相对吸附常数的方法 技术领域

本发明属于生物医学技术领域， 具体地说， 本发明涉及一种利用扫描隧 道显^敫技术（Scanning Tunneling Microscopy, STM )测定染料、 抗体、 药物 和药物前体等分子在多肽上相对吸附常数的方 法。 背景技术

在药物设计和开发研究中，解析靶标蛋白与药 物相互作用的模式和结合 本质是极其重要的，一般可以用高通量的蛋白 质结晶和高分辨的 X射线晶体 衍射技术、二维核磁共振技术来进行研究（可 参考 Daniel Picot, Patrick J. Loll et al., Nature 1994, 367, 243.及 Aneta T. Petkova, Yoshitaka Ishii et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002, 99, 16742. ) 。

现在 X射线晶体衍射技术已经很成熟，但由于一些� �要的蛋白（例如膜 蛋白， 淀粉样蛋白）分子本身的难结晶性， 很难获得高质量的晶体学数据来 研究药物分子与蛋白的相互作用。 另外， 即使获得了蛋白和药物分子的共结 晶， 药物在靶标蛋白上的结合位点也 ^艮难保证具有周期性， 所以解析药物分 子与蛋白的相互作用仍然困难重重。核磁共振 技术可以精确解析溶液中的分 子结构， 避开了结晶的困难， 但能解析的分子质量有限制。

现也有大量研究基于超级计算机， 进行分子模拟并实现可视化， 得以模 拟蛋白与蛋白或蛋白与小分子相互作用的动态 过程，解析药物作用的结构基 础， 并设计新的药物分子。 但是计算机模拟与实验研究之间不可避免的存 在 着一些差距。所以急需发展实验研究方法获得 药物分子与蛋白或多肽相互作 用的作用位点和直观图像，在分子尺度上研究 药物分子在蛋白或多肽上的吸 附能力。本发明发展了一种新方法，利用扫描 隧道显微技术测定染料、抗体、 药物和药物前体等待测分子在多肽上的相对吸 附常数。 发明内容

本发明的目的在于， 提供一种测定待测分子在多肽分子上相对吸附 常 数的方法， 该方法包括如下步骤：

1 )将多肽分子和标记分子进行组装， 获得多肽分子与标记分子的组装 体的扫描隧道显微镜图像；

2 )将多肽分子、 标记分子和待测分子进行组装， 形成组装体， 以获得 所述待测分子在多肽分子和标记分子上吸附的 扫描隧道显微镜图像；

3 )对比步骤 1 )和步驟 2 ) 中获得的扫描隧道显微镜图像， 统计待测分 子吸附在多肽分子以及标记分子上的吸附数量 ；

4 )将步骤 3 )获得的待测分子在标记分子上的吸附数量归� �化为单位 1 , 确定待测分子在多肽分子上的相对吸附常数。

优选地， 在所述步骤 1 ) 中， 所述组装体的制备方法包括如下步骤： i )将所述多肽分子与所述标记分子充分混合， 形成混合液；

ii )将步骤 i )得到的混合液滴加到导电性基底， 例如石墨， 金、 银、 铜、 铂等金属基底以及硅等半导体基底表面， 以形成组装体。

其中， 多肽分子与标记分子形成组装体， 可以除去溶剂在固 /气界面获得 组装体的扫描隧道显微镜图像，也可保留溶剂 在基底 /溶液界面获得组装体的 扫描隧道显微镜图像。

优选地， 在所述步骤 2 ) 中， 所述组装体的制备方法包括如下步骤： i )将所述多肽分子、 所述标记分子以及所述待测分子充分混合， 形成混 合液；

ii )将步骤 i )得到的混合液滴加到导电性基底， 例如石墨， 金、 银、 铜、 铂等金属基底以及硅等半导体基底表面， 以形成组装体。

其中， 多肽分子、 标记分子以及待测分子形成组装体， 可以除去溶剂在 固 /气界面获得组装体的扫描隧道显微镜图像 , 也可保留溶剂在基底 /溶液界 面获得组装体的扫描隧道显微镜图像。

优选地， 在制备组装体中， 采用超声来充分混合。

优选地， 在制备组装体中， 所述导电性基底为石墨， 所述石墨优选为新 解理的高定向石墨。 高定向石墨具有原子级平整的表面， 而且在很多环境中 都很稳定， 适于扫描隧道显微镜的研究。

优选地， 在制备组装体中， 还包括除去所述基底表面残留液的步骤， 优 选地， 可以采用吹惰性气体（例如氮气）的方式来除 去所述基底表面的残留 液。

其中， 可以除去溶剂在固 /气界面获得组装体的扫描隧道显微镜图像，� � 可保留溶剂在基底 /溶液界面获得组装体的扫描隧道显微镜图像� �

优选地， 所述待测分子为染料、 抗体、 药物或药物前体分子等。

优选地， 所述染料为酞菁、 卟啉类分子及其衍生物， 刚果红、 石克磺素、 姜黄素及其衍生物； 所述抗体为淀粉质多肽分子抗体； 所述药物为吡啶、 嘧 啶、 吡嗪、 咪，唑、 吡咯等氮杂环类分子及其衍生物， 例如 4'4-联吡啶， 乙烯 吡啶， 三吡啶， 刚果红， 姜黄素； 所述药物前体为 υ磺素。

优选地， 所述多肽分子为五聚丙氨酸、 八聚苯丙氨酸和八聚组氨酸。 本 发明以五聚丙氨酸、 八聚苯丙氨酸和八聚组氨酸为例， 其他多肽也可以， 例 如 beta淀粉样多肽及其片段、 胰淀素多肽及其片段、 prion片段多肽、 寡聚 多肽、 嵌段寡聚多肽、 人工序列多肽等。

优选地， 所述标记分子为吡啶、 嘧啶、 吡嗪、 咪唑、 吡咯类氮杂环分子 及其衍生物， 例如 4，4-联吡啶、 乙烯吡啶， 三吡啶、 嘧啶等， 优选地， 所述 标" ^己分子为 4，4-联吡啶。

综上所述， 本发明的目的在于发展一种基于扫描隧道显微 镜的新方法， 在分子水平上研究蛋白或多肽与小分子的相互 作用， 测定染料、 抗体、 药物 和药物前体等待测分子在多肽上的相对吸附常 数。

在利用扫描隧道显微镜来测定染料、 抗体、 药物和药物前体等待测分子 在多肽上相对吸附常数的方法中， 获得多肽分子自组装结构的 STM图像之 后， 或通过与标记分子的共吸附获得多肽 -标记分子的共组装结构的 STM图 像之后， 加入染料、 抗体、 药物和药物前体等待测分子， 得到待测分子在多 肽上的结合位点和吸附数量， 并在分子水平上研究多肽和待测分子的相互作 用， 测定待测分子在多肽上相对吸附常数的方法。

本发明的一个实施方案通过识别多肽分子组装 特征，来测定染料、抗体、 药物和药物前体等待测分子在多肽上相对吸附 常数， 包括如下步骤：

1 ) 制备多肽分子 （或与标记分子共混） 溶液， 超声 10分钟；

2 ) 在多肽分子的溶液中， 或多肽分子与标记分子的混合溶液中， 加 入染料、 抗体、 药物或药物前体等待测分子溶液， 使其充分混合；

3 ) 混合之后，取 15微升溶液滴在新解理的高定向石墨表面，静� �� 10 分钟；

4 ) 用高纯氮气把残留在石墨表面的溶液吹走；

5 ) 用扫描隧道显 4 镜来进行测定， 统计出高分辨扫描隧道显敖镜图 像中染料、 抗体、 药物或药物前体等待测分子在多肽分子上的结 合位点和吸 附数量， 并得到吸附常数的相对关系。

本发明至少具有以下有益效果：

本发明利用扫描隧道显微镜对染料、 抗体、 药物或药物前体等分子在多 肽上的相对吸附常数进行测定， 能清楚地识别多肽分子二维组装的方向性， 并在此基础上， 通过加入染料、 抗体、 药物或药物前体分子后得到分子在多 肽上的结合位点和吸附数量， 并由此得到不同多肽对于分子的相对吸附能 力， 即分子在多肽上的相对吸附常数。

本发明利用扫描隧道显微技术， 可在分子水平上研究药物分子与蛋白质 分子的相互作用， 药物分子在蛋白分子上的作用位点和吸附能力 ， 不受蛋白 结晶性的影响， 也不受结合信号强弱的影响。 本发明采用多肽分子与标记分子形成组装体， 或者采用多肽分子、 标记 分子以及待测分子形成组装体，可以除去溶剂 在固 /气界面获得组装体的扫描 隧道显微镜图像，也可保留溶剂在基底 /溶液界面获得组装体的扫描隧道显微 镜图像。

本发明釆用的高定向石墨具有原子级平整的表 面， 在很多环境中都很稳 定， 适于扫描隧道显微镜的研究。 本发明对于解析靶标蛋白与药物相互作用 的模式和结合本质具有非常重要的意义。

本发明可以用于在新药早期研究阶段中标靶的 确定， 不同序列蛋白对于 药物分子的吸附能力等的测试。 特别在治疗神经退行性疾病中， 研究淀粉样 蛋白的聚集机理及其与药物分子的相互作用机 理， 利用分子水平的证据来寻 找可能的药物靶点， 从而对寻找和设计有效的调节剂分子、 药物分子等提供 指导。 附图说明

图 1是三个模型多肽， 五聚丙氨酸（5Ala ) 、 八聚苯丙氨酸（8Phe )和 八聚组氨酸（ 8His )与 4,4，-联吡啶分子（ 4Bpy )的共同组装体的扫描隧道显 微镜图像；

图 2是染料分子磺酸基酞菁在三种多肽-标记分子� ��装体上吸附的扫描 隧道显微镜图像， 其中， A和 B表示在 5Ala-4Bpy组装体中， C和 D表示在 8Phe-4Bpy组装体中， E表示在 8His-4Bpy组装体中；

图 3是从图 1和图 2的扫描隧道显微镜图像中统计得到的染料分� �磺酸 基酞菁在三种组装体中的吸附数量；

图 4是三种多肽组装体对于染料分子磺 Stt酞菁的不同吸附能力， 即染 料分子在多肽分子上的相对吸附常数。 将 8Phe多肽分子对于染料分子的吸 附能力归一化为 1时， 8His和 5Ala多肽分子对于染料分子的吸附能力分别 为 10.2和 41.8;

图 5是药物分子刚果红在 5 Ala-4Bpy组装体上吸附的扫描隧道显微镜图 像；

图 6是从图 5的扫描隧道显微镜图像中统计得到的刚果红� �多肽和 4Bpy 上的吸附数量；

图 7是药物前体分子 ThT在 5Ala-4Bpy组装体上吸附的扫描隧道显微镜 图像。 实施发明的最佳方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步 详细的描述。 实施例 1: 基于扫描隧道显微镜来测定染料分子在多肽上 相对吸附常数

1、 所使用物质的化学结构

多肽分子 （5Ala、 8Phe和 8His ) , 吡啶类分子 （ 4Bpy ) 和染料分子磺 Stt酞菁的化学结构， 如下图所示：

Ώ H H Ώ H H

H ₂ N-CHC-N-CHC-N-CHC-N-CHC-N-CHC-OH

CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

五聚丙氨酸（5Ala )

H -

八聚苯丙氨酸（8Phe )

八聚组氨酸（ 8His )

- (： ■'、 N

4'4-联吡 ¹ ^ ( 4'4-bipyridyl, 4Bpy )

石黄酸基献菁 ( Phthalocyanine-tetrasulfonic ) 2、 测定方法

先将多肽分子（ 5Ala、 8Phe和 8His )和吡啶类标记分子 4Bpy混合于水 溶液中， 超声 10分钟， 充分混合之后， 取出 15微升溶液， 滴到新解理的石 墨表面， 静置 10分钟， 使混合分子体系在石墨上形成组装体并沉积在 表面 上之后， 再用高純氮气吹千。

利用商品化的多模式扫描探针显微镜 ( SPM, Nanoscope Ilia型， Veeco 公司， 美国） ， 实验条件为大气下恒电流模式， 对三种多肽与 4Bpy二组分 体系分别进行扫描， 得到高分辨 STM图像（如图 1所示） ， 用于对染料分 子加入之后的图像进行比对和染料分子吸附数 量的统计。

再把染料分子磺酸基酞菁加入到上述混合溶液 （即多肽分子（ 5 Ala, 8Phe 和 8His ) 和吡啶类标记分子 4Bpy的混合水溶液） 中超声 10分钟， 充分混 合之后， 取出 15微升溶液， 滴到新解理的石墨表面， 静置 10分钟， 高纯氮 气吹干。

利用扫描隧道显微镜获得礒酸基酞菁吸附在三 种多肽分子（5Ala、 8Phe 和 8His ) 与 4Bpy二组分组装体系中的高分辨 STM图像（如图 2所示） 。

统计得到的磺酸基酞菁在不同吸附位点上的吸 附数量， 即三种多肽分子 ( 5 Ala, 8Phe和 8His ) 上和 4Bpy上的吸附数量 （如图 3所示 ) 。

在图 2的扫描隧道显微镜图像中， 可分别统计染料分子在多肽和 4Bpy 上的吸附分子数， 考虑到磺酸基酞菁在 4Bpy上的吸附能力一定， 对染料分 子在 4Bpy上吸附数量进行归一化， 得到橫酸基酞菁在不同的多肽上吸附能 力的相对关系。 以染料分子在 8Phe上的吸附数量为基本单位 1 ,磺酸基酞菁 在 8His中的吸附能力是 8Phe的 10.2倍， 磺酸基酞菁在 5Ala中的吸附能力 是 8Phe的 41.8倍， 如图 4所示。 实施例 2: 基于扫描隧道显微技术测定药物分子在多肽上 相对吸附常数

1、 所使用物质的化学结构

多肽分子五聚丙氨酸（5Ala ) ， 吡啶类标记分子（4Bpy )和药物分子刚 果红 (Congo red)的化学结构， 如下图所示： H ί? Η Ώ Η Η ί?

H ₂ N-CHC-N-CHC-N-CHC-N-CHC-N-CHC-OH

CH ₃ CH ₃ CH ₃ CH ₃ CH ₃ 五聚丙氨酸（5Ala )

4，4-联吡定（4，4-bipyridyl, 4Bpy )

刚果红 ( Congo red )

2、 测定方法与实施例 1相同

利用扫描隧道显微镜获得刚果红吸附在 5Ala与 4Bpy二组分组装体系中 的高分辨 STM图像（如图 5所示）。 通过统计刚果红 ^多肽和 4Bpy上的吸 附数量， 对刚果红在多肽和标记分子 4Bpy上的相对吸附能力提供依据 （如 图 6所示） 。 实施例 3: 基于扫描隧道显微技术测定药物前体分子在多 肽上的相对吸附常 数

1、 所使用物质的化学结构

多肽分子五聚丙氨酸（5Ala ) , 吡啶类标记分子（4Bpy )和药物前体分 子硫磺素 （ Thioflavin T, ThT ) 的化学结构， 如下图所示： 五聚丙氨酸（5Ala ) ―… i…― \

\：：：：：：：：/

4'4-联吡 （4，4-bipyridyl, 4Bpy ) 硫磺素 （ Thioflavin T， 2、 测定方法

测定方法与实施例 1相同， 利用扫描隧道显敖镜获得药物前体分子 ThT 吸附在 5 Ala与 4Bpy二组分组装体系中的高分辨 STM图像（如图 7所示）。 通过统计 ThT在多肽和 4Bpy上的吸附数量，对 ThT在多肽和标记分子 4Bpy 上的相对吸附能力提供依据。 由于 ThT在 4Bpy上没有吸附， 所以相对吸附 常数极大。