Beschreibung:

„Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung des Adhäsionsverhaltens von Thrombozyten"

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Untersuchung des Adhäsionsverhaltens von Thrombozyten gemäß Oberbegriff des Anspruchs 1 bzw. Anspruchs 4.

Bekanntermaßen spielen Thrombozyten eine wesentliche Rolle bei der Blutge- rinnung. Sie haften an den Wänden lädierter Gefäße an, wodurch weitere Thrombozyten aktiviert werden, so dass sie durch Aggregation einen die verletzte Stelle abschließenden Blutblättchenpfropf bilden. Das Ausmaß, in welchem die im Blut vorhandenen Thrombozyten in der Lage sind, durch Adhäsion an einem Substrat anzuhaften, stellt ein wichtiges Charakteristikum für den Zustand des Hämostase- Systems dar.

Bei einem bekannten Verfahren zur Untersuchung des Adhäsionsverhaltens von Thrombozyten wird Blut durch zwei Röhrchen geleitet, von denen eines mit Glasperlen ausgefüllt ist, an denen Thrombozyten anhaften können. Zur Bestimmung des Haftvermögens werden die in den durch die verschiedenen Röhrchen geleiteten Blutfraktionen gemessenen Thrombozytenkonzentrationen ins Verhältnis gesetzt (Hellem AJ. The adhesiveness of human blood platelets in vitro. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 12 (Suppl.):l-17, 1960). Aus den Veröffentlichungen „Nickels RM, Seyfert UT, Wenzel E, Menger MD, Vollmar B. A simple and reproducible method to reliably assess platelet activation. Thrombosis research 1 10: 53-56, 2003" sowie

"Krischek B, Morgenstern E, Mestres P, Klinhardt U, Brannath W, Wieding U, Nemeh A, Heinrich W, Schenk J, Wenzel T, Wenzel E. Adhesion, spreading, and aggrega-

tion of plαtelets in flowing blood αnd the reliαbiiity of the retention fest Homburg. Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 31 (4):449-457 (2005)" gehen ähnliche Verfahren hervor.

Eine andere, aus der Veröffentlichung „Wasiluk, A. Markers of platelets activation, CD62P and soluble P-Selectin in healthy term neontates. J. Perinatal med.

32(6):514-515.2004." bekannte Richtung sieht die Detektion spezifischer Moleküle an der Oberfläche der Thrombozyten vor, die in verstärktem Maße erscheinen, wenn diese aktiviert sind. An der Zelloberfläche wird mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers das mit einem Fluoromarker versehene Protein p-Selectin mit Hilfe der Flow-Cytometry detektiert.

Diese bekannten Verfahren erfordern einen verhältnismäßig hohen gerätetechnischen Aufwand.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den zur Untersuchung des Adhäsions- Verhaltens von Thrombozyten erforderlichen Aufwand zu verringern.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, bei dem eine Suspension aus einer Blutprobe separierter Thrombozyten in eine Messkammer geleitet wird und die nach einer vorgegebenen Inkubationsdauer an der Wand der Messkammer durch Adhäsion anhaftenden Thrombozyten mit Hilfe eines Mikroskops beobachtet werden.

Zur Durchführung des Verfahrens lässt sich erfindungsgemäß eine Vorrichtung mit einem Probenträger benutzen, der eine Messkammer für die Aufnahme einer Suspension aus einer Blutprobe separierter Thrombozyten aufweist, wobei der Proben- träger im Bereich der Messkammern von wenigstens einer Seite her transparent ist, um an der Wand der Messkammer durch Adhäsion anhaftende Thrombozyten mit Hilfe eines Mikroskops beobachten zu können.

Gemäß der Erfindung werden also aus einer bestimmten Blutprobenmenge unter Vermeidung zusätzlicher Aktivierung Thrombozyten extrahiert, und die Thrombozy- tenfraktion wird unter Bildung einer Suspension verdünnt. Die in die Messkammer geleitete Suspension wird, z.B. bei 37°, über einen vorgegebenen Zeitraum inkubiert. Danach können die an der Kammerwand durch Adhäsion anhaftenden Thrombozyten mit Hilfe eines Mikroskops beobachtet werden. So lässt sich als charakteristische Größe die Zahl der anhaftenden Thrombozyten pro Flächen- einheit ermitteln. Unter dem Mikroskop beobachtbar sind ferner die verschiedenen Formen der Thrombozyten, welche sich je nach Aktivierungszustand einstellen.

Zur Zählung der Thrombozyten und Auswertung der Formen kommen auch automatische Bildauswertverfahren in Betracht.

Somit steht ein einfacher, mit geringem Aufwand an Geräten durchführbarer Test zur Verfügung, der sich als zuverlässig erwiesen hat und Eingang in die klinische Routine finden kann. Bei geringem Probendurchsatz kann die Analyse manuell durch einen Laboranten erfolgen, bei hohem Durchsatz sind insbesondere Bildverarbeitungssysteme anwendbar. Eine komplette Automatisierung ist möglich, wenn z.B. bekannte Methoden der Probendispensierung Anwendung finden. Der Test ist geeignet, die Diagnose erblicher oder erworbener Störungen der Thrombo- zytenfunktion zu unterstützen. Ebenso eignet sich der Test, um die Wirkung von Medikamenten auf die Hämostasie, insbesondere die Thrombozyten zu untersuchen. Weitere Anwendungsmöglichkeiten ergeben sich bei der Qualitätskontrolle in Blutbanken und bei der Transfusionsmedizin. Neben Anwendungs- möglichkeiten bei der Evaluierung neuer Stoffe kann der Test auch bei der Qualitätssicherung bereits etablierter Medikamente von Bedeutung sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Suspension in einen die Messkammer umfassenden, durch den Probenträger hindurchverlaufenden Mikrokanal injiziert. Durch vollständige Ausfüllung des Mikrokanals mit der Suspension ist gesichert, dass das Probenvolumen, aus dem sich Thrombozyten an der Messkammerwand absetzen können, stets gleich ist. Es bedarf keiner genauen Abmessung einer Probenmenge. Zur Beobachtung der Thrombozyten im Hellfeld eines gewöhnlichen Lichtmikros- kops kann eine Einfärbung der Thrombozyten erfolgen, z.B. durch ein Substrat auf Tetrazoliumbasis. Alternativ können durch einen Fluoromarker, z.B. Rhodamin G6, markierte Thrombozyten im Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden.

Vorzugsweise verläuft der die Messkammer enthaltende Mikrokanal zwischen zwei aneinander anliegenden, den Probenträger bildenden Teilen, welche zweckmäßig plattenförmig ausgebildet sind oder einen plattenförmigen Abschnitt umfassen.

In einem der Teile können zur Bildung des Mikrokanals Vertiefungen vorgesehen sein, während der andere Teil diese Vertiefungen fluiddicht abdeckt.

Ein Einlαsskαnαlαbschnitt und/oder ein Auslαsskαnαlαbschnitt können/kann in Fluid- verbindung mit einem von einem der Teile vorstehenden Rohransatz stehen, an welchen sich z.B. eine Pipette ansetzen oder eine Pumpe anschließen lässt.

Alternativ kann der Einlasskanalabschnitt in Fluidverbindung mit einem an den Probenträger angeformten Gefäß für die Aufnahme der Suspension, insbesondere für die Aufnahme einer Probengesamtmenge, stehen. Die in dem Gefäß enthaltene Suspension lässt sich über eine an den Rohransatz am Ausgangkanalabschnitt anschließbare Saugeinrichtung in den Mikrokanal hineinziehen.

Vorteilhaft weist der mit dem Auslasskanalabschnitt verbundene Rohransatz am freien Ende eine überlaufrinne auf, welche zu einem an den Probenträger angeformten Auffanggefäß führt. überschüssiges Probenmaterial verbleibt so auf dem Probenträger und gelangt nicht in die Umwelt.

Durch den Mikrokanal kann eine Reihenanordnung aus mehreren Messkammern und auf dem Probenträger können mehrere, jeweils wenigstens eine Messkammer umfassende Mikrokanäle in paralleler Anordnung gebildet sein.

Zweckmäßig entspricht die Kontur des Probenträgers in der Draufsicht der Kontur eines gewöhnlichen Mikroskop-Objektträgers. Der Probenträger lässt sich dann wie ein solcher Objektträger problemlos im Mikroskop verwenden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Messkam- merwand einen, vorzugsweise ebenen, Wandabschnitt auf, dessen Adhäsionsvermögen in bezug auf Thrombozyten gegenüber den an den Wandabschnitt angrenzenden Teilen der Messkammer, vorzugsweise gegenüber der gesamten übrigen Messkammerwand, erhöht ist. Auf diese Weise lässt sich sichern, dass Thrombozyten beispielsweise nur an einer von zwei zur Plattenebene parallelen Wand- abschnitten der Messkammer anhaften. Die Thrombozyten lassen sich dann ungestört durch an dem anderen parallelen Wandabschnitt anhaftende Thrombozyten beobachten.

Der Probenträger kann aus verschiedenen Materialien mit unterschiedlichem Adhäsionsvermδgen in bezug auf Thrombozyten bestehen. Insbesondere können die beiden Teile des Probenträgers im Material verschieden sein, so dass nur an einem der Teile, welcher einen der beiden zur Plattenebene parallelen Wandabschnitte der Messkammer bildet, Thrombozyten anhaften.

Der genannte Wandabschnitt kann einer das Adhäsionsvermögen steigernden Oberflächenbehandlung unterzogen und umgekehrt könnte das Adhäsionsvermögen der an den genannten Wandabschnitt angrenzenden Wandteile der Messkammer durch eine entsprechende Oberflächenbehandlung herabgesetzt sein. Letztere Oberflächenbehandlung kommt vor allem für außerhalb der Messkammern liegende Abschnitte des Mikrokanals in Betracht, um dort das Anhaften von Thrombozyten zu vermeiden. Für die Teile des Probenträgers kommt neben unterschiedlichen Kunststoffen auch eine Kombination Kunststoff/Glas in Betracht. Eines der beiden Teile könnte aus einer Kunststofffolie bestehen.

Zur Steigerung der Adhäsionsfähigkeit durch Oberflächenaktivierung kommt z.B. eine Behandlung mit Sauerstoffplasma in Betracht. Die Oberflächenbehandlung kann auch in einer Beschichtung, z.B. basierend auf Siliziumoxidverbindungen, durch Plasmapolymerisation bestehen. Ferner besteht die Möglichkeit der Bildung einer Mikro- oder Nano-Strukturierung an der betreffenden Oberfläche, die hierdurch vergrößert wird.

Zur Verringerung des Adhäsionsvermögen können z.B. auf Fluorpolymeren basierende Beschichtungen aufgebracht werden.

Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung gegenüber dem Stand der Technik besteht auch darin, dass nach erfolgter Auszählung oder/und qualitativer Bewertung der anhaftenden Thrombozyten das sich im Kanalsystem befindende flüssige Medium gegen ein sich dort verfestigendes Fixiermedium ausgetauscht werden kann, ohne dabei die anhaftenden Thrombozyten auszulösen. Das Analyseergebnis wird somit „eingefroren", lässt sich archivieren und steht für spätere Kontrollen und Einsichtnahmen zur Verfügung.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und der beilie- genden, sich auf diese Ausführungsbeispiele beziehenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 einen Probenträger nach der Erfindung in einer perspektivischen Darstellung, Fig.2 den Probenträger von Fig. 1 in einer Schnittansicht,

Fig.3 eine Schnittansicht eines Probenträgers gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel für die vorliegende Erfindung, und

Fig. 4 eine Teilαnsicht eines Probenträgers nach der Erfindung, mit einer Messkammer und einem an der Messkammer vorgesehenen Gitternetz.

Ein Probenträger 1 aus Kunststoff besteht aus einem ersten Teil 2 mit einem platten- förmigen Abschnitt 3 und einem zweiten, in der Form einer Platte ausgebildeten Teil 4, das mit dem Plattenabschnitt 3 des ersten Teils 2 verbunden ist. Die beiden Teile 2 und 4 sind jeweils einstückig im Spritzgießverfahren aus unterschiedlichen Kunststoffmaterialien hergestellt. Beide Materialien sind durchsichtig. Das Teil 4 ließe sich auch aus einer Folie herstellen.

Zur Bildung von Mikrokanälen 20 mit jeweils drei Messkammern 5, einem Einlasskanalabschnitt 6, einem Auslasskanalabschnitt 7 sowie die Messkammern 5 verbindenden Zwischenabschnitten 8 sind in dem Plattenabschnitt 3 des ersten Kunststoffteils 2 Vertiefungen gebildet, welche durch das plattenförmige Teil 4 fluiddicht abgedeckt werden.

Das den Messkammern 5 abgewandte Ende des Einlasskanalabschnitt 6 steht in Verbindung mit einem von dem Plattenabschnitt 3 vorstehenden Rohransatz 9. Das den Messkammern 5 abgewandte Ende des Auslasskanalabschnitt 8 ist mit einem solchen Rohransatz 10 verbunden. Am freien Ende des Rohransatzes 10 befindet sich eine überlaufrinne 11 , welche zu einem Auffanggefäß 12 führt. Das Kunststoff material des plattenförmigen Teils 4 weist ein gegenüber Thrombozyten großes Adhäsionsvermögen auf. Das Teil 2 besteht hingegen aus einem Kunststoffmaterial mit geringem Adhäsionsvermögen.

Bei der Untersuchung von Thrombozyten wird gemäß Pfeil 13 über den Rohransatz 9 eine Suspension aus einer Blutprobe separierter Thrombozyten eingefüllt. Der Innendurchmesser des Rohransatzes 9 ist so bemessen, dass zu diesem Zweck eine Pipette angesetzt werden kann. Die Suspension tritt durch den Einlasskanalab- schnitt 6 in die erste Messkammer 5 und danach über die Kanalzwischenabschnitte 8 in die weiteren Messkammern und schließlich in den Auslasskanalabschnitt 7. Dann steigt sie in dem Rohransatz 10 hoch. Das Hochsteigen kann durch eine an den Rohransatz 10 anschließbare Saugeinrichtung, z.B. eine Pipette, unterstützt werden. überschüssiges Probenmaterial läuft gemäß Pfeil 15 durch die überlaufrinne 11 hindurch in das Auffanggefäß 12. Durch das Auffanggefäß 12 wird gesichert, dass die gesamte Probe auf dem Probenträger verbleibt und nicht in die Umwelt gelangt. Wegen des hohen Adhäsionsvermögens des Kunststoff-

mαteriαls des plαttenförmigen Teils 4 und des geringen Adhäsionsvermögens des zur Herstellung des Teils 2 verwendeten Materials haften Thrombozyten lediglich an einem durch den plattenförmigen Teil 4 gebildeten, zur Plattenebene parallelen Wandabschnitt 16 der Messkammern 5 an.

Nach einer vorgegebenen Dauer einer z.B. bei 37°C durchgeführten Inkubation wird über den Rohransatz 9 ein Farbstoff eingefüllt, welcher die Probensuspension verdrängt und die am Wandabschnitt 16 der Messkammern 5 anhaftenden Thrombozyten einfärbt, so dass sie unter dem Mikroskop sichtbar sind.

Der in Rg. 1 und 2 gezeigte Probenträger 1 weist in der Draufsicht die Abmessungen eines Mikroskop-Objektträgers auf und lässt sich daher wie ein solcher Träger in ein Mikroskop einlegen, unter dem dann die an dem Wandabschnitt 16 durch Adhäsion anhafteten Thrombozyten beobachtet werden können. So lässt sich bei bekannter Größe des Wandabschnitts 16 leicht die Zahl der anhaftenden Thrombozyten pro Flächeneinheit ermitteln. Ferner können die Thrombozyten klassifiziert und die Häufigkeiten bestimmte Formmerkmale aufweisender Thrombozyten ermittelt werden.

Bei den nachfolgenden Ausführungsbeispielen sind gleiche oder gleichwirkende Teile mit derselben Bezugszahl wie bei dem vorangehenden Ausführungsbeispiel bezeichnet, wobei der betreffenden Bezugszahl der Buchstabe a bzw. b beigefügt ist.

Ein in Fig.3 gezeigtes Ausführungsbeispiel für einen Probenträger 1 a weist anstelle von Rohransätzen 9 Gefäße 17 zum Einfüllen einer Probengesamtmenge auf. An einen mit einem Auslasskanal 7a verbundenen Rohransatz 10a lässt sich bei 18 eine Saugpumpe anschließen, welche dafür sorgt, dass ein Messkammern 5a umfassender Mikrokanal 20a schnell vollständig mit Probenflüssigkeit ausgefüllt wird.

Bei dem Ausführungsbeispiel von Fig.4 ist eine im Querschnitt quadratische Messkammer 5b gebildet. Auf ihrer der Messkammer abgewandten Seite weist ein plat- tenförmiges Teil 4b ein Gitternetz 19 auf, welches die Zählung an einem Wandab- schnitt 16b der Messkammer 5b anhaftender Thrombozyten im Mikroskop erleichtert.

Innerhalb der Kanalabschnitte 6 bis 8 kann die durch das Teil 4 gebildete Kanalwand derart behandelt sein, dass die Anhaftung von Thrombozyten vermieden ist. Fehler durch Mitzählen innerhalb der Kanalabschnitte anhaftender Thrombozyten sind so ausgeschlossen.

Die vorangehend beschriebenen Ausführungsformen weisen zwei plattenförmige Bauteile auf, die fest miteinander verbunden sind. Es wäre ferner möglich, beide Komponenten fluiddicht aber dennoch lösbar miteinander zu verbinden, z.B. mit Hilfe einer Klemmvorrichtung.

Ein Glasobjektträger könnte ein stabiles Unterteil bilden und ein darauf festgeklemmtes Oberteil die Kanäle und Messkammern aufweisen. Zur Anpassung des Adhäsionsverhaltens ließe sich die Glasoberfläche modifizieren, wozu sich nasschemische und physikalische Verfahren eignen. Vorteilhaft weist das Oberteil eine gewisse Duktilität auf und kann z.B. aus einem Elastomer oder Silikon bestehen. So lassen sich die Kanäle und Messkammern durch die Glasplatte leicht fluiddicht verschließen. Vorteilhaft bleibt im Fall einer gewünschten Archivierung ein ausgehärtetes Fixiermedium nach Lösen der Klemmverbindung auf dem Glasobjektträger, der dann wie andere Mikroskopierproben archiviert werden kann. Das Oberteil mit den Messkammern und Kanälen steht für weitere Analysen zur Verfügung.