Eine häufig bei biologischen oder medizinischen Untersuchun- gen, in der Diagnostik sowie in biotechnologischen Prozessen gestellte Aufgabe besteht in der Trennung von Suspensionsge- mischen durch Verteilung oder Sortierung von Zellen oder Mik- ropartikeln aus einer großen Ausgangsmenge in bestimmte Grup- pen mit jeweils den gleichen Eigenschaften. Beispielsweise kann die Transfektion einer Zellinie oft nur unvollständig durchgeführt werden, so daß vor einer weiteren Bearbeitung oder Nutzung dieser Zellinie die erfolgreich transfizierten Zellen von den nicht erfolgreich bearbeiteten Zellen getrennt werden müssen. Insbesondere das Aussortieren selten vorkom- mender Individuen stellt eine sehr hohe Anforderung an das Trennverfahren hinsichtlich der Reinheit und Homogenität der Zielfraktion. Ein weiteres Beispiel im medizinischen Bereich ist mit der Knochenmarktransplatation gegeben, bei der Stamm- zellen von einer großen Zahl anderer. Zellen getrennt werden müssen. Auch bei der Analyse von fetalen Zellen im mütterli- chem Blut müssen einige wenige fetale Zellen von dem Zellen- gemisch abgetrennt werden, das sich im mütterlichen Blut be- findet. Eine wichtige Aufgabe in der Tumordiagnostik ist die Erkennung, das Aussortieren und die Analyse von metastasier- enden Krebszellen im Blut des Patienten. Es sind verschiedene Methoden zur Trennung von Zellgemischen bekannt, die die Trennaufgabe jedoch nur unvollkommen lösen. Hierzu zählen insbesondere die Affinitätschromatographie, Trennverfahren auf der Basis von Fluoreszenzmarkierungen wie zum Beispiel die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), auf der Ba- sis von Markierung mit ferromagnetischen Partikeln, die Mag- net-aktivierte Zellsortierung (MACS) und mikroskopische Ver- fahren.

Die Affinitätschromatographie wie auch die MACS (oder : Pan- ning-Verfahren) sind auf Trennvorgänge beschränkt, bei denen die Zellen an der Zelloberfläche ein Molekül exprimieren, das eine Affinität zu einer weiteren, bekannten oder unbekannten Substanz besitzt. Bei der Affinitätschromatographie wird die- se Substanz auf eine Chromatographiematrix, zum Beispiel auf der Basis von Beads, aufgebracht. Eine Suspension der zu tren- nenden Zellen wird uber diese-Matrix gegeben, so daß die ex- primierenden Zellen daran haften, während die anderen Zellen fort gespült werden. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht neben der Beschränkung auf zelluläre Systeme mit einer Ober- flachenexpression-von Molekülen, in der hohen mechanischen Be- lastung der Zellen und der geringen Trennschärfe der Chroma- tographie. Die Trennschärfe ist schwach, da viele Zellen mit geringer Affinität unspezifisch an der Matrix hängenbleiben, die eigentlich nicht zu den abzutrennenden Zellen gehören. In der Praxis ist die Affinitätschromatographie auf die Trennung von mechanisch wenig empfindlichen Bakterien beschränkt.

Beim Magnet-aktivierten Trennen von Zellen wird die Zellsus- pension mit mikrometergroßen Magnetpartikeln, auf die die af- fine Substanz aufgebracht ist, gemischt und die Magnetpartikel zusammen mit den Zielzellen mithilfe eines außerhalb des Reak- tionsgefäßes befindlichen Magneten abgetrennt. Auch hier ist die Verschleppung unspezifisch anhaftender Zellen an die Mag- netpartikel eine erhebliche Einschränkung des Verfahrens hin- sichtlich der Reinheit der Zielfraktion.

Beim Fluoreszenz-aktivierten Trennen von Zellen (FACS) werden diese in einem Flüssigkeitsstrom durch eine dünne Kapillare transportiert, wobei in der Regel noch ein weiterer, zellfrei- er Hüllstrom vorgesehen ist. Dieser Strom wird von einem Trop- fengenerator in Einzeltropfen zerlegt, die aus der Kapillare in einen freien Meßraum emittiert werden. Die Tropfen passie- ren im Flug eine optische Meßstrecke, in der sie einer Streu- licht-und/oder Fluoreszenzlichtmessung unterzogen werden.

Hierzu werden ein oder mehrere Laser auf die Flugbahn der Tropfen in der optischen Meßfläche fokussiert. Die gemessenen Streulicht-und/oder Fluoreszenzintensitäten erlauben die Feststellung, ob bestimmte Zelleneigenschaften gegeben sind oder nicht. In Abhängigkeit vom Meßergebnis wird eine nach der Meßstrecke angeordnete Verteilereinrichtung, zum Beispiel auf der Basis einer mechanischen Prallplatte oder einer elektro- statischen Ablenkvorrichtung, betätigt.

Der Nachteil der fluoreszenzaktivierten Zelltrennung besteht darin, daß es sich um ein serielles Verfahren handelt. Der op- tische Aufwand für die Meßstrecke ist so groß, daß eine Paral- lelisierung für praktische Anwendungen zu aufwendig ist. Ent- sprechendes gilt für die Tropfenerzeugung und die Verteiler- einrichtung. Um beispielsweise 10000 Zellen pro Sekunde analy- sieren zu können, muß bei einer seriellen Verfahrensweise die Meßzeit auf 100 ms oder weniger beschränkt werden. In derart kurzen Zeitbereichen sind Messungen zwar möglich, aber auch mit relativ großen Fehlern behaftet, so daß die Trennschärfe des Verfahrens negativ beeinflußt wird.

Die mikroskopische Zelltrennung basiert darauf, eine zweidi- mensionale Schicht von Zellen (sogenannter Zellrasen) zu bil- den und mit einem Mikroskop abzurastern. Von jeder Zelle wird ein Bild aufgenommen, das einer Bildauswertung zur Feststel- lung vorbestimmter Zelleigenschaften unterzogen wird. Je nach dem Auswertungsergebnis wird eine Pickvorrichtung dazu verwen- det, einzelne Zellen nach der Messung aus dem Zellrasen zu lö- sen und einem Zielort zuzuführen. Eine besonders hohe Auflö- sung bei der Bildaufnahme wird durch Einsatz der konfokalen Mikroskopie erzielt. Auch dieses Verfahren besitzt Beschrän- kungen vor allem in bezug auf den Durchsatz der Pickvorrich- tung. Ohne Zellen zu beschädigen, kann maximal im Rhythmus von ca. 10 s jeweils ein Pickvorgang erfolgen, der darüber hinaus eine mechanische Belastung der zu trennenden Zellen darstellt.

Die genannten Probleme treten nicht nur bei der Trennung von Zellgemischen, sondern allgemein bei der Trennung von Parti- kelgemischen natürlichen und/oder synthetischen Ursprungs auf.

In Fig. 7 ist ein aus der Mikrosystemtechnik allgemein bekann- tes Prinzip der Verteilung von Partikeln illustriert. Ein flu- idisches Mikrosystem 100'enthält eine erste Kanalstruktur 10' und eine zweite Kanalstruktur 20', die aneinandergrenzende, zum Beispiel nebeneinander oder übereinander angeordnete, Ka- näle oder Kammern umfassen. Ein in einer Flüssigkeit suspen- diertes Partikelgemisch 1'wird in der ersten Kammerstruktur 10'zu einem Feldkäfig 30'bewegt. Sobald ein Partikel im Feldkäfig 30'positioniert ist, erfolgen an dieser Beobach- tungsposition eine Vermessung des Partikels mit elektrischen Mitteln und nach Freigabe des Partikels vom Feldkäfig 30'in Abhängigkeit vom Meßergebnis eine Ansteuerung einer Ablenk- elektrode 40'derart, daß der Partikel in die zweite Kanal- struktur 20'überführt oder zur weiteren Bewegung in der ers- ten Kanalstruktur 10'verbleibt (siehe Pfeile). Dieses Verfah- ren ist wegen der seriellen Trennweise nachteilig. Soll das Trennverfahren gemäß Fig. 5 mit mehreren Feldkäfigen durchge- führt werden, so müßten entsprechend mehrere Ablenkelektroden selektiv verstimmt werden. Dies ist jedoch wegen der elektri- schen Wechselwirkung benachbarter Strukturen in praktisch in- teressierenden Zeitbereichen nicht zuverlässig durchführbar und es würde zu unerwünschten Fehltrennungen kommen. Ein wei- terer Nachteil besteht in der Beschränkung auf die Messung elektrischer Eigenschaften der Partikel im Mikrosystem.

Der Einsatz von optischen Kräften zur Trennung von Partikelge- mischen ist an sich bekannt (siehe Buican et al. in"Applied Optics", Bd. 26,1987, S. 5311 ff. und Fuhr et al. in"Topics in Current Chemistry"Springer-Verlag 1998, S. 83 ff.). Aller- dings sind die herkömmlichen Techniken auf Trennungen mit ei- nem sehr geringen Partikeldurchsatz beschränkt, da der Sor- tiervorgang nur an einer einzigen definierten Position durch- geführt wird und alle Partikel nacheinander diese Position durchlaufen. Außerdem ist die Reproduzierbarkeit der optischen Bewertung der Partikel vor der Trennung nur über optische Kräfte ohne eine zusätzliche Positionskontrolle der Partikel nur schwer möglich.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Trennver- fahren anzugeben, das sich durch einen hohen Durchsatz, eine hohe Trennschärfe und eine geringe mechanische Belastung der zu trennenden Partikel auszeichnet. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, eine Trennvorrichtung zur Implementierung eines derartigen Verfahrens anzugeben.

Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren und eine Vorrichtung mit den Merkmalen gemäß den Patenansprüchen 1 bzw. 23 gelöst.

Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Die Grundidee der Erfindung besteht darin, eine Partikeltren- nung in einem fluidischen Mikrosystem durchzuführen, in dem die zu trennenden Partikel zunächst einzeln oder gruppenweise in mindestens einer Aufnahmestruktur an einer Vielzahl von Funktionselementen, die zum mindestens zeitweiligen Haltern der Partikel oder Partikelgruppen eingerichtet sind, insbe- sondere Funktionselementen auf der Basis von Feldkäfigen oder anderen geeigneten Feldbarrieren durch positive oder negative Dielektrophorese positioniert und an dieser Beobachtungsposi- tion (oder : in diesem Beobachtungsfeld) vermessen werden.

Beim Vermessen werden vorbestimmte Eigenschaften der zu tren- nenden Partikel und dementsprechend die Positionen der Parti- kel ermittelt, die aus dem Gemisch zu trennen sind oder die Positionen der Partikel, die zum Restgemisch gehören. Im Rah- men der vorliegenden Beschreibung werden die abzutrennenden Partikel auch Zielpartikel und die zum übrigen Gemisch gehö- renden Partikel Restpartikel genannt. Unter zeitweiligem Hal- tern wird hier eine Positionierung der Partikel an einem vor- bestimmten Ort im Mikrosystem für die Dauer der jeweiligen Messung oder Manipulation verstanden.

Um die Ziel-oder Restpartikel in eine benachbarte Kanal- struktur des Mikrosystems zu übertragen, werden die Ziel- oder Restpartikel nach der Vermessung sukzessiv oder gleich- zeitig einer Laserbestrahlung zur Bildung von optischen Käfi- gen unterzogen. Vorzugsweise werden die Ziel-oder Restparti- kel nach der Vermessung gleichzeitig einer Laserbestrahlung zur Bildung von optischen Käfigen unterzogen. Die Laserbe- strahlung kann hierbei z. B. innerhalb eines Feldkäfigs, an einer Feldbarriere oder in Fließrichtung unmittelbar hinter einem Feldkäfig oder einer Feldbarriere erfolgen. Dementspre- chend werden die Ziel-oder Restpartikel zusätzlich zu den elektrischen Feldkräften auch optischen Kräften ausgesetzt.

Je nach Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Übertragung der Ziel-oder Restpartikel durch Verschiebung der optischen Käfige in die benachbarte Kanalstruktur oder durch Offnen der elektrischen Feldkäfige hin zur benachbarten Kanalstruktur bei gleichzeitigem Festhalten der optischen Käfige. Diese Übertragung erfolgt vorzugsweise für mehrere Ziel-oder Rest- partikel gleichzeitig. Die Zielpartikel werden entsprechend in der benachbarten oder in der ursprünglichen Kanalstruktur des Mikrosystems gesammelt und weiter bearbeitet. Es können auch Gruppen von Partikeln aus den Beobachtungsfeldern über- tragen werden.

Gemäß einer Grundform der Erfindung erfolgt ein Verteilen der Ziel-und Restpartikel in zwei Gruppen. Die Ziel-und Restpar- tikel können eine oder mehrere Arten von Partikeln umfassen.

Durch stufenweises Wiederholen der Trennung jeweils unter Be- zug auf andere Partikeleigenschaften kann auch ein Sortieren in mehrere Ziel-und Restpartikelgruppen erfolgen. Die Ziel- oder Restpartikel 2,3 werden nach der Trennung vorzugsweise in verschiedene Auffangbehälter überführt.

Eine Vorrichtung zur Partikeltrennung in fluidischen Mikrosys- temen umfaßt insbesondere eine oder mehrere erste Aufnahme- struktur (en) mit Einrichtungen zum mindestens zeitweiligen Haltern der Partikel, insbesondere mit Elektrodeneinrichtungen zur Bildung einer Vielzahl von Funktionselementen (z. B. die- lektrische Feldkäfige), eine oder mehrere insbesondere benach- barte, zweite Aufnahmestruktur (en), die jeweils mit der ersten oder den ersten Aufnahmestruktur (en) über Öffnungen verbunden ist oder sind, vorzugsweise an den Positionen der Funktions- elemente, eine oder mehrere Lasereinrichtung (en), die zur Bil- dung eines oder mehrerer optischer Käfige an jedem Funktions- element, insbesondere in jedem dielektrischen Feldkäfig, aus- gebildet ist oder sind, und einen oder mehrere Lichtmodula- tor (en), mit dem oder denen in jeder vorgegebenen Position der einzelne oder mehrere optische Käfige ein-oder ausgeschaltet werden kann oder können. Vorzugsweise können die optischen Kä- fige einzeln ein-oder ausgeschaltet werden. Des weiteren ist es bevorzugt, jeweils einen optischen Käfig an jedem Funkti- onselement zu bilden. Vorzugsweise weist die Vorrichtung eine oder mehrere Ladeeinrichtung (ein) zum Positionieren von Parti- keln an den Funktionselementen auf.

Die Aufnahmestrukturen sind insbesondere Kanal-oder Kammer- strukturen des fluidischen Mikrosystems. Die Öffnungen zwi- schen den Aufnahmestrukturen können mit Klappen zeitweilig verschließbar ausgebildet sein.

Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Übertragung der Zielpartikel durch Einschalten der optischen Käfige in oder hinter den Feldkäfigen oder Feldbarrieren mit den Zielpartikeln, Einfangen der Zielpartikel in den optischen Käfigen und Verschieben der optischen Käfige in die zweite Ka- nalstruktur, während die Restpartikel in der ersten Kanal- struktur bleiben. Die zweite Kanalstruktur liegt dabei entwe- der in y-Richtung parallel seitlich zu der ersten (relativ zur Fließrichtung des Partikelstroms) versetzt. In diesem Fall ge- schieht das Verschieben der in den optischen Käfigen gehalte- nen Partikel durch Verschieben der Vorrichtung in xy-Richtung relativ zur optischen Achse des Laserstrahls. Oder die zweite Kanalstruktur liegt in z-Richtung entlang der optische Achse über der ersten Kanalstruktur. In diesem Fall geschieht das Verschieben der Partikel in die zweite Ebene durch Fokusver- stellung der optischen Käfige.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden die Zielpartikel ebenfalls in den jeweiligen dielektrischen Feld- käfigen in optischen Käfigen gehalten, während die Restparti- kel in den übrigen dielektrischen Feldkäfigen unbeleuchtet und somit frei von optischen Kräften bleiben. Zur Partikeltrennung werden sämtliche Feldkäfige derart verstimmt, daß dielektri- sche Abstoßungskräfte ausgebildet werden, die auf die Partikel in den Feldkäfigen hin zu der zweiten Kanalstruktur gerichtet sind. Darauf hin werden die Restpartikel in die zweite Kanal- struktur übertragen, während die Zielpartikel unter Wirkung der optischen Kräfte trotz der Feldkäfigverstimmung in der ersten Kanalstruktur verbleiben.

Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht in einer Kombi- nation von parallelisierten Haltekräften, insbesondere elekt- rischen Feldkräften, zur Positionskontrolle mit parallelisier- ten optischen Kräften zur Sortierung. Beliebige Positionen in der erfindungsgemäßen Vorrichtung können durch den speziellen optischen Aufbau mit der Laserbestrahlung gleichzeitig adres- siert werden, ohne die Vorrichtung zu bewegen. Die Kombination mit vervielfältigten Feldkäfigen sieht die gleichzeitige Beo- bachtung und Bewertung einer großen Anzahl von Partikeln vor, die z. B. durch dielektrische Kräfte an vorbestimmten Positio- nen gehalten werden. Anschließend wird der Sortiervorgang durch die parallelisierte und adressierbare Laserbestrahlung für diese große Anzahl an Partikeln vorzugsweise in einem Schritt, d. h. gleichzeitig, vorgenommen. So wird ein hoher Durchsatz beim Sortieren ermöglicht. Das Ausbilden optischer Käfige an den Beobachtungsfeldern erfolgt über eine paralleli- sierte Optik zur gleichzeitigen Adressierung aller gewünschten Beobachtungsfelder.

Die Erfindung besitzt die folgenden Vorteile. Mit dem erfin- dungsgemäßen Prinzip des gleichzeitigen oder sukzessiven Ver- messens einer Vielzahl von Partikeln mit einer anschließenden gleichzeitigen oder sukzessiven Übertragung der Zielpartikel wird der Durchsatz der Partikeltrennung im Vergleich zu den herkömmlichen Techniken erheblich erhöht. Vorzugsweise erfolgt die Übertragung der Zielpartikel gleichzeitig. Die Vermessung der Partikel z. B. in den dielektrischen Feldkäfigen kann schonend ohne nachteilige Auswirkungen auf die Partikel durch- geführt werden. Für die Vermessung steht genügend Zeit zur Verfügung, um die jeweils gesuchten Eigenschaften der Partikel zuverlässig zu ermitteln. Insbesondere das Aussortieren von selten vorkommenden Partikeln in einer großen Ausgangspopula- tion kann so mit hoher Zuverlässigkeit erfolgen, da alle Par- tikel einzeln adressierbar sind. Die dielektrischen Feldkäfige oder Feldbarrieren trennen die einzelnen Partikel oder Gruppen von Partikeln während der Prozedur räumlich voneinander. Die optischen Käfige ermöglichen ein Erfassen einzelner Partikel ohne Übersprechen auf andere Partikel. Damit wird die Trenn- schärfe der Partikeltrennung erheblich verbessert. Die Vermes- sung kann sich auf elektrische und/oder optische Eigenschaften der Partikel beziehen. Die Erfindung ist mit beliebigen Parti- keln natürlichen oder synthetischen Ursprungs implementierbar, die in fluidischen Mikrosystemen manipulierbar sind. Ein wei- terer Vorteil besteht in der Kompatibilität des Trennverfah- rens mit der verfügbaren Mikrosystemtechnik.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der beigefügten Zeichnungen ersicht- lich. Es zeigen : Fig. 1 eine schematische Draufsicht eines Mikrosystems mit einer erfindungsgemäßen Trennvorrichtung, Fig. 2 eine schematische Seitenansicht eines Mikrosystems gemäß Fig. 1, Fig. 3 eine schematische Draufsicht eines Mikrosystems mit einer weiteren erfindungsgemäßen Trennvorrich- tung, Fig. 4A eine schematische Seitenansicht auf ein Mikrosys- tem gemäß Fig. 3 mit übereinander gelagerten Kanä- len, Fig. 4B eine schematische Draufsicht eines Mikrosystems mit nebeneinander gelagerten Kanälen, Fig. 5 eine schematische Draufsicht eines Mikrosystems mit einer zweidimensionalen, flächigen Matrixan- ordnung von Feldkäfigen und einem für die erfin- dungsgemäße Ausführung typischen Strömungsprofil, Fig. 6 eine schematische Draufsicht eines Mikrosystems mit einer zweidimensionalen, flächigen Matrixan- ordnung von Feldbarrieren, und Fig. 7 eine schematische Draufsicht auf einen herkömmli- chen Einzelpartikelverteiler (Stand der Technik).

Eine erste Ausführungsform der Erfindung, die in den Figuren 1 und 2 illustriert ist, basiert auf der Kombination von die- lektrischen Feldkäfigen mit verstellbaren optischen Käfigen.

Eine erfindungsgemäße Trennvorrichtung 200, die in ein fluidi- sches Mikrosystem 100 integriert ist, umfaßt eine Vielzahl dielektrischer Feldkäfige 30, in denen mit der Lasereinrich- tung 40 und der Optik 42 jeweils ein optischer Käfig mit ver- stellbarem Fokus 41 gebildet ist. Das Bezugszeichen 43 weist auf einen Lichtmodulator, mit dem die optischen Käfige in den Feldkäfigen 30 selektiv ein-oder ausgeschaltet werden können.

Die Erzeugung optischer Käfige und deren Verwendung zur Mani- pulierung mikroskopisch kleiner Partikel ist an sich bekannt (s. z. B. A. Ashkin et al. in"Nature", Bd. 330,1987, S. 796 ff., und G. Weber et al. in"International Review of Cytolo- gy", Bd. 133,1992, S. 1 ff.). Einzelheiten des Laserbetriebs (z. B. Leistung, Wellenlänge etc.) und der Strahlfokussierung können bei der Realisierung des erfindungsgemäßen Systems auf der Grundlage der bekannten Techniken an die konkrete Trenn- aufgabe angepaßt werden.

Das Mikrosystem 100 umfaßt mindestens zwei Kanalstrukturen 10,20. Die Kanalstrukturen 10,20 umfassen jeweils Mikroka- näle oder Mikrokammern, z. B. offene Reservoire oder Vertie- fungen wie in Nano-oder Mikrotiterplatten, mit anwendungsab- hängig gewählter Gestalt. Es sind auch Kombinationen aus Mik- rokanälen und Mikrokammern in einem Mikrosystem möglich. Vor- zugsweise sind Mikrokanäle vorgesehen. Beim dargestellten Beispiel sind beispielsweise zwei in Betriebsfunktion über- einander angeordnete Anale vorgesehen. Sie können aber auch nebeneinander angeordnet sein (siehe Figur 4B). Die Kanäle sind unter anderem aus Kunststoff-, Glas oder Halbleitermate- rialien mit aus der Mikrosystemtechnik an sich bekannten Ver- fahren hergestellt und dazu ausgelegt, von Flüssigkeiten mit suspendierten Partikeln durchströmt zu werden. Vorzugsweise werden die in einer Flüssigkeit suspendierten Partikel mit einem Flüssigkeitstransportsystem durch das Mikrosystem be- fördert. Die Kanäle besitzen charakteristische Dimensionen, die in Abhängigkeit von der Anwendung so gewählt sind, daß ein unbehinderter Suspensionsdurchsatz möglich ist. Dient das Mikrosystem beispielsweise der Manipulierung biologischer Zellen (charakteristische Größe : 10 um), so besitzt jeder Ka- nal einen typischen Querschnitt, der größer als 10 um ist und beispielsweise bis zu 50 um beträgt. Zum Trennen syntheti- scher Partikel (beads), zum Beispiel bei Anwendungen in der kombinatorischen Chemie, können die Kanäle aber auch charak- teristische Querschnittsdimensionen im Bereich von 100 bis 200 um besitzen. Um eine optische Partikelvermessung in den Feldkäfigen zu gewährleisten, werden die Wände des Mikrosys- tems 100 entsprechend mindestens teilweise transparent ges- taltet.

In der ersten Kanalstruktur 10 des Mikrosystems 100 ist eine Vielzahl von Feldkäfigen 30 gebildet. Jeder Feldkäfig 30 um- faßt eine Gruppe von schematisch dargestellten Mikroelektroden 31, die an den Deck-und Bodenflächen der jeweiligen Kanal- struktur angebracht sind. Die Mikroelektroden 31 sind dazu ausgelegt, mit Hochfrequenzfeldern derart beaufschlagt zu wer- den, daß sich zwischen den Mikroelektroden 31 eine Feldvertei- lung ergibt, in der auf dielektrische Partikel Polarisations- kräfte erzeugt werden, die die Partikel im Inneren des Feldkä- figs halten. Einzelheiten des Aufbaus und der Ansteuerung von dielektrischen Feldkäfigen und Feldbarrieren sind an sich be- kannt (s. z. B. G. Fuhr et al. in"Electromanipulation of Cells", CRT Press Inc., 1996, S. 259 ff.).

Im Mikrosystem 100 ist ferner vorzugsweise eine Ladeeinrich- tung 50 vorgesehen, die zur Verteilung von Partikeln auf die Feldkäfige 30 der Trennvorrichtung 200 ausgelegt ist. Mit be- sonderem Vorteil wird eine Ladeeinrichtung 50 verwendet, deren Funktion im einzelnen unten erläutert wird. Diese Form der La- deeinrichtung stellt jedoch kein zwingendes Merkmal der Erfin- dung dar und kann alternativ auch durch andere Lade-oder Auf- reihglieder ersetzt werden. Es können auch mehrere Ladeein- richtungen vorgesehen sein.

Die Beladung der Beobachtungspositionen oder-felder kann beispielsweise auch passiv durch Transport der Partikelsus- pension über den laminaren Flüssigkeitsstrom vorgenommen wer- den. Das Strömungsprofil in den Mikrokanälen der Vorrichtung ist nicht parabolisch, sondern verläuft über den größten Teil des Kanals-mit Ausnahme der äußersten Randbereiche-gerad- linig (siehe Fig. 5), da der Kanal erheblich breiter ist, als hoch. So werden die Partikel über den größten Teil des Kanals gleichmäßig schnell transportiert und die Feldkäfige oder Feldbarrieren werden statistisch gleichmäßig beladen. Ablenk- elektroden 63 am Rand des Kanals dienen dazu, Partikel aus den strömungsberuhigten Randzonen des Kanals in Zonen mit gleichförmiger Strömung zu befördern. Die Ablenkelektroden können dabei auch Teil von Feldkäfig-oder Feldbarrieren- elektroden sein. Sollte eine Beobachtungsposition einmal un- besetzt bleiben, ist dies für das weitere Verfahren unerheb- lich.

Die Kanalstrukturen 10,20 sind, abgesehen von Öffnungen 11 im Bereich jedes Feldkäfigs 30, durch eine durchgehende Wandung voneinander getrennt. Die Aufgabe des Trennverfahrens besteht nun darin, ein in der ersten Kanalstruktur 10 entsprechend der Pfeilrichtung A eingeströmtes Partikelgemisch 1 in Zielparti- kel 2, die bei dieser Ausführungsform der Erfindung in die zweite Kanalstruktur 20 übertragen werden sollen, und Restpar- tikel 3 zu trennen, die in der ersten Kanalstruktur 10 verbleiben sollen. So werden zunächst die Partikel einzeln oder gruppenweise, z. B. unter Verwendung der Ladeeinrichtung 50, in die in einer Reihe (siehe Fig. 1) angeordneten Beobach- tungspositionen (Feldkäfige oder Feldbarrieren) 30 geladen.

Die Ladeeinrichtung 50 umfaßt beispielweise zwei gerade, an den oberen und unteren Kanalseiten angeordnete, streifenförmi- ge Mikroelektroden, die bei Beaufschlagung mit hochfrequenten elektrischen Feldern unter Wirkung negativer Dielektrophorese Abstoßungskräfte auf die anströmenden Teilchen ausüben und da- mit eine schräg zur Strömungsrichtung (Pfeil A) verlaufende Feldbarriere bilden. Hier werden beispielhaft einzelne Parti- kel betrachtet. Die Umsetzung der Erfindung mit Gruppen von Partikeln erfolgt analog. Der erste anströmende Partikel la läuft bei eingeschalteter Feldbarriere zunächst entlang der Pfeilrichtung B bis zum Ende der Ladeeinrichtung 50 und dann in den Feldkäfig 30a (siehe Fig. 2). In diesem Zustand ist der Feldkäfig 30a auf der stromaufwärts gelegenen Seite offen, so daß der Partikel frei bis zum Mittelpunkt 31a des Feldkäfigs 30a gelangt. Sobald das Eintreffen des Partikels zum Beispiel mit optischen oder elektrischen Mitteln erfaßt ist, wird der Feldkäfig 30a auch auf der stromaufwärts gelegenen Seite ge- schlossen. Die übrigen Feldkäfige 30b, 30c,... werden analog durch Einströmen von Partikeln beladen. Die Ladeeinrichtung 50 wird synchron zum Beladungszustand der Feldkäfige betätigt. An der Ladeeinrichtung 50 sind ggf. weitere Aufreihglieder, Feld- käfige oder Barrieren zur Anordnung der anströmenden Partikel vorgesehen.

Wenn alle Feldkäfige beispielsweise mit einzelnen Partikeln beladen sind, erfolgt die Vermessung zur Bestimmung physikali- scher und/oder biologisch-chemischer Parameter der Partikel.

Diese Vermessung erfolgt beispielsweise auf optischem Wege (zum Beispiel Fluoreszenz-oder Streulichtmessung) und/oder auf elektrischem Wege (zum Beispiel Elektrorotationsmessung in den Feldkäfigen). Vorzugsweise wird zu den optischen Messungen eine Lasereinrichtung verwendet, die auch zur Bildung der op- tischen Käfige ausgelegt ist. Es kann auch vorgesehen sein, mit der Suspensionsflüssigkeit im Mikrosystem Zusatzstoffe zu den Feldkäfigen zu spülen, deren Wechselwirkung mit den gehal- terten Partikeln optisch und/oder elektrisch erfaßt wird. Die Feldkäfige, in denen sich die Zielpartikel mit vorbestimmten Parametern befinden, werden zur Vorbereitung des folgenden Trennschrittes erfaßt.

Zur gleichzeitigen Übertragung der Zielpartikel in die zweite Kanalstruktur 20 wird der Lichtmodulator 43 derart betätigt, daß eine Laserbestrahlung in die erfaßten Feldkäfige mit den Zielpartikeln freigegeben wird. Durch diese Bestrahlung wird jeweils ein optischer Käfig gebildet, dessen Fokus 41 mit dem Zentrum (z. B. 31a) des dielektrischen Feldkäfigs 30 überein- stimmt. Die Zielpartikel werden in den optischen Käfigen wie mit einer Laserpinzette gefangen. Anschließend wird gleichzei- tig für alle optischen Käfige der Fokus 41 durch die Öffnung 11 zwischen den Kanalstrukturen (Pfeil C) verschoben. Diese Verschiebung erfolgt beispielsweise durch Verstellung der Op- tik 42. Sobald die Zielpartikel mit dem verschobenen Fokus in die zweite Kanalstruktur 20 übertragen worden sind, wird mit dem Lichtmodulator 43 die Laserstrahlung abgeschaltet. Dadurch werden die Zielpartikel freigegeben, um einer weiteren Bewe- gung und/oder Bearbeitung in der zweiten Kanalstruktur 20 un- terzogen zu werden. Simultan werden die Feldkäfige 30 in der ersten Kanalstruktur 10 auf der stromabwärts gelegenen Seite geöffnet, so daß die Restpartikel 3 ebenfalls freigegeben wer- den. Die Ziel-oder Restpartikel 2,3 können jeweils einer oder mehreren weiteren Trennungen nach dem erläuterten Prinzip unterzogen werden, um eine Sortierung in eine Vielzahl von Partikelgruppen vorzunehmen.

Die Trennvorrichtung 200 umfaßt insbesondere die Lasereinrich- tung 40, deren Licht mit der Optik 42 zur Bildung des Fokus 41 gebündelt wird, und den Lichtmodulator 43. Die Lasereinrich- tung 40 umfaßt eine Laserdiodenanordnung oder einen einzelnen Laser mit einer Strahlaufweitungsoptik. Es können auch mehrere Laserstrahlen zur Bildung jeweils eines optischen Käfigs vor- gesehen sein. Bei der Laserdiodenanordnung sind eine Vielzahl von Laserdioden entsprechend der Position der Feldkäfige oder Feldbarrieren im Mikrosystem ausgerichtet. Beim Einsatz eines einzelnen Lasers hingegen wird die gesamte Anordnung der Feld- käfige mit dem einzelnen aufgeweiteten Strahl beleuchtet. Die Lasereinrichtung 40 wird vorzugsweise bei einer Wellenlänge betrieben, die sich zur Ausbildung effektiver optischer Käfige bei möglichst geringer Lichtleistung besonders gut eignet. Bei den meisten Anwendungen wird die Wellenlänge im infraroten oder roten Spektralbereich gewählt.

Der Lichtmodulator 43 ist ein Transmissions-oder Reflektions- Modulator. Als Transmissions-Modulator sind an sich bekannte Mikroshutteranordnungen verwendbar, bei denen eine Vielzahl von Mikroshuttern entsprechend der Position der Feldkäfige ausgerichtet ist. Es werden mechanische Mikroshutter oder schaltbare Flüssigkristall-Anordnungen verwendet. Als Reflek- tions-Modulator kann eine schaltbare Matrix von Spiegelelemen- ten (sog. Digital Mirror Array) verwendet werden. Alternativ ist es bei Ausbildung der Lasereinrichtung 40 mit einer Laser- diodenanordnung auch möglich, den Lichtmodulator in die Laser- einrichtung 40 zu integrieren. In diesem Fall ist der Lichtmo- dulator eine Steuerschaltung, mit der die einzelnen Laserdio- den individuell ein-oder ausgeschaltet werden können.

Die Optik 42 umfaßt eine Mikrolinsen-Anordnung aus einer Viel- zahl von Mikrolinsen, die vorzugsweise entsprechend den Posi- tionen der Feldkäfige ausgerichtet sind. Es ist mit der erfin- dungsgemäßen Optik ferner möglich, mehrere Teilbereiche eines Feldkäfigs parallel zu erfassen und Laserpinzetten auf diese Bereiche zu richten. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn Gruppen von Partikeln in den Feldkäfigen enthalten sind und einzelne Partikel oder Untergruppen aus den Gruppen von Ziel- oder Restpartikeln 2,3 den Beobachtungsfeldern übernommen werden sollen. An dieser Ausführungsform besteht insbesondere für Anwendungen zur Anreicherung von Partikelarten Interesse.

Die Mikrolinsenanordnung ist zur Verstellung des Fokus 41 ver- tikal beweglich angebracht, wie es an sich von Laserpinzetten bekannt ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Vermessung der Partikel in den Feldkäfigen unter Verwendung einer opti- schen Detektoreinrichtung, die beispielsweise durch einen Ar- ray-Detektor auf der Basis von CCD-, CID- (Charge Injection Device), CMOS-, APD- (Avalanche Photodiode) oder PD- (Photo- diode) Anordnungen gebildet ist. Die Detektoreinrichtung wird vorzugsweise auf der relativ zur Lasereinrichtung 40 gegenü- berliegenden Seite des Mikrosystems 100 angebracht. Die Detek- torelemente der Detektoreinrichtung sind vorzugsweise für eine wellenlängenselektive Lichterfassung ausgelegt. Hierzu sind Filtereinrichtungen, die ggf. in die Detektoreinrichtung in- tegriert sind, vorgesehen. Die wellenlängenselektive Messung dient insbesondere der Fluoreszenzmessung an den Partikeln.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung, die ebenfalls mit der in den Figuren 1 und 2 illustrierten Anordnung implemen- tiert werden kann, basiert auf der Kombination optischer Käfi- ge mit verstellbaren dielektrischen Feldkäfigen. Bei dieser Gestaltung werden zunächst, wie oben beschrieben wurde, die Partikel des Ausgangsgemisches 1 in den Feldkäfigen 30 positi- oniert und vermessen. Um nun die Ziel-und Restpartikel von- einander zu trennen, wird in Abhängigkeit vom Meßergebnis für eine Gruppe von Feldkäfigen 30, die beispielsweise die Ziel- partikel enthält, mit dem Lichtmodulator 43 die Laserbestrah- lung freigegeben. Dadurch wird jeder Zielpartikel in einem op- tischen Käfig gefangen. Zur Trennung der Partikel werden nun sämtliche Feldkäfige 30 derart verstimmt, daß eine resultie- rende dielektrische Kraft auf die Partikel durch die Öffnung 11 hin in die zweite Kanalstruktur 20 ausgeübt wird. Dieser Kraftwirkung folgen alle Partikel, die nicht zusätzlich durch den optischen Käfig gehaltert werden, so daß sich eine ent- sprechende Sammlung in der zweiten Kanalstruktur 20 ergibt.

Die beleuchteten Partikel (z. B. Zielpartikel) bleiben in die- sem Fall in der ersten Kanalstruktur 10. Nach Freigabe der op- tischen und dielektrischen Kräfte werden die Ziel-und Rest- partikel in der ersten oder zweiten Kanalstruktur 10,20 wei- ter transportiert.

Eine weitere abgewandelte Ausführungsform der Erfindung, die entsprechend einem der beiden oben genannten Kombinationsprin- zipien betrieben werden kann, ist in den Figuren 3,4A und 4B illustriert. Das Mikrosystem 100 enthält wiederum zwei über- einander oder nebeneinander angeordnete Kanalstrukturen 10,20 mit zumindest teilweise transparenten Kanalwänden. Auf den in- neren Deck-und Bodenflachen der Kanalstrukturen sind anwen- dungsabhängig gestaltete Mikroelektroden zur Erzeugung von Feldkäfigen und/oder Barrieren ausgebildet. Im Unterschied zu der in Fig. 1 gezeigten Feldkäfigreihe umfaßt die Trennvor- richtung 200 bei dieser Ausführungsform eine flächige Matrix- anordnung von Feldkäfigen 30 in geraden Reihen und Spalten. So sind mehrere Reihen von Beobachtungspositionen in Strömungs- richtung hintereinander angeordnet. Dies hat einerseits den Vorteil, daß individuelle Partikel mehrmals hintereinander be- wertet werden können, was die Zuverlässigkeit der Analyse und damit auch der Trennung beträchtlich verbessert. Auf der ande- ren Seite erhöht ein solches zweidimensionales Array an Beobachtungsfeldern erheblich den Durchsatz an Partikeln, die gleichzeitig bewertet werden. Die Kanäle können übereinander oder nebeneinander angeordnet sein, wie dies in den Figuren 4A und 4B illustriert ist.

Eine weitere abgewandelte Ausführungsform der Erfindung hin- sichtlich der Form der Elektroden zur Ausbildung von Feldkä- figen 60 zeigt die Figur 5. Hier werden die einzelnen Feldkä- fige durch Zinken-oder Kamm-artige Elektroden (61a, 61b, 61c...) gebildet. Die Partikel 62a, 62b, 62c... ordnen sich in einer solchen Anordnung in den Zwischenräumen der Zinken an. Diese Elektrodenform hat vor allem Vorteile hinsichtlich einer einfachen Elektrodenprozessierung mit verbundenen Zu- leitungen.

Eine weitere Abwandlung der Erfindung ist in Figur 6 demonst- riert. Hier werden keine vollständigen Feldkäfige geformt, sondern Feldbarrieren 70 mithilfe von Elektroden, wie bei 70a, 70b, 70c... gezeigt. Die Partikel 71a, 71b, 71c... wer- den durch einen stetigen Flüssigkeitsstrom 72 gegen die die- lektrischen Feldbarrieren gedrückt und so an den jeweiligen Beobachtungspositionen gehalten.

Erfindungsgemäß können verschiedene Richtungen der Bestrahlung durch die Lasereinrichtung 40 vorgesehen sein. Gemäß Fig. 4A erfolgt die Bestrahlung von der Unterseite des Mikrosystems, d. h. von der Seite der ersten Kanalstruktur 10 her. Dement- sprechend besteht mindestens der Kanalboden 12 aus einem transparenten Material. Eine optische Vermessung der in den Feldkäfigen 30 gefangenen Partikel kann ebenfalls von der Un- terseite des Mikrosystems 100 her oder auch von der entgegen- gesetzten Seite her erfolgen. Das Licht von der Lasereinrich- tung 40 wird wiederum uber einen Lichtmodulator 43 und über eine Optik 42 in die Feldkäfige 30 fokussiert.

Bei der in den Figuren 3 und 4A, B gezeigten Ausführungsformen ist als Ladeeinrichtung 50 eine Aufreihung von Feldkäfigen vorgesehen. Die in der ersten Kanalstruktur 10 anströmenden Partikel 1 (zu trennendes Gemisch) werden zunächst in der La- deeinrichtung 50 positioniert. Sobald jeder Feldkäfig 51 der Ladeeinrichtung 50 einen Partikel enthält, wird die gesamte Reihe der Feldkäfige 51 und die benachbarte Reihe der Feldkä- fige 30a so angesteuert, daß die Partikel in die Feldkäfige 30a übernommen werden. Anschließend werden die Feldkäfige 51 der Ladeeinrichtung 50 erneut beschickt. Wiederum werden die Partikel an die Feldkäfige 30a und von dieser zur Reihe der Feldkäfige 30b weitergegeben, bis schrittweise alle Reihen der Feldkäfige 30 gefüllt sind. Anschließend erfolgt die Vermes- sung und die Trennung der Partikel nach den oben erläuterten Prinzipien.

Ein wichtiger Vorteil der in den Figuren 1 bis 6 gezeigten Ausführungsformen der Erfindung besteht darin, daß sämtliche dielektrischen Feldkäfige gleichzeitig angesteuert werden. Da- durch werden Störfelder oder ein Übersprechen zwischen den Feldkäfigen vermieden, wodurch die Genauigkeit der erfindungs- gemäßen Trennung insbesondere im Vergleich zu der unter Bezug auf Fig. 7 erläuterten herkömmlichen Technik erheblich verbes- sert wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Partikeltrennung ausschließlich unter der Wirkung optischer Kräfte. Bei dieser (nicht dargestellten) Ausführungsform wer- den die zu trennenden Partikel nicht in dielektrischen Feldkä- figen, sondern an mechanisch ausgebildeten Halterungen im Mik- rosystem positioniert. Derartige Halterungen werden beispiels- weise durch Löcher in der Kanalwandung gebildet. Nach der Par- tikelvermessung wird die Gruppe der Zielpartikel in entspre- chende optische Käfige aufgenommen und mit diesen von den Hal- terungen weg in die benachbarte Kanalstruktur gehoben.

Bei einer weiteren Abwandlung des oben erläuterten Trennprin- zips ist vorgesehen, daß drei Kanalstrukturen zueinander be- nachbart angeordnet sind, wobei das Positionieren und Vermes- sen der Partikel in der mittleren Kanalstruktur und das Über- tragen von Zielpartikeln in die benachbarten Kanalstrukturen erfolgt, indem zunächst eine erste Gruppe von Zielpartikeln z. B. in die obere Kanalstruktur und anschließend eine weitere Gruppe von Zielpartikeln in die untere Kanalstruktur übertra- gen wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Partikel durch mechanische oder akustische Kräfte gehalten oder positioniert. Derartige Halterungen können z. B. mit Mik- romanipulatoren oder Ultraschalleinrichtungen gebildet werden.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirkli- chung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.