Alors que la biomasse est, d'évidence, la variable dont la connaissance est la plus importante pour la maîtrise des processus fermentaires, les capteurs pour la mesurer sont aujourd'hui relativement rares, chers, et souvent méconnus.

Une des raisons principales est probablement le caractère relativement flou de l'idée de biomasse : selon les domaines d'application, les opérateurs mesurent le volume cellulaire, la masse sèche, le nombre de cellules, le nombre de colonies après culture, la turbidité, voire mme l'activité métabolique (respiration, vitesse d'acidification...). La correspondance des mesures obtenues par ces diverses méthodes est loin d'tre constante, et évolue en fonction des conditions de culture.

Toutes ne sont pas toujours utilisables, comme par exemple la mesure de la concentration de matière sèche après filtration lorsque le milieu est visqueux ou contient des particules en suspension autres que la biomasse.

La concentration de biomasse n'est pas la seule variable caractérisant une biomasse. L'état physiologique de cette biomasse est également une variable importante pour la maîtrise des processus fermentaires. La notion d'état physiologique est délicate à définir : suivant les applications, elle fait référence à la position des cellules dans leur cycle végétatif ou cycle cellulaire, à leur état de viabilité, à leur morphologie... Les opérateurs décrivent pourtant leur culture comme étant en"bon (ou mauvais) état physiologique", en fonction de critères, pas toujours objectifs, souvent liés à l'évolution temporelle de la fermentation. Parmi les moyens conventionnels d'évaluation de l'état physiologique d'une population, on peut citer : la mesure de la morphologie cellulaire par microscopie (avec éventuellement l'appui de techniques d'analyse d'images). On peut mesurer la longueur (ou le diamètre) des cellules, l'état d'agrégation ou leur mode de groupement (cellules isolées, par paires...), l'état de division (ratio cellules en division/cellules isolées) ; l'aptitude à la division, après culture sur milieu approprié (milieu gélosé, liquide...). On dénombre alors le nombre de colonies obtenues, et on calcule le ratio au nombre initial de cellules ; le suivi par microscopie ou cytométrie de flux de la pénétration de marqueurs colorés, souvent fluorescents, et leur métabolisation éventuelle, qui permet d'évaluer la perméabilité membranaire et la présence d'activités physiologiques particulières ;

La mesure d'une activité métabolique globale (vitesse d'acidification, vitesse de consommation d'oxygène, de production de C02, éventuellement divisée par la concentration de biomasse totale (généralement exprimée en concentration de matière sèche).

A coté des mesures conventionnelles, qui nécessitent généralement un échantillonnage, la mise en oeuvre de systèmes de mesure in situ commence à se populariser. Il existe essentiellement deux technologies concurrentes, basées soit sur les propriétés optiques des suspensions cellulaires, soit sur les propriétés diélectriques des cellules vivantes.

Les mesures optiques sont le plus souvent basées sur l'évaluation simultanée de l'ensemble des phénomènes (absorption, réflexion, réfraction, diffraction) qui affectent les suspensions de cellules. Leur principal avantage est leur sensibilité aux faibles concentrations de biomasse. Leur principal inconvénient est la détection de particules autres que la biomasse, par exemple des bulles ou des matières insolubles, et dans une moindre mesure, des cellules mortes.

Les mesures de capacitance (à distinguer des mesures d'impédance) exploitent les propriétés diélectriques des membranes cellulaires, qui empchent la libre circulation des ions et confèrent aux cellules vivantes le comportement de petits condensateurs. Les mesures de capacitance permettent, en principe, une évaluation directe du volume cellulaire.

Cette technique peut sembler résoudre les problèmes rencontrés par les mesures optiques puisque son principal avantage est de ne détecter que les cellules vivantes. En réalité le signal

obtenu dépend du volume de cellules vivantes mais aussi de la taille des cellules et également de l'état membranaire des cellules.

L'utilisation des propriétés diélectriques des cellules vivantes pour évaluer une biomasse est malgré ses imperfections une technique performante étudiée depuis longtemps. De nombreux articles ont été publiés sur cette technique et différentes méthodes et appareils ont également été brevetés pour exploiter ce phénomène.

A ce jour et en référence à la figure 1 représentative de l'art antérieur, l'amplitude de la variation de capacitance correspondant à la dispersion ß est le seul paramètre explicitement exploité par les équipements de détermination de la biomasse.

On peut considérer que l'amplitude de la dispersion tant que la fraction volumique P n'est pas trop forte (comme c'est le cas dans la plupart des fermentations), est donnée par la relation Ar 9 i-r p<BR> 4£o m dans laquelle : As est l'incrément diélectrique, Eo est la permittivité du vide r est le rayon des cellules, supposées sphériques, Cm est la capacité membranaire, P est la fraction volumique, La fraction volumique P est donc proportionnelle à la concentration de biomasse sèche X, le facteur de

proportionnalité étant fonction de la teneur en eau des cellules (65-80 % d'eau environ) et de leur masse volumique (1.06-1. 09 g/cm3 environ), mais également au rayon des cellules et à la capacitance membranaire.

La mesure de l'incrément diélectrique fournit donc une information sur le produit r. Cm. X, sans qu'il soit possible d'évaluer directement la contribution de chacune des variables. La mesure de la biomasse à l'aide d'un capteur capacitif suppose donc que les cellules ne changent ni d'état (Cm) ni de taille (r), ce qui n'est pas le cas tout au long d'un processus de fermentation.

Par ailleurs, la capacité membranaire Cm peut tre considérée comme un indicateur de viabilité, car elle diminue jusqu'à s'annuler lorsque les cellules meurent. Au lieu de considérer Cm comme une constante, il serait donc préférable de mesurer cette variable, susceptible d'apporter une information utile aux opérateurs en fermentation.

En ce qui concerne la taille, il existe plusieurs travaux consacrés à l'étude de l'impact de variations morphologiques sur la permittivité des suspensions de microorganismes. On sait en effet que la vitesse de polarisation est fonction de la taille des cellules, et que la fréquence caractéristique varie avec la taille r selon la relation dans laquelle apparaissent la conductivité intracellulaire Oc et la conductivité du milieu Om.

Plusieurs auteurs ont utilisé la forme de la dispersion ß pour tenter de caractériser la biomasse. En pratique, c'est l'opération inverse qui a le plus souvent été réalisée, c'est à dire que les travaux ont montré comment la biomasse, en fonction de ses caractéristiques (concentration, morphologie, état...) affectait la capacitance d'une suspension de cellules.

Par exemple, Asami (1999. Effect of cell shape on dielectric behaviour of fission yeast. Biochim. Biophys. Acta, 1472,137- 141) a montré expérimentalement que pour des cellules allongées, la dispersion (3 présentait deux sous-dispersions.

En pratique, l'interdépendance d'un nombre élevé de variables, associée aux incertitudes de mesure, dues par exemple aux bruits de mesure ou à la polarisation de surface des électrodes, ne permet pas d'obtenir la valeur des variables à partir des mesures de capacitance. La forme de la dispersion P dépend en effet de nombreuses variables. De manière synthétique, la concentration de biomasse agit sur l'amplitude As, la taille moyenne des cellules agit sur la fréquence caractéristique fc et sur l'amplitude As, les conductivités membranaire et intracellulaire (état physiologique, viabilité...) agissent sur la fréquence caractéristique fc, la capacitance membranaire Cm (état physiologique, viabilité...) agit sur la fréquence caractéristique fc et sur l'amplitude As, la distribution de taille agit sur As l'état physiologique (évolution des structures

intracellulaires telles que vacuoles, mitochondries...) agit sur a, facteur de Cole et Cole, les changements de morphologie (élongation) des cellules agissent sur a, la rétention gazeuse agit sur l'amplitude As et sur Sinf, la composition du milieu (solutés à concentrations élevées) agit sur sine- D'un point de vue mathématique, dans le cas de cellules sphériques, la forme de la dispersion ß en fonction de la fréquence de mesure f peut tre entièrement définie à l'aide de trois paramètres qui sont l'incrément diélectrique As, la fréquence caractéristique fc et le facteur a de Cole et Cole, suivant la relation En principe, les valeurs des trois paramètres As, fc et le facteur a de Cole et Cole peuvent tre obtenues expérimentalement à partir de mesures de permittivité réalisées à différentes fréquences, et nécessitent à la fois des matériels et méthodes performants. Cependant, la difficulté n'est pas seulement de réaliser les mesures, mais aussi et surtout de pouvoir en extraire une information utile à l'opérateur.

Les deux paramètres principaux As et fc sont en effet eux- mmes dépendants de cinq variables, la concentration volumique

de biomasse P, la capacitance membranaire Cm, la taille des cellules r, la conductivité intracellulaire sc et la conductivité du milieu Puisque le nombre de variables est supérieur au nombre de paramètres accessibles expérimentalement, il est strictement impossible de déterminer, à partir de mesures de capacitance, la valeur des différentes variables.

A titre d'illustration, nous allons examiner dans le détail le problème posé par la détermination de la concentration de biomasse P. Nous avons vu que le paramètre As est fonction de P, mais également de r et de Cm. Dans la mesure où la taille et la capacitance membranaire ne sont pas des constantes, il n'est pas possible de déterminer P (trois inconnues et une seule équation). On peut obtenir expérimentalement la valeur de fc, ce qui fournit une équation supplémentaire, fonction de r et de Cm, inconnues qui pourront alors tre éliminées par combinaison avec l'expression de As, mais introduit les deux nouvelles variables vc et Cm. Or, les appareils de mesure capacitive fournissent également une mesure satisfaisante de la conductivité du milieu Omf ce qui supprime une inconnue. Au final, on obtient donc une relation entre As, P et Oc, mais il n'est toujours pas possible d'évaluer indépendamment P et Oc.

Or Oc, directement liée à la concentration des solutés intracellulaires, ioniques ou non, est une variable représentative de l'état des cellules.

On voit ainsi que les mesures de capacitance ne permettent l'évaluation de la concentration de biomasse que si on suppose que plusieurs variables, représentatives de l'état des

cellules en culture, soient constantes, ce qui conduit à supprimer des éléments d'information précieux pour l'opérateur.

L'objectif de la présente invention est d'apporter une solution technique à ce problème en proposant un procédé pour caractériser une biomasse, qui fournisse des données objectives de caractérisation, en l'occurrence la concentration, la taille ou l'état physiologique de cette biomasse. Les mesures de capacitance ne sont plus alors utilisées comme mesures directes de la concentration de biomasse, mais comme mesures complexes, caractéristiques à la fois de la concentration, de la taille et de l'état des cellules cultivées.

Suivant l'invention, ce procédé comprend : - une combinaison d'une première technique de mesure capacitive au sein de cette biomasse et d'au moins une autre technique de mesure de ladite biomasse, et - un traitement des données de mesure issues desdites première et autre techniques de mesure, pour déterminer au moins l'une des trois variables suivantes : la concentration de biomasse X, la taille des cellules @, une donnée représentative de l'état physiologique T desdites cellules.

Dans une forme préférée du procédé de caractérisation selon l'invention, les techniques de mesure sont mises en oeuvre in situ. La première technique de mesure capacitive est mise en oeuvre avec un balayage en fréquence dans une plage de

fréquences prédéterminées.

L'au moins autre technique de mesure peut avantageusement tre sélectionnée parmi l'une des techniques de mesure suivantes : - mesure d'absorbance optique de la suspension cellulaire, éventuellement par technique photo-acoustique - mesure acoustique, - spectroscopies en lumière infrarouge ou UV, - mesure de l'intensité de la lumière diffusée par la suspension cellulaire à divers angles, - mesure de conduction électrique dans la suspension cellulaire, - mesure par microscopie in situ de la taille et du nombre de cellules, - mesure de champ magnétique dans la suspension cellulaire, par résonance magnétique nucléaire (RMN) éventuellement, - mesures indirectes de la concentration de biomasse, par exemple par calcul des bilans matières.

Le traitement des données de mesure peut tre avantageusement effectué en temps réel.

On peut aussi inclure une analyse des variations temporelles des signaux de mesure pour apporter une information sur l'état d'agrégation des cellules en suspension, ou sur la présence de bulles de gaz dispersées. Suivant un autre aspect de l'invention, il est proposé un dispositif pour caractériser une biomasse, mettant en oeuvre le procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend : une combinaison d'au moins un premier moyen de mesure capacitive au sein de cette biomasse et d'autres moyens pour

mesurer des paramètres physico-chimiques de ladite biomasse, et des moyens pour traiter des données de mesure issues desdites première et autre techniques de mesure, agencés pour déterminer au moins l'une des trois variables suivantes : la concentration de biomasse X, la taille des cellules @, une donnée représentative de l'état physiologique T desdites cellules.

Dans une forme particulière de réalisation, on prévoit un dispositif de mesure de concentration de biomasse pour une suspension cellulaire, mettant en oeuvre le procédé selon l'invention, comprenant : des moyens pour mesurer la capacitance C de ladite suspension cellulaire pour une pluralité de fréquences, des moyens pour mesurer l'absorbance de ladite suspension cellulaire, et des moyens pour traiter en temps réel des signaux de mesure de capacitance et d'absorbance, de façon à déterminer l'une au moins des trois variables : concentration de biomasse X, la taille des cellules des cellules 0, une donnée représentative de l'état physiologique T desdites cellules.

Suivant encore un autre aspect de l'invention, il est proposé un procédé de pilotage d'un système de fermentation régulé par ajustement de paramètres d'action pour obtenir une biomasse satisfaisant à au moins un critère cible déterminé en termes de taille de cellules ou d'état physiologique, caractérisé en ce qu'au moins un de ces paramètres d'action

est calculé à partir d'au moins un paramètre d'état mesuré par un dispositif de caractérisation selon l'invention.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à l'examen de la description détaillée d'un mode de mise en oeuvre nullement limitatif, et des dessins annexés sur lesquels : - la figure 2 illustre l'évolution de la permittivité et de la densité optique au cours de deux cultures de Bacillus sp., et l'influence d'un changement de pH ; - la figure 3 illustre l'évolution de la densité optique et de la permittivité d'une culture de Bacillus sp., ainsi que l'évolution de la viabilité mesurée par dénombrements et calculée à partir du rapport permittivité/densité optique ; - la figure 4 illustre une relation entre le rapport densité optique/permittivité diélectrique et la longueur moyenne de Bacillus sp. ; - la figure 5 illustre un exemple pratique de réalisation d'un dispositif de mesure de biomasse selon l'invention ; - la figure 6 illustre l'évolution de la permittivité et de la viabilité après ajout d'éthanol à une culture de Zymomonas mobilis ; - la figure 7 montre la similitude entre l'évolution de la viabilité mesurée et celle du signal capacitif pondéré par les mesures de densité optique et de taille.

Les variables de taille et d'état physiologique sont généralement liées au cours d'un mme processus fermentaire, et on peut souvent se contenter d'une estimation de la taille moyenne.

Ainsi, on a pu mesurer simultanément la concentration et la taille moyenne de bactéries en utilisant simultanément un analyseur de biomasse développé et commercialisé par la société Fogale Nanotech et une sonde optique Wedgewood (système mesurant dans le proche infrarouge la densité optique de suspensions microbiennes), comme l'illustre la figure 4.

Pour illustration, la figure 2 représente l'évolution temporelle de la permittivité diélectrique de deux suspensions bactériennes (Bacillus sp. ). Au cours d'une de ces cultures, le pH du milieu (normalement régulé par addition contrôlée de soude) a été abaissé par addition d'acide phosphorique. On constate une déviation de la courbe de permittivité correspondante, qui pourrait indiquer un arrt de la croissance, suivi d'une reprise progressive. Cependant, la mesure simultanée de la densité optique montre que la variation de pH ne produit qu'un léger ralentissement de la croissance. Des mesures indépendantes (hors-ligne, non présentées) de concentration de matière sèche confirment le fait que la variation du pH n'a affecté que la vitesse de la croissance et que la quantité maximale de biomasse formée reste la mme. En fait, la variation du pH provoque une diminution de la taille des bactéries, qui passe de 8. 5 0. 5 um avant l'abaissement du pH, à 4.9 0. 5 um en fin de culture, avec une diminution correspondante du signal capacitif. Si on reporte le rapport des mesures Densité Optique/Permittivité en fonction de la longueur moyenne des bactéries, mesurée en microscopie optique, on obtient une corrélation très satisfaisante, qui peut ensuite tre utilisée

en sens inverse pour évaluer la longueur moyenne à partir des mesures simultanées de densité optique et de permittivité diélectrique.

Dans un second exemple de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on réalise un suivi de la sporulation de Bacillus sp.. La phase de croissance est suivie, après épuisement des éléments nutritifs du milieu de culture, par une phase de sporulation. La mesure simultanée de la densité optique de la suspension et de sa capacitance permet la détermination du pourcentage de spores : Le ratio capacitance/densité optique est comparé au nombre de spores et de bactéries, comptées d'une part en microscopie optique, d'autre part après cultures sur milieux nutritifs gélosés.

Dans un troisième exemple de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on détermine simultanément la concentration de biomasse, la taille et la viabilité au cours d'une culture de Zymomonas mobilisa Cette bactérie réalise la transformation anaérobie du glucose en éthanol. L'accumulation d'éthanol provoque l'inhibition de la multiplication cellulaire, qui se traduit par un ralentissement de la croissance, suivi de la mort cellulaire lorsque la concentration d'éthanol dépasse un seuil qui est fonction des conditions de culture (70-75 g/1 à 30°C). Dans l'expérience décrite, on a procédé à un ajout d'éthanol au cours d'une culture, pour porter la concentration d'alcool au seuil critique, et mettre ainsi en évidence l'évolution des différentes variables.

L'ajout d'alcool provoque un ralentissement marqué immédiat de la croissance, qui se poursuit néanmoins, avec un doublement de la masse sèche (x 2.16) en quelques heures. La production d'éthanol se poursuit. La vitesse de fermentation, mesurée par la production de COa reste d'abord constante, puis diminue progressivement. Le nombre de cellules, mesuré par dénombrement en microscopie optique reste sensiblement constant. La viabilité, mesurée par dénombrement sur milieu gélosé selon la méthode proposée par Vaija J. et coll. (1993.

« Zymomonas mobilis cell viability-measurement method comparison » ; Antonie van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology 64 (1) : 57-66), diminue progressivement. On obtient ainsi une image peu courante de la croissance microbienne, en apparence incohérente, puisque, selon la méthode d'évaluation retenue, l'alcool serait capable de : a/ralentir la croissance (masse sèche) ; b/arrter la croissance (dénombrements en microscopie) ; c/entraîner un déclin (dénombrements sur milieu gélosé).

Ceci illustre bien la complexité de l'évaluation d'une biomasse. Ces résultats peuvent tre réconciliés à l'aide de l'interprétation suivante : à la concentration utilisée, l'éthanol bloque la division cellulaire, sans bloquer la synthèse de matériel cellulaire, ce qui explique l'accroissement de la masse sèche alors que le nombre de cellules reste constant. En mme temps, les cellules commencent à mourir, ce qui provoque la diminution de la viabilité constatée sur milieu gélose. La population se

compose alors à la fois de cellules viables et de cellules mortes. Dans notre cas, la croissance de la biomasse viable compense la mort d'une partie de la population, ce qui explique le maintien de la vitesse de fermentation. Une mesure complémentaire permet de valider ce modèle : la longueur moyenne des bactéries, mesurée par analyse d'images, double (x 2. 3) en mme temps que la masse sèche, ce qui montre bien que la croissance se poursuit, alors que la division s'est arrtée.

Le couplage entre mesure d'absorbance optique, granulométrie laser et mesure capacitive permet de retrouver l'ensemble de ces informations en temps réel, et en particulier, de réaliser une mesure de viabilité. L'approche la plus élémentaire, basée sur l'assertion rencontrée généralement dans la littérature scientifique, selon laquelle les mesures de capacitance évaluent la biomasse viable, consisterait à réaliser le rapport mesure capacitive sur mesure d'absorbance, qui serait représentatif du ratio biomasse viable/biomasse totale. Cependant, une telle approche néglige l'effet de la variation de la taille observée expérimentalement, dont on connaît l'impact sur la mesure capacitive (cf. exemple 1). Pour résoudre le produit X. r. Cm, on réalise donc simultanément une mesure de capacitance (Biomass System, FOGALE Nanotech, d'absorbance (sonde optique Wedgewood) et de taille avec un granulomètre laser. La mesure réalisée avec ce dernier appareil est effectuée hors-ligne, mais pourrait tre réalisée en ligne en utilisant des appareils de construction dïfférente, commercialement

disponibles. Il a été démontré précédemment (Vaija J. et coll. <BR> <BR> <P>(1995) "Evaluation of image-analysis and laser granulometry for microbial cell sizing" ; Antonie van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology 67 (2) : 139-149) que la granulométrie laser, appliquée aux suspensions de microorganismes, ne fournit pas une mesure objective directe de la taille des cellules, et en particulier de Zymomonas, mais qu'un traitement approprié des données permet de la retrouver. On observe un doublement de la longueur moyenne (x 2.14), qui est équivalent à celui constaté à partir des mesures d'analyse d'image par microscopie.

La mesure d'absorbance permet une évaluation indirecte de la masse sèche. On retrouve sensiblement le doublement (x 2.35) constaté à partir des mesures de matière sèche.

La mesure capacitive montre également un doublement (x 2. 23) de As qui correspond ainsi à peu près à l'accroissement de masse sèche. Cependant, la variation de taille n'est pas prise en compte.

À partir de la mesure de As, on évalue Cm à une constante multiplicative près, en divisant £ par l'absorbance et la longueur cellulaire déterminée par granulométrie laser. On obtient ainsi une variable C'm, proportionnelle à Cm, qui peut tre utilisée comme un évaluateur de la viabilité.

Dans un exemple pratique de réalisation, l'analyseur de biomasse comprend une sonde capacitive, du type décrit dans le document WO 0179828, pour la détermination de la biomasse de cellules vivantes dont la surface cellulaire est inférieure ou égale à 10 um2. Cette sonde capacitive est conçue pour tre

immergée dans un réacteur de fermentation contenant un milieu de cellules en suspension. Elle comprend une première paire d'électrodes d'intensité pour injecter un courant électrique dans le milieu, une seconde paire d'électrodes de tension pour relever la tension appliquée à ce milieu, et un circuit de mesure du courant électrique injecté. L'analyseur de biomasse comprend un conditionneur incluant un circuit pour fournir une tension alternative isolée galvaniquement à appliquer entre les électrodes d'intensité, et un circuit pour traiter des signaux représentatifs du courant injecté dans le milieu et de la tension relevée aux bornes des électrodes de tension, de façon à délivrer des signaux de mesure de la capacitance et de la conductance du milieu.

Le circuit de traitement comprend (i) un pont de mesure par méthode de zéro agencé pour traiter un signal image du courant injecté et un signal image de la tension relevée, ces deux signaux étant appliqués respectivement à une branche de référence et à deux branches d'opposition, et (ii) un circuit de commande automatique de ce pont à partir du signal de mesure de conductance.

Bien sûr, l'invention n'est pas limitée aux exemples qui viennent d'tre décrits et de nombreux aménagements peuvent tre apportés à ces exemples sans sortir du cadre de l'invention.