Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer Höhenlage eines Objekts an einem lateralen ersten Ort des Objekts mittels eines Mikroskops, welches das Objekt mit einer Punktbildverwaschungsfunktion entlang einer z-Richtung, die mit der Höhenrichtung übereinstimmt, abbildet. Die Erfindung betrifft ferner ein Mikroskop zur Erzeugung einer teilkonfokalen Abbildung und einer Abbildung im Weitfeld eines Objekts, wobei das Mikroskop eine Detektoreinrichtung , eine Pinholeeinrichtung zur teilkonfokalen Abbildung sowie zur Aufnahme im Weitfeld, eine Fokussiereinrichtung, welche ausgebildet ist, eine z-Lage eines Fokus der teilkonfokalen Abbildung einzustellen, und eine Steuereinrichtung zur Steuerung der Pinholeeinrichtung, welche mit der Detektoreinrichtung verbunden ist, umfasst. Aus dem Stand der Technik sind Verfahren bekannt, m ittels welchen sich die Topographie eines Objektes m ithilfe von optischen Mikroskopen bestimmen lässt. Dazu werden

insbesondere konfokale Mikroskope verwendet. Bei diesen bekannten Verfahren wird der Fokus einer teilkonfokalen Abbildung in einer z-Richtung, d. h. in einer Richtung der Höhe der Topographie, verändert und an jeder z-Position eine teilkonfokale Abbildung aufgenommen. Meist wird die teilkonfokale Abbildung derart gewählt, dass das Bild einen rein konfokalen Anteil als auch einen Anteil eines Weitfelds umfasst. Für jedes dieser Bilder in z-Richtung, welche zusammenfassend auch als Stapel bezeichnet werden, wird die Intensität bestim mt und ein Intensitätsverlauf in z-Richtung berechnet. Anhand dieses berechneten Intensitätsverlaufs kann die maximale Intensität bestimmt werden, dessen z-Koordinate mit der Höhe des Objekts an dem gemessenen Punkt übereinstimmt. Um die Höhe des Objekts flächig zu bestimmen, wird das oben beschriebene Verfahren an verschiedenen Orten wiederholt.

Zur Bestimm ung der maximalen Intensität ist es meist notwendig, viele Messungen entlang der z-Richtung vorzunehmen, um m it entsprechender Genauigkeit das Intensitätsmaximum und dam it die Höhenlage des Objekts zu bestimmen. Daher kann das Verfahren mit einem hohen Zeitaufwand verbunden sein.

Die US 2004/0008515 A1 befasst sich mit der Verbesserung der Fluoreszenzbeleuchtung zur dreidimensional auflösenden Mikroskopie. Die Veröffentlichung Hiraoka Y. et al. , Biophys. J. , Vol. 57, Februar 1990, S. 325-333, schildert die Ermittlung der dreidimensionalen Abbildungseigenschaften bei einem Lichtmikroskop. McNally J. et al. , SPI E, Vol. 2984, 1997, S. 52-63, vergleicht mehrere 3D-Mikroskopieverfahren m ithilfe eines genau bekannten

Prüfobjektes. Aufgabe der Erfindung ist es, ein System zur schnellen Bestimmung einer Höhenlage eines Objekts bereitzustellen.

Die Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 und durch das Mikroskop nach Anspruch 13 gelöst. Die abhängigen Ansprüche befassen sich mit bevorzugten

Ausführungsformen der Erfindung.

Bei einem Verfahren zum Bestimmen einer Höhenlage eines Objekts an einem lateralen ersten Ort des Objekts m ittels eines Mikrokops, welches das Objekt m it einer

Punktbildverwaschungsfunktion entlang einer z-Richtung, die mit der Höheneinrichtung übereinstimmt, abbildet, werden folgende Schritte ausgeführt: Abbilden des Objekts m it dem Mikroskop im Weitfeld und Bestimmen einer Weitfeldintensität, Berechnen einer an dem ersten Ort erwarteten, maximalen Intensität durch Multiplikation der Weitfeldintensität mit einem vorgegebenen Skalierungsfaktor, teilkonfokales Abbilden des Objekts an dem ersten Ort mit dem Fokus an einer Messposition in z-Richtung , wobei die teilkonfokale Abbildung einen Tiefenschärfebereich festlegt und der Fokus in dem Tiefenschärfebereich liegt, sowie

Bestimmen einer teilkonfokalen Intensität der teilkonfokalen Abbildung an dem ersten Ort, Berechnen einer der Punktbildverwaschungsfunktion entsprechenden Intensität an dem ersten Ort durch Bildung einer Differenz zwischen der teilkonfokalen Intensität und einem Produkt aus Weitfeldintensität mit einem vorgegebenen Verknüpfungsfaktor, Berechnen einer z-Koordinate des Fokus in z-Richtung, an der die Punktbildverwaschungsfunktion maximal ist, unter

Verwendung einer vorbekannten Form der Punktbildverwaschungsfunktion, der berechneten Punktbildverwaschungsfunktion entsprechenden Intensität und der berechneten erwarteten maximalen Intensität, und Verwenden der z-Koordinate als Höhenlage des Objekts an dem ersten Ort.

Das Verfahren wird vorzugsweise dazu verwendet, eine Topographie eines lateral

ausgedehnten Objekts zu bestimmen. Dazu kann die Höhenlage an mehreren ersten Orten bestimmt werden, wobei die ersten Orte lateral zueinander beabstandet sind. Die ersten Orte beziehen sich som it insbesondere auf die laterale Ausdehnung des Objekts. Die ersten Orte sind bevorzugt senkrecht zu der z-Richtung beabstandet.

Vorzugsweise wird das Verfahren scannend verwendet, wobei an jedem Scanpunkt, welcher dem ersten Ort entsprechen kann, das beanspruchte Verfahren oder Teile des Verfahrens durchgeführt werden. Aus den Höhenlagen der einzelnen ersten Orte kann die Topographie des Objekts bestimmt werden.

Das Mikroskop ist insbesondere ausgebildet, das Objekt teilkonfokal abzubilden. Teilkonfokal soll in diesem Zusammenhang bedeuten, dass die Abbildung mithilfe eines Pinholes in der z-Richtung begrenzt, aber noch nicht beugungsbegrenzt, ist. Dabei bestimmt die Größe des Pinholes den Bereich des ersten Orts in z-Richtung, welcher durch die teilkonfokale Abbildung abgebildet wird. Wie dies allgemein bekannt ist, ist die Auflösung in z-Richtung umso größer, je kleiner das Pinhole ist.

Eine konfokale Abbildung soll in diesem Zusammenhang bedeuten, dass das Pinhole eine Ausdehnung hat, welche der Beugungsgrenze der Abbildung entspricht. Eine teilkonfokale Abbildung weist insbesondere Anteile einer rein konfokalen Abbildung und des Weitbilds auf. Das Pinhole für eine teilkonfokale Abbildung ist insbesondere größer als das Pinhole für eine konfokale Abbildung. Die teilkonfokale Abbildung dient insbesondere zur Erfassung eines sogenannten Komposit-Bilds.

Das Mikroskop, insbesondere dessen Optik und die Größe des Pinholes, bestimmt den Tiefenschärfenbereich in z-Richtung. Somit ist der Tiefenschärfebereich eine Eigenschaft des Mikroskops, welche vorab mit bekannten Vorfahren bestimmt werden kann.

Das Objekt weist insbesondere eine Topographie auf, der Höhenänderung im Nano- bis Millimeterbereich liegt. Das Objekt kann jede Probe sein, welche optisch abgebildet werden kann. Insbesondere kann das Objekt auch eine biologische Probe sein.

Die teilkonfokale Abbildung definiert den Tiefenschärfebereich. Der Tiefenschärfebereich hängt von der Größe des Pinholes ab, wobei der Tiefenschärfebereich in z-Richtung umso größer ist, je größer das Pinhole ist. Somit hat eine konfokale Abbildung einen kleineren

Tiefenschärfebereich in z-Richtung als die teilkonfokale Abbildung. Ferner ist der

Tiefenschärfebereich einer teilkonfokalen Abbildung kleiner als der Tiefenschärfenberich einer Weitfeldabbildung. Wenn bei einer konfokalen Abbildung das Pinhole weiter verkleinert wird, ändert sich der Tiefenschärfebereich nicht, sondern es wird lediglich die Intensität der konfokalen Abbildung reduziert. Eine Abbildung im Weitfeld soll insbesondere eine Abbildung des Objekts sein, welche keine oder eine geringe Ortsauflösung in z-Richtung hat. Dies kann dadurch geschehen, dass in einem Abbildungsstrahlengang, welcher den Strahlengang des von dem ersten Ort emittierten oder reflektierten Lichts zu einer Detektoreinrichtung des Mikroskops darstellt, kein Pinhole oder ein Pinhole mit einem großem Durchmesser vorgesehen ist. Nach Durchführung der Abbildung im Weitfeld wir dessen Intensität bestimmt, welche der Weitfeldintensität entspricht.

Die Abbildung im Weitfeld kann an dem ersten Ort erfolgen oder an jedem anderen Ort des Objekts und dient vorzugsweise dazu, die optischen Eigenschaften, wie beispielsweise die Reflektivität der Probe zu erfassen. Bevorzugt wird die Weitfeldintensität lediglich einmal bestimmt, so dass, wenn das Verfahren wiederholt wird, die Weitfeldintensität einer vorangegangenen Messung verwendet wird. Die Weitfeldintensität lediglich einmal zu bestimmen, funktioniert insbesondere dann , wenn ein Objekt vorliegt, dass dessen optische Eigenschaften, insbesondere die Reflektivität, über die Ausdehnung des Objekts als konstant oder annähernd konstant sind, oder sich weniger als 1 0%, 20% oder 50% ändert. Somit wird bei einer Wiederholung des hier dargestellten Verfahrens bevorzugt nur eine Abbildung im Weitfeld des ersten Orts durchgeführt. Als weiterer Schritt des Verfahrens wird die an dem ersten Ort erwartete maximale Intensität berechnet, welche der maximalen Intensität entspricht, die man bei einer teilkonfokalen Abbildung oder einer konfokalen Abbildung erhielt. Diese Berechnung beruht auf der Erkenntnis der Erfinder, dass die maximale Intensität einer konfokalen oder teilkonfokalen Abbildung proportional zu der Weitfeldintensität ist. Dieses Verhältnis entspricht dem Skalierungsfaktor, welcher vorzugsweise vorab bei dem Mikroskop, und insbesondere an dem Objekt, bestimmt wird. Die Berechnung der erwarteten maximalen Intensität an dem ersten Ort kann nur einmal durchgeführt werden, wenn die Bestimm ung der Weitfeldintensität ebenfalls nur einmal durchgeführt wird. Die Bestimmung der erwarteten, maximalen Intensität muss daher bei einer Wiederholung des Verfahrens nicht erneut durchgeführt werden.

Das teilkonfokale Abbilden des Objekts an dem ersten Ort wird bei einer Wiederholung des Verfahrens insbesondere an jedem der ersten Orte durchgeführt. Der Fokus dieser Abbildung wird an einer z-Messposition vorgesehen, welche in dem Tiefenschärfebereich der

teilkonfokalen Abbildung des Mikroskops liegt. Insbesondere liegt die z-Messpostion in einem Tiefenschärfebereich, der durch eine konfokale Abbildung festgelegt ist. Die Wahl der z-Messposition erfolgt vorzugsweise zufällig, oder es wird für die teilkonfokale Abbildung an jedem der ersten Orte die gleiche z-Messposition verwendet. Die Festlegung der

z-Messposition derart, dass sie im Tiefenschärfenbereich der teilkonfokalen Abbildung liegt, kann durch ein Trial-and-Error-Verfahren oder manuell erfolgen. Insbesondere können zur Festlegung des Tiefenschärfebereichs der teilkonfokalen Abbildung andere bekannte

Parameter des Objekts oder des Mikroskops herangezogen werden. Die aus der teilkonfokalen Abbildung bestimmte teilkonfokale Intensität kann vorzugsweise verwendet werden, um zu eruieren, ob die z-Messposition im Tiefenschärfebereich liegt. Ist dies nicht der Fall, kann dieser Verfahrensschritt wiederholt werden, bis feststeht, dass die z-Messposition im

Tiefenschärfenbereich der teilkonfokalen Abbildung liegt.

Die teilkonfokale Abbildung erfolgt vorzugsweise dadurch, dass in dem Abbildungsstrahlengang ein Pinhole vorgesehen ist. Die teilkonfokale Abbildung weist somit im Unterschied zur Abbildung im Weitfeld eine bessere Auflösung in z-Richtung auf. Dadurch dass sich für das Mikroskop die Punktbildverwaschungsfunktion bestimmen lässt, ist insbesondere deren genauer Verlauf bekannt, beispielsweise die Abweichung der Punktbildverwaschungsfunktion von einer Gauß-Kurve sowie deren Standardbreite. Eine rein konfokale Abbildung bildet das Objekt vorzugsweise mit der Punktbildverwaschungsfunktion ab.

Die maximale Intensität der Punktbildverwaschungsfunktion wird insbesondere als die der Punktbildverwaschungsfunktion entsprechende Intensität bezeichnet. Die z-Messposition in z-Richtung, welche mit der maximalen Intensität der Punktbildverwaschungsfunktion übereinstimmt, lässt sich aufgrund der Annahme berechnen, dass die Intensität einer teilkonfokalen Abbildung an dem ersten Ort gleich der Summe aus der Intensität einer konfokalen Abbildung an dem ersten Ort und der mit einem Verknüpfungsfaktor multiplizierten Weitfeldintensität entspricht. Der Verknüpfungsfaktor wird vorzugsweise vor Durchführung des Verfahrens bestimmt, beispielsweise für das beobachtete Objekt oder allgemein für das Mikroskop. Aus diesem Zusammenhang lässt sich aus mit den gemessenen Größen, nämlich der teilkonfokalen Intensität und der Weitfeldintensität, die der Punktbildverwaschungsfunktion entsprechende Intensität an dem ersten Ort berechnen. Dieser Verfahrensschritt wird vorzugsweise bei der Topographieermittlung für jeden ersten Ort durchgeführt. Die gesuchte z-Koordinate ist die Position des Fokus in z-Richtung, an der die Intensität der Punktbildverwaschungsfunktion maximal ist. Sie wird unter Verwendung der Information der Form der Punktbildverwaschungsfunktion und zweier Punkte, welche von der

Punktbildverwaschungsfunktion bekannt sind, berechnet. Dies gelingt, da die

Punktbildverwaschungsfunktion in z-Richtung mit dem Intensitätsverlauf einer konfokalen Abbildung übereinstimmt. Die Berechnung der Position an dem die

Punktbildverwaschungsfunktion maximal ist, kann beispielsweise durch Fitten der

Punktbildverwaschungsfunktion an die zwei bekannten Punkte durchgeführt werden.

Diese zwei bekannten Punkte entsprechen der der Punktbildverwaschungsfunktion entsprechenden Intensität der teilkonfokalen Abbildung sowie der erwarteten, maximalen

Intensität, welche zuvor, wie oben beschrieben, bestimmt wurde. Die z-Koordinate des Fokus, an der der Intensitätsverlauf der Punktbildverwaschungsfunktion maximal ist, entspricht der Höhenlage des ersten Orts des Objekts. Bei der Bestimmung der Position, für den die Punktbildverwaschungsfunktion maximal ist, kann eine Doppeldeutigkeit auftreten. Diese kann wie im Folgenden beschrieben aufgelöst werden. Optional kann dieses Problem dadurch gelöst werden, dass die bestimmte z-Koordinate des Fokus m it zuvor bestimmten z-Koordinaten verglichen werden, beispielweise indem diejenige der zwei bestimmten z-Koordinaten als wahre Position verwendet wird, die am nächsten an der vorangegangenen Messung liegt. Darüber hinaus ist es möglich, dass weitere von dem Objekt bekannte Informationen zur Auflösung der Uneindeutigkeit herangezogen werden. Bevorzugt wird zur Bestimm ung der Höhenlage des Objekts an dem ersten Ort nur eine einzige teilkonfokale Abbildung durchgeführt. Da bei bekannten Verfahren zur optischen Bestimmung der Topographie eines Objekts z-Stapel mit meist zehn oder mehr teilkonfokalen Abbildungen mit zueinander in z-Richtung beabstandeten Foki augenommen werden müssen und diese Messungen sequenziell vorgenommen werden , reduziert die Erfindung die Verfahrensdauer zur Bestimm ung der Höhenlage eines Punktes des Objekts auf bis zu 10 % im Vergleich zu bekannten Verfahren. Insbesondere ist es m it dem Verfahren möglich, für jeden ersten Ort nur eine einzige teilkonfokale Abbildung aufzunehmen, so dass m it bekannten konfokalen

Abbildungsverfahren nicht nur ein zweidimensionales Bild, sondern sogleich ein

dreidimensionales Bild des Objekts erzeugt werden kann.

Es ist bevorzugt, dass für die teilkonfokale Aufnahme eine Pinholeeinrichtung m it einer Öffnung verwendet wird, welche größer als eine Beugungsgrenze ist, so dass die Intensität der teilkonfokalen Aufnahme Anteile einer Weitfeldabbildung aufweist. Vorteil dieser Ausführungsform ist, dass der Intensitätsverlauf der teilkonfokalen Abbildung in Abhängigkeit von der z-Messposition einen größeren Tiefenschärfebereich aufweist verglichen mit einer rein konfokalen Abbildung, also eine Abbildung, bei der das Pinhole eine Öffnung, welche der Beugungsgrenze entspricht, aufweist. Som it ist der Tiefenschärfebereich bei dieser Ausführungsform vergrößert und kann leichter eingestellt werden. Darüber hinaus können größere Höhenunterschiede bestimmt werden.

Es ist bevorzugt, dass der Skalierungsfaktor durch folgende Schritte bestimmt wird : Erzeugen eines z-Stapels durch wiederholtes teilkonfokales Abbilden eines lateralen ersten

Kalibrationsorts eines ersten Kalibrationsobjekts oder des Objekts m it unterschiedlichen, in z-Richtung verschobenen Foki und Bestimmen der teilkonfokalen Intensitäten für jede der teilkonfokalen Abbildung ; Berechnen eines Intensitätsverlaufs in z-Richtung an dem ersten Kalibrationsort und Bestim men einer maximalen Kalibrationsintensität des Intensitätsverlaufs an dem ersten Kalibrationsort; Abbilden des ersten Kalibrationsorts mit dem Mikroskop im Weitfeld und Bestimmen einer ersten Kalibrationsweitfeldintensität an dem ersten Kalibrationsort; und Berechnen des Skalierungsfaktors als Verhältnis zwischen der maximalen Kalibrationsintensität und der ersten Kalibrationsweitfeldintensität. Der Skalierungsfaktor kann an einem von dem Objekt unterschiedlichen ersten

Kalibrationsobjekt oder an dem Objekt selbst bestim mt werden. Das erste Kalibrationsobjekt weist vorzugsweise ähnliche optische Eigenschaften, speziell hinsichtlich der Reflektion und der Streuung von Licht, wie das zu messende Objekt auf. Das Objekt und das erste

Kalibrationsobjekt weichen insbesondere hinsichtlich ihrer optischen Eigenschaften um weniger als 10%, 20% oder 50% ab. Die Verwendung eines ersten Kalibrationsobjekts hat den Vorteil, dass die Bestimm ung des Skalierungsfaktors nicht jedesmal vor dem Verfahren durchgeführt werden muss. Die Ermittlung des Skalierungsfaktors an dem zu messenden Objekt selbst hat hingegen den Vorteil, dass der Skalierungsfaktor m it einer besonders hohen Genauigkeit bestimmt werden kann. Die Bestimmung des Skalierungsfaktors erfolgt insbesondere vor der Durchführung des Verfahrens, wie es oben beschrieben wurde.

Der erste Kalibrationsort kann ein beliebig ausgewählter Ort des ersten Kalibrationsobjekts oder des Objekts sein. Beispielsweise ist es möglich, dass der erste Kalibrationsort m it dem ersten Ort übereinstimmt, etwa dann, wenn die Bestimm ung des Skalierungsfaktors unmittelbar vor der Durchführung des beschriebenen Verfahrens vorgenommen wird.

Zur Bestimm ung des Skalierungsfaktors wird der Intensitätsverlauf der teilkonfokalen Abbildung in z-Richtung bestimmt. Dabei wird im Abbildungsstrahlengang ein Pinhole vorgesehen , dessen Öffnung eine Größe hat, wie sie später in dem beschriebenen Verfahren verwendet wird .

Insbesondere wird für die teilkonfokale Abbildung ein Pinhole verwendet, das sowohl für die Bestimm ung des Skalierungsfaktors als auch für die Bestimmung der Höhenlage des Objekts an dem ersten Ort eingesetzt wird.

Die mehreren teilkonfokalen Abbildungen, deren Foki in z-Richtung verschoben sind, bilden einen z-Stapel, aus dem jeweils die teilkonfokale Intensität bestimmt wird, so dass sich daraus der Intensitätsverlauf in z-Richtung bestimmen lässt. Anhand diesem Intensitätsverlauf wird die maximale Kalibrationsintensität berechnet und zu der ebenfalls erfassten

Kalibrationsweitfeldintensität, welche an dem ersten Kalibrationsort bestimmt wurde, ins Verhältnis gesetzt. Insbesondere ist der Skalierungsfaktor das Verhältnis von der maximalen Kalibrationsintensität zu der ersten Kalibrationsweitfeldintensität. Die

Kalibrationsweitfeldintensität wird insbesondere wie die oben bestimmte Weitfeldintensität erm ittelt. Es ist bevorzugt, dass der Verknüpfungsfaktor durch folgende Schritte bestimmt wird :

Teilkonfokales Abbilden eines lateralen zweiten Kalibrationsort eines zweiten

Kalibrationsobjekts oder des Objekts mit dem Fokus an einer Kalibrationsmessposition in z-Richtung, der in dem Tiefenschärfebereich liegt, und Bestimmen einer teilkonfokalen Kalibrationsintensität der teilkonfokalen Abbildung an dem zweiten Kalibrationsort; konfokales Abbilden des zweiten Kalibrationsorts mit dem Fokus an der Kalibrationsmessposition und Bestimmen einer konfokalen Kalibrationsintensität der konfokalen Abbildung an dem zweiten Kalibrationsort; Abbilden des zweiten Kalibrationsort m it dem Mikroskop im Weitfeld und Bestimmen einer zweiten Kalibrationsweitfeldintensität an dem zweiten Kalibrationsort; und Berechnen des Verknüpfungsfaktors als Verhältnis zwischen der Differenz zwischen der teilkonfokalen Kalibrationsintensität und der konfokalen Kalibrationsintensität zu der zweiten Kalibrationsweitfeldintensität.

Das zweite Kalibrationsobjekt kann mit dem ersten Kalibrationsobjekt übereinstim men.

Insbesondere ist das zweite Kalibrationsobjekt hinsichtlich seiner Reflexion und Streuung von Licht ähnlich wie das Objekt ausgebildet, beispielsweise unterschieden sich die optischen Parameter weniger als 1 0%, 20% oder 50%. Bevorzugt wird jedoch die Bestimmung des Verknüpfungsfaktors an dem Objekt selbst durchgeführt. Dazu wird an einem beliebig gewählten zweiten Kalibrationsort, der mit dem ersten Kalibrationsort oder dem ersten Ort übereinstimmen kann, eine teilkonfokale Abbildung erzeugt. Insbesondere ist die Größe des Pinholes in dem Abbildungsstrahlengang dieselbe wie bei dem oben beschriebenen Verfahren. Vorzugsweise ist das Pinhole identisch zu dem im Anschluss an die Berechnung des

Verknüpfungsfaktors durchgeführten und oben beschriebenen Verfahren. Die konfokale Abbildung erfolgt m it einem Pinhole, dessen Durchmesser der Beugungsgrenze der Abbildung entspricht. Das Pinhole für die teilkonfokale Abbildung ist som it größer als das Pinhole für die teilkonfokale Abbildung. Die an dem zweiten Kalibrationsort bestimmte konfokale Kalibrationsintensität der konfokalen Abbildung entspricht einer der

Punktbildverwaschungsfunktion entsprechenden Kalibrationsintensität, da die

Punktbildverwaschungsfunktion bei der konfokalen Abbildung erreicht wird.

Die zweite Kalibrationsweitfeldintensität kann mit der ersten Kalibrationsweitfeldintensität übereinstimmen, wenn diese an demselben Ort wie die erste Kalibrationsweitfeldintensität bestimmt wird. Insbesondere kann der Schritt Abbilden des zweiten Kalibrationsort m it dem Mikroskop im Weitfeld und Bestimmen einer zweiten Kalibrationsweitfeldintensität an dem zweiten Kalibrationsort dann ausbleiben, wenn der erste Kalibrationsort m it dem zweiten Kalibrationsort übereinstim mt. Die Berechnung des Verknüpfungsfaktors erfolgt umgekehrt wie die Bestimmung der der Punktbildverwaschungsfunktion entsprechenden Intensität anhand der oben beschriebenen Beziehung zwischen Intensität der teilkonfokalen Abbildung, Intensität der konfokalen Abbildung und Weitfeldintensität.

Es ist bevorzugt, dass der erste Ort mit dem Mikroskop im Weitfeld abgebildet wird und dass eine aktuelle Weitfeldintensität an dem ersten Ort bestimmt wird.

Insbesondere wird bei einer Wiederholung des oben beschriebenen Verfahrens an jedem der ersten Orte ein Weitfeldbild aufgenommen und somit an jedem ersten Ort die Weitfeldintensität bestimmt. Dieses Vorgehen hat den Vorteil, dass, wenn das Objekt hinsichtlich optischen Eigenschaften, speziell der Reflektivität oder Streuung des Lichts, entlang der Ausdehnung des Objekts stark variiert, die jeweils passende Weitfeldintensität verwendet wird. Somit lässt sich durch die Bestimmung der Weitfeldintensität an jedem ersten Ort die Genauigkeit des

Verfahrens erhöhen.

Es ist bevorzugt, dass das Verfahren ferner die folgenden Schritte aufweist: Teilkonfokales Abbilden des ersten Orts mit dem Fokus an wenigstens zwei in z-Richtung beabstandeten z-Messpositionen, die jeweils in dem Tiefenschärfebereich liegen, und Bestimmen von teilkonfokalen Intensitäten für jede teilkonfokale Abbildung an dem ersten Ort; Berechnen der der Punktbildverwaschungsfunktion entsprechenden Intensitäten an dem ersten Ort durch jeweilige Bildung einer Differenz zwischen der jeweiligen teilkonfokalen Intensität und einem Produkt aus Weitfeldintensität mit dem vorgegebenen Verknüpfungsfaktor; Berechnen der z-Koordinate des Fokus in z-Richtung an dem die Punktbildverwaschungsfunktion maximal ist, unter Verwendung der Form der Punktbildverwaschungsfunktion, der berechneten, der

Punktbildverwaschungsfunktion entsprechenden Intensitäten und der berechneten, erwarteten maximalen Intensität.

In dieser bevorzugten Ausführungsform werden zwei oder mehr teilkonfokale Abbildungen des Ortes bestimmt, wobei die Foki der teilkonfokalen Abbildungen in z-Richtung beabstandet sind.

Die Größe des Pinholes ist bevorzugt für jede der teilkonfokalen Abbildungen gleich. Zwei teilkonfokale Abbildungen und die entsprechende Bestimmung der teilkonfokalen Intensitäten erlauben es, dass die Bestimmung der Position, an dem die Punktbildverwaschungsfunktion maximal ist, anhand drei Punkten erfolgt, nämlich die beiden der

Punktbildverwaschungsfunktion entsprechenden Intensitäten sowie der maximalen Intensität der Punktbildverwaschungsfunktion. Aufgrund dessen ist es möglich, die Uneindeutigkeit des oben beschriebenen Verfahrens zuverlässig aufzulösen. Es ist bevorzugt, dass zur Erzeugung einer Live-Bestimmung einer Höhenlage des Objekts an einem von dem ersten unterschiedlichen, lateral zweiten Ort des Objekts der zweite Ort teilkonfokal abgebildet wird und dass zum Berechnen einer z-Koordinate des Fokus in z-Richtung an dem zweiten Ort die z-Koordinate des Fokus in z-Richtung an dem ersten Ort berücksichtigt wird.

Bei dieser Ausführungsform wird die Information der Höhenlage des Objekts an einem vorherigen Punkt dazu verwendet, die Uneindeutigkeit des oben beschriebenen Verfahrens aufzulösen. Es ist insbesondere vorgesehen, diejenige z-Koordinate als die wahre z-Koordinate zu verwenden, welche am nächsten zu der vorhergehenden Messung liegt. Der zweite Ort kann jeder beliebige Ort auf dem Objekt sein, welcher zu dem ersten Ort beabstandet ist.

Insbesondere kann der zweite Ort von einem Nutzer des Mikroskops ausgewählt werden.

Da für diese Ausführungsform nur eine teilkonfokale Abbildung des zweiten Orts erfolgt, ist diese Ausführungsform besonders schnell, so dass auch Live-Bilder der Höhenlage des Objekts dem Beobachter angezeigt werden können. Dies ist insbesondere dann hilfreich, wenn der Benutzer manuell den zweiten Ort ansteuern kann. Es ist auch möglich, dass die manuell angesteuerten zweiten Orte zu einem Topographiebild des Objekts miteinander verknüpft werden.

Es ist bevorzugt, dass das Verfahren ferner die Schritte umfasst: Teilkonfokales Abbilden des ersten Orts mit wenigstens zwei unterschiedlichen Pinholes und mit dem Fokus an einer z-Messposition in z-Richtung, welche in dem Tiefenschärfebereich liegt, und Bestimmen einer weiteren teilkonfokalen Intensität für die teilkonfokale Abbildung mit dem weiteren Pinhole; und Berechnen der z-Koordinate unter Verwendung der Punktbildverwaschungsfunktion, der berechneten der Punktbildverwaschungsfunktion entsprechenden Intensität, der weiteren teilkonfokalen Intensität und der berechneten, erwarteten maximalen Intensität.

In dieser Ausführungsform, welche zusätzlich oder alternativ zu den zuvor genannten

Ausführungsformen verwendet werden kann, werden zwei teilkonfokale Abbildungen an dem ersten Ort aufgenommen, wobei die teilkonfokalen Abbildungen mit jeweils unterschiedlich großen Pinholes erfolgen. Vorzugsweise wird nur für eine der teilkonfokalen Abbildungen eine der Punktbildverwaschungsfunktion entsprechende Intensität berechnet, sowie dies oben ausgeführt wurde. Die weitere teilkonfokale Intensität wird insbesondere dazu verwendet, die oben beschriebene Uneindeutigkeit aufzulösen. Die weitere teilkonfokale Intensität kann insbesondere dazu verwendet werden, die Seite der Bildpunktverwaschungsfunktion zu bestimmen, auf welcher Seite sich die der Bildpunktverwaschungsfunktion entsprechende Intensität befindet. Vorteil dieser Ausführungsform ist, dass zur Bestimmung der Höhenlage des Objekts an dem ersten Ort der Fokus der teilkonfokalen Abbildung nicht verändert werden muss, sondern nur die Größe des Pinholes.

Es ist bevorzugt, dass als Mikroskop ein Laser-Scanning-Mikroskop verwendet wird, wobei zum teilkonfokalen Abbilden und Abbilden im Weitfeld die Größe des Pinholes durch Verstellen oder Austauschen des Pinholes geändert wird. Das verwendete Laser-Scanning-Mikroskop weist insbesondere eine Pinholeeinrichtung auf, bei dem die Größe des Pinholes manuell oder automatisch verstellt werden kann. Insbesondere verwendet diese Ausführungsform des Verfahrens ein Laser-Scanning-Mikroskop mit nur einen Detektor, der sowohl die teilkonfokale Abbildung als auch die Abbildung im Weitfeld aufnimmt. Darüber hinaus ist es bei dieser Ausführungsform möglich, die Uneindeutigkeit der Bestimmung der Höhenlage des Objekts an dem ersten Ort durch zwei Aufnahmen mit unterschiedlich großen Pinholes zu bestimmen.

Es ist bevorzugt, dass als Mikroskop ein Laser-Scanning-Mikroskop verwendet wird, wobei zum teilkonfokalen Abbilden und Abbilden im Weitfeld zwei Detektoren hinter einem Pinhole unterschiedlicher Größe vorgesehen werden.

Diese Ausführungsform kann alternativ oder zusätzlich zu der zuvor beschriebenen

Ausführungsform implementiert sein. Für die beiden Detektoren, die Teil einer

Detektoreinrichtung sein können, ist jeweils ein Pinhole unterschiedlicher Größe vorgesehen. Die beiden Pinholes bilden insbesondere eine Pinholeeinrrichtung. Das größere der beiden Pinholes ist speziell zur Erzeugung einer Abbildung im Weitfeld vorgesehen, wobei das kleine Pinhole zur Erzeugung der teilkonfokalen Abbildung verwendet werden kann.

Bevorzugter Vorteil dieser Ausführungsform ist, dass das Weitfeldbild und die teilkonfokale Abbildung gleichzeitig erzeugt werden können, beispielweise indem ein Strahlteiler vorgesehen wird. Somit kann bei dieser Ausführungsform bei jeder Bestimmung der Höhenlage an dem ersten Ort die Weitfeldintensität gleichzeitig mit der teilkonfokalen Intensität bestimmt werden, so dass das Verfahren bei dieser Ausführungsform des Mikroskops besonders schnell ist.

Es ist bevorzugt, dass als Mikroskop ein Laser-Scanning-Mikroskop verwendet wird, wobei zum Abbilden im Weitfeld eine Weitfeldkamera verwendet wird. In dieser Ausgestaltung wird das Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Weitfeldkamera versehen, auf welche, beispielweise mit Hilfe eines Strahlteilers, ein Anteil der Strahlung des Abbildungsstrahlengangs gelenkt wird. Die Abbildung im Weitfeld und die teilkonfokale Abbildung werden dabei vorzugsweise lateral und vertikal übereinandergelegt. In dieser Ausgestaltung ist es insbesondere möglich, die teilkonfokale Abbildung und die Abbildung im Weitfeld gleichzeitig aufzunehmen.

Es ist bevorzugt, dass als Mikroskop ein konfokales Topographie-Mikroskop verwendet wird, bei dem ein Gitter als Pinhole verwendet wird, wobei zum teilkonfokalen Abbilden eine erste Kamera mit dem Gitter und zum Abbilden im Weitfeld eine zweite Kamera verwendet wird.

Konfokale Topographie-Mikroskope dienen insbesondere zur Bestimmung der Topographie eines Objekts, wobei das Objekt in einem großen Wellenlängenbereich abgebildet wird.

Konfokale Topographie-Mikroskope sind aus dem Stand der Technik bekannt. Im Unterschied dazu wird in dem Abbildungsstrahlengang gemäß dieser Ausführungsform ein Strahlteiler eingebaut, welcher die Abbildungsstrahlung auf die erste Kamera und die zweite Kamera lenkt. Mithilfe der ersten Kamera und dem davor vorgesehenen Gitter kann eine teilkonfokale Abbildung des Objekts erzeugt werden, wohingegen mit der zweiten Kamera ein Weitfeldbild des Objekts dargestellt werden. Auch hier ist es wieder von Vorteil, dass die teilkonfokale Abbildung und die Abbildung im Weitfeld gleichzeitig aufgenommen werden kann. Das Gitter kann Teil einer Pinholeeinrichtung sein, während die erste Kamera und die zweite Kamera Teil einer Detektoreinrichtung sein können.

Es ist bevorzugt, dass als Mikroskop ein konfokales Airy-Mikroskop verwendet wird, bei dem das Objekt auf eine Detektoreinrichtung abgebildet wird, die mehrere Pixel aufweist, und der eine Beugungsstruktur der teilkonfokalen Abbildung auflöst, wobei die Weitfeldintensität und die teilkonfokale Intensität aus einer Aufnahme bestimmt werden.

Airy-Mikroskope erlauben es, den ersten Ort des Objekts derart abzubilden, dass die

Beugungsstruktur der Abbildung mithilfe der Pixel der Detektoreinrichtung aufgelöst werden können. Da auf dem Detektor der Beugungsverlauf der Abbildung dargestellt wird, können auf der Detektoreinrichtung gleichzeitig die teilkonfokale Intensität als auch die Intensität in Weitfeldabbildung erfasst werden. Somit ist es möglich, die teilkonfokale Abbildung und die Abbildung im Weitfeld gleichzeitig aufzunehmen.

Es ist bevorzugt, dass als Mikroskop ein konfokales Airy-Mikroskop verwendet wird, bei dem das Objekt auf eine Detektoreinrichtung abgebildet wird, die mehrere Pixel aufweist, und der eine Beugungsstruktur der teilkonfokalen Abbildung auflöst, wobei zum Abbilden im Weitfeld eine Weitfeldkamera verwendet wird.

In dieser Ausgestaltung wird das Airy-Mikroskop mit einer Weitfeldkamera versehen, auf welche, beispielweise mit Hilfe eines Strahlteilers, ein Anteil der Strahlung des

Abbildungsstrahlengangs gelenkt wird. Die Abbildung im Weitfeld und die teilkonfokale Abbildung werden dabei vorzugsweise lateral und vertikal übereinandergelegt. In dieser Ausgestaltung ist es insbesondere möglich, die teilkonfokale Abbildung und die Abbildung im Weitfeld gleichzeitig aufzunehmen.

Die Erfindung betrifft ferner ein Mikroskop zur Erzeugung einer teilkonfokalen Abbildung und einer Abbildung im Weitfeld eines Objekts, wobei das Mikroskop eine Detektoreinrichtung zur Erfassung der Abbildung des Objekts, eine Pinholeeinrichtung zur Bereitstellung einer teilkonfokalen Abbildung sowie eine Aufnahme im Weitfeld, eine Fokussiereinrichtung, welche ausgebildet ist, einen Fokus der teilkonfokalen Abbildung einzustellen, und eine

Steuereinrichtung zur Steuerung der Pinholeeinrichtung, welche mit der Detektoreinrichtung verbunden ist, aufweist. Das Mikroskop bildet das Objekt entlang einer z-Richtung, welche mit der Höhenrichtung des Objekts übereinstimmt, mit einer Punktbildverwaschungsfunktion ab. Die Steuereinrichtung ist ausgebildet, das Verfahren, wie es zuvor geschildert wurde,

durchzuführen.

Das Mikroskop kann ein Laser-Scanning-Mikroskop, ein Airy-Mikroskop, oder ein konfokales Topographie-Mikroskop sein. Das Mikroskop kann eine Lichtquelle umfassen, die Weißlicht oder Licht einer bestimmten Wellenlänge bereitstellt, je nachdem , wie es für die Abbildung des Objekts notwendig ist. Die Detektoreinrichtung weist insbesondere Detektoren auf, mittels welchen einfallende Strahlung in elektrische Signale umgewandelt werden kann, wobei diese elektrischen Signale an die Steuereinrichtung weitergeleitet werden.

Die Pinholeeinrichtung weist bevorzugt ein Pinhole auf, mittels welchem das Objekt teilkonfokal auf die Detektoreinrichtung abgebildet werden kann. Das Pinhole kann in der Größe verstellbar sein, so dass mittels der Pinholeeinrichtung auch eine Abbildung im Weitfeld erzeugt werden kann. Alternativ kann das Pinhole aus dem Abbildungsstrahlengang entfernt werden, so dass auf diese Weise eine Abbildung im Weitfeld dargestellt werden kann. Bei dem

Topographiemikroskop sind bevorzugt mehrere Pinholes oder Gitter vorgesehen, welche auf einer Maske angeordnet sind, die lateral durch den Abbildungsstrahlengang bewegbar ist. Dabei weisen die Pinholes unterschiedliche Durchmesser beziehungsweise die Gitter unterschiedliche Gitterkonstanten auf. Die Fokussiereinrichtung ist ausgebildet, den Fokus der teilkonfokalen Abbildung einzustellen. Dazu kann die Fokussiereinrichtung eine Optik aufweisen, mittels welcher die Lage der Fokalebene auf dem Objekt verändert werden kann. Alternativ kann die Fokussiereinrichtung das Objekt in z-Richtung bewegen und dadurch die Lage der Fokalebene der Abbildung verändern. Letztlich kommt es nur auf eine Relativverschiebung zwischen Fokalebene und Objekt an.

Das Mikroskop kann ferner eine Positioniereinrichtung, welche ausgebildet ist, den ersten Ort gegenüber der Detektoreinrichtung lateral zu verschieben, aufweisen. Die Positioniereinrichtung kann als Scanner ausgebildet sein, mittels welchem das Objekt gegenüber der

Detektoreinrichtung bewegt werden kann. Alternativ kann der Strahlengang zur Beleuchtung des Objekts derart moduliert werden , dass sich dadurch der erste Ort gegenüber der

Detektoreinrichtung verändern lässt; dies ist beispielsweise bei einem Laser-Scanning- Mikroskop implementiert.

Es ist bevorzugt, dass die Detektoreinrichtung einen ersten Detektor für die teilkonfokale Abbildung und einen zweiten Detektor für die Abbildung im Weitfeld umfasst.

Die Steuereinrichtung dient insbesondere zur Steuerung der oben genannten Einrichtungen und zur Durchführung des zuvor beschriebenen Verfahrens. Insbesondere gelten die für das

Verfahren angestellten Überlegungen, bevorzugte Ausführungsformen und Vorteile hinsichtlich des Mikroskops analog.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen , sondern auch in anderen

Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen :

Fig. 1 ein Laser-Scanning-Mikroskop als erste Ausführungsform eines Mikroskops zur

Ausführung eines Verfahrens zur Ermittlung einer Höhenlage eines Objekts; Fig. 2 eine Blockdarstellung zur Illustrierung der Verfahrensschritte;

Fig. 3 ein Diagramm zur Darstellung der Kalibration des Verfahrens; Fig. 4 ein Diagramm zur Darstellung der für das Verfahren verwendeten, bestimmten und gemessenen Intensitäten;

Fig. 5 ein Airy-Mikroskop als zweite Ausführungsform eines Mikroskops zur Ausführung des Verfahrens; und

Fig. 6 ein konfokales Topographie-Mikroskop als dritte Ausführungsform eines Mikroskops zur Ausführung des Verfahrens. Ein Laser-Scanning-Mikroskop 10 dient zur scannenden Abbildung eines Objekts 12, wobei auf dem Laser-Scanning-Mikroskop 10 ein nachstehend beschriebenes Verfahren zur Bestimmung einer Höhenlage des Objekts 12 durchgeführt werden kann.

Das Laser-Scanning-Mikroskop 10 weist eine Lichtquelle 14, eine Detektoreinrichtung 16, eine Pinholeeinrichung 18, eine Fokussiereinrichtung 20, eine Positioniereinrichtung 22, eine Steuereinrichtung 24 und einen Strahlteiler 26 auf.

Die Lichtquelle 14 ist z. B. ein Laser, eine Light Emitting Diode (LED) oder andere monochrome Lichtquelle, welche Licht einer Wellenlänge aussendet, das in dem Objekt 12

Fluoreszenzfarbstoffe zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt. Eine von der Lichtquelle 14 erzeugte Strahlung eines Beleuchtungsstrahlengangs 28 wird auf den Strahlteiler 26 gerichtet, welcher als dichroitischer Spiegel ausgebildet ist. Der Strahlteiler 26 reflektiert das Licht des Beleuchtungsstrahlengangs 28 auf die Positioniereinrichtung 22. Die Positioniereinrichtung 22 weist einen Scanner, z. B. zwei beweglich aufgehängte Spiegel, auf, die in Fig. 1 nicht dargestellt sind. Mittels des Scanners kann die Positioniereinrichtung 22 den Beleuchtungsstrahlengang 28 auf verschiedene Orte des Objekts 12 richten. Die

Ablenkung der Beleuchtungsstrahlung wird durch die Steuereinrichtung 24 gesteuert, welche mit der Positioniereinrichtung 22 verbunden ist. Insbesondere lenkt die Positioniereinrichtung 22 den Beleuchtungsstrahlengang 28 scannend über das Objekt 12. Alternativ wird ein das Objekt 12 tragender Probentisch verstellt.

Von der Positioniereinrichtung 22 gelangt die Beleuchtungsstrahlung 28 zu der

Fokussiereinrichtung 20, welche als Objektiv ausgestaltet ist. Mittels der Fokussiereinrichtung 20 wird der Fokus des Beleuchtungsstrahlengangs 28 auf das Objekt 12 in einer z-Richtung verändert. Die z-Richtung stimmt mit der Höhenläge des Objekts 12 überein und liegt senkrecht zu einer lateralen Richtung des Objekts 12, welche durch eine x- und y-Richtung definiert ist. Die Fokussiereinrichtung 20 weist mehrere zueinander bewegliche Linsen auf, die z. B. mittels eines Elektromotors betätigt werden. Die Fokussiereinrichtung 20 ist ebenfalls mit der

Steuereinrichtung 24 verbunden, so dass die Steuereinrichtung 24 den Fokus des Laser- Scanning-Mikroskops 10 verändern kann. Der Fokus stimmt mit einer z-Messposition des Laser-Scanning-Mikroskops 10 überein. Von der Fokussiereinrichtung 20 läuft der

Beleuchtungsstrahlengang 28 zum Objekt 12, welches an einem Probenhalter 30 befestigt ist.

Mittels der Fokussiereinrichtung 20 kann der Fokus längs der z-Richtung variiert werden. Mittels der der Positioniereinrichtung 22 kann der Fokus des Beleuchtungsstrahlengangs 28 in einer x-Richtung und einer y-Richtung, welche beide senkrecht zu der z-Richtung sind, lateral verschoben werden.

In dem Objekt 12 sind Fluoreszenzfarbstoffe vorgesehen, welche durch die

Beleuchtungsstrahlung angeregt werden und Licht in einen Abbildungsstrahlengang 32 aussenden. Sind in dem Objekt 12 keine Fluoreszenzfarbstoffe vorhanden, wird die

Beleuchtungsstrahlung teilweise von dem Objekt 12 in den Abbildungsstrahlengang 32 reflektiert. Der Abbildungsstrahlengang 32 verläuft in umgekehrtem Weg zum

Beleuchtungsstrahlengang 28 bis zum Strahlteiler 26. Aufgrund der Tatsache, dass das Fluoreszenzlicht eine andere Wellenlänge als Beleuchtungsstrahlung hat, kann die Strahlung im Abbildungsstrahlengang 32 den dichroitischen Strahlteiler 26 passieren und gelangt zur Pinholeeinrichtung 18, welche ein Pinhole aufweist, dessen Größe verstellt werden kann.

Alternativ kann statt des dichroitischen Strahlteilers 26 ein teilreflektiver Strahlteiler vorgesehen sein, insbesondere dann wenn die Beleuchtungsstrahlung von dem Objekt 12 reflektiert wird. Insbesondere hat die Pinholeeinrichtung einen Elektromotor, der die Größe des Pinholes stufenlos oder schrittweise verändert. Die Pinholeeinrichtung 18 ist mit der Steuereinrichtung 24 verbunden, so dass die Steuereinrichtung 24 die Größe des Pinholes einstellt.

Das Pinhole liegt in einer Zwischenbildebene des Abbildungsstrahlengangs 32. Ihm

nachgeordnet ist die Detektoreinrichtung 16, welche einen Detektor zur Umwandlung der Strahlung des Abbildungsstrahlengangs 32 in elektrische Signale aufweist. Die elektrischen Signale werden an die Steuereinrichtung 24 weitergeleitet, welche die daraus die Intensität der Strahlung im Abbildungsstrahlengang 32 bestimmen kann.

Das Laser-Scanning-Mikroskop 10 erzeugt eine teilkonfokale Abbildung dadurch, dass das Pinhole der Pinholeeinrichtung 18 klein eingestellt wird, beispielweise 50-300 % größer als ein Pinhole, das das Objekt 12 beugungsbegrenzt abbildet. Zur Erzeugung einer Abbildung im Weitfeld wird das Pinhole der Pinholeeinrichtung 18 im Vergleich zur teilkonfokalen Abbildung weiter vergrößert, so dass die Abbildung hauptsächlich Anteile im Weitfeld aufweist. Das Verfahren zum Betreiben des Laser-Scanning-Mikroskops 10 wird mithilfe des

Blockschaltbilds von Fig. 2 erläutert. Das Verfahren dient dazu, eine Höhenlage des Objekts 12 an einem ersten Ort des Objekts 12 zu bestimmen. Der erste Ort kann ein beliebiger Ort des Objekts 12 sein. Insbesondere wird das Verfahren an mehreren ersten Orten wiederholt, so dass mehrere Höhenlagen des Objekts 12 bestimmt werden könne, woraus sich die

Topographie des Objekts 12 ableiten lässt.

Das Verfahren umfasst drei wesentliche Schritte: Schritt S1 dient zur Kalibrierung eines Skalierungsfaktors Sk, Schritt S2 dient zur Kalibrierung eines Verknüpfungsfaktors Vk und Schritt S3 dient zur Berechnung der Höhenlage des ersten Ortes.

Zunächst wird die Kalibration des Skalierungsfaktors Sk in Schritt S1 erläutert. Die Kalibration des Skalierungsfaktors Sk kann an dem Objekt 12 oder einem Kalibrationsobjekt erfolgen, das insbesondere ähnliche Eigenschaften hinsichtlich der Reflektion und Streuung von Licht wie das Objekt 12 aufweist. In dem nachfolgenden Ausführungsbeispiel wird die Kalibration des

Skalierungsfaktors Sk an dem Objekt 12 an einem Kalibrationsort, welcher eine Stelle auf dem Objekt 12 ist, diskutiert. Der Kalibrationsort ist ein Beispiel für den ersten Kalibrationsort.

In Schritt S1 .1 wird ein z-Stapel aus mehreren teilkonfokalen Abbildungen des Kalibrationsorts aufgenommen. Die Abbildungen werden im Tiefenschärfebereich der teilkonfokalen Abbildung vorgenommen, wobei die Pinholeeinrichtung 18 eine erste Größe für das Pinhole einstellt. Für jede teilkonfokale Abbildung wird die Intensität bestimmt, so dass sich in Schritt S1 .2 ein Intensitätsverlauf IK (Z) in Abhängigkeit von der Messposition z des Fokus ergibt. Dies ist beispielweise in Fig. 3 dargestellt. Anhand des Intensitätsverlaufs Ik (z) lässt sich eine maximale Kalibrationsintensität lk,max bestimmen, welche an der Position des Fokus Zk.max vorliegt.

In Schritt S1 .3 wird eine Kalibrationsweitfeldintensität IKWI bestimmt, indem die

Pinholeeinrichtung 18 auf eine zweite Größe für das Pinhole, welche größer als die erste Größe ist, eingestellt wird. Die zweite Größe des Pinholes ist derart, dass bei der Intensität der Abbildung die Intensität der Weitfeldabbildung dominiert. Die zweite Größe ist beispielsweise 5- 10-mal größer als die erste Größe. In Schritt S1 .4 wird der Skalierungsfaktor Sk der, folgende Gleichung erfüllt, berechnet:

In Teilschritt S2.1 von Schritt S2 wird eine Punktbildverwaschungsfunktion PSF(z) in z-Richtung des Laser-Scanning-Mikroskops 10 bestimmt. Dieser Schritt ist nicht notwendig, wenn die Punktbildverwaschungsfunktion PSF(z) für das Laser-Scanning-Mikroskop 10 bereits bekannt ist. In Schritt S2.2 wird an einem zweiten Kalibrationsobjekt, welches mit dem ersten

Kalibrationsobjekt übereinstimmen kann, oder an dem Objekt 12 an einem zweiten

Kalibrationsort, welcher mit dem ersten Kalibrationsort übereinstimmen kann, eine teilkonfokale Abbildung des zweiten Kalibrationsorts vorgenommen. Die Größe des Pinholes wird auf die erste Größe eingestellt. Der Fokus der teilkonfokalen Abbildung befindet sich an einer

Kalibrationsmessposition ZM , welche im Tiefenschärfebereich der teilkonfokalen Abbildung liegt. Im Anschluss daran wird eine teilkonfokale Kalibrationsintensität IM der teilkonfokalen Abbildung des zweiten Kalibrationsorts an der Kalibrationsmessposition ZM bestimmt.

In Schritt S2.3 wird eine konfokale Abbildung des zweiten Kalibrationsorts vorgenommen. Der Fokus der konfokalen Abbildung befindet sich ebenfalls an der Kalibrationsmessposition ZM . Im Anschluss daran wird eine konfokale Kalibrationsintensität IM ^* der konfokalen Abbildung des zweiten Kalibrationsorts an der Kalibrationsmessposition ZM bestimmt. Die konfokale Abbildung wird dadurch erzeugt, dass die Größe des Pinholes der Pinholeeinrichtung 18 derart eingestellt wird, dass sie mit der Beugungsgrenze der Abbildung übereinstimmt. Die konfokale

Kalibrationsintensität IM ^* stimmt mit der Intensität der Punktbildverwaschungsfunktion PSF(z) an der Kalibrationsmessposition Zki überein. In Schritt S2.4 wird auch eine Kalibrationsweitfeldintensität IKW2 bestimmt. Dies erfolgt analog zur Bestimmung der Kalibrationsweitfeldintensität IKWI in Schritt S1 .3.

Der Verknüpfungsfaktor Vk wird in Schritt S2.5 aus der teilkonfokalen Kalibrationsintensität lki , der konfokalen Kalibrationsintensität IM ^* und der Kalibrationsweitfeldintensität I kW2 gemäß folgender Gleichung bestimmt:

Im Folgenden wird erläutert, wie in Schritt S3 die Topographie bei dem kalibrierten Laser- Scanning-Mikroskop 10 bestimmt wird. Dazu wird in Schritt S3.1 der erste Ort des Laser-

Scanning-Mikroskops 10 teilkonfokal abgebildet, wobei der Fokus an einer z-Messposition zi , welche im Tiefenschärfenbereich liegt, liegt. Das Pinhole wird dabei auf die erste Größe eingestellt. Im Anschluss daran wird die teilkonfokale Intensität h bestimmt. Aus der teilkonfokalen Intensität h wird in Schritt S3.2 mithilfe des Verknüpfungsfaktors Vk und der oben beschriebenen Gleichung (2) die der Punktbildverwaschungsfunktion PSF entsprechende teilkonfokale Intensität h ^* berechnet. Die der Punktbildverwaschungsfunktion PSF

entsprechende Intensität h ^* entspricht der Intensität der Punktbildverwaschungsfunktion PSF an der z-Messposition zi . An der z-Messposition zi wird in Schritt S3.3 eine weitere teilkonfokale Abbildung

vorgenommen, bei der das Pinhole gegenüber der ersten vorgenommenen teilkonfokalen Abbildung verändert ist. Dazu kann das Pinhole größenverstellbar ausgedildet sein oder die Pinholes werden ausgestauscht. Aus dieser weiteren teilkonfokalen Abbildung mit verändertem Pinhole lässt sich eine weitere teilkonfokale Intensität h, _P in berechnen.

Durch Vergrößerung des Pinholes der Pinholeeinrichtung 18 wird, wie oben beschrieben, in Schritt S3.4 eine Abbildung des ersten Orts im Weitfeld erzeugt und daraus die

Weitfeldintensität Iw bestimmt. Mithilfe von Gleichung (1 ) und dem Skalierungsfaktor Sk wird die maximale Intensität Lax ^* der Punktbildverwaschungsfunktion PSF berechnet.

Aus dem Verknüpfungsfaktor Vk, der erwarteten maximalen Intensität Lax ^* und der der Punktbildverwaschungsfunktion PSF entsprechenden Intensität h ^* wird in Schritt S3.5 mit Hilfe von Gleichung (2) eine z-Koordinate Zh des Fokus bestimmt, welche mit der z-Koordinate der maximalen Intensität Lax ^* der Punktbildverwaschungsfunktion PSF übereinstimmt. Da nur zwei Werte zur Bestimmung verwendet werden, ist die Bestimmung nicht immer eindeutig, wie dies in Fig. 4 durch die beiden Bereiche in z-Richtung Δζι und Δζι' angedeutet wird. Mit Hilfe der weiteren teilkonfokalen Intensität h, _P in lässt sich nun bestimmen, wie der Verlauf der

Punktbildverwaschungsfunktion PSF ist, so dass festgelegt werden kann, welcher der Abstände Δζι und Δζι ' der korrekte ist, so dass die z-Messposition Zh eindeutig bestimmt werden kann. Die z-Koordinate Zh des Fokus entspricht der Höhenlage des Objekts 12 an dem ersten Ort. Schritte S3.1 bis S3.5 werden jedem der zu messenden Orte wiederholt, während Schritte S1 bis S2 nur einmal ausgeführt werden.

Eine zweite Ausführungsform eines Mikroskops zur Durchführung des Verfahrens ist in Fig. 5 schematisch dargestellt. Hier wird ein Airy-Mikroskop 100 verwendet, dessen schematischer Aufbau mit dem Laser-Scanning-Mikroskop 10, bis auf die folgenden dargestellten

Unterschiede übereinstimmt:

Eine Positioniereinrichtung 122 des Airy-Mikroskops 100 funktioniert nicht durch Ablenkung der Strahlung des Beleuchtungsstrahlengang 28, sondern durch Bewegung des Objekts 12 gegenüber dem Beleuchtungsstrahlengang 28 mittels eines Scanners, welche die

Positioniereinrichtung 122 bildet. Der Scanner bewegt den Probenhalter 30. Allerdings kann auch eine Positioniereinrichtung 122, wie bei dem Laser-Scanning-Mikroskop 10 beschrieben, verwendet werden. Die Positioniereinrichtung 122 ist auch hier mit der Steuereinrichtung 24 verbunden, so dass die Steuereinrichtung 24 die Positionierung des Objekts 12 gegenüber dem Beleuchtungsstrahlengang 28 einstellen kann. Eine Detektoreinrichtung 1 16 weist mehrere Pixel auf, welche die Beugungsstruktur der teilkonfokalen Abbildung auflösen. Die Funktionsweise des Airy-Mikroskops 100 unterscheidet sich von der Funktionsweise des Laser-Scanning-Mikroskops 10 hinsichtlich des Prinzips der Bestimmung der Höhenlage an dem ersten Ort des Objekts 12 nicht. Lediglich die Erzeugungen der teilkonfokalen Abbildung und der Abbildung im Weitfeld unterscheiden sich. Da mit Hilfe der Detektoreinrichtung 1 16 die Beugungsstruktur aufgelöst werden kann, weisen die von den Pixeln gemessenen Intensitäten einer einzigen teilkonfokalen Abbildung die teilkonfokale Intensität h sowie die Weitfeldintensität lw auf. Somit ist es möglich, m it einer einzigen teilkonfokalen Abbildung beide für die Berechnung der Höhenläge des ersten Orts benötigten Intensitäten h und lw zu bestimmen.

Das oben beschriebene Verfahren zur Bestimmung der teilkonfokalen Intensität h (Schritt S3.1 ) und der der Punktbildverwaschungsfunktion PSF entsprechenden teilkonfokalen Intensität h * (Schritt S3.2) wird an einer zweiten Messposition Z2 wiederholt, woraus sich die teilkonfokale Intensität I2 und eine der Punktbildverwaschungsfunktion PSF entsprechende teilkonfokale Intensität I2* ergibt. Eine weitere teilkonfokale Abbildung m it geänderter Größe des Pinholes

(Schritt S3.3) wird bei dem Airy-Mikroskops 100 nicht durchgeführt, sondern Schritt S3.5 erfährt folgende Abwandlung.

Man hat nun drei Punkte der Punktbildverwaschungsfunktion PSF, näm lich die der

Punktbildverwaschungsfunktion PSF ensprechenden Intensitäten h * und I2* sowie der maximale Wert Punktbildverwaschungsfunktion PSF, die Intensität Lax ^* . Anhand dieser Werte lässt sich die PSF, dessen Form bekannt ist, fitten , sodass die z-Koordinate Zh der maximalen Intensität Lax ^* erm ittelt werden kann. Diese z-Koordinate Zh entspricht die Höhenlage des Objekts 12 an dem ersten Ort, so dass der erste Ort aus den beiden teilkonfokalen Abbildungen an den Messpositionen zi und Z2 erm ittelt werden kann.

Eine weitere Ausführungsform eines Mikroskops wird anhand von Fig. 6 erläutert. In Fig. 6 ist schematisch ein konfokales Topographie-Mikroskop 200 dargestellt, welches sich von dem Laser-Scanning-Mikroskop 10 und dem Airy-Mikroskop 100 lediglich durch die folgenden Unterschiede unterscheidet:

Das konfokale Topographie-Mikroskop 200 weist analog dem Airy-Mikroskop 100 eine Positioniereinrichtung 222 auf, welche ebenfalls als Scanner zur Bewegung des Probenhalters 30 umfasst. Auch hier ist die Ausgestaltung der Positioniereinrichtung nicht entscheidend. Eine Lichtquelle 214 kann als Laser, Light Emitting Diode (LED) oder jede andere monochrome Lichtquelle ausgestaltet sein, aber auch die Verwendung einer Weißlichtquelle ist möglich, welche Licht im kompletten sichtbaren Bereich erzeugt, so dass das Objekt 12 mit

Beleuchtungsstrahlung im sichtbaren Wellenlängenbereich beleuchtet wird.

Eine Detektoreinrichtung 216 weist eine erste Kamera 216a, eine zweite Kamera 216b und einen zweiten Strahlteiler 216c auf. Der zweite Strahlteiler 21 6c ist als teilreflektiver Spiegel ausgebildet, welcher 50% der Strahlung im Abbildungsstrahlengang 32 auf die erste Kamera 216a und 50% der Strahlung im Abbildungsstrahlengang 32 auf die zweite Kamera 21 6b lenkt. Eine Pinholeeinrichtung 218 ist als Maske m it mehreren Gittern unterschiedlichen

Gitterabstands ausgebildet, welche lateral durch den Abbildungsstrahlengang 32 bewegbar ist.

Mithilfe des konfokalen Topographie-Mikroskops 200 kann aufgrund des zweiten Strahlteilers 216c gleichzeitig ein Bild im Weitfeld m ithilfe der zweiten Kamera 216b, vor der kein Pinhole angeordnet ist, und eine teilkonfokale Abbildung m ithilfe der ersten Kamera 216a erzeugt werden. Die Funktionsweise stimmt insofern mit der Funktionsweise des Airy-Mikroskops 100 überein, da auch hier gleichzeitig eine teilkonfokale Abbildung und eine Abbildung im Weitfeld erzeugt werden.