Für viele biologische, medizinische, pharmakologische aber auch nicht-biologische Anwendungen ist die präzise Beladung mit Substanzen und berührungslose Halterung mikroskopischer kleiner Teilchen, wie biologische Zellen oder Zellhaufen, La- texpartikeln oder andere Microbeads in freier Flüssigkeit von Bedeutung. Die häufigste Lösung ist das Aufwachsen von Zellen auf einem festen Substrat, das dann mit der geforderten Genau- igkeit mit einer Lösung überspült wird bzw. die Halterung in einem Sieb oder an Kapillaröffnungen. Nachteilig an diesem Verfahren ist der mechanische Oberflächenkontakt und die Schwierigkeit, viele Objekte in gleicher Weise und nacheinan- der zu behandeln. Besondere Schwierigkeiten bereitet es, Mi- kroobjekte ohne Oberflächenberührung für sehr kurze und ein- stellbare Zeiten einer anderen Lösung auszusetzen und sie dann in das ursprüngliche Medium rückzuführen. Bisher wird das durch aufwendige Wasch-und Zentrifugierschritte erreicht.

Ebenfalls benutzt werden sogenannte"Laserstrahl-Tweezers", mit denen es gelingt, Partikel in freier Lösung an einer mi- krometergenauen Position zu halten oder definiert zu verschie- ben [siehe A. Ashkin et al. in"Optics Lett.", Bd. 11, S. 288 (1986)]. Nachteilig ist, daß dieses Prinzip einen beträchtli- chen externen Apparateaufwand erfordert, der den Vorteilen der Miniaturisierung von Systemen entgegensteht und kostenintensiv ist. Hinzu kommt die Belastung des Objektes im Fokusbereich.

Eine Alternative stellen elektrische Mikrofeldkäfige dar, in denen Mikropartikeln und Zellen über Polarisationskräfte ana- log zu den"Laser-Tweezers"gehalten werden können [G. Fuhr et al. in"Naturwiss.", Bd. 81, S. 528 (1994)]. Bei derartigen Systemen befindet sich jedoch nur eine Lösung in dem System, so daß eine Überführung der Mikropartikel in ein anderes Medi- um nur durch Flüssigkeitsaustausch erfolgen kann, was langer Zeiten bis zur nächsten Benutzung und ggf. gesonderte Reini- gungsschritte erfordert. Das Halten eines Partikels in einer Halterungs-oder Parkposition läßt sich zwar mit einer Laser- Pinzette bewerkstelligen, ist jedoch für mehrere Teilchen technisch nicht sinnvoll realisierbar. Zudem befindet sich das Objekt während der Parkzeit unter einer permanenten Strahlen- belastung.

In Mikrosystemen wurden magnetisch geladene Teilchen über rechtwinklig zu den Kanälen wirkende Magnetfelder oder Ultra- schallquellen von einer Lösung in eine andere überführt [siehe G. Blankenstein in"Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers", Hrsg. Häfeli et al., Plenum Press New York 1997 (Kap. 16, S. 233 ff.)]. Beide Techniken eigenen sich je- doch nur sehr bedingt zur Miniaturisierung, erlauben keine Fo- kussierung der Kraftwirkung auf die Teilchen und lassen sich schwer in integrierter Form mit den Techniken der Halbleiter- strukturierungsverfahren umsetzen. Ferner ist diese Technik an eine für biologische Objekte ggf. physiologisch störende Bela- dung mit magnetischen Teilchen gebunden.

Aus DE-OS 41 43 573 ist eine Vorrichtung zur Trennung von Ge- mischen mikroskopisch kleiner Teilchen in einer Flüssigkeit bekannt, bei der die Teilchen elektrischen Wanderfeldern aus- gesetzt werden, unter deren Wirkung die Teilchen aus einer Strömung der Flüssigkeit ausgekoppelt werden. Diese Vorrich- tung besitzt die folgenden Nachteile. Zur Erzeugung der Wan- derwellen ist eine Vielzahl von Mikroelektroden erforderlich, so daß sich mit den jeweiligen separaten Ansteuerungen ein komplexer Aufbau ergibt. Die Mikroelektroden sind in einem Be- reich angeordnet, der wesentlich größer als die auszukoppeln-- den Teilchen ist. Die Wanderwellen verursachen in der Flüssig- keit Temperaturgradienten, durch die störende Querströmungen entstehen. Durch diese Querströmungen und ggf. vorhandene wei- tere Strömungensinhomogenitäten bewegen sich die Teilchen nicht auf definierten Bahnen. Zur Kompensation dieser örtlich undefinierten Auskopplung muß diese sich uber einen relativ weiten Bereich in Strömungsrichtung erstrecken. Dadurch wiederum werden ganze Teilchengruppen ausgekoppelt, oder die Teilchen müssen sich mit großen Abständen durch das Mikro- system bewegen, so daß die Verarbeitung großer Teilchenzahlen verzögert wird.

Mit den bekannten Techniken ist es somit bisher nicht oder nur beschränkt möglich, Mikroteilchen von einer Flüssigkeit in eine oder mehrere andere und zuruck zu überführen oder eine berührungsfreie Zwischenlagerung in einem Mikrosystem vorzu- nehmen.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein verbessertes Verfahren zur Manipulierung von Mikropartikeln in Fluidströmungen anzu- geben, das einen erweiterten Einsatzbereich besitzt und insbe- sondere mit hoher Geschwindigkeit seriell und parallel ein- setzbar ist sowie elektrisch steuerbare Verfahren zur beruh- rungsfreien Halterung und zur Überführung von Mikropartikeln in verschiedene Medien ermöglicht. Aufgabe der Erfindung ist es auch, eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens be- reitzustellen, die einen vereinfachten Aufbau und eine verein- fachte und zuverlässige Ansteuerung besitzt und zur Ausbildung definierter Bewegungsbahnen der zu manipulierenden Mikroparti- kel eingerichtet ist.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen gemäß Patentanspruch 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen gemäß Patentanspruch 9 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Anspruchen. _ Der Erfindung liegt die Idee zugrunde, Mikropartikel in einem strömenden Fluid elektrischen Feldkräften auszusetzen. Die elektrischen Feldkräfte werden durch mindestens eine elektri- sche Feldbarriere ausgeübt, gegen die die Mikropartikel mit dem strömenden Fluid bewegt werden und die eine Bewegungsände- rung der Mikropartikel mit einer von der Strömungsrichtung ab- weichenden Richtung bewirkt. Die elektrische Feldbarriere wird z. B. mit mindestens einem Paar bandförmiger Mikroelektroden erzeugt, das an gegenüberliegenden Begrenzungen des strömenden Fluids angeordnet ist und mit einer hochfrequenten Wech- selspannung beaufschlagt wird. Die Amplitude der Wechselspan- nung bzw. die Feldbarriere ist so hoch gewählt, daß Mikropar- tikel, die abgelenkt werden sollen, nicht zwischen die Elek- troden gelangen können. Das Fluid mit den darin suspendierten Mikropartikeln strömt durch einen Kanal mit mindestens einer seitlichen Öffnung, zu der mindestens ein Mikropartikel ent- lang der elektrischen Feldbarriere bewegt wird. An die Öffnung grenzt ein weiterer Kanal mit einem strömenden Fluid oder ein schleifenförmiger Abzweig (sog. Parkschleife) des ersten Kanals. An der Öffnung berühren sich die Fluidströmungen der jeweiligen Kanäle. Bei Realisierung des Fluidströmungssystems mit laminaren Strömungen findet jedoch keine Durchmischung der Fluide statt. Die laminaren Strömungen werden vorzugsweise in Mikrosystemen oder mit kapillarförmigen Kanälen realisiert.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die strömenden Fluide an den Öffnungen zwischen den Kanälen Grenz- flächen ausbilden, die von den zu manipulierenden Mikroparti- keln durchlaufen werden können.

Die elektrischen Feldkräfte werden allgemein durch 3-dimen- sional angeordnete Elektrodeneinrichtungen über oder an den Öffnungen zwischen den Kanälen zur Überführung der Objekte in einen oder mehrere Nachbarkanäle oder Parkschleifen durch An-- legen von Hochfrequenzspannungen bei permanenter hydrodynami- scher Durchströmung des Systems ausgeübt. Die Ansteuerung der als Ablenksysteme funktionierenden Elektrodeneinrichtungen kann computerbasiert erfolgen und erlaubt minimale Manipulati- onszeiten im ms-Bereich. Die Bewegung kann in freier Lösung ausgeführt werden, ohne eine mechanische Berührung oder Füh- rung des Objektes. Das Verfahren arbeitet ohne Interferenz mit den üblichen optischen Meßmethoden und vermeidet daher Schäden an lebenden biologischen Objekte, wie z. B. Zellen. Die Auf- enthaltsdauer der Teilchen in den Kompartimenten oder Kanalab- schnitten läßt sich extern festigen. Typische Bahndurchmesser bzw. Auslenkungen liegen im Bereich von 50 nm und einigen 100 um oder mehr. Es ist keine Feedback-Kontrolle oder Beobachtung der Objekte erforderlich (sie kann jedoch zusätzlich erfol- gen.) Besondere Vorteile der Erfindung bestehen darin, daß mit einem relativ einfachen Elektrodenaufbau (im einfachsten Fall : mit einem Paar von Elektrodenstreifen) eine zielgenaue, zuverläs- sige und schnelle Partikelmanipulierung erzielt wird. Störende Querströmungen werden vermieden. Die Elektroden können mit einer ausreichend hohen Wechselspannung beaufschlagt werden, so daß die Partikel sicher auf der stromaufwärts gelegenen Seite der Feldbarriere bleiben und zur seitlichen Öffnung ge- führt werden. Die Elektroden besitzen charakteristische Dimen- sionen, die kleiner oder gleich der Dimensionen der zu manipu- lierenden Partikel sind. Die erfindungsgemäße Partikelmanipu- lierung erlaubt eine Bewegung der Partikel in die und aus der Strömung, also eine Partikelrückführung aus einer benach- barten Strömung.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden im fol- genden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrie- ben. Es zeigen : Fig. 1 : eine Perspektivansicht einer ersten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Fluidströmungssystems ; Fig. 2 : eine Draufsicht auf ein Fluidströmungssystem gemäß Fig. 1 ; Fign. 3 bis 5 : Draufsichten auf Fluidströmungssysteme gemäß einer zweiten, dritten und vierten Ausführungsform der Erfindung ; Fig. 6 : eine Draufsicht auf ein Fluidströmungssystem gemäß einer Ausführungsform mit einem schleifenförmigen Abzweig ; und Fign. 7 und 8 : Draufsichten auf Fluidströmungssysteme gemäß einer Ausführungsform der Erfindung mit schleifenför- migen Strömungen zwischen zwei Kanälen.

Bei den illustrierten Beispielen handelt es sich stets um dreidimensionale Anordnungen von Mikroelektroden, mit denen barriereartige elektrische Hochfrequenzfelder in Kanälen er- zeugt werden. In der perspektivischen Darstellung ist ein der- artiges System stellvertretend in Figur 1 dargestellt. Die Beispiele zeigen lediglich 1-, 2-oder 3-Kanalsysteme. Die Er- findung ist jedoch durch beliebige weitere Kombinationen er- weiterbar. Die Erfindung wird am Beispiel strömender Flüssig- keiten erlautert, ist jedoch bei genügend starken Feldkräften auch mit anderen Fluiden realisierbar. Die Erfindung ist nicht auf die dargestellten ebenen Kanalwänden beschränkt, sondern auch mit Kanälen anderer, z. B. runder, Querschnitte reali- sierbar.

Figur 1 zeigt eine perspektivische Ansicht (Ausschnitt) eines 2-Kanalsystems bestehend aus einem Bodensubstrat 11, auf dem in planarer Weise die Mikroelektroden oder Elektrodenabschnit= te 16a, 16b (mit geraden Zuleitungen gezeigt) angeordnet sind, dem die Kanalwande bildenden Spacer 12 und einem Decksubstrat 13 (transparent dargestellt, transparent oder nicht- transparent realisierbar), auf dessen zum Kanal weisenden Sei- te ebenfalls planar Mikroelektroden oder Elektrodenabschnitte 15a, 15b (mit geraden Zuleitungen gezeigt) angeordnet sind.

Der Spacer 12 bildet einen rechten (ersten) und einen iinken (zweiten) Kanal. Die mittlere Trennwand besitzt Öffnungen 17.

Jeder Öffnung 17 ist eine Elektrodeneinrichtung bestehend aus den jeweiligen Elektrodenabschnitten 15a, 16a bzw. 15b, 16b zugeordnet. Die Elektrodenabschnitte erstrecken sich jeweils in einem Kanalabschnitt stromaufwärts von der jeweiligen Off- nung von einer der Öffnung gegenüberliegenden Wand bis zur Öffnung bzw. vorzugsweise durch diese hindurch bis in den be- nachbarten Kanal. Damit definieren die Elektrodenabschnitte eine Bezugsebene, die senkrecht auf der Fläche des Bodensub- strats 11 und unter einem Winkel zur Kanallängsrichtung steht.

Zwischen den Elektrodenabschnitten 15a, 16a und 15b, 16b wird eine Wechselspannung (Frequenz : kHz bis MHz, Amplitude : 0.1 bis 50 V) angelegt. Die Frequenz wird in Abhängigkeit von den dielektrischen Eigenschaften der Mikropartikel oder Teilchen derart ausgewählt, daß diese eine negative Polarisation, d. h. negative Dielektrophorese, aufweisen, und vom Hochfrequenzfeld abgestoßen werden. Alternativ ist es auch möglich, die Fre- quenz so zu wahlen, daß positive Dielektrophorese stattfindet (Anziehung), wobei dann die zu einer Öffnung gehörenden Elek- trodenabschnitte stromaufwärts im jeweils anderen Kanal anzu- ordnen wären. Die negative Dielektrophorese besitzt jedoch entscheidende Vorteil bei der berührungsfreien Manipulierung der Mikropartikel.

Im Bereich der genannten Bezugsebene wird somit ein abstoßen- des Feld als Barriere gebildet, das aufgrund der Neigung ge-_ genüber der Kanallängsrichtung im Zusammenwirken mit der Strö- mung eine Kraftwirkung auf die Teilchen hin zur Öffnung 17 verursacht.

Im vorliegenden Beispiel werden die Kanäle in gleicher Rich- tung (Pfeile) von verschiedenen Flüssigkeiten durchströmt.

Über den ersten Kanal werden suspendierte Teilchen (z. B. auch lebende Zellen) mit einer Trägerflüssigkeit eingespült. Im zweiten Kanal strömt eine Behandlungsflüssigkeit (z. B. ein Beladungsmedium mit einer gelösten Substanz, mit der die Teil- chen beladen werden sollen).

Ein Teilchen 14 bewegt sich auf der gestrichelt gezeichneten Bahn. Zur definierten Behandlung der Mikropartikel werden dese durch die erste Öffnung 17 in den zweiten Kanal bewegt. Über die Strömungsgeschwindigkeit und die Anordnung der ablenkenden Elektrodenabschnitte 15a, 16a bzw. 15b, 16b lassen sich die Partikel für eine definierte Zeit in das Beladungsmedium über- führen. In der Regel erfolgt dieser Vorgang bei Strömungsge- schwindigkeiten von einigen bis zu einigen hundert um/s. Die Verweildauer im Beladungsmedium liegt damit in Abhängigkeit vom Abstand der Ablenkelektroden im ms bis s-Bereich.

Die Ruckführung vom zweiten Kanal in den ersten Kanal erfolgt analog an der zweiten Öffnung 17.

Figur 2 zeigt eine Draufsicht auf das in Figur 1 beschriebene System. Die beiden Kanale 21,22 werden von links nach rechts durchströmt. Die Kanalwände bildet ein Spacer 27. Die Parti- keln 23 werden bei angeschaltetem Feld der Bahn 28 erfolgen.

Anderenfalls wechseln sie nicht in den Nachbarkanal über. Die Elektrodenabschnitte 25a, 26a und 25b, 26b (auch Ablenkelek- trodenpaare genannt) sind hier schematisch dargestellt, d. h., die dünne Linie stellt die untere Elektrodenebene 26a, 26b dar und die dickere Linie die obere Elektrodenebene 25a, 25b. Die- Breite der Elektroden kann im Bereich zwischen einigen 100 nm bis zu etwa 100 um liegen (typischerweise 10 bis 20 um). Die Größe der Partikeln 23 (nm bis mm) bestimmt die Höhe der Kanä- le. Günstige Werte sind etwa das 2-bis 20-fache des Partikel- durchmessers. Zur Minimierung von elektrischen Verlusten sind die Zuführung zu den Ablenkelektroden nicht untereinander, sondern möglichst weit seitlich versetzt anzuordnen. Wird die Ablenkeinheit 25b, 26b abgeschaltet, so verbleiben die Parti- keln in der Lösung des Kanals 21. Über den Abstand der Öffnun- gen 24a, 24b oder die Strömungsgeschwindigkeit kann die Ver- weilzeit in Kanal 21 festgelegt werden.

Die Kanäle besitzen Dimensionen, die in Abhängigkeit von der Fluidviskosität (Bereitstellung laminarer Strömungen) ausge- wählt sein konnen. Bevorzugte charakteristische Dimensionen liegen im Bereich von Sub-um bis mm, vorzugsweise einige um bis 0.5 mm, z. B. 200 um.

Die Elektrodenabschnitte sind bandförmig dargestellt, können aber auch jede andere Form haben, die die Kraftwirkung hin zu den Öffnungen in der Kanalwand sicherstellt.

Figur 3 zeigt einen besonderen Vorteil der Erfindung. In Mi- krokanälen mit einem Durchmesser <1/2 mm findet nämlich keine gegenseitige Störung der Flüssigkeitsstromungen statt (keine Vermischung). Strömungen bleiben über große Strecken laminar.

Im dargestellten Beispiel wird dieser Effekt genutzt, um die Partikeln aus Figur 1 und 2 temporar in eine andere Lösung zu überführen. Die Trennwand zwischen den Kanälen 31 und 32 bil- det hier eine mehrere um oder auch einige hundert um lange Öffnung 35. Bei einer Durchströmung des Kanals in gleicher Richtung kommt es an dieser Berührungsfläche aus o. g. Gründen nicht zu einer Vermischung. Über die Ablenkeinheit 34a läßt sich ein Partikel 33 vom Kanal 32 in den Kanal 31 überführen.

Über die Ablenkeinheiten 34b-e kann die Dauer der Verweilzeit_ im Medium des Kanals 31 bestimmt werden. Die Teilchen bewegen sich auf den mit Pfeilen eingezeichneten Trajektorien.

Figur 4 zeigt eine Anordnung, bei der die Überfuhrung eines Partikels 43 von Kanal 42 in Kanal 41 und zurück mehrfach er- folgen kann. Das System kann man auch weiter forgesetzt reali- siert werden. Die Teilchen folgen der Bewegungsbahn 46. Im er- sten Element 44a, 44b befindet sich eine Trennwand 45. Die zweite Ablenkvorrichtung 44c, 44c kommt ohne dieses Element aus. Je nach Abstand der Ablenksysteme kann auch beim ersten Übergangsbereich auf das Trennwandelement verzichtet werden.

Für biochemische und zellbiologisch-medizinische Aufgabenstel- lungen ist es häufig von Bedeutung, Objekte definiert und steuerbar kurzzeitig in mehrere Flüssigkeiten zu überführen.

Beispielhaft ist in Fig. 5 ein 3-Kanalsystem dargestellt. Alle Kanäle 51,52,53 werden von links nach rechts durchströmt.

Die Partikel 54 können uber das Ablenksystem 54a in den Kanal 52 und über 55b in den Kanal 53 überführt werden. Über die Ab- lenk-einheit 55c läßt sich das Teilchen wieder in Kanal 52 zu- rückführen. Es folgt der Bewegungsbahn 56. Durch Anordnung ei- ner weiteren Ablenkeinheit und Öffnung zwischen den Kanälen 51 und 52 läßt sich das Teilchen auch wieder in den Kanal 51 zu- rückführen. Nach dem dargestellten Muster können sich weitaus höhere Kanalzahlen und Uberführungselemente realisieren.

Ein bisher ungelöstes Problem in Mikrofluidiksystemen mit zellbiologischer Anbindung stellen die kurzen Durchflußzeiten dar. Wird beispielsweise ein Partikel vermessen, so mußte bis- her entweder die Strömung angehalten werden oder weitere im Kanalsystem befindliche Teilchen werden unwiederbringlich aus- gespült. Wird die Strömung angehalten, besteht die Gefahr ei- nes Oberflächenkontaktes und nachfolgende Adhåsion. Aus diesem Grunde ist es wünschenswert, bei permanenter Strömung Park- schleifen für Partikel zu realisieren. In Figur 6 ist ein der= artiges Grundelement dargestellt. Der Kanal 61 wird von links nach rechts durchstromt. In einer der Wände (67a) befindet sich ein Ringkanal 62, der durch einen Spacerabschnitt 66 ge- bildet wird. Der Spacer ragt an der hinteren Seite etwas in den Kanal 68 hinein, so daß ein Teil der Flüssigkeit im Kanal 62 zu zirkulieren beginnt. Ein Partikel 64 kann über die Ab- lenkelektrode 63a in diese Strömung hineingeführt werden.

Falls die Ablenk-elektrode 63b nicht angesteuert wird, ver- bleibt es in der Ringströmung und bewegt sich auf einer schleifenförmigen Parkbahn 65. Soll das Teilchen entnommen werden, so wird das Ablenksystem 63 angeschaltet und das Par- tikel verläßt die Parkschleife.

Eine Kombination aus Partikelparkschleife und definierter Überführung in eine andere Lösung erfolgt, wenn zwei Ablenksy- steme 74a, 74b über Öffnungen in der gemeinsamen Kanalwand in den jeweils benachbarten Kanal 71,72 hineinragen. Ein Teil- chen 73 würde sich bei entgegengesetzter Durchströmung der Ka- näle 71,72 in eine kreisförmige Bewegungsbahn 75 begeben, in der gleichzeitig auch mehrere Partikeln Platz fänden. Durch Abschalten der HF-Spannung an einer oder beiden Ablenksystemen kann das Partikel in den einen oder anderen Lösungsstrom ent- lassen werden. Diese Anordnung besitzt gleichzeitig den Vor- teil, daß in beiden Kanälen unterschiedlich zusammengesetzte Flüssigkeiten benutzt werden können. Über die Zahl der Umläufe des Teilchens läßt sich die Zeit, die es der jeweiligen Sub- stanz ausgesetzt sein soll, einstellen und meßbar reproduzie- ren. Über zusätzliche Detektionsmaßnahmen an einer oder mehre- ren Stellen kann die Umlaufzeit und die Zahl der gefangenen Partikeln bestimmt werden. Da kann optisch, aber auch über die Art eines"Coulter Counters"an den Öffnungen 76a, 76b erfol- gen. Das System kann man sich auch erweitert, bestehend aus einer Vielzahl solcher Elemente in Serie als auch parallel vorstellen. Es ist damit geeignet, eine Vielzahl von Partikeln zu halten, ihren Aufenthaltsort zu erfassen und sie in ver-- gleichbarer Weise zu behandeln.

Von besonderem Interesse sind sehr kurze Aufenthaltszeiten bzw. Parkschleifen, die in großer Zahl und jeweils nur von einem oder wenigen Partikeln gleichzeitig belegt wären können.

Dazu sind die Ablenksysteme 84a, 84b möglichst nahe zueinander und in einer Öffnung 86 zwischen den Kanalen 81,82 zu plazie- ren. Werden nun beide Kanäle in entgegengesetzter Richtung durchströmt, so wird das Teilchen 83 der Trajektorie 85 fol- gen. Der minimale Durchmesser der Bewegungsbahn liegt bei etwa dem Doppelten des Partikeldurchmessers. Geht man davon aus, daß auch Submikrometerteilchen wie Viren auf diese Weise ge- fangen und von einer Lösung in eine andere periodisch über- führt werden können, so liegen die kürzesten Zeiten für einen Umlauf bei einigen ms.