Titel

Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung eines gPCR-Verfahrens

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft die Anwendung eines Polymerase- Kettenreaktionsverfahrens (PCR-Verfahrens), insbesondere zur Detektion des Vorliegens eines Erregers. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Auswertung von qPCR-Messungen.

Technischer Hintergrund

Zur Detektion von DNA-Strangabschnitten in einer zu untersuchenden Substanz, wie beispielsweise einem Serum oder dergleichen, werden in automatisierten Systemen PCR-Verfahren durchgeführt. Die PCR-Systeme ermöglichen es, bestimmte zu detektierende DNA-Strangabschnitte, die z.B. einem Erreger zuzuordnen sind, zu amplifizieren und zu detektieren. Ein PCR-Verfahren umfasst generell eine zyklische Anwendung der Schritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation. Insbesondere wird beim PCR-Prozess ein DNA-Doppelstrang in Einzelstränge aufgespalten und diese jeweils durch Anlagerung von Nukleotiden wieder vervollständigt, um die DNA-Strangabschnitte in jedem Zyklus zu vervielfältigen.

Das qPCR-Verfahren ermöglicht die Erregerlast, nachgewiesen mit diesem Prozess zu quantifizieren. Dazu sind die Nukleotide zumindest teilweise mit Fluoreszenzmolekülen versehen, die bei Anbinden an den Einzelstrang des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts eine Fluoreszenzeigenschaft aktivieren. Nach dem Aufbau der Doppelstränge kann nach jedem Zyklus ein Fluoreszenzwert ermittelt werden, der von der Anzahl der erzeugten DNA- Strangabschnitte abhängt.

Im Laufe der Amplifikation kann dann aus den ermittelten Fluoreszenzwerten (Intensitätswerten) eine qPCR-Kurve ermittelt werden, die bei Vorliegen des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts in der zu untersuchenden Substanz einen sigmoidförmigen Verlauf hat. Die gemessenen qPCR-Kurven können in der Realität mit Artefakten behaftet sein, so dass in der Regel mehrere parallele Messungen durchgeführt werden, um durch eine Mittelwertbildung der Messwerte eine genauere Auswertung der qPCR-Kurven zu ermöglichen.

Offenbarung der Erfindung

Erfindungsgemäß sind ein Verfahren zum Durchführen eines qPCR-Verfahrens gemäß Anspruch 1 sowie eine Vorrichtung und ein qPCR-System gemäß den nebengeordneten Ansprüchen vorgesehen.

Weitere Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.

Gemäß einem ersten Aspekt ist ein Verfahren zum Betreiben eines quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Verfahren vorgesehen, mit folgenden Schritten:

- Zyklisches Ausführen von qPCR-Zyklen

Messen eines Intensitätswertes einer Fluoreszenz nach oder während jedem qPCR-Zyklus, um eine qPCR-Kurve aus Intensitätswerten zu erhalten;

- Auswerten des Verlaufs der qPCR-Kurve mithilfe eines datenbasierten Klassifikationsmodells, das trainiert ist, um ein Klassifikationsergebnis abhängig von dem Verlauf der qPCR-Kurve bereitzustellen;

Betreiben des qPCR-Verfahrens abhängig von dem Klassifikationsergebnis der Auswertung des Verlaufs der qPCR-Kurve.

Das qPCR-Verfahren weist eine zyklische Wiederholung der Schritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation auf. Bei der Denaturierung wird bei einer hohen Temperatur die gesamte doppelsträngige DNA in der zu untersuchenden Substanz in zwei Einzelstränge aufgespalten. In dem Schritt des Annealing wird an die Einzelstränge einer der Substanz zugegebenen Primer angebunden, die den Startpunkt der Amplifizierung der zu detektierenden DNA- Strangabschnitte vorgeben. Bei dem Schritt der Elongation wird ein zweiter komplementärer DNA-Strangabschnitt aus freien Nukleotiden auf den mit dem Primer versehenen Einzelsträngen aufgebaut. Nach jedem dieser Zyklen hat sich also idealerweise die DNA-Menge der zu detektierenden DNA-Strangabschnitte verdoppelt.

Durch die Anwendung des qPCR-Verfahrens werden in die zu detektierenden DNA-Strangabschnitte Fluoreszenzmoleküle als Marker eingebaut, so dass über eine Messung der Intensität der Fluoreszenz nach jedem Elongationsschritt ein zeitlicher Verlauf der Intensitätswerte ermittelt werden kann. Die so erhaltene qPCR-Kurve weist dabei drei distinkte Phasen auf, nämlich eine Baseline, in der die Intensität der Fluoreszenz des von eingebauten Markern emittierten Fluoreszenzlichts noch nicht von der Hintergrund-Fluoreszenz zu unterscheiden ist, einer exponentiellen Phase, in der die Fluoreszenzintensität über die Baseline ansteigt, also sichtbar wird, wobei durch die Verdoppelung der DNA-Stränge in jedem Zyklus das Fluoreszenzsignal proportional zur Menge der zu detektierenden DNA-Strangabschnitte exponentiell ansteigt, und einer Plateau-Phase, in der die Reagenzien, d. h. der Primer und die freien Nukleotide, nicht mehr in der benötigten Konzentration vorhanden sind und keine weitere Verdoppelung stattfindet.

Für den Nachweis eines vorgegebenen zu detektierenden DNA-Strangabschnitts, der beispielsweise einem Erreger entsprechen kann, ist hierbei der sogenannte ct (cycle threshold)-Wert maßgeblich. Der ct-Wert bestimmt den Beginn der exponentiellen Phase und wird durch Überschreiten eines spezifischen Grenzwerts, der für den jeweils zu detektierenden DNA-Strangabschnitt festgelegt ist und der für alle Proben für den zu detektierenden DNA-Strangabschnitt identisch ist, ermittelt oder rechnerisch durch die zweite Ableitung der qPCR-Kurve in der exponentiellen Phase ermittelt und dem Intensitätswert des steilsten Anstiegs der qPCR-Kurve entspricht. Ist der Zielwert bekannt, kann durch Rückrechnung die Anfangskonzentration des zu detektierenden DNA- Strangabschnitts in der zu untersuchenden Substanz bestimmt werden. In der Realität sind die qPCR-Kurven sehr ungenau und erheblichen Schwankungen unterworfen. Es kann ein Baseline-Drift auftreten, mit der das Ansteigen der Hintergrundfluoreszenz über die Messzyklen bezeichnet wird. Das heißt, dass, selbst wenn keine Amplifikation stattfindet, das Fluoreszenzsignal ansteigt. Weitere Einflussfaktoren, die sich negativ auf die Genauigkeit der qPCR- Kurve auswirken, können beispielsweise aus thermischem Rauschen, Schwankungen bzw. Zumesstoleranzen in der Reagenzkonzentration, Lufteinschlüsse und Artefakten im Fluoreszenzvolumen resultieren.

In herkömmlichen qPCR-Systemen findet einerseits eine softwarebasierte Korrektur der qPCR-Kurven statt, andererseits kann vorgesehen sein, eine Probe unter gleichen Bedingungen mehrfach zu messen und die resultierenden qPCR- Kurven durch Mittelwertbildung zu glätten. Dies erfordert jedoch einen erhöhten Aufwand.

Eine Idee des obigen Verfahrens besteht darin, mithilfe eines datenbasierten Klassifikationsmodells, insbesondere in Form eines künstlichen neuronalen Netzes, insbesondere eines tiefen neuronalen Netzes oder eines rekurrenten neuronalen Netzes, insbesondere eines LSTM, oder in Form einer Support Vector Machine, zu entscheiden, ob eine gemessene qPCR-Kurve angibt, dass der zu detektierende DNA-Strangabschnitt in der zu untersuchenden Substanz vorkommt oder nicht. Da gemessene qPCR-Kurven in der Regel stark rauschbehaftet sind, kann durch die Benutzung des trainierten datenbasierten Klassifikationsmodells der qPCR-Kurvenverlauf auch in Grenzfällen zuverlässiger dahingehend bewertet werden, ob der zu detektierende DNA-Strangabschnitt in der zu untersuchenden Substanz vorkommt oder nicht.

Das Klassifikationsmodell kann trainiert sein, um abhängig von der qPCR-Kurve ein Klassifikationsergebnis bereitzustellen, das ein Vorhandensein eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts angibt oder nicht. Insbesondere ist es möglich, das datenbasierte Klassifikationsmodell auf gelabelte qPCR-Kurven als Trainingsdaten zu trainieren, so dass eine gemessene qPCR-Kurve in entsprechender Weise klassifiziert werden kann. Dies erfordert jedoch ein umfangreiches Training des Klassifikationsmodells mit einer hohen Anzahl von Datensätzen aus manuell klassifizierten bzw. gelabelten qPCR-Kurven, da keine Vorannahmen berücksichtigt werden.

Weiterhin können Restfehlerverläufe zwischen der gemessenen qPCR-Kurve und einer parametrierten Vorhandenseinsfunktion und einer parametrierten Nichtvorhandenseinsfunktion bestimmt werden, wobei das Klassifikationsmodell trainiert ist, um abhängig von mindestens einer der Restfehlerverläufe ein Klassifikationsergebnis bereitzustellen, das ein Vorhandensein eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts angibt oder nicht. Somit ist es alternativ möglich, die gemessene qPCR-Kurve an parametrisierte Idealverläufe einer qPCR-Kurve bei Vorhandensein eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts (Vorhandenseins-Kurvenverlauf) in der zu untersuchenden Substanz und bei Nichtvorhandensein eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts (Nicht- Vorhandenseins-Kurvenverlauf) in der zu untersuchenden Substanz zu fitten. Dies erfolgt durch Parametrisierung des Vorhandenseins-Kurvenverlauf und des Nicht- Vorhandenseins-Kurvenverlauf an die gemessene qPCR-Kurve. Die Restfehlerverläufe zwischen dem parametrisierten Vorhandenseins-Kurvenverlauf bzw. dem parametrisierten Nicht-Vorhandenseins-Kurvenverlauf und der tatsächlichen gemessenen qPCR-Kurve können dann mithilfe eines trainierten datenbasierten Klassifikationsmodells ausgewertet werden. Das Klassifikationsmodell ist dabei trainiert, zu entscheiden, ob der jeweilige Kurvenfit auf einem parametrisierten Idealverlauf basiert, der dem gemessenen Verlauf der qPCR-Kurve am nächsten kommt. Das heißt, mithilfe des Klassifikationsmodells wird festgestellt, ob die gemessene qPCR-Kurve eher einer Vorhandensein- qPCR-Kurve oder Nichtvorhandensein-qPCR-Kurve entspricht.

Dabei wird ein Vorhandensein eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts festgestellt, wenn das Klassifikationsergebnis basierend auf dem Restfehlerverlauf aus der parametrierten Vorhandenseinsfunktion das Vorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts anzeigt. Entsprechend kann ein Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts festgestellt werden, wenn das Klassifikationsergebnis basierend auf dem Restfehlerverlauf aus der parametrierten Nichtvorhandenseinsfunktion das Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts anzeigt. Die Auswertung kann erfolgen, indem auf ein Vorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitt geschlossen wird, wenn das Klassifikationsergebnis einen Kurvenfit mit dem Vorhandenseins-Kurvenverlauf bestätigt und einen Kurvenfit mit dem Nicht-Vorhandenseins-Kurvenverlauf nicht bestätigt. Analog wird auf ein Nicht-Vorhandensein des zu detektierenden DNA- Strangabschnitt geschlossen, wenn das Klassifikationsergebnis einen Kurvenfit mit dem Nicht-Vorhandenseins-Kurvenverlauf bestätigt und einen Kurvenfit mit dem Vorhandenseins-Kurvenverlauf nicht bestätigt.

Während die erste oben beschriebene Variante mögliche fehlerhafte oder ungenaue Grundannahmen über die zugrundeliegenden typischen Kurvenverläufe vermeidet und auch unbekannte Zusammenhänge und Dynamiken abbilden kann, kann die zweite oben beschriebene Variante aufgrund des vorhandenen Domänenwissens mit einem Klassifikationsmodell verwendet werden, das für sein Training einen weniger umfangreichen Trainingsdatensatz erfordert. Insgesamt führt die Nutzung eines datenbasierten Klassifikationsmodells zu einer geringeren Anzahl von Fehlklassifikationen im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren.

Es kann vorgesehen sein, dass das qPCR-Verfahren betrieben wird, indem bei Feststellen eines Vorhandenseins des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts, signalisiert wird, dass ein ct-Wert ermittelbar ist, und/oder der ct-Wert aus der parametrierten Vorhandenseinsfunktion ermittelt wird.

Gemäß einem weiteren Aspekt ist eine Vorrichtung zum Betreiben eines quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Verfahren, wobei die Vorrichtung ausgebildet ist, um folgende Schritte auszuführen:

- Zyklisches Ausführen von qPCR-Zyklen

Messen eines Intensitätswertes einer Fluoreszenz zu jedem qPCR-Zyklus, um eine qPCR-Kurve aus Intensitätswerten zu erhalten;

- Auswerten des Verlaufs der qPCR-Kurve mithilfe eines datenbasierten Klassifikationsmodells, das trainiert ist, um ein Klassifikationsergebnis abhängig von dem Verlauf der qPCR-Kurve bereitzustellen;

Betreiben des qPCR-Verfahrens abhängig von dem Klassifikationsergebnis der Auswertung des Verlaufs der qPCR-Kurve. Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Ausführungsformen werden nachfolgend anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Figur 1 eine schematische Darstellung eines Zyklus eines PCR-

Verfahrens;

Figur 2 eine schematische Darstellung einer typischen qPCR-Kurve mit einem Intensitätswerteverlauf;

Figur 3 ein gemessener Verlauf einer qPCR-Kurve;

Figur 4a und 4b ideale Verläufe der qPCR-Kurve für den Fall einer nicht nachweisbaren Substanz bzw. einer nachweisbaren Substanz; und

Figur 5 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Verfahrens zum Betreiben einer qPCR-Messung; und

Figur 6 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines weiteren

Verfahrens zum Betreiben einer qPCR-Messung.

Beschreibung von Ausführungsformen

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung eines an sich bekannten PCR- Verfahrens mit den Schritten der Denaturierung des Annealing und der Elongation.

In dem Schritt des Annealing S1 wird bei einer hohen Temperatur von beispielsweise über 90°C die doppelsträngige DNA in einer Substanz in zwei Einzelstränge aufgebrochen. In einem nachfolgenden Annealing-Schritt S2 wird an die Einzelstränge an einer bestimmten DNA-Position, die einen Beginn eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts markiert, ein sogenannter Primer angebunden. Dieser Primer stellt den Startpunkt einer Amplifizierung des DNA- Strangabschnitts dar. In einem Elongationsschritt S3 wird beginnend an der von dem Primer markierten Position aus der Substanz zugesetzten freien Nukleotiden der komplementäre DNA- Strangabschnitts an den Einzelsträngen aufgebaut, so dass am Ende des Elongationsschrittes die zuvor aufgespaltenen Einzelstränge zu vollständigen Doppelsträngen ergänzt worden sind.

Durch Versehen der freien Nukleotide bzw. des Primers mit Fluoreszenzmolekülen, die nur in dem an den DNA-Strangabschnitt gebundenen Zustand Fluoreszenzeigenschaften aufweisen, ist es möglich, durch Ermitteln einer Intensität einer Fluoreszenz im Anschluss an den Elongationsschritt S3 einen Intensitätswertes der Fluoreszenz durch eine geeignete Messung zu erhalten. Der gemessenen Intensität des Fluoreszenzlichts wird ein Intensitätswert zugeordnet.

Das Verfahren der Schritte S1 bis S3 wird zyklisch ausgeführt und die Intensitätswerte aufgezeichnet, um einen Intensitätswerteverlauf als eine qPCR- Kurve zu erhalten.

Der Intensitätswerteverlauf hat im Idealfall einen Verlauf, der in Figur 2 dargestellt ist. Figur 2 zeigt einen Verlauf einer normalisierten Intensität I über dem Zyklusindex z. Dieser Verlauf unterteilt sich in drei Abschnitte, nämlich einen Baseline-Abschnitt B, in dem die Fluoreszenz der eingebauten Fluoreszenzmoleküle noch nicht von einer Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden ist, einen exponentiellen Abschnitt E, in dem die Intensitätswerte sichtbar sind und exponentiell ansteigen, und in einem Plateau-Abschnitt P, in dem sich der Anstieg der Intensitätswerte abflacht, da die verwendeten Reagenzien (Lösung mit Nukleotiden) aufgebraucht sind und keine weitere Anbindung an aufgebrochenen Einzelsträngen stattfindet.

In Figur 3 ist beispielhaft ein bei einer realen Messung erhaltener Verlauf der Intensitätswerte als qPCR-Kurve dargestellt. Man erkennt starke Schwankungen, die sich aus einer Hintergrundfluoreszenz, thermisches Rauschen, Schwankungen in den Reagenzkonzentrationen sowie Bläschen und Artefakte im Fluoreszenzvolumen ergeben können. Man erkennt, dass die Bestimmung des Baseline-Abschnitts, des exponentiellen Abschnitts und des Plateau-Abschnitts der qPCR-Kurve nicht ohne weiteres möglich ist. Figur 4a und 4b zeigen ideale Verläufe einer qPCR-Kurve ohne Vorliegen eines nachzuweisenden DNA-Strangabschnitts bzw. mit Vorliegen eines nachzuweisenden DNA-Strangabschnitts.

In Figur 5 ist ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Verfahrens zum Betreiben eines qPCR-Messprozesses dargestellt. Das Verfahren kann auf einer Datenverarbeitungseinrichtung ausgeführt werden, die einen qPCR-Prozess auf einem PCR-System steuert und die von einem PCR-System in jedem Zyklus einen Intensitätswert, der die Intensität einer Fluoreszenz abhängig von einem während der qPCR amplifizierten DNA-Strangabschnitt angibt, bereitstellt. In der Datenverarbeitungseinrichtung kann das nachfolgend beschriebene Verfahren in Software und/oder Hardware implementiert sein.

In Schritt S11 wird die qPCR-Messung durchgeführt, um Intensitätswerte in aufeinanderfolgenden Zyklen einer qPCR-Messung zu empfangen. Die Anzahl der Zyklen für die qPCR-Messung liegt bei etwa 30 bis 60 Zyklen, vorzugsweise bei 40 Zyklen. Man erhält eine qPCR-Kurve, die die Intensitätswerte (oder davon abgeleitete Werte) über einen Zyklusindex abbildet.

In Schritt S12 werden die Intensitätswerte der qPCR-Kurve einem trainierten Klassifikationsmodell zugeführt. Das Klassifikationsmodell ist als datenbasiertes Modell ausgebildet, wie z. B. eine SVM (Support Vector Machine) oder ein tiefes neuronales Netz. Alternativ kann das datenbasierte Klassifikationsmodell auch mit einem neuronalen Netz aus zeitlichen Konvolutionsschichten gebildet sein.

Das Klassifikationsmodell kann mit Datensätzen aus real gemessenen qPCR- Verläufen trainiert sein, denen jeweils ein Label zugeordnet ist, das angibt, ob der Datensatz (qPCR-Kurve) einer Messung einer Substanz, die den zu detektierenden DNA-Strangabschnitt enthält, entspricht oder nicht.

In Schritt S13 wird entsprechend dem Ergebnis der Klassifikation durch das Klassifikationsmodell bestimmt, ob die qPCR-Kurve ein Vorhandensein oder ein Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts entspricht, d. h. angibt, ob der zu detektierenden DNA-Strangabschnitt in der Substanz enthalten ist oder nicht. In Schritt S14 wird das PCR-Verfahren entsprechend dem Klassifikationsergebnis ausgeführt. Insbesondere kann das qPCR-Verfahren betrieben werden, indem bei Feststellen eines Vorhandenseins des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts, signalisiert wird, dass ein ct-Wert ermittelbar ist, und der ct-Wert aus der parametrierten Vorhandenseinsfunktion ermittelt.

In Figur 6 ist ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines alternativen Verfahrens zum Betreiben der PCR-Messung und zur Auswertung einer gemessenen qPCR-Kurve dargestellt.

In Schritt S21 wird mithilfe eines qPCR-Verfahrens eine qPCR-Messung durchgeführt und eine qPCR-Kurve durch aufeinanderfolgendes Messen von Intensitätswerten bestimmt.

In Schritt S22 wird zunächst eine vorgegebene parametrische Nichtvorhandenseinsfunktion parametrisiert, indem die gemessene qPCR-Kurve an die Nichtvorhandenseinsfunktion gefittet wird. Beispielsweise kann die Nichtvorhandenseinsfunktion eine lineare Funktion, wie sie in Figur 4a dargestellt ist, sein, die im Wesentlichen der Verlaufscharakteristik einer Baseline entspricht. Das Fitten an die Nichtvorhandenseinsfunktion kann beispielsweise mithilfe einer Least-Squares-Minimierung erfolgen.

In Schritt S23 wird die gemessene qPCR-Kurve an eine Vorhandenseinsfunktion gefittet. Die Vorhandenseinsfunktion entspricht einer parametrisierten Funktion, die im Wesentlichen einer Verlaufscharakteristik, wie sie in Fig. 4b dargestellt ist, entspricht. Die Vorhandenseinsfunktion kann eine Sigmoid-Funktion aufweisen. Durch Parametrisieren der Vorhandenseinsfunktion kann die gemessene qPCR- Kurve an die Vorhandenseinsfunktion gefittet werden.

In Schritt S24 werden Restfehlerverläufe der gemessenen qPCR-Kurve zu der parametrisierten Vorhandenseinsfunktion und zu der parametrisierten Nichtvorhandenseinsfunktion ermittelt.

In Schritt S25 werden die Restfehlerverläufe einem datenbasierten Klassifikationsmodell zugeführt. Das Klassifikationsmodell ist basierend auf Trainingsdaten trainiert, die Restfehlerverläufe den entsprechenden Vorhandenseins- oder Nichtvorhandenseinsfunktion zuordnet. Das heißt, die Trainingsdaten geben an, ob ein Restfehlerverlauf aus der parametrisierten Vorhandenseinsfunktion das Vorhandensein des zu detektierenden Strangabschnitt bestätigt oder nicht. Weiterhin geben die Trainingsdaten an, ob der Restfehlerverlauf aus der parametrisierten Nichtvorhandenseinsfunktion das Nicht-Vorhandensein des zu detektierenden Strangabschnitt bestätigt oder nicht.

Entsprechend wird in Schritt S25 mithilfe des Restfehlerverlaufs festgestellt, dass eine gemessene qPCR-Kurve ein Vorhandensein des zu detektierenden DNA- Strangabschnitts in der Substanz angibt, wenn das Klassifikationsmodell den Restfehlerverlauf aus der Vorhandenseinsfunktion bestätigt. Analog wird mithilfe des Restfehlerverlaufs festgestellt, dass eine gemessene qPCR-Kurve ein Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts in der Substanz angibt, wenn das Klassifikationsmodell den Restfehlerverlauf aus der Nicht- Vorhandenseinsfunktion bestätigt. Das heißt, ergibt sich allgemein aus dem Restfehlerverlauf basierend auf der parametrierten Vorhandenseinsfunktion oder der parametrierten Nichtvorhandenseinsfunktion, dass das Klassifikationsergebnis den Restfehlerverlauf der entsprechenden parametrierten Vorhandenseinsfunktion oder der parametrierten Nichtvorhandenseinsfunktion, die dem Restfehlerverlauf zugrunde liegt, so wird festgestellt, dass der zu detektierende DNA-Strangabschnitt vorhanden bzw. nicht vorhanden ist.

Ergibt sich aus dem Klassifikationsergebnis bezüglich des Restfehlerverlaufs ein dem Restfehlerverlauf zugrunde liegenden parametrisierten Vorhandenseins- oder Nichtvorhandenseinsfunktion entgegengesetztes Ergebnis, so kann entschieden werden, die qPCR-Messung zu verwerfen, da eine eindeutige Entscheidung über ein Vorhandensein oder Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA- Strangabschnitts nicht getroffen werden kann.