Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Fertilität männlicher Säugetiere und des Menschen, ein Verfahren zur Empfängnisverhütung sowie ein Verfahren zur Erhöhung der Fertilität männlicher Säugetiere und des Menschen.

Fruchtbarkeit bzw. Fertilität ist eine der wichtigsten Voraussetzungen dafür, dass sich Organismen entwickeln und immer neu reproduzieren können. Aus diesem Grund sind Fertilitätsbestimmungen männlicher Säuger und die Erhöhung deren Fertilität von zentraler Bedeutung für den Prozess der Reproduktion.

Zur Bestimmung der Fertilität männlicher Säugetiere und des Menschen sind eine Reihe an Standardverfahren bekannt, die häufig auf einer Erfassung der Morphologie der Spermienzellen des zu untersuchenden Individuums, der Erfassung der Spermienkonzentration und/oder der Erfassung der Spermienmotilität basieren. Allerdings sind die Bewertungskriterien einiger dieser Tests relativ ungenau. Zudem kann ein Teil von ihnen nur in der präovulatorischen Phase durchgeführt werden. Beim Sims-Huhner ¹ Test beispielsweise wird 2 bis 6 Stunden nach der Kohabitation Schleim aus dem Gebärmutterhalskanal entnommen, und auf das Vorhandensein und die Anzahl beweglicher Spermien untersucht. Finden sich im Zervixschleim reichlich bewegliche normale Spermien, wird der Test als positiv bewertet, d.h. das Sperma des Mannes ist wahrscheinlich als fertil anzusehen, und es liegt keine funktionelle zervikale Störung vor.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein Verfahren zur Bestimmung der Fertilität männlicher Säugetiere und des Menschen zur Verfügung zu stellen, welches einfach durchzuführen ist und Rückschlüsse auf die Fertilität des untersuch- ten Individuums zulässt. Ferner wird angestrebt, ein Verfahren zur Erhöhung der Fertilität männlicher Säugetiere bereitzustellen, sowie ein Verfahren zur Empfängnisverhütung bei Säugetieren. Alle Verfahren sollen zudem den biologischen und hormonellen Haushalt eines Individuums möglichst wenig beeinflussen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch den kennzeichnenden Teil der Ansprüche 1 , 14 und 20 sowie durch die Ansprüche 19 und 25 gelöst.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde herausgefunden und nachgewie- sen, dass der Geschmacksrezeptor-Subtyp T1 R3 im Akrosomenbereich verschiedener Säugerspermien, d.h. in der vesikulären Kappe im Kopfbereich der Spermien, dem eine wichtige Funktion bezüglich der Vorbereitung für die eigentliche Fusion des Spermiums mit der Eizelle zukommt, vorkommt.

Dieser Rezeptor spielt nach ersten Erkenntnissen eine wichtige Rolle bei der Wegfindung der Spermien zu befruchtungsfähigen Eizellen und der Einleitung des Fusionsprozesses zwischen Spermien und Eizellen. Nach den bis jetzt erhaltenen Ergebnissen der vorliegenden Erfindung ist der T1 R3-Rezeptor demnach ein Indikator für die Fertilität männlicher Säugetiere und des Menschen. Dies war insbe- sondere deshalb unerwartet, weil der T1 R3-Rezeptor bisher nur als Geschmacksrezeptor charakterisiert wurde.

Die Aminosäuresequenzen des in verschiedenen Säugerspezies exprimierten T1 R3-Rezeptors sind bekannt und beispielsweise in der WO 03 / 001 876 A2 und US 2004 / 0 219 632 A1 offenbart. Aus den Aminosäuresequenzen lässt sich ableiten, dass es sich bei dem T1 R3-Rezeptor um ein etwa 850 Aminosäuren umfassendes Protein mit sieben Transmembranhelices und einer langen N- terminalen Domäne handelt. Aus der US 2004 / 0 185 469 A1 , der US 2004 / 0 175 793 A1 , der US 2004 / 0 191 862 A1 und der WO 03 / 001 876 A2 ist bekannt, dass der T1 R3-Rezeptor in Verbindung mit dem T1 R2-Rezeptor einen Geschmacksrezeptor für süße Kohlenhydrate, künstliche Süßstoffe sowie süße Proteine bildet, wohingegen der T1 R3-Rezeptor in Verbindung mit dem T1 R1 -Rezeptor einen Rezeptor für Umami-Geschmack (Glutamat) ergibt. Zudem wurde in der US 2004 / 0 219 632 A1 die Expression des T1 R3-Rezeptors in Geschmackspapillen umfassendem Zungengewebe nachgewiesen, wohingegen Zungengewebe ohne Geschmackspapillen diesen Rezeptor nicht exprimiert. Daneben wurde die Transkription des T1 R3-Rezeptor-Gens in Hoden, Thymus und im Gehirn beobachtet, wobei die entsprechenden Transkripte jedoch kürzer waren als jene aus Geschmackspapillen enthaltendem Zungengewebe. Ferner

wird die Nukleotidsequenz des humanen T1 R3-Rezeptors in der US 2004 / 01 320 775 A1 und der US 2004 / 0 219 632 A1 beschrieben. Ein heterolo- ges Expressionsverfahren für den humanen T1 R3-Rezeptor ist beispielsweise aus der US 2004 / 0 191 862 A1 bekannt. Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur Bestimmung der Fertilität männlicher Säugetiere und Menschen bereitgestellt, bei dem der Gehalt an T1 R3-Rezeptoren in Spermien des zu untersuchenden Individuums in vitro bestimmt wird. Da sich das erfindungsgemäße Verfahren einfach standardisieren lässt, kann es sowohl in der Humanmedizin, insbesondere bei der Überwachung von in wϊra-Fertilisationen oder bei Fertilisationsdiagnosen und Fertilisationsgutachten, als auch im Rahmen der modernen Tierzucht eingesetzt werden.

Vorzugsweise erfolgt die Quantifizierung des T1 R3-Rezeptor-Gehaltes in Spermien, indem ermittelte Messdaten mit einem Referenzwert verglichen werden. Auf diese Weise können zuverlässige Rückschlüsse auf die Fertilität der untersuchten Individuen gezogen werden. Als Referenzwert wird üblicherweise ein T1R3- Rezeptor-Normalwert in Spermien herangezogen. Dieser wird beispielsweise aus Vergleichskurven oder Vergleichstabellen ermittelt oder in Form von Vergleichswerten zugrunde gelegt. Vorzugsweise bestimmt man ihn parallel zur Analyse der Probe des zu untersuchenden Individuums und zwar durch Analyse einer Referenzprobe, die einen definierten Gehalt an rekombinant exprimiertem oder aus HEK Zellen gewonnenem T1 R3-Rezeptor aufweist. In dem letztgenannten Fall können systematische Fehler bei der Durchführung der Bestimmung ausgeschlossen werden. Liegt der Gehalt an T1 R3-Rezeptor der Probe unterhalb des Wertes der Referenzprobe, ist dies ein Hinweis auf mangelnde Fertilität der Spermien.

Gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bestimmung des T1 R3-Rezeptor-Gehalts durch Nachweis des T1 R3- Rezeptor-Transkripts in den Spermien mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Prinzipiell kann die PCR mit aus Hoden isolierter chromosomaler DNA als Matrizen-DNA und geeigneten Primern durchgeführt werden. Letztere sind an eine Amplifikation einer zumindest einen Teil des den T1 R3-Rezeptor kodierenden Genbereichs in der DNA umfassenden Nukleinsäuresequenz angepasst. Im An-

Schluss an die PCR wird das PCR-Produkt, beispielsweise durch Sequenzierung, auf Übereinstimmung mit einer den funktionsfähigen T1 R3-Rezeptor kodierenden Sequenz analysiert.

Um jedoch zuverlässigere Informationen über eine tatsächlich stattfindende Transkription des T1 R3-Rezeptor-Gens und somit über die Bildung und den Gehalt an T1 R3-Rezeptor in den Spermien zu erhalten, wird eine RT-PCR durchgeführt, wobei zunächst Gesamt-RNA oder mRNA aus Hoden des zu untersuchenden Individuums isoliert wird. Diese wird anschließend mit Reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben und letztere einer PCR mit geeigneten Primern unterzogen.

Vorzugsweise werden in der RT-PCR zwei oder mehr Primer eingesetzt, welche daran angepasst sind, eine zumindest einen Teil des den T1 R3-Rezeptor kodie- renden Genbereichs in der DNA umfassende Nukleinsäuresequenz zu amplifizie- ren

Zuverlässige Ergebnisse werden insbesondere erhalten, wenn eine quantitative PCR oder quantitative RT-PCR durchgeführt wird, wobei sich insbesondere eine Real Time PCR unter Einsatz von fluoreszenz-markierten Sonden oder unter Einsatz von fluoreszierenden, in die gebildeten PCR-Produkte interkalierenden Substanzen als besonders geeignet erwiesen hat. Geeignete Systeme hierfür sind beispielsweise das LightCycler ^® Real Time PCR System und das Taqman ^® - System der Firma Roche. Selbstverständlich kann die quantitative PCR auch mit jedem anderen dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Verfahren erfolgen.

Gemäß einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bestimmung des T1 R3-Rezeptor-Gehaltes in Spermien mittels immunologischer Methoden, die gegen Proteine gerichtet sind. Insbesondere immuncytochemische Verfahren, eine Bestimmung durch Radioimmunoassay (RIA) oder eine Bestimmung durch einen „Enzyme linked Immunosorbent Assay" (ELISA) haben sich als besonders geeignet erwiesen.

Bei dem letztgenannten Verfahren wird üblicherweise zuerst die zu untersuchende Probe an einer Oberfläche beispielsweise einer Mikrotiterplatte, einer Polyvinylchloridplatte oder einer geeigneten Gewebeplatte immobilisiert, bevor ein für das zu identifizierende Protein spezifischer Antikörper, hier ein spezifischer Antikörper für den im Akrosomenbereich der Spermien vorliegenden T1 R3-Rezeptor, aufgegeben wird. Sofern die Probe den T1 R3-Rezeptor enthält, bindet der Antikörper an die auf der Oberfläche immobilisierte Probe. Nach einem Waschschritt wird die Oberfläche schließlich mit einem zweiten den T1 R3-Rezeptor-Antikörper detektie- renden Sekundärantikörper (kommerziell erhältlich), der mit einem Enzym bei- spielsweise einer alkalischen Phosphatase oder Peroxidase gekoppelt ist, nachgewiesen. Nach einem erneuten Waschschritt wird der Probe schließlich ein farbloses bzw. nicht-fluoreszierendes Substrat für das am zweiten Antikörper gebundene Enzym zugefügt. Dieses Enzym wandelt das Substrat zu einem farbigen o- der fluoreszierenden Produkt um, dessen Konzentration durch einen geeigneten Detektor, beispielsweise ein Photometer bestimmt werden kann. Mit dem ELISA- Verfahren lassen sich selbst geringe Mengen des T1 R3-Rezeptors schnell und zuverlässig nachweisen. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es mit gebräuchlichen ELISA-Geräten und kommerziell erhältlichen Mikroti- terplatten im 96-, 256- oder gar 1024-Format betreibbar ist, weshalb sich eine große Anzahl von Analysen gleichzeitig durchführen lassen.

Bei dem RIA-Verfahren finden im Prinzip die gleichen Schritte wie beim ELISA- Verfahren statt, ausgenommen, dass anstelle eines mit einem geeigneten Enzym konjugierten zweiten Antikörpers ein radioaktiv markierter zweiter Antikörper ein- gesetzt wird. Die quantitative Detektion erfolgt in diesem Fall beispielsweise mittels eines Scintillationszählers.

Bei dem immuncytochemischen Verfahren werden die Spermien des zu untersuchenden Individuums vorzugsweise auf einer geeigneten Oberfläche fixiert und nach anschließender Blockierung der verbliebenen Oberflächenstellen mit einem T1 R3-rezeptor-spezifischen Antikörper inkubiert. Danach wird der gebundene erste Antikörper beispielsweise mit einem kommerziell erhältlichen FITC-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG behandelt und so für die Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, bevor man ihn, wie in Fig. 2 zu sehen, fluoreszenzmikroskopisch erfasst.

Mit diesem Verfahren lässt sich nicht nur die Menge des T1 R3-Rezeptors, sondern auch dessen genaue Lage in den Spermien des zu untersuchenden Individuums bestimmen.

Abgesehen von den vorgenannten Verfahren kann die Bestimmung des T1R3- Rezeptor-Gehalts in Spermien auch mit anderen dem Fachmann bekannten immunologischen Methoden quantifiziert werden, wobei lediglich beispielsweise das „Western-Blof-Verfahren bzw. das Dot-Blot-Verfahren genannt sei.

Gemäß einer dritten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bestimmung des T1 R3-Rezeptor-Gehalts in den Spermien bzw. deren Reaktivität, indem aus dem zu untersuchenden Individuum isolierte Spermien mit einem oder mehreren Geschmackstoffen, sprich den natürlichen Bindungspartnern des T1 R3-Rezeptors, kontaktiert und stimuliert werden. Diese umfassen Süßmittel wie die natürlich vorkommenden Zucker Sucrose, Glucose, Maltose, Galactose, Lactose und Fructose und die synthetisch hergestellten Verbindungen Acesulfam K, Saccharin. Aspartam, Dulcin, Cyclamat und SC-45647. Zu den Süßmitteln gehören auch Guanidin-1-Esssigsäure (GA-D, Guanidin-2-Essigsäure (GA-2), Glycyrrhizinsäure (GA), Neohesperidin Dihydrochalkon und weiterhin Süßstoffe mit Proteincharakter wie vorzugsweise Monellin, Thaumatin, Mabinlin, Pentadin, Brazzein, Curculin und Miraculin. Schließlich läßt sich wenigstens eine Aminosäure, vorzugsweise eine aus der aus Glutamat, L-Alanin, L-Prolin, L-Serin, L-Aspartat, L-Asparagin, L-Arginin und Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure oder deren entsprechendes Salz, insbesondere Alkali oder Erdalkalisalz als Geschmackstoff und Stimulans für den T1 R3-Rezep- tor in Spermien einsetzen. Nach der Kontaktierung, also nach der Bindung des Geschmackstoffs an eine dafür vorgesehene Bindungsstelle auf dem T1 R3- Rezeptor, wird die cytosolische Calciumkonzentration in den Spermien mit Hilfe membranpermeabler Calcium-sensitiver Farbstoffe, beispielsweise Fura2 oder Fluo bestimmt.

Gemäß einer vierten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bestimmung des Gehalts an intaktem T1 R3-Rezeptor-in den Spermien durch Bestimmung des Geschmacksprofils von männlichen Säugetieren oder be-

vorzugt von Männern beispielsweise mit Hilfe des „two bottle preference test" oder anderer Geschmackstests. Diese Verfahren zur Bestimmung der Schwellenwerte für bestimmte Geschmacksstoffe (Erstellung eines Geschmackssprofils) sind dem Fachmann bekannt (Feigin et al„, Neurosci Biobehav Rev.11 , pp 231-240, 1987; Ruiz et al., Chemical Senses, 28, pp, 573-579, 2003) und werden routinemäßig für Säuger und Menschen eingesetzt.

Vorzugsweise wird bei den Ausführungsformen drei und vier der Schwellenwert eines oder mehrerer Geschmackstoffe des zu untersuchenden Individuums be- stimmt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl zu medizinischen als auch zu nicht medizinischen Zwecken erfolgen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Empfängnisverhütung bei Säugetieren und Menschen, bei dem einem männlichen Säugetier oder einem Menschen wenigstens ein Inhibitor für den T1 R3-Rezeptor verabreicht wird.

Inhibitoren gemäß der Erfindung sind Stoffe, die mit dem T1 R3-Rezeptor in Wechselwirkung treten und eine Anlagerung von Geschmackstoffen an ihn erschweren oder vollständig unterbinden (kompetitive und nicht-kompetitive Antago- nisten). Insbesondere mit einer aus der aus Lactisol, Gurmarin, Cyclohexylessig- säure, Indolessigsäure und Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählten Verbindung werden besonders gute Ergebnisse erhalten. Auch Derivate dieser Verbindungen zählen zu den Inhibitoren. Genauso werden ein oder mehrere Vertreter aus einer Gruppe von Verbindungen verabreicht, die in der Lage sind, sich fest an Rezeptoren für den Süßgeschmack zu binden.

Jeder Inhibitor kann separat, in Kombination mit einem oder mehreren weiteren Inhibitoren und/oder zusammen mit pharmazeutisch verwendbaren Trägerstoffen, sprich als pharmazeutisch akzeptable Komposition verabreicht werden, wobei das Verhältnis von Inhibitor zu Trägerstoff durch die Löslichkeit bzw. chemische Be- schaffenheit des Inhibitors, durch den ausgewählten Verabreichungsweg und/oder durch in der pharmazeutischen Praxis allgemein übliche Vorgehensweisen bestimmt wird.

Pharmazeutisch akzeptable Kompositionen können den oder die Inhibitoren auch in Form eines Salzes, Esters, Amids oder als „Prodrug", sprich als inaktive Inhibitorvorstufe beinhalten. Für die örtliche Administration des Inhibitors umfassen sie Salben, Puder, Sprays oder Inhalationsmittel. Besagte Kompositionen stellt man her, indem der Inhibitor unter sterilen Bedingungen, mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff und möglichen Färb- und Geschmacksstoffen, Puffern oder Treibmitteln, je nach Bedarf, vermischt wird.

Die Verabreichung des Inhibitors bzw. seiner pharmazeutisch akzeptablen Kom- position erfolgt vorzugsweise oral, sublingual, rektal, parenteral, intrazisternal, intrathekal oder intravesikal (durch Instillation in die Blase).

Um eine Verdauung des Inhibitors im Magen-Darm-Trakt zu verhindern, wird er bzw. seine pharmazeutisch akzeptable Komposition besonders bevorzugt paren- teral zugeführt. Mögliche Formen der parenteralen Gabe sind eine intravaskuläre, beispielsweise intravenöse Gabe (mit einer Spritze in eine Vene), eine intramuskuläre Injektion (in einen Skelettmuskel), eine subkutane Injektion (unter die Haut), eine transdermale Gabe (z.B. mit einem "Pflaster"), eine intragenitale Verabreichung in das Geschlechtsorgan, eine intrapulmonale Gabe (als Aerosol oder Injektion), eine intraperitoneale Injektion (in die Bauchhöhle), eine intrakardiale Injektion (in das Herz) oder ein Auftrag auf die Schleimhäute (z.B. auf die Genitalschleimhaut, die Nasenschleimhaut oder lokal auf die Bindehaut), bzw. lokal als Puder, Salbe, Tropfen oder in Sprayform (Aerosol) bevorzugt im Genitalbereich. Parenteralia umfassen Injektionen, Infusionen, Pulver zur Herstellung einer Lösung, Konzentrate und Implantate.

Um die gleiche Wirkung wie mit parenteral verabreichten Mengen zu erzielen, müssen bei oraler Verabreichung größere Mengen an Inhibitor eingesetzt werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Schwangerschaften einfach und zuverlässig verhindert werden, ohne dass Nebenwirkungen bei den behandelten Individuen zu befürchten sind. Gegenüber den herkömmlichen Empfängnisverhütungsverfahren, wie hormonelle Verhütungsverfahren für Frauen, bei denen beispielsweise Östrogene bzw. Gestagene eingesetzt werden, oder hormonellen

Verhütungsverfahren für Männer auf der Basis von Testosteron, Gestagen und Etonogestrel, welche jeweils mit signifikanten Nebenwirkungen verbunden sind, bietet das erfindungsgemäße Empfängnisverhütungsverfahren erhebliche Vorteile. Es ist im Vergleich zu den bekannten Verhütungsmethoden kostengünstiger, zeigt nahezu keine Nebenwirkungen und ist sehr zuverlässig. Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl zu medizinischen als auch zu nicht medizinischen Zwecken erfolgen

Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Inhibitors für den T1 R3-Rezeptor zur Empfängnisverhütung bei Säugetieren und Menschen. Wie der Fachmann erkennt, kann die Verwendung sowohl zu medizinischen als auch zu nicht medizinischen Zwecken erfolgen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erhö- hung der Fertilität männlicher Säugetiere bzw. des Menschen, bei dem einem männlichen Säugetier oder Menschen wenigstens ein die Erkennung des T1 R3 Rezeptors potenzierender Ligand, insbesondere ein positiver allosterischer Modulator verabreicht wird.

Potenzierende Liganden im Sinne der Erfindung sind Moleküle, die an eine Bindungsstelle des T1 R3-Rezeptor binden, die beabstandet von der Bindungsstelle für Geschmackstoffe bzw. Inhibitoren angeordnet ist. Mit dem Rezeptor wechselwirkende potenzierende üganden bewirken, daß dieser eine noch größere Affinität für Geschmackstoffe bzw. Inhibitoren besitzt und/oder diese noch fester bindet. Ein aus der aus Monophosphaten insbesondere aus Inosinmonophosphat (IMP) und Guanosinmonophosphat (GMP) und Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählter Ligand liefert besonders gute Ergebnisse. Auch Derivate dieser Monophosphate zählen zu den potenzierenden Liganden.

Jeder potenzierende Ligand läßt sich separat, in Kombination mit einem oder mehreren weiteren Liganden und/oder zusammen mit pharmazeutisch verwendbaren Trägerstoffen, sprich als pharmazeutisch akzeptable Komposition verabreichen, wobei das Verhältnis von Ligand zu Trägerstoff durch die Löslichkeit bzw. chemische Beschaffenheit des Liganden, durch den ausgewählten Verabrei-

chungsweg und/oder durch in der pharmazeutischen Praxis allgemein übliche Vorgehensweisen bestimmt wird.

Pharmazeutisch akzeptable Kompositionen können den oder die Liganden auch in Form eines Salzes, Esters, Amids oder als „Prodrug", sprich als inaktive Ligan- denvorstufe beinhalten. Für die örtliche Administration des Liganden umfassen sie

Salben, Puder, Sprays oder Inhalationsmittel. Benannte Komposition erhält man, indem der oder die Liganden unter sterilen Bedingungen mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff und möglichen Färb- und Geschmacksstoffen, Puffern oder Treibmitteln, je nach Bedarf, vermischt wird.

Die Verabreichung des Liganden bzw. der pharmazeutisch akzeptablen Komposition erfolgt vorzugsweise oral, sublingual, rektal, parenteral, intrazistemal, intrathekal oder intravesikal (durch Instillation in die Blase).

Um eine Verdauung des Liganden im Magen-Darm-Trakt zu verhindern, wird er bzw. seine pharmazeutisch akzeptable Komposition besondes bevorzugt parenteral zugeführt. Mögliche Formen der parenteralen Gabe sind: eine intravaskuläre, beispielsweise intravenöse Gabe (mit einer Spritze in eine Vene), eine intramuskuläre Injektion (in einen Skelettmuskel), eine subkutane Injektion (unter die Haut), eine transdermale Gabe (z.B. mit einem "Pflaster"), eine intragenitale Verabreichung in das Geschlechtsorgan, eine intrapulmonale Gabe (als Aerosol oder Injektion), eine intraperitoneale Injektion (in die Bauchhöhle), eine intrakardiale Injektion (in das Herz), oder ein Auftrag auf die Schleimhäute (z.B. auf die Genitalschleimhaut, die Nasenschleimhaut oder lokal auf die Bindehaut), bzw. lokal als Puder, Salbe oder Tropfen oder in Sprayform (Aerosol) bevorzugt im Genitalbereich. Parenteralia: umfassen Injektionen, Infusionen, Pulver zur Herstellung einer Lösung, Konzentrate und Implantate.

Um die gleiche Wirkung wie mit parenteral verabreichten Mengen zu erzielen, müssen bei oraler Verabreichung größere Mengen an Ligand eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl zu medizinischen als auch zu nicht medizinischen Zwecken erfolgen.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines die Erkennung des T1 R3 Rezeptors potenzierenden Liganden, insbesondere eines positiven allosteri- schen Modulators zur Erhöhung der Fertilität von männlichen Säugetieren und Menschen. Wie der Fachmann erkennt, kann die Verwendung sowohl zu medizi- nischen als auch zu nicht medizinischen Zwecken erfolgen.

Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem Wortlaut der Ansprüche und der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnungen. Es zeigen:

Fig. 1 ein Agarosegel mit den in Beispiel 1 erhaltenen PCR-Produkten und

Fig. 2 einen immuncytochemischen Nachweis des T1 R3-Rezeptors in isolierten Spermien der Maus gemäß Beispiel 2.

Beispiel 1

Zum Nachweis einer Expression des T1 R3-Rezeptors in Testis wurde eine RT- PCR mit Maus-Hodengewebe und Gewebe circumvallater Geschmackspapillen als Positivkontrolle (CV) durchgeführt.

Hierzu wurden zunächst mit einem molekularbiologischen Standardverfahren Ge- samt-RNA aus Maushodenzellen und Gesamt-RNA aus circumvallaten Geschmackspapillen einer Maus isoliert. Anschließend wurde die RNA beider Proben getrennt voneinander in cDNA umgeschrieben, indem die Proben mit einem Oligo- dT-Primer bzw. „random" Hexamer-Primer hybridisiert und nach Zugabe eines Desoxynukleotidgemischs mit reverser Transkriptase inkubiert wurden. Danach wurde jeweils eine Teilmenge der so erhaltenen Proben mit einem für den T1 R3- Rezeptor spezifischen Primerpaar durch PCR amplifiziert, bevor jeweils eine Teilmenge der resultierenden Amplifikationsprodukte mit DNA-Proben-Puffer versetzt und in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt wurden. Das so erhaltene Gel ist in der Fig. 1 wiedergegeben.

Als T1 R3-Rezeptor spezifisches Primerpaar wurde ein Maus-spezifisches T1 R3 Primerpaar verwendet mit der Sequenz 5 ^' TGA GCT GGG CAA ACT GGC TA 3 ^x als kodierendem oder Sense-Primer und der Sequenz 5 ^* TCT TGG CAT TCC

TTC CCA GG 3 ^v als nicht kodierendem oder Antisense-Primer. Die PCR Reaktion wurde eine Minute lang bei einer Anlagerungstemperatur von 60 °C in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt. Dieses enthielt 20 -100 ng Maus cDNA, 0,4 μM jedes Primers, 0,4 mM dNTP, 1.5 mM MgCI ₂ und 2.5 U Taq DNA Polymerase (MasterTaq Kit, Eppendorf, Hamburg). Um die Größe der Amplifikationsprodukte anhand ihres molekularen Gewichts zu bestimmen, wurde ganz links auf dem Agarosegel ein Molekulargewichts-Standardmarker aufgebracht.

Wie aus der Fig. 1 ersichtlich, ließen sich sowohl mit dem Gewebe aus den Maus- Hoden als auch dem Gewebe aus den Geschmackspapillen PCR-Produkte des T1 R3-Rezeptors mit einer erwarteten Größe von jeweils 510 Basenpaaren (bp) erhalten. Dies zeigt, dass der T1 R3-Rezeptor, der bisher nur als Geschmacksrezeptor charakterisiert wurde, nicht nur in Geschmackspapillen, sondern auch in Säuger-Hoden exprimiert wird.

Beispiel 2

Um den in den Maus-Hoden exprimierten T1 R3-Rezeptor zu lokalisieren, wurden Spermien aus dem Nebenhoden (Epidydimis) der Maus isoliert und immuncyto- chemisch untersucht.

Hierzu wurden die Spermien mit eiskaltem Methanol auf einem Objektträger fixiert und nach anschließender Blockierung mit PBS/10% FCS mit einem T1 R3- rezeptorspezifischen Antikörper bei 4°C über Nacht inkubiert. Der T1 R3- spezifische Antikörper ist gegen die Aminosäuresequenz 239-254 des T1 R3- Mausrezeptors gerichtet (Damek et al., Science, 301 , pp. 850-853, 2003). Der verwendete T1 R3-spezifische Antikörper gegen den humanen Rezeptor erkennt die Aminosäuresequenz 829-843 (Damek et al., Science, 301 , pp. 850-853, 2003).

Danach wurde der gebundene Antikörper mit einem kommerziell erhältlichen FITC-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG behandelt, wodurch ersterer für die Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht wurde, bevor der so präparierte Objektträger unter dem Mikroskop betrachtet wurde.

Die jeweiligen Einzelbilder der Figur 2A und B zeigen links oben eine Kernfärbung mit Propidium Jodid, die daneben dargestellte Abbildung das entsprechende Durchlichtbild; darunter links ist die Markierung des T1 R3-Rezeptors durch den Nachweis mit dem FITC-markierten Antikörper zu sehen. Die Abbildung rechts unten zeigt die Überlagerung aller drei Einzelaufnahmen. Dabei wird ersichtlich, dass der T1 R3-Rezeptor ausschließlich im Akrosomenbereich der Spermien lokalisiert ist.