La présente invention concerne un procédé pour déterminer, qualitativement, le cas échéant quantitativement, les origines bio- et/ou techno-synthétiques de substances organiques. En effet, pour des substances organiques de toutes sortes, l'indication de leur origine peut être d'une grande importance, notamment dans les domaines de la chimie, de la biologie, de la chimie alimentaire, de la médecine, de la pharmacologie et dans tous les autres domaines où il importe d'élucider l'origine de ladite substance.

Les quelques procédés connus pour la détermination de l'origine de substances organiques sont généralement basés sur la mise en évidence d'un ou de plusieurs produits secondaires ou d'impu¬ retés qui accompagnent de manière caractéristique la substance orga- nique considérée en fonction de son' mode de synthèse. La possibilité d'éliminer ou d'a outer un tel produit indicateur/marqueur, chimiquement différent de la substance à examiner, entraîne l'inconvénient de pouvoir fausser le résultat d'une éventuelle analyse dans le sens souhaité. En conséquence, une analyse à l'abri de toute falsifi¬ cation ne peut être effectuée que directement sur la substance elle- même, à l'état chimiquement pur. Une substance pure est représentée par sa formule chimique structurale qui est identique pour un compost? donné, quelle que soit son origine : biologique, technique ou mixte. II convient donc de rechercher des différences caractéristiques et reproductibles â l'intérieur de l'identité chimique, c'est-à-dire d'utiliser le fait que la formule chimique structurale n'est qu'une approximation de la réalité moléculaire qui couvre en effet des structures isotopiques différentes. On sait en effet que, pour une substance donnée, il existe dans le cadre de sa forme structurale plusieurs espèces isotopiques dénommées couramment "isotopomères". Leur nombre croît rapidement avec la complexité de la molécule. A titre d'exemple,- on indique ci-après l'isotopie carbone-13/carbone-12 pour l'acide acétique :

taux isotopique global

13 = % ₀ C dans la molécule e

®

13 12

CH ₃ - " C00H 13 12. isotopomères C + % M + 1

12 13 CH ₃ - C00H

2 χ ¹³ C % M + 2

13 taux isotopique positionnel = % _a C

On définit ainsi, aussi bien pour ce cas particulier que de manière générale, 4 paramètres d'identification isotopiqueτ a. Le taux isotopique global (a) qui correspond ici à l'abondance moyenne du carbone-13 dans les 2 positions possibles. b. Les groupes de masse dans lesquels on trouve la somme des concentrations des isotopomères présentant une masse iden¬ tique, mais une répartition isotopique différente. c. Le taux isotopique position par position. Il existe autant de taux isotopiques positionnais (c) que de nombre de positions non équivalentes N susceptibles d'une substitution isotopique. Dans le

12 13 cas de l'acide acétique C C est égale à 2. d. Les espèces à identité isotopique également dénommées isotopomères. L'isotopomère constitue le véritable corps chimique

N élémentaire. Il y a 2 isotopomères lorsqu'il y a N positions non équivalentes, et 2 (N'+l) ... lorsqu'il y a en plus N' positions équivalentes, et ainsi de suite. Ainsi, le nombre des isotopomères pour l'acétate de sodium est 2 =4 par rapport à l'isotopie carbone-13/ carbone-12, 3+1=4 par rapport audeuterium/protium. Leur nombre total par rapport aux atomes de carbone et d'hydrogène est donc de 16. L'étude des isotopomères a déjà fait l'objet de nombreux travaux qui ont été effectués en milieu hautement enrichi.

OMP

A cet effet, on peut citer les références ci-après concernant, d'une part, les -travaux en milieu hautement enrichi relatifs au deuterium : (E. BENGSCH, M. CORVAL, Préparation de l'éthanol deutérié Oi-DCH-OH. Bull. Soc. Chim. France 1963, 1867-68 - E. BENGSCH. Préparation de quelques homologues isotopiques de l'éthanol. Etude physico-chimique des conditions de leur synthèse et de leur purification. Diplδme d'Etudes Supérieures. Faculté des Sciences de Paris, mai 1966 - E. BENGSCH. Préparation et analyse spectroscopique des espèces iso¬ top ^r iques deutériées de l'éthanol C2„H5--nDnOH. Bull Soc. Chim. France 4B, 1971, 15 - E. BENGSCH. Isotopieeffekte in der Protonen- und

Deuteronenresonanz der deuterierten Homologen des Athanols. Comptes- Rendus de l'Assemblée de la Société Chimique de la R.F.A., septembre 1971, p. 171-2 - E. BENGSCH. Contribution à l'étude de la molécule d'éthanol par résonance magnétique nucléaire. Deutériat on et analyse positionnelle. Résonance*du proton et du deuton. Effets d'isotopie. Doctorat d'Etat, Université de Paris VI, juin 1972 - E. BENGSCH, M. CORVAL, M. DELEAUMONY. Préparation des éthanols deutériés C 2H5_-nDnOH. Bull. Soc. Chim. France, 1973, ' 1788-93 -

E. BENGSCH. Résonance magnétique Nucléaire du proton et du carbone-13 effets d'isotopie observés avec les méthanols deutériés. Actualité chimique, 1973, n°4, 100 - E. BENGSCH, M. CORVAL, G.L. MARTIN.

Analyse isotopique de mélanges d'éthanols deutériés C H_ H OH.

- 5-n n

Organic Magnetic Résonance _, 1974, 195-9); d'autre part, les travaux en milieu hautement enrichi relatifs au carbone-13 sont : (E. BENGSCH, M. PTA . Analyse des spectres RMN du carbone-13 pour quelques acides aminés enrichis et les peptides correspondants. Dans "Stable Isotopes in the Life Sciences". Agence Internationale à l'Energie Atomique I.A.E.A., Vienne, Autriche, 1977, p. 197-206 - E. BENGSCH,

J.-Ph. GRIVET, H.R. SCHULTEN. Non-statistical label distribution in biosynthesis 13C enriched amino acids. 9e Conférence Internationale de RMN dans les Systèmes Biologiques, 1-6 septembre 1980, Bendor/

Marseille - ..E. BENGSCH, J.-Ph.GRIVET, H.R. SCHULTEN. Non-statistical label distribution in bio-synthetic enriched amino acids. Z. Naturf.

36b. 1981, 1989-1996 - E. BENGSCH, J.-Ph.GRIVET, H.R. SCHULTEN Inter - and Intramolecular isotopic heterogeneity in biosynthetic 13C

- enriched amino acids dans Analytical Chemistry Symposium Séries

"Stable Isotopes" vol. 11, p. 587-92 édité par H.L. Sch idt, H. FBrstel, K. Heinzinger Elsevier Amsterdam, Oxford, New York 1982.

En ce qui concerne les molécules biologiques, il est connu que la répartition globale et positionnelle des isotopes n'est ni statistique ni uniforme (H.L. SCHMIDT et F.J. WINKLER dans Ber.

Deutsch Bot. Ges. 92_, 1979, p. 185-191 et H. ZIEGLER dans Ber. Deutsch Bot. Ges. __. 1979, p. 169-184). Elle varie au contraire en fonction des perturbations des conditions intracellulaires du fait que les systèmes enzymatiques de la matière vivante préfèrent plus ou moins l'isotope naturel majoritaire, c'est-à-dire le carbone-12 au carbone-13, le protium au deuterium, etc. Il en résulte pour les substances biolo¬ giques une discrimination en isotope lourd, créée avant tout par quelques réactions clefs de la photosynthèse. Cette discrimination se maintient essentiellement à travers le métabolisme secondaire, le cas échéant également à travers la chaîne alimentaire plante-herbivore- carnivore, de telle sorte que l'on peut espérer remonter à l'origine végétale, c'est-à-dire photosynthétique d'une substance donnée, lorsqu'on réussit à :

1. déterminer un nombre suffisant de paramètres isoto- piques a, b, c, d;

2. systématiser, malgré la complexité des flux métaboliques, le phénomène de la répartition isotopique, c'est-à-dire se baser sur des standards reproductibles et prévisibles.

On a constaté notamment que, dans une molécule donnée, les groupes à caractère hydrophile, tels que par exemple -COOH,—CH OH avec n =0, 1 ou 2, et/ou les groupes facilement recyclables pendant le métabolisme, tels que par exemple le groupe -COOH,sont enrichis en isotope lourd par rapport à la teneur isotopique moyenne de la molécule, alors que les groupes hydrophobes, tels que par exemple -CH, ou -CH„-, sont appauvris en isotope lourd.

Au contraire, pour une substance organique obtenue par synthèse technique, la répartition en Isotopes est différente et tend à être homogène, car les procédés de synthèse fonctionnent avec des rendements proches de 100%. Ils évitent la ramification du flux de la matière; la totalité de celle-ci ou presque est convertie, les compositions isotopiques initiales et finales des fractions

OM ^~

moléculaires impliquées dans la réaction sont très proches..Les cas de disproportions isotopiques rencontrés dans les procédés de synthèse sont limités à quelques positions et prévisibles en fonction du procédé de synthèse utilisé. II en résulte que les caractéristiques isotopiques d'une substance donnée devraient permettre d'identifier l'origine de celle-ci.

On a déjà proposé de déterminer l'origine d'une substance organique par mesure, en abondance naturelle, du taux iso- topique positionnel du deuterium.par résonance magnétique nucléaire. A cet effet, on peut citer l'article de G.J. MARTIN et M.L. MARTIN paru dans Tetrahedron Letters vol. 22, n ^c 36, p. 3525-3528, 1981. Cependant, étant donné que l'eau lourde est un produit industriel bon marché, on peut par son adjonction fausser le cas échéant le résultat d'une telle détermination dans un sens souhaité. De plus, une telle détermination peut parfois n'être significative que de l'environnement de la substance à examiner, ce qui permet alors de définir plutôt les conditions climatiques de sa biosynthèse, sa provenance géographique et d'autres facteurs liés au milieu aqueux des biosynthèses. En effet, on a constaté que, par exemple, l'alcool éthylique présente, en fonction de son origine, des modifications assez spectaculaires de son taux de deuterium. Cependant, il s'est avéré que ces modifications sont extrêmement sensibles aux facteurs d'environnement définis ci-dessus.et à la morphologie de la plante, ' de telle sorte qu'elles ne peuvent pas dans tous les cas servir d'unique critère pour déterminer l'origine biologique et/ou synthé¬ tique d'un alcool.

Il est donc nécessaire de déterminer d'autres caracté¬ ristiques isotopiques significatives de l'origine bio- et/ou techno- synthétique d'une substance, par exemple d'un alcool.

Jusqu'à présent, il n'a été possible de déterminer, en abondance naturelle pour le carbone-13, que le taux isotopique global (a) (par combustion totale de la molécule) et, de manière précaire et incertaine, les groupes de masse (b). Par ailleurs, on a tenté de déterminer les facteurs (c) et (d) selon la technique, comprenant des dégradations chimiques quantitatives, la combustion

des fragments recueillis à l'état pur et sans perte et la spectro- étrie dé masse des produits de combustion (C0-, H_0). Cette technique est très longue à réaliser, limitée à quelques composés particuliers très simples et elle est peu fiable car elle exige des réactions chimiques susceptibles d'entraîner elles-mêmes un frac¬ tionnement isotopique.

On a maintenant trouvé un nouveau procédé pour déterminer qualitativement et/ou quantitativement l'origine d'une substance organique donnée, qui consiste à déterminer la répartition isotopique positionnelle d'au moins un isotope léger, stable et magnétiquement actif autre que le deuterium par résonance magnétique nucléaire quantitative. Sous son aspect général, le procédé de l'invention consiste à enregistrer par résonance magnétique nucléaire quantitative par transformée de Fourier, dans des condi- tions assurant une sensibilité suffisante et une parfaire propor¬ tionnalité entre le nombre de noyaux résonnants et l'amplitude du signal, les spectres des noyaux concernés, en particulier ceux du carbone-13, à calculer la surface des différentes raies et à comparer ces surfaces par rapport à la moyenne desdites surfaces. Le procédé de l'invention rend accessibles de façon inattendue les paramètres (c) et (d) définis ci-dessus, en abondance naturelle, malgré les préjugés techniques existants notamment pour le carbone-13 selon lesquels :

1. on ne pouvait pas réaliser par RMN, en particulier du carbone-13, une analyse quantitative assez précise pour déceler les différences des abondances isotopiques naturelles, telles qu'elles résultent de la faible sélectivité d'une séquence de réactions chimi¬ ques et-biologiques ;

2. si cela s ¹ était avéré possible pour quelquescas exceptionnels et en milieu enrichi, il était impensable jusqu'à présent d'effectuer la même détermination sur des composés présen¬ tant seulement une abondance naturelle, par exemple en carbone-13;

3. les éventuelles règles trouvées pour la répartition intramoléculaire (c) systématique des isotopes dans les biomolécules, règles établies pour les milieux enrichis, ne sont pas transposables aux composés formés sous conditions d'abondance isotopique naturelle.

OMPI

L'exploitation quantitative du spectre R.M.N. de la substance ^* à examiner peut être effectuée par planimétrie; par inté¬ gration automatique et/ou par simulation spectrale itérative,. c'est-à- dire en modifiant pour chaque isαtopomêre contribuant au spectre global 5 et dont on connaît les paramètres spectroscopiques, son poids jusqu'à ce que les spectres calculés deviennent identiques aux spectres enregistrés.

Selon un autre mode de réalisation, on peut avantageu¬ sement procéder à une mesure différentielle par rapport à une posi¬ tion donnée dans la molécule prise comme référence isotopique interne.

10 Un autre mode de réalisation consiste dans l'enregis¬ trement, dans des conditions identiques, des spectres en module. Ce mode de réalisation accentue la faible différence qui existe entre les différents signaux, c'est-à-dire que les pics les plus faibles sont diminués et les pics les plus grands sont relativement augmentés,

15 de telle sorte qu'on peut qualitativement reconnaître plus facilement les positions enrichies ou appauvries en carbone-13 sans intégration. L'exploitation quantitative de l'isotopie intra olécu- laire réalisée selon l'invention peut être avantageusement complétée par la détermination des groupes à masse égale (b) par spectrométrie

20 de masse, de préférence à désorption par champ, méthode sans fragmen¬ tation des molécules et de ce fait particulièrement apte à des déterminations isotopiques quantitatives. Cette méthode qui utilise de préférence la cationisation à l'aide d'un métal mono-isotopiq e comme le sodium convient particulièrement aux molécules biologiques

25 qui sont dans la plupart des cas des molécules polaires peu volatiles et sujettes à fragmentation et le cas échéant relativement compli¬ quées; les méthodes classiques de la spectrométrie de masse ne laissent espérer aucun résultat pour ce type de molécules. L'obten¬ tion simple, rapide et précise des valeurs pour les groupes de masse

30 (paramètres a et b définis précédemment") est assurée par l'utilisation d'un enregistreur permettant l'accumulation de spectres ( .D. LEHMANN, H.R. SCHULTEN. Quantitative Feld désorption - Massenspektroskopie VI,

Z.Anal. Chem. 289, 1978, 11-16 - H.M. SCHIEBEL, H.R. SCHULTEN. Depletion

13 of Carbon in the Biosynthesis of Vita in B-_. Natur issenschaften 67,

35 1980, 256-257). En outre, cette méthode a l'avantage de n'exiger que quelques microgrammes de substances.

Ainsi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, on combine, pour déterminer l'origine bio- et/ou techno-synthétique d'une substance organique, la résonance magnétique nucléaire quantitative et la spectrométrie de masse, de préférence à désorption par champ. Dans ce cas, les intensités positionnelles déterminées selon l'invention peuvent être exprimées en taux absolus de carbone.

Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, la substance à examiner doit être en solution relativement concentrée. L'asservissement champ-fréquence est réalisé soit sur la résonance deutonique du solvant, si celui-ci est disponible sous forme deutériée (D„0, CDC1- ou similaires), soit sur une substance deutériée miscible au mélange solvant/substance à examiner, soit sur un corps de référence placé dans un tube coaxlal. On indiquera ci-après les conditions particulièrement préférées pour l'enregistrement par R.M.N. des spectres des substances à examiner, qui assurent une sensibilité suffisante et une parfaite proportionnalité entre le nombre de noyaux résonnants et l'amplitude du signal : - l'angle de nutation est de 90°,

- le nombre de passages accumulés doit être compris entre 100 et 50000, de préférence entre 5 000 et 20000, avanta¬ geusement de 5000,

- la résolution numérique doit être comprise entre 0,8 et 0,05 Hz/point, de préférence 0,1 à 0,2..

La digitalisation du signal doit être réalisée avec- soin. Si le nombre de points par hertz est trop faible, les aires mesurées pour les raies fines sont sous-évaluées, ce qui fausse ainsi l'analyse Isotopique. Pour éviter cet inconvénient, on doit soit : a) comparer préféreπtiellement des largeurs semblables, b) choisir une résolution numérique telle que la raie la plus fine soit représentée par au moins 10 points, c) choisir un algorithme d'intégration tel que l'erreur de troncation soit Inférieure à 0,5%,

d) rendre toutes les largeurs pratiquement semblables soit par une multiplication exponentielle du signal avant la transformée de Fourier, soit par addition à l'échantillon d'un agent relaxant.

On réalise un découplage total des protons. Pour éviter toute altération du résultat par des effets d'isotopie sur l'effet nucléaire OVERHAUSER, on supprime ce dernier par la méthode de l'irradiation alternée décrite par R. FREEDMAN, H.D. HILL et R. KAPTEIN (Proton-Decoupled NMR Spectra of Carbon-13 with the Nuclear OVERHAUSER Effect Suppressed. J. Magn. Res. _. 1972, 327-329). Pour assurer le rétablissement quasi parfait de l'équi¬ libre de BOLTZMANN après chaque irradiation, on observe après chaque passage un temps d'attente T_ qui correspond à 10 fois lestemps de relaxation T peu différent de T. du noyau le plus lent.

Afin de réduire les temps de relaxation du carbone-13 à des valeurs de l'ordre d'une seconde, on ajoute des agents relaxants connus tels que, par exemple, le trichlorure de gadolinium. Quand l'échantillon ne doit pas être contaminé par des ions paramagnétiques, il faut accepter une durée d'enregistrement plus longue pouvant atteindre plusieurs jours lorsqu'on veut tenir compte descarbones quaternaires.

En cas de superposition des signaux à analyser ou lorsqu'on veut déterminer des isotopomères (paramètres d), on procède à des simulations spectrales (programmes BRUKER IIR CAL et LAOCOON 4 B) en modifiant itérativement la contribution qu'apporte chaque espèce isotopique au spectre global, le cas échéant à l'aide d'une plani- étrie différentielle entre les spectres expérimentaux et simulés jusqu'à ce qu'il y ait identité. Pour ce faire, il faut tenir compte des paramètres R.M.N. : positions des signaux, les largeurs des raies, le cas échéant des couplages et des effets d'isotopie sur ces paramètres.

En général, les signaux du carbone-13 sont relativement espacés et certains spectro ètres de R.M.N. ne possèdent pas une caractéristique d'intensité (courbe de réponse) rigoureusement identique sur toute la largeur du spectre dans le domaine de fréquences utilisées . En général, cette courbe de réponse est principalement déterminée par les caractéristiques du filtre

passe-bas utilisé avant le convertisseur analogue numérique . On peut s ' affranchir en partie de cet effet en choisissant une bande passante bien supérieure , par exemple trois fois supérieure à la largeur spec¬ trale intéressante. Cependant, ceci entraîne une diminution importante du rapport signal/bruit , donc de la sensibilité.

On peut partiellement parvenir à éliminer cette source d'erreur en enregistrant les spectres des composés biologiques et techniques à comparer dans des conditions rigoureusement identiques .

Cependant, le moyen idéal pour palier cet inconvénient con- siste à calibrer -le spectro ètre avec un tube de calibrage contenant un mélange défini de composés qui ne produisent chacun qu'une seule raie en R.M.N. pour un isotope donné et dont on connaît pour chacun la teneur Isotopique globale . Ce tube de calibrage consitute un autre objet de l' invention. Les composés constituant le mélange de calibrage sont pour la R.M.N. du carbone-13 des composés à carbones équivalents , tous mis¬ cibles entre eux dans des proportions données, stables , inertes les uns par rapport aux autres et décomposàbles par combustion.

Le mélange de calibrage préféré est un mélange de composés en quantités sens iblement égales en carbone- 13 , dont les raies sont es- pacées sur toute la largeur du spectre de façon relativement régulière .

A titre d'exemples de mélanges de calibrages appropriés aux fins de l ' invention, on citera le mélange dans l 'eau lourde des composés suivants pour lesquels on a indiqué entre paranthêses la position relati ve de leur signal par rapport au diméthylsulfoxyde exprimée en ppm et comptée positivement vers les champs faibles .

- thiocyanate de sodium NaSCN (+ 100 ppm)

- urée NH ₂ CO H ₂ (+ 70 ppm)

- diméthylsulfoxyde (CH_) ₂ SO

- glycol (CH ₂ 0H) ₂ (- 13 , 6 ppm) - alcool mëthylique CH-OH (-23 , 7 ppm) en des quantités telles que chaque composé apporte la même quantité molaire de carbone.

L'invention a également pour objet le tube de calibrage contenant un mélange du type défini précédemment, le tube étant de préférence un tube scellé.

O P

I I

Le calibrage interne du spectre peut être automatisé à l'aide d'une fonction polynomiale de compensation. On introduit alors dans l'ordinateur les caractéristiques du mélange de calibrage, on enregistre le spectre du mélange de calibrage et l'ordinateur établit une fonction polynomiale de compensation qui neutralise les fluctua¬ tions dans la courbe de réponse du spectromètre, de telle sorte que pour chaque signal, indépendamment de sa position, la surface devienne strictement proportionnelle au nombre réel de noyaux C._.

La mise en oeuvre du procédé de l'invention ne nécessite pas l'utilisation d'un étalon de référence.

Le procédé de l'invention permet de déterminer l'origine bio et/ou techno-synthétique d'une substance donnée en confrontant les caractéristiques isotopiques obtenues par le procédé de l'invention avec celles de substances témoins ou substances de référence.

En l'absence de telles substances témoins, le procédé de l'invention permet également de donner des indications sur l'origine de la substance en utilisant comme moyen standard d'analyse une matrice de répartition isotopique prédéterminée par la formule chimique structurale, schéma isotopique Interne selon lequel, en particulier pour l'élément carbone, les groupes à caractère hydrophile et/ou facilement recyclables pendant le métabolisme, sont enrichis en isotope lourd par rapport à la teneur isotopique moyenne de la molécule, les groupes à caractère hydrophobe par contre sont appauvris en isotope lourd.

Dans le cas de molécules complexes, il est suffisant

N de déterminer quelques-uns des 2 (N'+l) (N"+2) ... isotopomères possibles, respectivement en prenant en considération seulement certaines, de préférence deux positions particulièrement révéla- trices, quant à leur taux en isotope lourd, l'un par rapport à l'autre.

Le spectromètre R.M.N. utilisé pour la mise en oeuvre de l'invention peut avantageusement être couplé avec un microproces¬ seur, dans lequel on mémorise d'abord des compositions isotopiques standards, par exemple pour les substances en provenance de plantes

C-,. C,, CAM (mécanisme mixte entre C, et C.) ou de cultures sous- 3' 3 4 marines et pour les substances techniques. On peut également intro¬ duire certains facteurs correctifs empiriques qui tiennent compte, de facteurs climatiques, géographiques de l'environnement et de la mor- phologie de la plante d'origine, facteurs qui provoquent des fluctua¬ tions isotopiques. On introduit ensuite dans ce microprocesseur les caractéristiques spectrales de l'échantillon, en particulier celles concernant l'isotope carbone-13.

On notera que le procédé de l'Invention est avanta- geusement réalisé avec l'isotope carbone-13, mais peut également être effectué pour l'azote-15, l'oxygène-17 et le soufre-33.

De plus, on peut combiner la détermination de l'isotopie du carbone-13 avec celle du deuterium ou des autres isotopes cités ci-dessus.

L'invention va être maintenant illustrée par les exemples non limitatifs ci-après, dans lesquels on utilise le symbole

CH, - îCOOH pour caractériser se i-quantitativement une

hétérogénéité intramoléculaire typique d'un acide acétique plus pauvre en carbone-13 méthylique et plus riche en carbone-13 carboxy- lique.

Les spectres enregistrés selon les exemples ci-après l'ont été sur des spectromètrés BRUKER WH 90, WP 200 SY et WM 400.

Exemple 1 ; détermination de l'origine de l'acide acétique. La méthode est basée ici sur l'unique détermination

13 13 par R.M.N. quantitative du rapport intramoléculaire CH,/ COOH.

L'acide acétique est un composé-clef dans la biosynthèse.

Cette molécule ultra-simple est pratiquement la seule pour laquelle on a réussi à déterminer les distributions internes du carbone-13 par la technique antérieure (voir E.R. SCHMIDT, H. GRUNDMANN, I. FOGY.

13 12 Intramolecular C/ C Isotope Ratios of Acetic of Biological and

Technical Origin. Biomédical Mass Spectrometry , 1981, 496-490 - W.G. MEINSCHEIN, G.G.L. RINALDI, J.M. HAYES, D.A. SCHOELLER, Intra¬ molecular Isotopic Order in Biologically Produced Acetic Acid _, 1974, 172-174). Les résultats sont donc connus et le composé sert de substance-test pour le procédé selon l'invention. Préparation des échantillons : l'échantillon purement biologique (I) a été obtenu à partir d'un vinaigre de vin 8,5° résultant d'une fermentation de surface "à l'ancienne" pendant 21 jours (vinaigre "Vieille Réserve" MARTIN POURET, ORLEANS). Dans une installation à extraction continue, on extrait 1 litre de ce vinaigre par 1,5 litre d'éther isopropylique pendant au moins 24 heures. L'acide acétique ainsi extrait est isolé et purifié par distillations fractionnées. On obtient environ 60 g d'acide acétique, qui reproduit essentiel- lement la composition en carbone-13 de l'éthanol du vin de départ.

Comme échantillon d'origine technique (II), on a utilisé l'acide acétique glacial de RIEDEL-DE-HAEN (SEELZE, R.F.A.). Ce composé est fabriqué à partir de l'éthylène, produit

O PI

secondaire du procédé de craquage du pétrole, par oxydation de l'acétaldéhyde (procédé ACKER-HOCHST). L'acide acétique, obtenu à partir de cet acétaldéhyde, est ensuite utilisé pour la fabrication d'acétate de polyvinyle. Par hydrolyse partielle de ce produit, on procède à une récupération d'une partie de cet acide acétique. Cet acide acétique dit de récupération est particulièrement pur du point de vue chimique et vendu tel quel. Plusieurs étapes de ce mode de fabrication sont susceptibles d'entraîner un fractionnement des isotopes du carbone tel que le taux en carbone-13 du .groupement carboxyle se trouve diminué unilatéralement. Selon l'invention, on a trouvé que cette répartition isotopique est inverse de celle pour l'acide acétique d'origine bio-synthétique.

On a également utilisé un mélange équimoléculaire (III) des échantillons (i) et (II). On a utilisé comme quatrième échantillon (IV) l'acide acétique glacial de MERCK (DARMSTADT, R.F.A.), pour lequel on a trouvé une distribution intramoléculaire strictement "biologique". On a constaté ultérieurement que ce produit provient de la distilla¬ tion du bois. Aux quatre échantillons d'acide acétique, on a ajouté environ 20% en volume d'eau lourde. Par adjonction de traces de trichlorure de gadolinium (GdCl,), on a établi un temps moyen de relaxation magnétique T_ du carbone-13 voisin d'une seconde. L'.échan¬ tillon était alors de 0,002 à 0,005 molaire par rapport au gadolinium. On a ajouté du sel disodique de l'acide éthylènediaminotétracétique ≈ EDTA (TITRIPLEX III, MERCK) comme co plexant, en quantité molaire double par rapport au gadolinium.

Mesure de la répartition isotopique par résonance magnétique nucléaire du carbone-13. On prend soin d'assurer un rapport signal/bruit suf¬ fisant et une parfaite proportionnalité entre le nombre des noyaux résonnants et l'amplitude des signaux en réalisant les conditions expérimentales suivantes.

On a procédé à une simple intégration des deux signaux de carbone-13 qui sont éloignés de 160 ppm.

10000 passages, 0,2 : Hz/point, T = 10 s.

Selon le type de sonde R.M.N., on a utilisé 0,7 ml (tubes de ^" 5 mm) ou 2 ml (tubes de 10 mm) de l'échantillon. Distinction de l'origine de l'acide acétique.

Pour chaque échantillon, on a calculé la surface des deux signaux du carbone-13, on a fait la moyenne de ces surfaces et déterminé l'écart Δ-.

S - S Λ _ max min m S = surface du signal qui correspond à la position la plus riche en C._ min surface du signal qui correspond à la position la moins riche en C,, ^• = moyenne des surfaces de tous les signaux pour m la molécule

Le procédé selon l'invention permet donc de faire d'une manière directe, rapide et non destructive une distinction nette entre l'acide 100% à base de vin (I) qui présente une posi- tion hydrophile (-C00H) 12% plus riche en carbone-13 que la position hydrophile (CH,) et l'échantillon technique utilisé (II) où la

situation est presque inversée. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus à l'aide de la technique antérieure. Dans un mélange comme l'échantillon (III), les concentrations relatives peuvent être déterminées avec une précision d'environ 20% avec les appareils actuellement sur le marché.

Exemple 2 : détermination de l'origine d'acides aminés, particulièrement de l'acide aspartique.

Les conditions expérimentales sont identiques à celles décrites dans l'exemple n° 1. Préparation des échantillons.

On a utilisé les acides aminés serine (Ser), thréonine (Thr), acide glutamique (Glu) et acide aspartique (Asp). Leurs Isomères optiques L proviennent des firmes MERCK (DARMSTADT, R.F.A.) et FLUKA (BUCHS, Suisse). Ils sont fabriqués en culture sous-marine par des mutants de micro-organismes qui produisent sélectivement un ^' seul acide aminé. Pour Asp, on a examiné également le racémate D/L, produit d'origine technique, qui est fabriqué à partir du gaz de craquage du pétrole ou de gaz de cokerie, par l'intermédiaire de l'anhydride maléique. On a préparé des solutions de ces acides aminés dans l'eau lourde. Afin d'augmenter la solubilité, on a établi un milieu acide (acide chlorhydrique). Pour réduire les temps de relaxation du carbone-13, on a ajouté des traces de chlorure de gadolinium comme décrit précédemment. Résultats

Les caractéristiques isotopiques suivantes ont été déterminées pour les trois échantillons suivants :

^ JH

OMP

1.7

On donne ci-après les résultats chiffrés obtenus pour l'acide aspartique L-Asp (origine biologique) et D/L-Asp (racé ate- origine technique).

Les deux spectres ont été enregistrés dans des conditions strictement identiques, de sorte que la courbe de réponse du spectromètre est la même.

* mesurées avec un planimètre (OTT, type 131 L, KEÎÎPTEN, RFA) permettant une précision de 0,1 % en utilisant un bras de traçage de 50 cm.

( OMPI

On peut à partir de ces résultats représenter schématiquément les deux acides aspartiques de la manière suivante

Comme cela a déjà été observé pour- l'acide _, acêtique'd'origine bio- logique, on trouve pour tous les acides aminés biologiques des tableaux ci-dessus que les positions à caractère hydrophile et/ou facilement recyclables pendant le métabolisme sont enrichies en carbone-13 par rapport à la teneur isotopique moyenne de la molécule, les positions à caractère hydrophobe par contre sont appauvries en ce même isotope. Le groupement C des acides aminés se comporte comme une position à caractère hydrophobe.

Il n'était pas prévisible que la complexité quasi illimitée des interactions biologiques aboutisse à un schéma de répar¬ tition isotopique finale aussi simple et généralement valable, schéma qui, dans son application analytique, permet une première orientation rapide, sans obligation d'avoir recours à un composé de référence.

L'acide aspartique technique (D/L) présente une répar¬ tition isotopique presque inverse de celle observée pour le composé biologique (L-Asp). Bien que les deux produits soient considérés comme étant chimiquement identiques, le procédé selon l'invention permet de déterminer sans ambiguïté leur origine respective.

Le taux isotopique global en carbone-13 (paramètre a défini cl-dessus) a été déterminé pour l'acide glutamique L. La molécule

13 12 13 contient 10,75 %. C par rapport à la totalité du carbone ( C. + C) ce qui représente un appauvrissement de 0,27 %. en valeur absolue lorsqu'on prend comme référence l'abondance naturelle de cet isotope (11,12 %« 13C) .

13

L'appauvrissement relatif en C de ce composé est donc de 25 .. Pour obtenir le taux global en carbone-13, on utilise de préférence pour les petites molécules ( / 20 atomes

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13 12 de carbone) la combustion totale et l'analyse du rapport C0 / CO_

(technique ancienne), alors que, pour des molécules plus grandes, la spectrométrie de masse à désorption par champ est plus avantageuse.

Exemple de réalisation n° 3 : détermination de l'origine de l'alcool éthylique

L'alcool éthylique présente, en fonction de son origine, des modifications assez spectaculaires de son taux en deuterium. Lorsqu'on compare les alcools de différentes origines bio-synthétiques, on touche également le problème important de la chaptalisation des vins. L'origine d'un alcool n'a pu être déterminée jusqu'à présent qu'en utilisant simultanément les taux Isotopiques globaux (paramètre a) et positionnels (paramètres c) et en deuterium et en carbone-13. Les effets sont moins spectaculaires pour le carbone-13, mais moins sensibles aux facteurs variables de l'environnement. Le procédé selon l'invention basé sur la détermination des rapports des isotopomères essentiels de l'alcool (paramètres d) permet une détermination précise de l'origine. Parmi les

2 ^N (N'+1) (N"+l) = 2 ² (3+l) (2+1) = 48 isotopomères possibles de l'éthanol

2 N ≈ 2 positions non équivalentes du carbone,

N' ≈ 3 positions équivalentes d'hydrogène méthylique, N" == 2 positions équivalentes d'hydrogène méthylénique, le proton hydroxylique échangeable n'étant pas compté les six isoto¬ pomères suivants participent avec une probabilité plus élevée que 0,01% : ^X CH- CH OH, CH ₃ CH ₂ OH, CH ₃ CH ₂ 0H, CH ₃ CH ₂ 0H, ¹² CH ₂ D ¹² CH ₂ 0H et ¹² CH ₃ ¹² CHD0H. Dans le tableau ci-dessous, le rapport de ces isotopomères ressort semi-quantitativement. Préparation des échantillons

Les alcools ont été préparés et/ou extraits selon un procédé classique (L. GATTERMANN, H. WIELAND, Praxis des Organischen Chemikers, Walter de Gruyter-Verlag, BERLIN, 1954, p. 350-1).

On a utilisé de l'alcool en provenance d'un vin de table rouge 10° de Béziers et d'un vin rouge d'Algérie 12° qui ont à peu près les mêmes caractéristiques isotopiques (échantillon I), d'un vin blanc Sylvaner 10° qui montre une chaptalisation (II), de l'alcool de provenance de sucre de betterave (III), de sucre de

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canne et glucose de aîs (IV). On a également examiné un alcool techno-synthétique (V) à base d'éthylène, gaz de craquage de produits de pétrole. Résultats

Les résultats semi-quantitatifs sont présentés dans le tableau suivant ₃ n utilisant pour la répartition positionnelle des isotopes le symbole défini et déjà utilisé ci-dessus. Les taux isotopiques globaux (appauvrissement en isotope lourd) obtenus en utilisant comme étalon intermédiaire un échantillon défini d'amidon de blé sont exprimés en ₀ par rapport au standard isotopique international tel que défini par H. CRAIG Geochim.Cos ochim. Acta 12,133-149 (1957)

Δ = 10-30% ₀ Δ ₌ 10-15% _c

Une distinction nette entre les alcools biologiques (I-IV) et l'alcool technique (V) se manifeste par tous les paramètres.

A l'intérieur des échantillons biologiques, la différence est très nette entre l'alcool en provenance de la vigne (I, II) et de la betterave (III) d'une part (plantes C,, dont le produit primaire de la photosynthèse est une molécule à trois atomes de carbone) et l'alcool à base de canne à sucre ou de maïs (IV) d'autre part (plantes C,, dont le produit primaire est une molécule à quatre carbones). Le critère ici est le taux global en carbone-13.

Il existe également une différence entre l'alcool en provenance de la vigne (I) et celui en provenance de la betterave (III) aussi bien pour le deuterium que pour le carbone-13. Mais le taux en deuterium est extrêmement sensible aux facteurs extérieurs et saisonniers. Il décroît particulièrement

- avec la latitude géographique.

- avec l'altitude - lorsque la température baisse

- lorsqu'on s'éloigne de l'influence maritime

- en passant de la Méditerranée à l'Océan Atlantique

- lorsque le fruit est recueilli prématurément.

Le procédé selon l'invention convient également pour déterminer l'origine des acides gras. En plus de l'effet indiqué ci- dessus pour les autres substances (comportement des groupes à carac¬ tère hydrophobe et hydrophile) , on a trouvé que pour un acide gras natu¬ rel en provenance de plantes C3, l'extrémité hydrophobe est plus pauvre en 13C que l'extrêrnitê hydrophile bien qu'il s'agisse chimiquement des mêmes :carbones (-CH„-) . On a constaté d'autre part une faible alternan¬ ce régulière des abondances, de telle sorte qu'une semi-synthèse a partir de deux fractions naturelles peut être détectée par le procédé selon l'invention.

Le procédé selon l'invention a d'autres applications dans des domaines très variés. On notera par exemple que le procédé de l'in¬ vention peut être utilisé pour déterminer les conditions de croissance optimales d'une plante donnée puisque l'on a constaté que la discrimi¬ nation isotopique est minimale lorsque les conditions écologiques d'une plante sont optimales. Un autre exemple d'application du procédé est la détermination des substances organiques de l'animal pour déceler la ma-

nière dont 11 a été nourri. Certains metabolismes anormaux chez l 'homme et l 'animal sont suceptibles d'être détectés par l'analyse isotopique positionnelle. Le procédé de l 'invention permet de nombreuses extensions et est susceptible de devenir ainsi une "véritable radiographie de la matière organique" .