswert, dass die Identität der den Massen entsprechenden Stoffe ermittelt wird, wobei ausschließlich Signale berücksichtigt werden, die von proSAAS oder-proSAAS-Fragmenten abgeleitet werden können. Diese Absicherung erfolgt über eine Identifizierung der Peptidsignale vorzugsweise mit massenspektrometrischen Verfahren, z. B. einer MS/MS-Analyse [21].

Es wurden, spezifische von proSAAS abgeleitete proSAAS-Fragmente identifiziert und in ihrer Bedeutung erkannt. Sequenzen von Stoffen die diesem Verfahren zugänglich sind, sind im Sequenzprotokoll angegeben (Seq.-ID 1 bis 35 und Seq.-ID 37 bis 52). Einige der proSAAS-Fragmente stellen neue, bisher nicht beschriebene Stoffe dar (Seq.-ID 1 bis 9). Die proSAAS-Fragmente entsprechend Seq.-) D 2 bis 9 können am N-und/oder C-Terminus zusätzliche Aminosäuren entsprechend der korrespondierenden Sequenz von proSAAS beinhalten. Seq.-) D 1 wurde in Form von zwei verschiedenen Varianten aufgefunden, die beide neue, bisher nicht bekannte Stoffe darstellen. Die proSAAS-Fragmente, die bisher schon bekannt waren, entsprechen den Seq.- IDs 10 bis 35 und Seq.-ID 37 bis 52. Die Erfindung umfasst auch rekombinant,

enzymatisch oder synthetisch hergestelltes, sowie aus biologischen Proben isolierten proSAAS und-proSAAS-Fragmente sowie entsprechende Derivate.

Molekularbiologische Nachweistechniken Schließlich umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuren, die für proSAAS oder proSAAS-Fragmente kodieren, sowie die entsprechenden komplementären Sequenzen, zur indirekten Bestimmung und Quantifizierung der zugehörigen proSAAS-Peptide einschließlich entsprechender Derivate. Darin eingeschlossen sind auch Nukleinsäuren, die z. B. nicht codierende Sequenzen, wie etwa 5'- oder 3'-untranslatierte Bereiche der proSAAS mRNA darstellen, und Nukleinsäuren, die eine für spezifische Hybridisierungs-oder PCR-Experimente ausreichende Sequenzübereinstimmung mit einer Nukleinsäuresequenz von proSAAS oder Teilen der Nukleinsäuresequenz von proSAAS aufweisen, und die daher zum indirekten Nachweis der zugehörigen Stoffe geeignet sind.

Ein Ausführungsbeispiel hierfür umfasst die Gewinnung von Gewebeproben, z. B. von Biopsiepräparaten, von Patienten und die nachfolgende Bestimmung der Konzentration einer proSAAS-RNA, die mindestens 70 % Homologie zu AF181562 (= Seq.-ID 26) aufweisen. Dabei werden quantitative Messergebnisse (Intensitäten) aus einer zu untersuchenden Probe mit den Messwerten, die bei einem Kollektiv von Morbus-Alzheimer-Patienten und einem Kontrollkollektiv gewonnen wurden, verglichen. Zur Quantifizierung können Methoden wie z. B. Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), quantitative Echtzeit-PCR (ABI PRISME 7700 Sequence Detection System, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), DNA-Chips z. B. erhältlich von Affimetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA, In-situ-Hybridisierungen, Northernblots usw., sowie weitere dem Fachmann bekannte Methoden angewendet werden.

Viele molekularbiologische Nachweismethoden funktionieren über Hybridisierungen von Nukleinsäuren. Um eine spezifische Hybridisierung zu erreichen wird vorzugsweise eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen

durchgeführt. Beispiele für stringente Hybridisierungsbedingungen können im dem Stand der Technik gefunden werden. Zum Beispiel kann eine stringente Hybridisierung bei 65 °C in einem Puffer enthaltend 3, 5x SSC, 0,02 % Vicoll, 0, 02 % Polyvinylpyrrolidon, 0, 02 % Rinderserumalbumin in 2, 5 mSl NaH2POeS, pH 7,0, 0,5 % Natrimudodecylsulfat (SDS), 2 mM Ethylen-Diamin-Tetra- Essigsäure (EDTA) durchgeführt werden. SSC besteht aus 150 miVi NaCi und 150 mM Natrimucitrat, pH 7,0. Nach der Hybridisierung wird die Membran bei Raumtemperatur in 2x SSC und in 0, 1-0, 5x SSC mit 0,1 % SDS bei Temperaturen bis zu 68'C gewaschen. Eins spezifische Hybridisierung erfordert, das zumindest 40 %, vorzugsweise 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % der hybridisierenden Sequenzen komplementär zueinander sind.

Es ist nicht notwendig, dass die gesamten Nukleinsäuresequenzen miteinander hybridisieren, solange die Duplex-Nukleinsäure unter den stringenten Versuchsbedingungen stabil ist. Weitere Protokolle für stringente Hybridisierungen, auch für spezielle Arten von Versuchen wie z. B. DNA-Chip Tests sind dem Fachmann bekannt.

Aus den Ergebnissen kann das Vorliegen einer neurologischen, demenziellen Erkrankung, die mit einer Verschlechterung des Kurz-oder Langzeitgedächtnis einhergeht, vorzugsweise Morbus Alzheimer und/oder deren Schweregrad und/oder eine Prognose des Auftretens der Erkrankung abgeleitet werden.

Immunologische Nachweismethoden Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die labordiagnostische Bestimmung von proSAAS und proSAAS-Fragmenten unter Verwendung eines immunologischen Nachweissystems, vorzugsweise eines ELISAs ("Enzyme-linked immunosorbent assay") durchgeführt werden. Dabei erfasst dieser immunologische Nachweis wenigstens ein proSAAS oder proSAAS-Fragment. Zur Erhöhung der Spezifität kann weiterhin bevorzugt ein sogenannter"Sandwich-ELISA"verwendet werden, bei dem der Nachweis von der Spezifität von zwei Antikörpern, die unterschiedliche Epitope innerhalb des

selben Moleküls erkennen, abhängig ist. Zum labordiagnostischen Nachweis dieser Stoffe können jedoch auch andere ELISA-Systeme, z. B. direkte oder kompetitive ELISA Verwendung finden. Auch weitere, ELISA-ähnliche Nachweistechniken, wie z. B. R) A ("radio immuno assay"), EtA ("enzyme immuno assay"), ELI-Spot (Enzyme Linked Immuno-Spot") usw. sind geeignet als immunologische Nachweissysteme. Als Standard für die Quantifizierung kann aus biologischen Proben isoliertes, rekombinantes oder enzymatisch hergestelltes oder chemisch synthetisiertes proSAAS oder proSAAS-Fragmente verwendet werden. Die Bestimmung dieser Stoffe kann z. B. allgemein mit Hilfe eines auf die jeweiligen Stoffe gerichteten, spezifischen Antikörpers, erfolgen.

Weitere für solche labordiagnostischen Nachweise geeignete Methoden sind unter anderem Westernblotting, Immunpräzipitationen, Dot-Blots, <BR> <BR> <BR> <BR> Plasmonresonanzspektrometrie (BIACORE@-Technologie, Biacore International AB, Uppsala, Schweden), Affinitätsmatrizen (z. B. ABICAP-Technologie, ABION Gesellschaft für Biowissenschaften und Technik mbH, Jülich, Deutschland), Protein-Chips z. B. erhältlich von Affimetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA, usw.

Generell sind alle Substanzen/Moleküle (Binder) als Nachweisagenzien geeignet, die es erlauben, ein spezifisches labordiagnostisches Nachweissystem aufzubauen, da sie spezifisch an proSAAS oder-proSAAS-Fragmente binden.

Zahlreiche dem Fachmann bekannte, hier nicht ausdrücklich genannte immunologische Nachweismethoden sind dazu ebenfalls geeignet.

Gewinnung von proSAAS und-proSAAS-Fragmenten Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Gewinnung von proSAAS und-proSAAS-Fragmenten unter Verwendung von rekombinanten Expressionssystemen, In-vitro-Translation, Chromatographiemethoden und chemischen Syntheseprotokollen, usw., die dem Fachmann bekannt sind. Diese Stoffe können aus natürlichen biologischen Proben oder aus rekombinanten Expressionssystemen z. B. unter Verwendung von Reverse-Phase- Chromatographie, Affinitätschromatographie, lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration, isoelektrischer Fokussierung, präparativer Immunpräzipitation,

Ammoniumsulfatfällung, Extraktion mit organischen Lösungsmitteln usw. sowie mit weiteren dem Fachmann bekannten Methoden gewonnen werden. Die so erhaltenen Stoffe können unter anderem als Therapeutikum zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer, als Standards zur Quantifizierung der jeweiligen Stoffe oder als Antigen zur <BR> <BR> <BR> Herstellung von Antikörpern gegen diese Stoffe verwendet werden. ProSAAS oder proSAAS-Fragmente können C-oder N-terminal mit heterologen Sequenzen von fremden Peptiden wie z. B. Poly-Histidinsequenzen (His-tag), Hemagglutinin- Epitopen (HA-tag), HIV-Tat-Sequenzen, Antennapedia-Sequenzen, VP22- Sequenzen oder Proteinen wie z. B. Maltose-bindenden Proteinen, Glutathion-S- Transferase (GST),"Green Fluorescent Protein" (GFP), oder Proteindomänen wie der GAL4-DNA-Bindungsdomäne oder der GAL4-Aktivierungsdomäne fusioniert sein. Diese zusätzlichen Bestandteile von proSAAS und proSAAS- Fragmenten können z. B. dazu genutzt werden, um proSAAS oder proSAAS- Fragmente besser isolieren zu können (His-tag, HA-tag, Glutathion-S- Transferase), um sie besser labordiagnostisch nachweisen zu können (His-tag, HA-tag, GFP), um mit Ihnen das Auffinden von Bindungspartnern zu ermöglichen z. B."yeast two-hybrid"System (GAL4-Domähnen), um die Aufnahme dieser Stoffe durch Zellen zu fördern (HIV-Tat, Antennapedia, VP22), usw.

Verwendung und Gewinnung von anti-proSAAS Antikörpern Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung und Herstellung von proSAAS oder proSAAS-Fragment-spezifischen Antikörpern, eine insbesondere bevorzugte Ausführungsform ist die Verwendung und Herstellung von spezifischen Antikörpern die neo-Epitope in proSAAS- Fragmenten erkennen, das heißt Epitope, die nur in proSAAS-Fragmenten vorhanden sind, nicht jedoch in proSAAS. Solche Antikörper ermöglichen den spezifischen immunologischen Nachweis von proSAAS-Fragmenten in Gegenwart von proSAAS. Polyklonale Antikörper können durch Immunisierungen von Versuchstieren wie z. B. Mäusen, Ratten, Kaninchen oder

Ziegen hergestellt werden. Monoklonale Antikörper können z. B. durch Immunisierungen von Versuchstieren wie z. B. Mäusen oder Ratten und anschließender Anwendung von Hybridomatechniken oder z. B. über rekombinante Versuchsansätze wie z. B. über Antikörperbanken wie die HUCALO -Antikörperbank der Firma MorphoSys, Martinsried, Deutschland, oder andere dem Fachmann bekannte, rekombinante Herstellungsverfahren gewonnen werden. Diese Antikörper können auch in Form von Antigen-bindenden Antikorperfragmenten Verwendung finden. Beispiele für solche Antikörperfragmente sind Intrabodies, Fab- (fragment, antigen binding-), Fab2- oder scFv- (single-chain Fv fragment) Fragmente. Die Antikörper können auch als Fusionsproteine, bestehend aus einem oder mehreren Antikörper-Proteinen oder Antikörper-Proteinfragmenten und einem oder mehreren weiteren Proteinen oder Proteinfragmenten, wie z. B. Enzymen wie Peroxidase, alkalische Phosphatase, Luciferase, usw., fluoreszierenden Proteinen wie z. B."green fluorescent protein" (GFP), usw. rekombinant oder synthetisch hergestellt werden, oder es können chemische Gruppen wie z. B. Biotin, Farbstoffe wie z. B.

Digoxigenin, oder Fluorophore wie z. B. Fluorescein, BODIPY usw., radioaktive Nuklide wie Phosphor-32, Phosphor-35, lod-125, usw. angefügt werden.

Zahlreiche zur Markierung von Antikörpern und Proteinen geeignete Reagenzien sind dem Fachmann bekannt und unter anderem von der Firma Molecular Probes Europe BV, Leiden, The Netherlands erhältlich.

Therapieentwicklung und Überwachung durch proSAAS-und-proSAAS- Fragment-Bestimmungen Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die quantitative oder qualitative Bestimmung des oben genannten proSAAS oder-von proSAAS-Fragmenten zur Abschätzung der Wirksamkeit einer sich in der Entwicklung befindlichen Therapie gegen neurologische, demenzielle Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer. Die Erfindung kann auch zur Stratifizierung von Teilnehmern klinischer Studien zur Entwicklung von Therapien gegen derartige Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer, verwendet werden. Die Wirksamkeitsprüfung

und die Auswahl der richtigen Patienten für Therapien und für klinische Studien ist für eine erfolgreiche Entwicklung und Anwendung eines Therapeutikums von herausragender Bedeutung. Bisher steht für Morbus Alzheimer kein klinisch messbarer Parameter zur Verfügung, der dieses zuverlässig ermöglicht [221.

Überprüfung der therapeutischen Wirksamkeit von proSAAS und und von proSAAS-Fragmenten und von Agenzien, die die Expression und die biologische Verfügbarkeit dieser Stoffe modulieren Ein Ausführungsbeispiel hierfür umfasst die Kultivierung lebender Zellen mit proSAAS oder-proSAAS-Fragmenten und Agenzien, die die Expression, Prozessierung oder die biologische Verfügbarkeit dieser Stoffe modulieren.

Substanzen, die die Prozessierung fördern, können z. B. Proteasen wie Prohormonkonvertasen sein, die di-basische Sequenzmotive erkennen. Dadurch können biologische Eigenschaften von proSAAS und proSAAS-Fragmenten im Zusammenhang mit neurologischen Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer, ermittelt werden. Auch Fusionsmoleküle können zur Untersuchung der Zelllinien verwendet werden, wie z. B. proSAAS-Fusionspeptide die Sequenzen beinhalten, die z. B. den Transport des Fusionspeptids ins Zellinnere fördern. Beispiele für Sequenzen, die dafür verwendet werden können sind z. B. : HIV-Tat-, Antennapedia-, Herpes-Simplex-VP22-Sequenzen usw. Ebenso können Zelllinien mit Expressionsvektoren transfiziert werden, die direkt oder indirekt die Expression von proSAAS oder die Freisetzung von-proSAAS- Fragmenten erhöhen, indem sie z. B. direkt für diese Stoffe kodieren oder indem sie z. B. für Prohormonkonvertasen oder Expressionsfaktorenkodieren. Auch die gleichzeitige Transfektion mit mehreren verschiedenen Expressionsvektoren kann durchgeführt werden. Insbesondere Zelllinien, die als neurologische Modellsysteme im Zusammenhang mit proSAAS als geeignet erscheinen, können zu solchen Untersuchungen herangezogen werden. Als"read-out" Systeme für diese Untersuchungen können unter anderem Tests verwendet werden, die die Proliferationsrate der behandelten Zellen, ihre Stoffwechselaktivität, die Apoptoserate der Zellen, Änderungen der

Zellmorphologie, Änderungen in der Expression von zelleigenen Proteinen oder Änderungen der Expression von den Zellen zugefügten Reportergenen usw., messen oder die die Freisetzung von zytosolischen Zellbestandteilen als Marker für Zellsterben ermitteln.

Als weitere Testsysteme können geeignete Stämme von Versuchstieren, z. B. von Mäusen oder Ratten, die als Modell für neurologische Erkrankungen, insbesondere als Modell für Morbus Alzheimer, gelten, verwendet werden.

Diese Versuchstiere können zur Untersuchung der Wirksamkeit von Therapiestrategien, die die Erhöhung der Konzentration von proSAAS oder- proSAAS-Fragmenten zum Ziel haben, herangezogen werden. Außerdem kann in geeigneten Versuchstieren, wie z. B. Mäusen, Ratten, Kaninchen, Hunden, Affen usw. die In-vivo-Wirkung dieser Stoffe untersucht werden. Dazu können proSAAS oder proSAAS-Fragmente z. B. durch intravenöse Injektionen, verabreicht werden und ihre Wirkung auf das Versuchstier ermittelt werden, insbesondere wenn es sich um ein Tiermodell für neurologische, demenzielle Erkrankungen handelt.

Messparameter bei Experimenten mit Versuchstieren können z. B. die Überlebensdauer der Tiere, ihr Verhalten, ihre Kurzzeitgedächtnisleistung und ihre Lernfähigkeit sein. Ein Beispiel für einen Gedächtnistest, der für Versuchstiere, wie z. B. Ratten, geeignet ist, ist der"Morris water maze test".

Als weitere Parameter können die Bestimmung von Körperfunktion (Temperatur, Atemfrequenz, Herzfrequenz usw. ), die Bestimmung von z. B. neurologischen Mediatoren aus z. B. dem Blut, Urin, Gewebeproben oder Liquor, die Messung von Gehirnströmen (EEG), Stoffwechseltests, die Expression von proSAAS oder - von proSAAS-Fragmenten und anderen mit der Erkrankung im Zusammenhang stehenden Stoffen wie Proteinen, Peptiden,"Second-Messengern", Hormonen, Lipiden, Steroide, usw., sowie morphologische und histologische Untersuchungen an Geweben, wie z. B. dem Gehirn herangezogen werden.

Als weitere Möglichkeit zur Untersuchung der Funktion von proSAAS und proSAAS-Fragmenten können mit molekularbiologischen Methoden Versuchstiere erhalten werden, in deren Organismus diese Stoffe nicht produziert werden, oder in verminderter oder erhöhter Menge produziert werden. Dazu kann die Expression sowohl lokal als auch im gesamten Organismus des Versuchstieres gezielt verändert werden. Als Versuchstiere sind unter anderem Caenorhabditis elegans, Drosophila, Zebrafische, Mäuse, Ratten usw. geeignet.

Screeningverfahren Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Expression, Konzentration oder Aktivität von proSAAS oder-proSAAS-Fragmenten, oder von proSAAS-Agonisten wie z. B. von Proteasen wie z. B. Prohormonkonvertasen oder von Nukleinsäuren, die für diese Stoffe kodieren, modulieren. Insbesondere schließt die Erfindung Verfahren ein, bei denen eine Probe, die proSAAS oder ein proSAAS-Fragment oder eine entsprechende Nukleinsäure enthält, mit einer Testsubstanz in Verbindung gebracht wird. In diesen Verfahren wird dann untersucht, ob die Testsubstanz die Fähigkeit hat, die Expression von proSAAS oder die Generierung von proSAAS-Fragmenten zu modulieren, oder ob die Testsubstanz die Aktivität oder Konzentration von proSAAS oder-proSAAS-Fragmenten beeinflusst.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen näher illustriert. Dabei wird auch Bezug auf die Abbildungen genommen.

Abbildung 1 : Die Sequenz von humanem proSAAS, wobei sowohl neue als auch im Stand der Technik bereits bekannte proSAAS-Fragmente dargestellt sind

Abbildung 2 : Elutionsprofil einer Reverse-Phase-Chromatographie zur Separation und Anreicherung von proSAAS-Fragmenten aus Liquor cerebrospinalis Abbildung 3 : Massenspektrometrische Messung (MALDI) am Beispiel eines proSAAS-Fragments, das der proSAAS- Aminosäuresequenz von 221 bis 238 entspricht, wobei dieses proSAAS-Fragment in nicht modifizierter Form oder ein Derivat des proSAAS-Fragments bestimmt wird (die Massenangaben sind experimentell ermittelte Werte, nicht monoisotopische, theoretische Massen) Abbildung 4 : MALDI-Massenspektrometrie als relativ quantifizierende massenspektrometrische Methode Abbildung 5 : MS/MS-Fragmentspektrum am Beispiel des proSAAS- Fragments, das der proSAAS-Aminosäuresequenz von 221 bis 238 entspricht, wobei dieses proSAAS-Fragment in nicht modifizierter Form oder ein Derivat des proSAAS-Fragments bestimmt wird Abbildung 6 :"Box-Whisker-Plots"zum quantitativen Vergleich der Konzentrationen des proSAAS-Fragments, das der proSAAS-Aminosäuresequenz von 221 bis 238 entspricht, in Morbus-Alzheimer-Patienten verglichen mit Kontrollpatienten. Bei dem analysierten proSAAS- Fragment befinden sich an Position 231 ein Hydroxyprolinrest und an Position 233 ein Natrium- Addukt

Die Abbildung 1 zeigt die humane Sequenz von proSAAS entsprechend der SwissProt Accession No. Q9UHG2 (Seq.-ID 28). Zusätzlich sind die Positionen des von uns neu identifizierten proSAAS-Fragments (Seq.-ID 1) entsprechend der proSAAS-Aminosäuresequenz 221-238) sowie die Positionen von acht proSAAS-Fragmenten mit variablen Sequenzlängen in Form von gestrichelten Linien mit einem-r"am Ende eingetragen. Außerdem sind die Sequenzen von einigen der aus der Literatur bereits bekannten proSAAS-Fragmente wie z. B.

PEN, LEN, PEN-LEN, usw. eingetragen. Die Signalsequenz ist markiert und di- basische Sequenzpositionen sind unterstrichen.

Die Abbildung 2 zeigt ein Elutionsprofil einer mit Reverse-Phase- Chromatographie gemäß Beispiel 2, zur Separation und Anreicherung der proSAAS-Fragmenten aus Liquor cerebrospinalis analysierten Probe.

Die Abbildung 3 zeigt ein Spektrum, das durch MALDI-massenspektrometrische Messung gemäß Beispiel 3 von proSAAS-Fragmenten entstanden ist, nach erfolgter Reverse-Phase-Chromatographie von humanem Liquor cerebrospinales gemäß Beispiel 2. Das proSAAS-Fragment entspricht der proSAAS-Sequenz von Aminosäure 221-238. Der Massenpeak von 1733 Dalton entspricht der nicht modifizierten Sequenz, während der Massenpeak von 1772 Dalton einem Derivat des besagten proSAAS-Fragments entspricht, das einen Hydroxyprolinrest und Natrium-Addukt beinhaltet. Die Massen entsprechen den experimentell bestimmten Massen der beiden Peptide, die von den theoretischen mit GPMAW 4.02 berechneten Massen im Rahmen der Messungenauigkeit von MALDI-Massenspektrometern gringfügig abweichen.

1733 Dalton entspricht der berechneten Masse von 1732, 8 Dalton und 1772 Dalton entspricht der berechneten Masse 1770, 8 Dalton.

Die Abbildung 4 zeigt durch MALDI-Massenspektrometrie als relativ quantifizierende Massenspektrometrie-Methode erzeugte Daten. Eine Probe wurde mit unterschiedlichen Mengen verschiedener Standard-Peptide versetzt

und die Intensität sowohl dieser Standardsignale, als auch repräsentativer Probensignale ermittelt. Alle Signal-Intensitäten der Standards wurden auf ihre Signalintensität bei einer Konzentration von 0, 64 uM (= 1) normiert (siehe Pfeil in Abbildung 4). Jedes Peptid zeigt ein individuelles, typisches Verhältnis von Signalstärke zu Konzentration, was in diesem Diagramm anhand der Steigung der Kurve ablesbar ist. MW = relative molekulare Masse.

Die Abbildung 5 zeigt MS/MS-Fragmentspektren gemäß Beispiel 4 des erfindungsgemäßen proSAAS-Fragments entsprechend der Aminosäurensequenz von 221-238 ohne Modifizierungen (Abbildung 5A und B) und des entsprechenden Derivats des besagten proSAAS-Fragments mit einem Hydroxyprolinrest an Position 231 und einem Natrium-Addukt an Position 233 (Abbildung 5C und D).

Abbildung A und C : Rohdaten der Messungen.

Abbildung B und D : Konvertierte, dekonvolutierte Massenspektren der proSAAS-Fragmente.

Die Abbildung 6 zeigt"Box-Whisker-Plots"zum quantitativen Vergleich der Konzentrationen des proSAAS-Fragments, das der proSAAS-Sequenz von Aminosäure 221-238 entspricht, in Morbus-Alzheimer-Patienten verglichen mit Kontrollpatienten. Es werden Daten gezeigt, die mit dem Derivat des proSAAS- Fragments 221-238 mit einer Hydroxyprolin-Aminosäure an Position 231 und einem Natrium-Addukt an Position 233 erhalten wurden. Die Abbildung zeigt in Form eines"Box-Whisker-Plots"einen Vergleich der integrierten MALDI- massenspektrometrischen Signalintensitäten. Die linke Hälfte von Abbildung 6 A zeigt die Ergebnisse, die beim Vergleich von Morbus-Alzheimer-Proben mit Proben von Patienten mit anderen Demenzen erhalten wurden (aktive Kontrolle).

Die rechte Hälfte der Abbildung 6 A zeigt die Ergebnisse, die beim Vergleich von Morbus-Alzheimer-Proben mit Proben von gesunden Personen gleichen Alters erhalten wurden (passive Kontrolle). Abbildung 6 B zeigt die Peptidsequenz, einschließlich vorhandener Modifizierungen.

Beispiel 1 : Gewinnung von Liquor cerebrospinalis zur Bestimmung von proSAAS und proSAAS-Fragmenten Liquor cerebrospinalis ist die in den vier Hirnventrikeln und im cerebra) en und spinalen Subarachnoidalraum enthaltene Flüssigkeit, die vor allem in den Plexus choroidei der Seitenventrikel gebildet wird. Die Entnahme von Liquor cerebrospinalis erfolgt meist durch Lumbalpunktion, seltener durch Subokzipitalpunktion oder Ventrikelpunktion. Bei der Lumbalpunktion (Spinalpunktion) zur Entnahme von Liquor cerebrospinalis wird bei der Punktion der spinale Subarachnoidalraum zwischen dem 3. und 4. oder dem 4. und 5.

Lendenwirbeldornfortsatz mit einer langen Hohlnadel punktiert und so Liquor gewonnen. Anschließend wird die Probe 10 Minuten bei 2000 x g zentrifugiert und der Überstand bei minus 80°C gelagert. Für 279 klinische Proben, d. h. 86 passive Kontrollproben, 66 aktive Kontrollproben und 127 Proben von Patienten, die an Morbus Alzheimer erkrankt sind, wurde eine Probenvorbereitung gemäß Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 2. Trennung von Peptiden in Liquor cerebrospinalis (CSF) zur massenspektrometrischen Messung von proSAAS-Fragmenten Zum massenspektrometrischen Nachweis von proSAAS-Fragmenten in CSF ist in diesem Beispiel eine Trennung der peptidischen Inhaltsstoffe notwendig.

Diese Probenvorbehandlung dient der Anreicherung der erfindungsgemäßen Peptide und zur Abtrennung von Komponenten, die die Messung stören können.

Als Trennverfahren wird eine Reverse-Phase-Chromatographie durchgeführt.

Hierbei eignen sich verschiedene RP-Chromatographie-Harze und Elutionsmittel gleichermaßen. Im Folgenden ist beispielhaft die Trennung von proSAAS- Fragmenten unter Verwendung einer C 18-Reverse-Phase-Chromatographiesäule mit der Größe 4 mm x 250 mm der Firma Vydac dargestellt. Es wurden Laufmittel folgender Zusammensetzung verwendet : Laufmittel A : 0,06 % (v/v) Trifluoressigsäure, Laufmittel B : 0,05 % (v/v) Trifluoressigsäure, 80 % (v/v) Acetonitril. Die Chromatographie erfolgte bei 33 °C unter Verwendung einer

HP-ChemStation 1100 der Firma Agilent Technologies mit einer Flusszelle Micro der Firma Agilent Technologies. Als Probe wurde humaner Liquor cerebrospinalis verwendet. 440 pI Liquor wurden mit Wasser auf 1650 ßul verdünnt, der pH auf 2-3 eingestellt, die Probe für 10 Minuten bei 18000 x g zentrifugiert und schließlich 1500, ul der so vorbereiteten Probe auf die Chromatographiesäule aufgetragen. Die Chromatographiebedingungen waren wie folgt : 5 % Laufmittel B zum Zeitpunkt 0 min., vom Zeitpunkt 1 bis 45 min lzontinuierliche Steigerung der Laufmittel B Konzentration auf 50 %, von Zeitpunkt 45 bis 49 min kontinuierliche Steigerung der Laufmittel B Konzentration auf 100 % und anschließend bis zum Zeitpunkt 53 min konstant 100 % Puffer B. 10 Minuten nach Beginn der Chromatographie wird mit dem Sammeln von 96 Fraktionen zu je 0,5 ml begonnen. Das Chromatogramm einer Liquor-cerebrospinalis-Probe, hergestellt unter den hier beschriebenen Versuchsbedingungen, ist in Abbildung 2 dargestellt.

Beispiel 3 : Ermittlung der Massen von Peptiden mit Hilfe von MALDI- Massenspektrometrie Zur Massenanalyse werden typische Positiv'Ionen-Spektren von Peptiden in einem MALDI-TOF-Massenspektrometer (MALDI-TOF = Matrix-Assisted- Laserdesorption-lonisation-Time-Of-Flight). Geeignete MALDI-TOF- Massenspektrometer werden von PerSeptive Biosystems Framingham (Voyager- DE, Voyager-DE PRO oder Voyager-DE STR) oder von Bruker Daltonik Bremen (BIFLEX) hergestellt. Zur Präparation der Proben werden diese mit einer Matrixsubstanz vermischt, die typischerweise aus einer organischen Säure besteht. Typische Matrix-Substanzen, die sich für Peptide eignen, sind die 3,5- Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure, die a-Cyano-4-hydroxyzimtsäure und die 2,5- Dihydroxybenzoesäure. Zur Messung der erfindungsgemäßen proSAAS- Fragmente wird ein lyophylisiertes, nach Reverse-Phase-Chromatographie gewonnenes Äquivalent entsprechend 500 pl humanem Liquor cerebrospinalis, verwendet. Die chromatographierte Probe wird in 15, ul einer Matrix-Lösung gelöst. Diese Matrix-Lösung enthält z. B. 10 g/L a-Cyano-4-hydroxyzimtsäure

und 10 g/L L (-) Fucose gelöst in einem Lösungsmittelgemisch bestehend aus Acetonitril, Wasser, Trifluoressigsäure und Aceton im Volumenverhältnis 49 : 49 : 1 : 1. Von dieser Lösung werden 0, 3, ul auf eine MALDI-Trägerplatte transferiert und die getrocknete Probe im MALDI-Massenspektrometer Voyager- DE STR von PerSeptive Biosystems analysiert. Die Messung erfolgt im"Linear Mode"mit"Delayed Extraction"". Ein Beispiel für eine Messung eines der erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente (Seq.-ID 1) zeigt Abbildung 3.

Die MALDI-TOF-Massenspektrometrie kann zur Quantifizierung von Peptiden wie z. B. der erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente eingesetzt werden, wenn diese Peptide in einer Konzentration vorliegen, die sich im dynamischen Messbereich des Massenspektrometers befindet, wodurch Detektorsättigung vermieden wird. Dieses ist für die Messung der erfindungsgemäßen proSAAS- Fragmente in Liquor cerebrospinalis bei einer Liquor-Äquivalentkonzentration von 33, 3, ul pro, ul Matrixlösung der Fall. Für jedes Peptid gibt es ein spezifisches Verhältnis zwischen Messsignal und Konzentration, was bedeutet, dass die MALDI-Massenspektrometrie vorzugsweise zur relativen Quantifizierung von Peptiden herangezogen werden kann. Dieser Sachverhalt ist in Abbildung 4 dargestellt. Wird eine Probe mit unterschiedlichen Mengen verschiedener Standard-Peptide versetzt, so kann die Intensität sowohl dieser Standardsignale, als auch der Probensignale ermittelt werden. Beispielhaft zeigt Abbildung 4 eine MALDI-Messung als relativ quantifizierende massenspektroskopische (MS) Methode. Alle Signalintensitäten der Standards wurden auf ihre Signalintensität bei einer Konzentration von 0, 64, uM (= 1) normiert. Jedes Peptid zeigt ein individuelles, typisches Verhältnis von Signalstärke zu Konzentration, was anhand der Steigung der Kurve ablesbar ist.

Beispiel 4 : Massenspektrometrische Identifizierung von proSAAS-Fragmenten Zur Quantifizierung der erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente muss sichergestellt werden, dass es sich bei den zu analysierenden Massensignalen in den Fraktionen, gewonnen durch Reverse-Phase-Chromatographie von Liquor

cerebrospinalis, gemäß Beispiel 2, tatsächlich um die erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente handelt.

Die Identifikation der erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente, in diesen Fraktionen erfolgt z. B. mit nanoSpray-MS/MS [21]. Dabei wird ein proSAAS-lon oder ein proSAAS-Fragment-lon im Massenspektrometer anhand seines spezifischen m/z-Wertes (Masse/Ladung) in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise im Massenspektrometer selektiert. Dieses selektierte Ion wird anschließend durch Zuführung von Kollisionsenergie mit einem Stoßgas, z. B.

Helium oder Stickstoff, fragmentiert und die resultierenden proSAAS-Fragment- Bruchstücke im Massenspektrometer in einer integrierten Analyseneinheit detektiert und korrespondierende m/z-Werte bestimmt (Prinzip der Tandem- Massenspektrometrie) [23]. Das Fragmentierungsverhalten von Peptiden ermöglicht bei einer Massengenauigkeit von z. B. 50ppm eine eindeutige Identifizierung der erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente unter Verwendung von computergestützten Suchverfahren [24] in Sequenzdatenbanken, in die die Sequenz von proSAAS eingetragen wurde. In diesem speziellen Fall erfolgte die massenspektrometrische Analyse mit einem Quadrupol-TOF-Instrument, Modell "QStar-Pulsar"der Firma Applied Biosystems-Sciex, USA. Beispielhafte MS/MS Fragmentspektren sind in Abbildung 5 gezeigt. Um die Auswertung der Fragmentspektren zu vereinfachen wird in der Regel eine sogenannte Dekonvolutierung der Fragmentspektren durchgeführt. Dazu wird die gemessene Masse (m) jedes Fragments durch die Anzahl seiner Ladungen (z) dividiert. Dadurch werden die gemessenen Massen der einzelnen Fragmente in ihre realen Massen umgerechnet, was die Komplexität der Fragmentspektren verringert und ihre Auswertung erleichtert. Ein Fragment mit der Masse 1000 Dalton kann z. B. mit einer und mit zwei Ladungen im Rohdatensatz der Messung vorhanden sein. Für das Fragment mit einer Ladung wird dann eine Masse von 1000 Da und für das zweifach geladene, ansonsten identische Fragment wird jedoch eine Masse von 500 Da gemessen. Teilt man beide Massensignale durch die Anzahl der Ladungen, so haben beide die richtige

Masse von 1000 Da und sie treten nun nur noch als ein homogenes Massensignal mit ihrer realen Masse auf.

Beispiel 5 : Mass@nsioektrometrische Quantifizierung von proSAAS-Fragmenten zum Vergleich ihrer relativen Konzentration in Kontrollproben verglichen mit Patientenproben Nach einer Probenvorbereitung gemäß Beispiel 1 und 2 wurde eine nachgeschaltete MALDI-Messung der erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente gemäß Beispiel 3 durchgeführt. Exemplarische MALDI-Signalintensitäten sind in Form eines"Box-Whisker-Plots"in der Abbildung 6 dargestellt. Die in Abbildung 6 dargestellten"Box-Whisker-Plots"beruhen auf Messwerten, die jeweils anhand von 29 bis 45 Proben von Morbus-Alzheimer-Patienten, bzw. 13 bis 44 Kontrollproben je Messreihe durchgeführt wurden. Insgesamt wurden 4 unabhängige Messreihen im Sinn einer Kreuzvalidierung durchgeführt, wobei die Messreihen jeweils Morbus-Alzheimer-Proben und Kontrollproben beinhalteten.

Die dargestellten"Box-Whisker-Plots"ermöglichen den Vergleich der integrierten MALDI-massenspektrometrischen Signalintensitäten verschiedener proSAAS-Fragmente in Kontrollen, mit den MALDI-Signalintensitäten in Proben von Morbus-Alzheimer-Patienten. Dabei umfasst die"Box", d. h. die Kästen in den Diagrammen in Abbildung 6 jeweils den Bereich der MALDI- Signalintensitäten, in dem sich 50 % der jeweiligen MALDI-Signalintensitäten befinden (= 2. und 3. Quartil), die von der"Box"ausgehenden nach oben und nach unten weisenden Linien ("Whisker") geben den Bereich an, in dem sich jeweils die 25 % der Messwerte befinden, die die höchsten Signalintensitäten aufweisen (oberes Quartil), bzw. in dem sich die 25 % der Messwerte befinden, die die niedrigsten Signalintensitäten aufweisen (unteres Quartil). Die durchgezogene Linie in den Kästen gibt den Medianwert und die gestrichelte Linie in den Kästen gibt den Mittelwert an.

Die Überschriften und Beispiele in diesem Dokument sind lediglich zur Strukturierung des Textes und zur exemplarischen Veranschaulichung

bestimmt. Sie sind nicht dazu bestimmt, die beschriebenen Sachverhalte zu limitieren oder einzuschränken. Alle Beispiele sollen den Erfindungsgedanken näher charakterisieren, sollen jedoch den Äquivalenzbereich der Erfindung nicht eingrenzen.

Falls in dieser Patenschrift ein Begriff nicht eindeutig definiert ist oder dem Fachmann auf dem jeweiligem Fachgebiet nicht bekannt sein sollte oder ein Begriff aus dem Textzusammenhang nicht eindeutig definiert werden kann, so gilt die jeweils in den nachfolgenden Standardwerken genannte Definition des jeweiligen Begriffs. Falls ein Begriff in mehreren der nachfolgend zitierten Werke mit verschiedenen Definitionen aufgeführt wird, so gilt jeweils die Definition, die in dem zuerst in der nachfolgenden Liste aufgeführten Werk genannt wird.

Folgende Publikationen werden zu diesem Zweck zitiert : The Merck Mannual of Diagnosis and Therapy [25] Molecular Cloning-A Laboratory Manual [26] Current Protocols in Immunology [27] Current Protocols in Protein Science [28] Current Protocols in Pharmacology [29] Current Protocols in Cell Biology [30]

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