ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Algunas especies o grupos neutros con un excedente en densidad electrónica presentan carácter nucleofílico. La detección de determinadas especies nucleófilas puede ser de interés. Un ejemplo de este tipo de especies químicas son aquellas que incluyen un grupo tiol, "SH". Los tioles son un grupo de compuestos que se caracterizan por su olor extremadamente desagradable. De hecho, el butanotiol se utiliza como aditivo del gas natural para indicar la presencia de fugas de gas antes de que estas alcancen concentraciones peligrosas. Sin embargo, este grupo de compuestos, también llamados mercaptanos, incluye moléculas de gran importancia bioquímica. Así, los tioles están involucrados en la estructura secundaria de las proteínas, contribuyendo al mantenimiento de su forma mediante la formación de enlaces azufre-azufre entre diferentes aminoácidos. Algunos de los aminoácidos que contienen el grupo tiol son parámetros importantes en el diagnóstico clínico. Por ejemplo, el nivel en plasma de glutanotiona, cisteína y homocisteína está relacionado con diferentes enfermedades humanas como son las enfermedades del SIDA, Alzheimer y Parkinson, así como con enfermedades cardiovasculares. La cisteína, además, es uno de los principales componentes de la proteína keratina que se encuentra en el pelo, plumas y piel. La oxidación suave de la cisteína para formar el enlace disulfuro está directamente relacionada con la forma de estos tejidos.

Durante los últimos años, se ha puesto de manifiesto un creciente interés en el

estudio y desarrollo de nuevos sensores químicos para aniones o especies neutras, con capacidad de emitir una señal macroscópica de tipo óptico. En presencia de las especies químicas a detectar, estos sensores espectroscópicos responden mediante una variación de la fluorescencia (fluoroionóforos) o mediante un cambio en la absorbancia (cromoionóforos). Ejemplos de sensores de aniones de tipo fluorescente son : D. H. Vance et al. J. Am. Chem. Soc., 116 (1994) pág. 9397-9398; G. D. Santis et al., A7zgew. Chem.

Int. Ed. Eslgl., 35 (1996) pág. 202; M. T. Albelda et al., J. Chem. Soe. Perkiii Trans, 2 (1999) pág. 2545-2549; R. Prohens et al., Chem. Commun., 2001 pág. 1456; M. E.

Padilla-Tosta et al, Eur. J Iíiorg. Chem., 2001 pág. 1221-1226 ; y de sensores colorimétricos de aniones : S. Watanabe et al., J. X. Chem. Soc., 120 (1998) pág. 229- 230; K. Niilcura et al., J. Am. Chem. Soc., 120 (1998) pág. 8533-8534; J. J. Lavigne, E. V.

Anslyn, Ange. Chem. Int. Ed., 38 (1999) pág. 3666-3669; P. Anzenbacher, Jr. et al., Ana.

Chem. Soc., 122 (2000) pág. 10268-10272; F. Sancenón et al., Angew. Chem. Int. Ed., 40 (2001) pág. 2640-2643. Entre todos los sensores desarrollados, son de especial interés los basados en cambios de la absorbancia de radiación visible puesto que, de esta forma, la presencia de las especies químicas a detectar puede ser fácilmente reconocible a través de un simple cambio de color.

La detección de tioles mediante métodos colorimétricos o por fluorescencia ha sido muy poco estudiada, tan solo se han descrito algunos ensayos que presentan escasa selectividad. Por ejemplo, D. R. Grasetti et al en J. of Cromatography, 41, (1969), pag 121 presenta un método para la detección de tioles basado en la combinación de la técnica de cromatografia de papel con un indicador selectivo, sin embargo este método presenta algunos interferentes como son el NaHS03 y el Na2S203. En otra publicación algo más reciente, H. Takashashi et al. en Agricultural and Biol.. Chem., 40, (1976) 2493, proponen la utilización de un reactivo para la detección de tioles y disulfuros mediante fluorescencia. A. Neal et al en Nature 406, (2000), pag. 710, plantean una aproximación más novedosa, la utilización de una serie de diferentes sensores montados en conjunto que son capaces de detectar olores, entre ellos los tioles. Quizá mayor atención se le ha prestado a la detección de los tioles asociados con aminoácidos, sin embargo en este caso la mayoría de los métodos desarrollados están relacionados con procedimientos instrumentales que exigen una implementación técnica importante como son cromatografía de gases, cromatografia de líquidos de alta resolución, espectroscopía de

masas o resonancia magnética nuclear. Un conjunto importante de métodos instrumentales desarrollados para la detección de aminoácidos que contienen el grupo tiol como la cisteína, están basados en la capacidad de este grupo de ser oxidado : Electrochemical detection of tiols with a coenzyme pyrroloquinoline quinone modified electrode", T. Imone et al, Anal. Chem., 72, (2000), pág. 5755;"Lead phatolocyanine as a selective carrier for preparation of cysteine-selective electrode", Ch.-F-Chow et al. Anal.

Chem., 73, (2001), pág. 5972 ;"Voltametric sensing of tiols. The electrocatalytic oxidation of 4-acetamidophenol in the presence of cystéine : a mechanistic rotating disk electrode study. "B. A. Brookes et al, J. Phys. Chem. B, 105, (2001), pág. 6361; "Preparation of multi carbon nabotubes film modified electrode and its application to simultaneous determination of oxidizable amino acids in ion cromatography"N. A.

Rakow et al, Talanta 60, (2003), pag 1123;"Cobalt (II)-salophen-modified carbon-paste electrode for potentiometric and voltametric determination of cysteine", M. K. Amini et al, Anal. Biochem., 320, (2003), pag. 32; Renewable sol-gel carbon ceramic electrodcs modified with a pre-complex for the amperometric electrón of L-cystein and gluthatione", A. Salini et al., Talanta 60, (2003), pag. 205.

El diseño de nuevos sensores químicos se ha abordado desde diferentes enfoques.

En la mayoría de los casos, el proceso implica la unión de una molécula capaz de enlazar con el/los aniones a detectar, con otra molécula que genera la correspondiente seña) macroscópica, bien sea por fluorescencia o por cambio de absorción. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la señal óptica es solamente observable en disolventes no acuosos como por ejemplo cloroformo o acetonitrilo, y son menos los ejemplos de sensores químicos para especies neutras que sean capaces de trabajar en medio acuoso. Un enfoque alternativo es la utilización de reacciones específicas producidas por las especies que se desea detectar, convenientemente acopladas con un proceso simultáneo que dé lugar a una señal macroscópicamente medible. Por ejemplo, entre los avances más recientes Ch.-F, Chow et al en J. Am. Chem. Soc., 125, (2003) pág. 7802-7803, proponen un método para la detección de aminoácidos que contienen el grupo tiol basado en la ruptura de un complejo trinuclear heterobimetálico de rutenio y platino : el grupo tiol coordina a los centros platino dejando el complejo de rutenio libre con lo que se produce un aumento de la fluorescencia. El inconveniente de este método es la necesidad de implementar el instrumental necesario para producir y medir el proceso de fluorescencia en el que se basa

la detección.

Así pues, la invención se enfrenta, en general, con el problema de proporcionar un método alternativo para la detección de nucleófilos como son los tioles, en medio acuoso, que sea fácilmente aplicable sin que sea necesaria la implementación de un instrumental sofisticado.

La solución proporcionada por esta invención se basa en la observación por parte de los inventores de que, una vez se ha conseguido la solubilización en agua de las escuaridinas de la invención (a partir de ahora reactivos de la invención), estos son capaces de sufrir una decoloración en presencia de moléculas conteniendo el grupo tiol debido a que contienen un anillo cargado positivamente. Los autores también han observado que modificando el pH del medio se puede conseguir que estos reactivos respondan de forma selectiva a estas moléculas que contienen el grupo tiol.

Las escuaridinas se han utilizado en numerosas aplicaciones pero nunca como reactivos para la detección y determinación de especies neutras debido a su baja solubilidad en agua. Para evitar este gran inconveniente en la presente invención se plantea la preparación de una familia de reactivos funcionalizados con grupos polares obteniéndose de esta forma moléculas con una solubilidad en agua o mezclas de agua con disolventes orgánicos adecuada.

OBJETO DE LA INVENCIÓN En primer lugar, la presente invención tiene por objeto proporcionar unos reactivos (reactivos de la invención) derivados de sales de la escuaridina con formula general (I) :

así como el procedimiento para su preparación.

Dentro del objeto de la presente solicitud se encuentra también el uso de los mencionados compuestos de fórmula general I para la detección y/o cuantificación de tioles en medio acuoso.

Otro objeto adicional, de la presente solicitud es proporcionar un método para detectar tioles en un medio acuoso que comprende poner en contacto la disolución de la especie a detectar con una disolución de alguno de los reactivos de la invención que, al reaccionar, tienen la capacidad de proporcionar una señal o evento macroscópicamente observable y medible en disolución (cambio de color). La aparición de dicho evento es indicativa de la presencia de tioles en dicha disolución ensayada. Opcionalmente, el método de la invención pennite, por medio de un sistema-óptico, calcular la concentración de la citada especie en dicha disolución ensayada por inteipolación en una curva de calibrado. Un método como el proporcionado por esta invención permite detectar y si se desea cuantificar, la presencia de tioles en un medio acuoso, de fonna rápida, sencilla y reproducible.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el esquema de reacción del reactivo 1.

La Figura 2 es una gráfica que muestra la respuesta obtenida mediante la utilización de una disolución 1.21 x 10-5 M del reactivo II en función de la concentración de cisteína, medida como el logaritmo de la absorbancia en el máximo de la banda (k = 641 nm) que presenta la disolución final resultante.

La Figura 3 muestra el espectro de UV-Vis del reactivo II en mezclas agua- disolvente orgánico a una concentración de 6.05 x 10-5 M en presencia de 10 equivalentes de diversos aminoácidos. Se observa que sólo hay decoloración apreciable en presencia de cisteína.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la invención se relaciona con un conjunto de compuestos derivados de la escuaridina capaces de detectar selectivamente la presencia de determinados nucleófilos en un medio acuoso. Concretamente, estos reactivos para la detección selectiva de determinadas especies químicas de carácter nucleofilico en agua o mezclas de agua/disolvente orgánico responden a la fórmula general I :

en donde R1 representa cadenas alquílicas cerradas o abiertas C2-C10 que pueden contener o no heteroátomos como son O, N y S; y R2 y R3, iguales o diferentes, representan grupos orgánicos pequeños tales como hidrógeno, ácidos carboxílicos (- COOH) o sulfónicos (-SO3H), grupos nitro (-NO3), bases como aminas primarias, secundarias o terciarias, o grupos aromáticos como los fenilos, caracterizados por sufrir un cambio de color en presencia de la especie química a detectar. La finalidad principal de los grupos Rl, R2 y R3 es aumentar la solubilidad en agua.

Los compuestos de fórmula general I tienen la particularidad de poseer grupos especialmente electrófilos (deficientes en carga electrónica) de forma que dan reacciones químicas en determinadas condiciones con ciertos nucleófilos como los tioles produciendo cambios de color.

En una realización particular y preferida, uno de los reactivos de la invención posee la formula II :

Otro aspecto de la invención se refiere al procedimiento de obtención de los reactivos de formula general I que comprende : a) hacer reaccionar un derivado mesilado grupo orgánico R, que se desee introducir en el reactivo I, con la N-fenildietanolamina, b) hacer reaccionar la anilina resultante de la etapa anterior con el ácido escuárico.

Una realización particular para obtener los reactivos de fórmula general II comprende : a) hacer reaccionar un derivado mesilado del 2-(2-metoxietoxi) etanol con la N-fenildietanolamina, b) hacer reaccionar la N, N-dietil 2- [2- (metoxietoxi) etoxi] anilina resultante de la etapa anterior con ácido escuárico.

La etapa b) se lleva a cabo añadiendo dos equivalentes de esta anilina por cada equivalente del ácido escuárico, dando lugar a la obtención del reactivo II.

Un tercer aspecto de la invención hace referencia al uso de los reactivos de la invención para la detección de especies nucleofflicas preferentemente tioles en disoluciones acuosas o mezclas agua/disolvente orgánico. Como ejemplo de tiol se puede señalar la cisteína. Una realización particular de la invención supone el uso de los reactivos de la invención incorporados sobre soportes sólidos que pueden ser materiales poliméricos o soportes inorgánicos y que en contacto con disoluciones acuosas que contienen el nucleófilo a detectar, dan una señal macroscópicamente observable y medible.

En un último aspecto la invención se relaciona con un método para la detección de nucleófilos en un medio acuoso o en mezclas disolvente orgánico-agua, en adelante método de la invención, que comprende las siguientes etapas : a) preparar una disolución de uno de los reactivos de la reivindicación 1, b) selección del pH de trabajo

c) mezclar la disolución a ensayar que contiene el nucleófilo con la disolución preparada en la etapa a), d) medir la señal macroscópica producida y, opcionalmente, cuantificar dicha señal por interpolación en una curva de calibrado.

La disolución de la etapa a) se obtiene preferiblemente solubilizando uno de los reactivos de la invención en un disolvente preferiblemente acetonitrilo, La elección del pH es una parte fundamental del método de la invención ya que, en primer lugar, está relacionado con la estabilidad del reactivo y, por otra, puede permitir la detección selectiva de ciertos nucleófilos en disolución acuosa en presencia de otras especies químicas. En la siguiente tabla viene detallado el pH necesario para la detección selectiva de tioles en disolución acuosa : Escuaridinas Rango de estabilidad del reactivo 3 < pH < 11 Selectividad frente a tioles pH<8. 6 La mezcla resultante de poner en contacto la disolución acuosa que contiene el nucleófilo con la disolución que contiene el reactivo selectivo al nucleófilo se homogeniza, se introduce en una celda de medida de un sistema óptico y se mide.

Para la elaboración de la curva de calibrado que relaciona la concentración de la especie química a detectar (nucleófilo) con el valor de la señal macroscópicamente observable y medible, la disolución del reactivo selectivo se distribuye en alícuotas y sobre ellas se añaden unas disoluciones patrón del nucleófilo, normalmente preparadas en agua aunque podría utilizarse otros medios como disolventes orgánicos o mezclas de estos con agua. Las disoluciones patrón del nucleófilo se preparan disolviendo cantidades conocidas del nucleófilo en volúmenes conocidos del disolvente correspondiente. La medida de la señal macroscópica que se produce en las disoluciones resultantes de adicionar las disoluciones patrón del nucleófilo sobre dichas alícuotas preparadas a partir de dicha disolución del reactivo selectivo proporciona los distintos puntos de calibrado.

En una realización concreta del método de la invención (véase el Ejemplo 3), este se basa en la decoloración que produce el ataque nucleofflico del aminoácido cisteína sobre una escuaridina funcionalizada (reactivo II). El color de la escuaridina

funcionalizada se debe a una banda de transferencia de carga desde los grupos dadores anilinio hasta el grupo aceptor que es el anillo de cuatro miembros típico de las escuaridinas. Cuando la molécula que contiene el grupo tiol (cisteína) está presente, esta ataca al anillo de escuaridina con lo que desaparece la deslocalización electrónica, dando lugar a la desaparición del color asociado a la transición antes mencionada.

El método de la invención puede ser implementado en un equipo de medida rápida que comprende un dispositivo mecánico que permita la reacción entre el reactivo selectivo y la especie a determinar presente en la disolución problema y el cálculo de su concentración por comparación con un patrón de concentraciones. En una realización particular, el método de la invención se puede implementar en forma de tiras o bandas para ensayos analíticos soportando. los reactivos en sólidos adecuados como polímeros o matrices silíceas.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

EJEMPLO 1 Obtención del reactivo II La obtención del reactivo II se lleva a cabo mediante dos etapas ftndamentales : en primer lugar se prepara la N, N-di (etil 2- (2 (2-metoxietoxi) etoxi) anilina y posteriormente se hace reaccionar esta con el ácido escuárico para formar la escuaridina correspondiente que hemos nombrado como II.

Inicialmente, se obtiene el derivado mesilado del 2- (2-metoxietoxi) etanol mediante tratamiento de este último con cloruro de mesilo. 11, 9mL (0,1 mol) de 2- (2- metoxietoxi) etanol se disuelven en 150 mL de diclorometano (CH2Cl2) y se coloca la mezcla en un baño de hielo. Se añade a esta mezcla el cloruro de mesilo (9,29 mL, 0, 12 mol) disuelto en 30 mL de diclorometano, gota a gota durante 30 minutos, y se deja reposar en el baño de hielo durante 10 minutos y, a temperatura ambiente, 24 horas más.

A continuación, la disolución se vierte sobre una mezcla que contiene 100 mL de agua, 80 mL de hielo y 40 mL de HC1 (37%). Se realiza la extracción, se recoge la fase orgánica y esta se lava con disolución saturada de NaCl en H2O y se seca con MgSO4 anhidro.

Por otra parte, se disuelve la N-fenildietanolamina (3,63 g, 0,02 mol) en 70 mL de acetonitrilo y se añade hidruro sódico (1,2 g, 0,05 mol) durante 30 minutos. Sobre la

suspensión formada se añade el derivado mesilado del 2- (2-metoxietoxi) etanol obtenido previamente disuelto en 20 mL de acetonitrilo y se mantiene a reflujo durante 24 horas.

La mezcla se filtra y se concentra, y el concentrado se purifica mediante cromatografia de columna, utilizando alúmina como fase estacionaria y diclorometano como fase móvil.

Por último, se disuelve el derivado de la anilina obtenido en el apartado anterior (1, 155 g, 3 mmol) y el ácido escuárico (157, 3 mg, 1, 37 mmol) en 20 mL de una mezcla 2 : 1 tolueno : butanol, se calienta a ebullición durante 7 horas, eliminando aceotrópicamente el agua formada en la reacción. Se deja enfriar la disolución y una vez fría se le añade hexano y el sólido que precipita se separa por filtración y se lava con hexano.

EJEMPLO 2 Determinación de cisteína mediante colorimetría utilizando el reactivo selectivo II del Ejemplo 1 Se prepara una disolución de concentración 6,05 x 10-5 M del reactivo II en acetonitrilo.

Por otra parte, se preparan distintas disoluciones acuosas de cisteína, con cantidades conocidas de cisteína dentro del intervalo de concentración comprendido entre O y 35 (x 10-5) M todas ellas tamponadas a pH = 6 utilizando una disolución 0, 01M ácido 2- [N-morfolino] etanosulfónico (MES).

Se mezclan ocho partes de cada una de las disoluciones de cisteína patrón con dos partes de la disolución del reactivo selectivo II, se homogeneizan mediante agitación y las disoluciones resultantes se introducen en el espectrofotómetro y se mide la absorbancia de cada una a 641 nm.

La respuesta obtenida para las diferentes concentraciones de cisteina se muestra en la Figura 2. De la misma forma, ocho partes de la disolución acuosa conteniendo cisteína que se desea detenninar se mezclan con dos partes de la disolución del reactivo selectivo II. Se opera de la misma forma que para la preparación de los puntos de la curva de calibrado y se calcula la concentración en cisteína buscada por interpolación en la curva de calibrado obtenida anteriormente.

La Figura 3 muestra el espectro de UV-Vis de II en mezclas agua-disolvente orgánico (acetonitrilo) en presencia de aminoácidos, observándose la respuesta selectiva a la cisteína.