Bei vielen biotechnologischen, medizinischen oder genetischen Aufgaben ist die kurzzeitige und reversible Erhöhung der Durchlässigkeit der Umhüllung lebender, in einer Flüssigkeit suspendierter Zellen von Interesse (Übersicht in"Electromani- pulation of Cells", U. Zimmermann, G. A. Neil, CRC, 1996). Ne- ben chemischen und virusbasierten Methoden hat sich wegen der Einfachheit und Definiertheit der Applikation die Permeabili- sierung mittels kurzer elektrischer Pulse durchgesetzt. Das Verfahren wird als Elektroporation, Elektropermeation oder auch Elektropermeabilisierung bezeichnet und mit kommerziellen Geräten von einer Vielzahl von Herstellern implementiert.

In herkömmlichen Elektroporationsgeräten befinden sich die zu manipulierenden Zellen in einer Lösung suspendiert in einer Küvette zwischen Elektroden zur Applikation der elektrischen Pulse. Allen Geräten gemeinsam ist der Einsatz eines oder meh- rerer elektrischer Pulse einer Amplitude zwischen einigen 10 V bis zu einigen 1000 V. Die Pulsform ist geräteabhängig. Die Pulsdauer wird objektabhängig (vor allem größenabhängig) ge- wählt und liegt im Bereich von wenigen us bis zu einigen 100 ms. Die Elektroden (zumeist zwei) werden jeweils paarig als Kathode bzw. Anode fest verschaltet.

Ein gravierendes, bisher ungelöstes Problem der Elektropermea- bilisierung besteht darin, daß sich der pH-Wert in der Nähe der Elektroden durch zeitlich nicht stationäre Elektrolyseer- scheinungen lokal ändert, so daß es zu nachhaltigen Störungen der Porationsbedingungen kommt. Je nach Lösungszusammensetzung führt die Beaufschlagung der Elektroden mit elektrischen Pul- sen zur Erzeugung von H+- (Protonen-) bzw.

OH- (Hydroxylionen-) Anreicherungen ("Wolken") und somit zu einem lokal sauren oder basischen Bereich. Mit zunehmender Pulsdauer wandert von beiden Elektroden jeweils eine Front niedrigen bzw. hohen pH-Wertes aufeinander zu. Auch wenn die pH-Anderungen an beiden Elektrodenbereichen sich über die ge- samte Flussigkeitsfüllung der Küvette nahezu neutralisieren, sind die Zellen der jeweiligen räumlichen Bereiche einem pH- Gradienten bzw.-wechsel von bis zu 5 pH-Einheiten ausgesetzt, was zu einer erheblichen Beeinflussung der Lebensprozesse, bis zur Devitalisierung und Einleitung der Apopthose führen kann.

Außerdem werden durch die lokalen pH-Anderungen ggf. uner- wünschte Elektrodenreaktionen ausgelöst. Wird beispielsweise Aluminium als Elektrodenmaterial verwendet, so kann beim Pul- sen Aluminium gelöst werden und die Zellsuspension vergiften.

Diesem Problem kann zwar durch den Einsatz edler Metalle als Elektrodenmaterialien begegnet werden, wodurch aber ein Elek- troporationsgerät teuer wird.

Mit den bekannten Pulstechniken (Kondensatorentladung, Recht- eckpuls, Dreieckpuls etc.) ist es nicht möglich, die pH- Belastung der Zellen zu verhindern, da es sich hierbei um grundlegende Erscheinungen an der Anode bzw. Kathode handelt.

Es wird zwar bisher versucht, den Elektrolyseeffekt über die Applikation sehr kurzer Pulse zu minimieren. Dadurch wird je- doch die Einsetzbarkeit der Elektroporation eingeschränkt.

Gerade bei Objekten mit weiteren aufgelagerten Schichten, wie Bakterien, sind langer Pulszeiten jedoch wirksamer, so daß die pH-Änderungen besonders negativ zum Tragen kommen und ein Bedarf an alternativen Techniken ohne Verlust der Vorteile der elektrischen Feldapplikation besteht.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein gegenüber herkömmlichen Permeabilisierungssystemen verbessertes Verfahren auf der Ba- sis der elektrischen Pulstechnik anzugeben, das sich insbeson- dere durch eine verminderte oder nahezu kompensierte pH- Anderungs-Belastung der Zellen und eine Unterdrückung von Elektrodenreaktionen auszeichnet, und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens bereitzustellen, mit der die Ein- satzmöglichkeiten der genannten Elektropermeationstechniken erweitert und die Effizienz der Permeation bzw. Zellfusion er- höht wird.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren und Vorrichtungen mit den Merkmalen gemäß Patentanspruch 1,8 bzw. 13 gelöst. Vor- teilhafte Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Der Erfindung liegt die Idee zugrunde, von der vorher festge- legten Beschaltung von Elektroden als Anode bzw. Kathode abzu- gehen und statt dessen die Polarität der Elektroden bzw. die Feldrichtung während der Pulszeit jeder Behandlung oder Pora- tion mindestens einmal zu ändern. Dadurch werden an jeder Elektrode aufeinanderfolgend abwechselnd einander kompensie- rende elektrolytische Erhöhungen und Absenkungen des pH-Wertes erzielt. Beim Einsatz von z. B. zwei Elektroden wird jede Elektrode wahrend der eingestellten Pulszeit (die in der Regel im us-bis ms-Bereich liegt) mindestens einmal als Kathode und einmal als Anode betrieben. Um dies zu erreichen, wird der Puls in sehr rasch aufeinander folgende Einzel-oder Teilpulse entgegengesetzter Polarität zerlegt oder eine elektronische Torschaltung eingeführt, die es gestattet, ein elektrisches Wechselsignal als Pulspaket einzukoppeln oder die Verschaltung der Pulselektroden im us-Bereich zu wechseln.

Der Begriff Kathode bzw. Anode bezeichnet hier jeweils die Elektrode mit dem positiveren bzw. negativeren Potential. Die Erfindung ist mit Potentialdifferenz-Pulsen unabhängig von de- ren absoluter Potentiallage realisierbar.

Die erfindungsgemäße Wechselpulstechnik basiert insbesondere auf den folgenden Überlegungen. Bei Applikation eines elektri- schen Feld-oder Porationspulses einer vorbestimmten Pulszeit (z. B. 50 us) für die Zellpermeation zwischen zwei Elektroden ist bei einer Zerlegung des Porationspulses in zwei Teilpulse unterschiedlicher Polarität (jeweils mit der halben Pulsdauer (z. B. 25 us) oder mit einem anderen Teilerverhältnis), die im wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgen, jede der Elektro- den einmal als Anode und Kathode wirksam. Dadurch werden Pro- tonen-und Hydroxylionenwolken schneller aufeinanderfolgend erzeugt, als sie sich von den Elektroden entfernen können, so daß sie sich bereits innerhalb eines Bereiches der ersten Mi- krometer um die Elektroden neutralisieren und dämpfen. Damit können die erzeugten pH-Anderungen für eine Zellbeeinflussung oder-schadigung nicht mehr oder nicht mehr in vollem Umfang wirksam werden.

Die Pulszerlegung (Teilerverhältnis, Amplitudenverhältnis, Formverhältnis) wird anwendungsabhängig unter Berücksichtigung der Diffusionszeiten und-längen der Protonen-und Hydroxylionen ausgewahlt. Da die Diffusionszeiten und-längen in wäßrigen Lösungen abgeschätzt werden können, kann auch die Dauer der zerlegten Pulse über die bekannten Diffusionsglei- chungen ermittelt werden. Hierfür ist der folgende Ansatz zu nutzen.

Ji =-D [dci/dx + ( (ziFci)/RT) d'I'/dx] wobei Ji der Flux des Ions i, D der Diffusionskoeffizient, c die Konzentration, x der Weg, z die Ladungszahl des Ions, T das Potential, T die Temperatur und F, R die Faraday-bzw.

Gas-Konstanten sind. Fur medizinisch und biologisch interes- sierende Flüssigkeiten ergeben sich bei Wegen kleiner 1 um Zeiten im Bereich von einigen us bis zu maximal 1 ms.

Die Dauer eines Teilpulses (Teilpulsdauer) wird so gewählt, daß sie kurzer oder vergleichbar mit der Diffusionszeit der beim jeweils vorhergehenden Teilpuls erzeugten H+-oder OH-- Ionenwolken ist. Damit wird eine räumlichen Trennung der Reak- tionsprodukte (H+-und OH--Ionenwolken) unterbunden. Da die Konzentration der H+-oder OH--Ionenwolken lösungsabhängig un- symmetrisch sein kann, wird ggf. ein unsymmetrisches Teiler- verhältnis der Teilpulsdauern realisiert. Die Schaltzeit zwi- schen den Teilpulsen ist vorzugsweise wesentlich kürzer als die Teilpulsdauern und beträgt rund 1 us.

Eine Zerlegung der gewünschten Pulsdauer in mehr als zwei Ein- zel-oder Teilpulse ist insbesondere bei längeren oder mehre- ren Porationspulsen (ms-Bereich) sinnvoll und führt erfin- dungsgemäß zur Applikation einer Wechselspannung über ein elektronische Torschaltung. Entsprechend der oben erläuterten Diffusionslängen sind Frequenzen zwischen 1 kHz und 1 MHz, insbesondere 10 kHz bis 800 kHz, bevorzugt. Höhere Frequenzen erfordern eine deutliche Steigerung der Amplitude, um die Bre- akdownspannung der Zellmembranen zu übersteigen. Niedrigere Frequenzen sind in der Kürze der Pulsdauer nicht unterzubrin- gen.

Die Erfindung bietet die folgenden Vorteile. Erfindungsgemäße Verfahren und Vorrichtungen können effektiv für die pH- neutrale oder pH-kompensierte Permeabilisierung und Ein-bzw.

Ausschleusung von Molekülen, Flüssigkeiten, Organellen und Mi- kroteilchen für biotechnologische, gentechnische und medizini- sche Anwendungen benutzt werden. Sie können gleichermaßen für Zellgruppen, die Zell-Zell-Fusion oder Aggregation von Zellen und Mikropartikeln oder Mikroorganismen verwendet werden. Das Verfahren macht es insbesondere möglich, Mikroelektroden und kleinste Räume (einige 10 bis 100 um), wie sie in halbleiter- technologisch hergestellten Mikrosystemen erzeugt werden kön- nen, zu nutzen. Obwohl die zu behandelnden Objekte während je- des Pulses zeitlich wechselnden Feldrichtungen ausgesetzt wer- den, sind zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse wie bei der herkommlichen Elektroporation erzielbar. Es werden Lö- sungsvergiftungen durch gelöstes Elektrodenmaterial vermieden.

Damit lassen sich Porationsgefäße (insbesondere Küvetten) auch mit unedlen Elektrodenmetallen verwenden.

Bevorzugte Anwendungen der Erfindung sind die Bereitstellung pH-neutraler oder pH-kompensierter Elektroporationsgeräte und der Aufbau von Mikrosystemen für die Behandlung oder Manipu- lierung biologischer Zellen zwischen Mikroelektroden. Ein Mi- krosystem hat charakteristische Dimensionen der Elektroden im Bereich von 100 um oder geringer und charakteristische Dimen- sionen der Elektrodenabstände im Bereich von einigen (z. B. 2 bis 5) Zelldurchmessern.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden im fol- genden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen erläutert.

Es zeigen : Fig. lA, lB eine Darstellung der erfindungsgemäßen Zerlegung eines Exponential-Porationspulses in Teilpulse, Fig. 2A, 2B eine Darstellung der erfindungsgemäßen Zerlegung eines Rechteck-Porationspulses in Teilpulse, Fig. 3 eine Darstellung der erfindungsgemäßen Zerlegung eines Rechteck-Porationspulses in Teilpulse verschie- dener Amplituden Fig. 4 eine Darstellung der erfindungsgemäßen Zerlegung eines Rechteck-Porationspulses in eine Vielzahl von Teilpulsen, Fig. 5 eine Darstellung der Applikation einer Wechselspan- nung für die Dauer eines Porationspulses, Fig. 6 ein Blockschaltbild einer Steuerschaltung einer er- findungsgemäßen Porationsvorrichtung, und Fig. 7 ein Blockschaltbild einer Steuerschaltung mit einer Torschaltung zur Applikation von Pulsen oder Wech- selspannungen.

Die folgende Erläuterung bezieht sich auf die erfindungsgemäße Pulszerlegung, die bei Einführung entsprechender Maßnahmen bei herkömmlichen Elektroporationsgeräten implementiert werden kann. Auf bekannte Einzelheiten von Elektroporationsgeräten wie insbesondere die Elektrodenanordnung, den Küvettenaufbau u. dgl. wird daher hier nicht gesondert eingegangen.

Fig. 1A zeigt den Spannungsverlauf einer zeitlich beschnitte- nen Kondensatorentladung, die bisher als Porationspuls an ei- nem Elektrodenpaar appliziert wurde (Stand der Technik). Die Eingangsamplitude Ul fällt entsprechend einer Exponen- tialfunktion ab. Bei einer Pulszeit von tl, die in der Regel 10 us bis zu einigen 100 ms beträgt, wird der Porationspuls abgeschaltet. Fur die Dauer des Pulses erfolgen an der jewei- ligen Anode und Kathode eine Ansäuerung bzw. Alkalisierung.

Fig. 1B zeigt den erfindungsgemäß zerlegten Puls als zeitli- chen Spannungsverlauf zwischen zwei Elektroden beispielhaft mit zwei Teilpulsen unterschiedlicher Polarität. Die Kondensa- torentladung fällt von der Eingangsamplitude U1 für die Teil- pulsdauer tll (hier tll = 0.5 tl) des ersten Teilpulses ent- sprechend einer Exponentialfunktion ab. Bei der Pulszeit tll, die in der Regel einige us bis maximal 1 ms beträgt, wird der Teilpuls umgeschaltet. Für die restliche Zeit tl2 (hier tll = tl2) wird die restliche Kondensatorentladung bis zur Endampli- tude U2 mit umgekehrter Polaritat an die Elektroden geschal- tet. Abweichend vom hier angegebenen Teilerverhältnis tll = tl2 können andere Verhältnisse der Teilpuls-dauern realisiert werden.

Es ist ersichtlich, daß bei den angegebenen Amplituden und Zeiten der Absolutwert der Flächen unter den beiden Pulsen der Flache des Pulses in Fig. 1A vollständig entspricht. Durch die Verringerung der Amplitude bis zum Polarisationswechsel ent- steht eine geringfugige Asymmetrie, die zu einer Rest-pH- Anderung fuhrt. Dies kann durch eine Anderung des Teilerver- hältnisses kompensiert oder, falls bei bestimmten Ionenzusam- mensetzungen der Medien auf der anodischen und kathodischen Seite nicht in gleicher Menge angesäuert bzw. alkalisiert wird, gezielt dazu genutzt werden, diese Differenzen auszu- gleichen.

Die genannte Asymmetrie bei der Verwendung von Entladevorgän- gen zur Pulserzeugung (asymmetrische Pulsformen) kann auch durch den Einsatz von Rechteckpulsen verhindert werden. Dies ist in den Figr.. 2A und 2B illustriert. Fig. 2A zeigt den unzerlegten (herkömmlichen) Porationspuls. Erfindungsgemäß wird während des Pulsverlaufs die Polaritat umgeschaltet (Fign. 2B) so daß sich zwei Teilpulse ergeben. Nunmehr ist die umgesetzte Leistung an jeder Elektrode exakt gleich. In ent- sprechender Weise sind auch anders realisierte Pulsformen zer- legbar.

Die Zerlegung eines Porationspulses in Teilpulse unterschied- licher Amplituden ist in Fig. 3 illustriert. Demnach ist z. B. die Amplitude des ersten Teilpulses geringer als die Amplitude des zweiten Teilpulses. Dies wird insbesondere bei an den Elektroden unsymmetrisch ablaufenden Elektrolyseprozessen be- vorzugt, so beispielsweise in Chlorid-haltigen Suspensionslö- sungen, bei denen Chlor gasförmig lokal an einer Elektrode aus der Lösung entweichen kann. Die Amplitudenaufteilung erfolgt derart, daß die geringere H+-bzw. OH--Bildung (pro Zeit) je- weils durch eine höhere Amplitude kompensiert und die Gesamt- leistung des beabsichtigten Porationspulses beibehalten wird.

Entsprechend kann zusätzlich die Teilpulsdauer variiert wer- den.

Fig. 4 zeigt die Zerlegung eines Porationspulses in mehr als zwei Teilpulse. Zur nahezu vollstandigen Kompensation der pH- Effekte wird eine geradzahlige Zerlegung bevorzugt. Bei sehr vielen Zerlegungspulsen kann jedoch auch eine ungeradzahlige Aufteilung erfolgen, falls die Restdifferenz entsprechend klein bleibt bzw. die Medien eine Asymmetrie der Pulse erfor- dern.

Anstelle einer Pulsumschaltung an den Elektroden ist ersatz- weise auch die Applikation einer Wechselspannung möglich. Fig.

5 zeigt die Applikation einer Vielzahl von Pulsen in Form ei- ner Wechselspannung über ein für die gewunschte Dauer der Po- ration (entsprechend der Pulsdauer beim herkömmlichen Verfah- ren) freigegebenes elektronisches Tor.

Ein Blockschaltbild einer elektronischen Schaltung, mit der die Pulszerlegung erfolgen kann, ist in Fig. 6 gezeigt. Das Bezugszeichen 61 steht für einen Pulsgenerator, der in her- kömmlicher Weise die Einzelpulse erzeugt, hier jedoch jeweils mit der kürzeren Teilpulsdauer, die sich aus der Zerlegung der anwendungsabhängig gewünschten Pulszeit in 2,4,6 oder mehr Teilpulse ergibt. Der Pulsgenerator 61 ist einerseits über ei- nen ersten Endverstärker 63a mit den Elektroden 64 und ande- rerseits tuber ein Verzögerungsglied 62 und einen zweiten End- verstarker 63b mit den Elektroden 64 verbunden. Der zweite Endverstarker 63b ist ein Umkehrverstärker. Jeder Puls gelangt somit zuerst direkt an den Endverstarker 63a und an die Elek- troden 64, und dann mit einer Zeitverzögerung über den Endver- stärker 63a polaritätsumgekehrt an die Elektroden 64. Die Zeitverzögerung ist im wesentlichen gleich der Pulsbreite ge- wählt.

Die Endverstärker und das Verzögerungsglied erlauben eine Ein- stellung der jeweiligen Verstärkungsfaktoren (Amplitudenasym- metrie der Pulse) bzw. der Zeitverzögerung (Asymmetrie des Teilerverhältnisses der Pulse). Zusätzlich kann eine Pulsform- schaltung vorgesehen sein.

Soll eine Kondensatorentladung nachgeformt werden, ist der Pulsgenerator 61 entsprechend auszubilden. Eine von einer Vielzahl bekannter Verfahren ist die Digitalisierung des Pul- ses. Auf diese Weise kann eine Asymmetrie der Pulse zwischen dem Zweig 61-> 63a und 61-> 62-> 63b erzeugt und damit jede beliebige Pulsform nachvollzogen werden.

Im Falle der Benutzung von sehr eng benachbarten Elektroden (z. B. in Mikrosystemen) sind Pulshöhen von maximal 100 V er- forderlich, um eine Permeation von Zellen oder deren Fusion herbeizuführen. Dafür eignen sich eine Vielzahl von Schal- tungsvarianten der Tri-State-Technik und Gegentaktstufen der Elektronik.

Fig. 7 zeigt ein Blockschaltbild zur Applikation der disku- tierten Pulse oder Wechselspannungen über ein Tor. Das Bezugs- zeichen 71 bezeichnet einen Puls-oder Wechselspannungsgenera- tor, dessen Signal über eine Torschaltung 72 für die Zeit der gewunschten Applikation an den Endverstarker 73 gelangt und von dort an den Elektroden 74 zur Permeation oder Fusion der Zellen zur Verfügung steht.

Bei Anordnungen mit mehreren Elektrodenpaaren wird die erfin- dungsgemäße Pulszerlegung für jedes Elektrodenpaar durchge- führt. Die Schaltungen gemäß den Figuren 6 bzw. 7 werden ent- sprechend vervielfältigt bzw. angepaßt. Falls die Elektropora- tion mit mehreren Pulsen induziert wird, wird j. eder der Pulse erfindungsgemäß zerlegt.

Die erfindungsgemäße Pulszerlegung ist bei der Behandlung bio- logischer beliebiger Objekte anwendbar, zu denen insbesondere biologische Objekte, wie beispielsweise biologische Zellen oder Zellgruppen, oder auch synthetische Objekte, wie bei- spielsweise Liposomen, Vesikel oder dgl., zählen.