Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Aufreinigung und Anreicherung von ladungstragenden ersten Molekülen wie Proteinen, Nukleinsäuren und dgi..

Die Anreicherung von biologisch relevanten Molekülen, wie Nukleinsäuren zur Durchfuhrung analytischer Tests, bsp. der "polymerase chain reaction" (PCR), kann durch Fallen der Nukleinsäuren, durch Binden der Nukleinsäuren an eine geeig¬ nete Matrix, bsp. unter Verwendung einer Ionenaustauscher- Saule, sowie durch verschiedene Zentrifugationsverfahren er- folgen. Die Selektion spezifischer Nukleinsäuren aus einem Nuklemsauregemisch kann durch Anreicherung und Abtrennung in einem Gel, durch Hybridisation an Membranen oder durch das Komplexieren mit spezifischen Proteinen erfolgen. - Zur Aufreinigung von Proteinen werden ähnliche Verfahren herange- zogen; dabei kommen auch Verfahren wie die Hochdruckflussigkeitschromatographie (HPLC) sowie antikorper- abhangige Aufreinigungsverfahren zur Anwendung. Antikorper- abhangige Verfahren verwenden oberflachenfixierte Moleküle, wie z.B. Latex-beads . - Die bekannten Verfahren haben den Nachteil mangelnder Sensitivitat und Geschwindigkeit. Außerdem ist deren Durchfuhrung kostenaufwendig.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Aufreinigungs- und Anreicherungsverfahren sowie eine entspre- chende Vorrichtung bereitzustellen, mit denen die Nachteile nach dem Stand der Technik beseitigt werden. Außerdem sollen insbesondere Nukleinsäuren, Proteine und andere ladungstra ^¬ gende Moleküle von vorgegebenem Homologiegrad bzw. vorgegebe ^¬ ner Bindungsaffinitat aus einem großen Volumen anreicherbar sein.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Patentansprüche 1 und 13 gelost. Zweckmäßige Weiterbildungen ergeben sich aus den Merkmalen der Patentansprüche 2 - 12 sowie 14 - 35.

Nach der verfahrensseitigen Maßgabe der Erfindung wird die Aufgabe durch die folgenden Schritte gelost:

a) Bereitstellen einer die ersten Moleküle enthaltenden Losung,

b) Inkontaktbnngen der Losung mit mindestens einer Elektrode, auf der unmittelbar eine Beschichtung mit eine Affinitat zu den ersten Molekülen aufweisenden zweiten Molekülen vorgesehen ist und

c) Verbinden der Elektrode mit einem Mittel zur Erzeugung eines elektrischen Felds, so daß in der Losung eine m bezug zur Beschichtung gerichtete Bewegung der ersten Moleküle bewirkt wird.

Die Elektrode ist zweckmaßigerweise aus einem elektrisch leitfahigen Kuststoff hergestellt. Sie kann eine Schicht auf einem elektrisch nichtleitenden Kunststofftragerstab oder ein, vorzugsweise endstandiger, Abschnitt eines solchen Kuststofftragerstabs sein. Es ist auch möglich, den Kunstofftragerstab vollständig aus elektrisch leitfahigem Kunststoff herzustellen und mit einem aus elektrisch nichtleitenden Kunststoff hergestellten Griffelement zu versehen, das bspw. aufgesteckt sein kann.

Unter Einwirkung des elektrischen Felds wird der Effekt aus¬ genutzt, daß die in Losung befindlichen ersten Moleküle, z.B. Nuklemsaure-Molekule, eine Ladung tragen und somit im elektrischen Feld bewegbar sind. Die durch die Einwirkung des

elektrischen Felds mit der Beschichtung in Kontakt getretenen oder m unmittelbare Nahe gelangten zweiten Moleküle können dort an die ersten Moleküle gebunden werden. Dabei kann als Bindung insbesondere eine ionische, kovalente, Wasserstoffbrucken- oder durch sterische Einflüsse hervorge¬ rufene Bindung in Frage kommen. Wahrend der Ausbildung dieser Bindung muß kein elektrisches Feld anliegen.

Das erfmdungsgemaße Verfahren ist nicht nur dann anwendbar, wenn die ersten Moleküle sich in einer Losung befinden. Es genügt, wenn sich die ersten Moleküle in einer Matrix, bspw. Gel, Fleisch oder dgi., sich befinden, die im elektrischen Feld eine Wanderung derselben ermöglicht.

Nach einer Ausgestaltung der Erfindung wird zur Erzeugung des elektrischen Felds eine erste Spannung an die Elektrode ange¬ legt, so daß sie als Anode wirkt, an die eine negative Ladung tragende erste Moleküle, z.B. Nuklemsaure-Molekule, so ange¬ zogen werden, daß eine Bindung an die zweiten Moleküle er- reicht wird. Nach einer alternativen Ausgestaltung wird zur Erzeugung des elektrischen Felds eine erste Spannung an die Elektrode angelegt, so daß sie als Kathode wirkt, an die eine positive Ladung tragende erste Moleküle, z.B. Proteine, so angezogen werden, daß eine Bindung an die zweiten Moleküle erreicht wird.

Als besonders vorteilhaft wird angesehen, wenn insbesondere nach dem Binden der ersten an die zweiten Moleküle der fol¬ gende Schritt durchgeführt wird:

di) Umpolen und Anlegen einer zweiten Spannung, so daß die Elektrode als Kathode wirkt, von der eine negative Ladung tragende erste Moleküle, z.B. Nukleinsäuren, abgestoßen werden.

Alternativ dazu kann insbesondere nach dem Binden der ersten an die zweiten Moleküle der folgende Schritt durchgeführt werden:

d2) Umpolen und Anlegen einer zweiten Spannung, so daß die

Elektrode als Anode wirkt, von der eine positive Ladung tragende erste Moleküle, z.B. Proteine, abgestoßen werden.

Durch die Schritte lit. d^) und d2> kann ein Zusetzen der Beschichtung verhindert werden. Durch eine geeignet gewählte zweite Spannung ist es nämlich möglich, nicht an die Beschichtung gebundene Ladungsträger von der Beschichtung abzustoßen und so den Zugang für weitere erste Moleküle zu verbessern. Durch eine geeignete Erhöhung der zweiten Spannung können außerdem gezielt bestimmte ladungstragende erste Moleküle von der Beschichtung entfernt werden. Auf diese Weise kann auch eine Selektion bestimmter erster Moleküle erreicht werden. Dieser Vorgang ist als Stnngenz einer Hybridisationsreaktion für Nukleinsäuren bekannt.

Bei der Umpolung ist zu beachten, daß die Wanderung derjeni ^¬ gen ersten Moleküle, die eine Wechselwirkung mit den zweiten Molekülen eingegangen sind bzw. mit diesen hybridisieren, eingeschränkt ist. Der Grad dieser Behinderung ist von der Art und Anzahl der Wechselwirkungen, d.h. m erster Linie vom Grad der Homologie, der miteinander wechselwirkenden ersten und zweiten Moleküle bzw. deren Affinitat abhangig. Erste Moleküle, die eine hohe Affinitat bzw. Komplementaπtat zu den zweiten Molekülen aufweisen, werden dabei am stärksten zurückgehalten.

Zweckmaßigerweise wird wahrend und/oder nach dem Schritt lit. c der folgende Schritt durchgeführt:

e) Aufheizen der Elektrode oder der Losung, so daß die ersten Moleküle thermisch in ihre Komponenten oder Untereinheiten, z.B. emzelstrangige Nukleinsäuren, dis¬ soziiert oder denaturiert werden.

Diese Ausgestaltung ermöglicht bsp. das Aufschmelzen von an die Beschichtung angezogenen doppelstrangigen Nukleinsäuren und erleichtert somit die Bindung der Einzelstrange an bspw. m der Beschichtung vorgesehene komplementären Oligonukleotiden. Auch das Halten der Oberflache be einer bestimmten Temperatur leistet somit einen Beitrag zur Stringenz der Selektion bestimmter bindender erster Moleküle.

Zweckmaßigerweise wird insbesondere nach dem Schritt lit. d _] _ bzw. d2 der folgende Schritt durchgeführt:

f) Abkühlen der Elektrode oder der Losung, so daß eine Bindung der ersten Moleküle, Komponenten und/oder Untereinheiten derselben an die zweiten Moleküle bewirkt wird.

Durch den Schritt lit. f wird die Bindung der ersten Moleküle, deren Komponenten oder Untereinheiten an die Beschichtung zusätzlich unterstutzt.

Je nachdem welcher Art die ersten Moleküle sind, kann/können einer oder mehrere der Schritte lit. c - lit. e wiederholt werden.

Insbesondere wahrend und/oder nach dem Schritt lit. d^ bzw. d2 ist es zweckmäßig, die Losung vorzugsweise mechanisch zu durchmischen. Auf diese Weise wird die Entfernung von durch die Schritte lit. d _] _ bzw. d2 von der Elektrode abgestoßenen ersten Molekülen, Komponenten und/oder Untereinheiten unter- stutzt.

Vorteilhafterweise werden die Maximalwerte der ersten und zweiten Spannung so gewählt, daß eine Degradierung durch Elektrolyse der ersten und zweiten Moleküle sowie der Komponenten und/oder Untereinheiten vermieden wird. Daneben hat es sich als gunstig erwiesen, den Maximalwert der zweiten Spannung so zu wählen, daß eine Trennung von zwischen den er¬ sten Molekülen bzw. deren Komponenten oder Untereinheiten und den zweiten Molekülen gebildeten Bindungen vermieden wird.

In Anpassung an die Art des anzureichernden bzw. aufzureini¬ genden ersten Moleküls können d e Maximalwerte der ersten und/oder zweiten Spannung/en, die Dauer der Polung bzw. Umpolung und/oder die Temperatur der Elektrode in Abhängigkeit von Parametern der Losung, wie deren ph-Wert, Ionenleitfahigkeit, Konzentration an ersten Molekülen, Temperatur und dgi. vorzugsweise automatisch gesteuert wer¬ den.

Nach der vorrichtungsseitigen Losung ist eine Vorrichtung zur Anreicherung von ladungstragenden in einer Losung befindlichen ersten Molekülen, wie Nukleinsäuren, Proteinen und dgi., mit einer Elektrode vorgesehen, auf der unmittelbar eine Beschichtung mit eine Affinitat zu den ersten Molekülen aufweisenden zweiten Molekülen vorgesehen ist, und wobei die Elektrode mit einem Mittel zur Erzeugung eines elektrischen Felds verbunden ist, so daß in der Losung eine in bezug zur Elektrode gerichtete Bewegung der ersten Moleküle bewirkbar

Damit wird eine Vorrichtung zur Durchfuhrung des neuerungs- gemaßen Verfahrens zur Verfugung gestellt, bei der das nach¬ teilige Zusetzen der Beschichtung vermieden und ein Anreichern spezifischer Moleküle an einer Oberflache bewirk-

bar ist. Die Elektrode ist einfach und billig herstellbar; sie kann daher als Einmalartikel verwendet werden.

Die Elektrode ist vorzugsweise aus einem elektrisch leitfahigen Kunststoff, insbesondere einem Polycarbonat, einem Polycarben, Polycarbonat, Polycarbonat-Mischpolymerisat oder Homopolymerisat mit einem leitfahigen Zusatz, wie Graphit, hergestellt. Derartige elektrisch leitfahige Kunststoffe sind bsp. aus der DE 35 41 721 AI bekannt, deren Inhalt hiermit einbezogen wird.

Das Mittel zur Erzeugung des elektrischen Felds kann ein Mittel zur Erzeugung eines elektrischen Wechselfelds sein. So kann eine schnelle und spezifische Belegung der Beschichtung mit den anzureichernden bzw. aufzureinigenden ersten Molekülen erzielt werden.

Je nachdem, ob das erste Molekül eine positive oder eine ne¬ gative Ladung tragt, kann das Mittel zur Erzeugung des elek- frischen Felds die Elektrode als Anode oder als Kathode umfassen.

Die als Elektrodenmatenal vorliegenden Kunststoffe lassen eine sehr einfache und damit kostengünstige Belegungschemie (Hitoshi Kohsaka : J. Clm. Lab. Anal. 8:452-455 (1994) ) für die die Selktionskriterien vorgebenden zweiten Moleküle zu. Die auf der Elektrode vorgesehene Beschichtung weist nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal mindestens einen aliphatischen Rest auf, der vorzugsweise über eine NH- oder SH-Bmdung an die Elektrode gebunden ist. Der aliphatische Rest kann dabei eine Kettenlange von 2 - 20, vorzugsweise von 6 - 10, Kohlenstoffatomen aufweisen. An das freie Ende des aliphatischen Rests ist zweckmaßigerweise eine Protein-, Peptid- oder eine Nukleotid-Sequenz gebunden. Die Nukleotid- Sequenz kann 5 - 30 Nukleotide umfassen. Dabei ist es

vorteilhaft, wenn die Nukleotid-Sequenz ein erstes Oligonukleotid ist, das aus einer Kette von 10 - 20, vorzugs¬ weise von 15 Nukleotiden, gebildet ist. Als besonders vor¬ teilhaft wird angesehen, an das erste Oligonukleotid, vorzugsweise über eine Zuckerphosphat-Bmdung, ein zweites Oligonukleotid zu binden.

Die Elektrode kann mit einem Heizelement versehen sein, das durch einen elektrischen Isolator von der Elektrode getrennt ist. Der Isolator kann aus Glas oder Keramik, vorzugsweise aus Alummiumoxid oder -nitrid, hergestellt sein. Bei dem Heizelement kann es sich um ein aus Platin hergestelltes Widerstandsheizelement handeln. Das Widerstandsheizelement kann in einer Ausgestaltung der Erfindung auch mit der Elektrode identisch sein, da bei geeigneter Schaltung der im Vergleich zu den Zuleitungen hohe elektrische Wiederstand der Kunststoffelektrode zur Erwärmung der Elektrodenoberflache genutzt werden kann.

Um unerwünschte Moleküle von der Beschichtung abzuführen und eine Neuverteilung von aufzureinigenden und anzureichernden ersten Molekülen in der Losung zu bewirken, ist zweckmaßigerweise ein Mittel zum Durchmischen der Losung vor¬ gesehen. Dabei kann es sich um einen elektrisch betreibaren Ruhrer oder um einen hmdurchgeleiteten Gasstrom handeln.

Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal der Erfindung sind die elektrischen Großen zur Erzeugung des elektrischen Felds, zum Betrieb des Heizelements sowie des Mittels zum Durchmischen in Abhängigkeit von Parametern der Losung wie deren ph-Wert, Ionenleitfahigkeit, Konzentration an ersten Molekülen, Temperatur und dgi. vorzugsweise automatisch steu¬ erbar. Zur automatischen Steuerung wird zweckmaßigerweise ein Computer zum Einsatz kommen.

Schließlich wird eine Zusammenstellung von Mitteln zur Herstellung der neuerungsgemaßen Vorrichtung und zur Durchfuhrung des neuerungsgemaßen Verfahrens beansprucht.

Beispiel 1 - Aufbau der Beschichtung und des darunter befindlichen Korpers

Auf einen Tragerstab ist eine erste Isolationsschicht, die aus Glas oder Keramik, bsp. aus Alummiumoxid, gebildet sein kann, aufgebracht. Darauf ist eine leitfahige, bsp. m Form eines Platin aanders hergestellte, Schicht zum Heizen aufgebracht. Die leitfahige Schicht ist wiederum mit einer dünnen zweiten Isolationsschicht abgedeckt. Sie kann eine Dicke von 150 μm aufweisen und aus Glas hergestellt sein. Darauf befindet sich eine aus Gold gebildete Elektrode. Sie ist kontaktiert.

Auf der Elektrode ist die Beschichtung vorgesehen. Über SH- Gruppen sind an die Oberflache der Elektrode C6 aliphatische Linkermolekule gebunden. An das freie Ende der Linkermolekule sind eweils Spacer olekule, bsp. aus 10 Thymidinresten bestehende Oligonukleotide, gebunden. An deren freien Enden ist jeweils über eine Zuckerphosphat-Bmdung 10 pmol eines 20-mer mit einer vorgegebenen Sequenz gebunden. Die mit der Beschichtung versehene Elektrode wird üblicherweise Kombination mit der beanspruchten Vorrichtung verwendet. Er kann aber auch ein gesonderter Neuerungsgegenstand sein.

Beispiel 2 - Aufreinigung

Die im Beispiel 1 beschriebene Elektrode wird in 1 ml einer 20 pmol radioaktiv markiertes Olionukleotid (20-mer) und 40 pmol DNA-Emzelstrange enthaltenden Meßlosung eingetaucht. Das Oligonukleotid ist komplementär zu dem m der Beschichtung gebundenen Oligonukleotid, die DNA-Emzelstrange

dagegen nicht. Für die mittels Cherenkov-Zahlung ermittelte Aktivität der der Beschichtung werden die folgenden Werte beobachtet :

Wird an die Elektrode eine Spannung von 0,2 V und ein Strom vom 0, 8 mA angelegt, so wird nach mehrmaligem Umpolen eine Bindung von 9« der Gesamtaktivitat an die Beschichtung beob¬ achtet. Bei zweimmutiger Schaltung der Elektrode als Anode ohne Umpolung betragt die Bindung der Gesamtativitat 2 . - Ohne Anlegen einer Spannung werden weniger als 0,2 ^c ό der Gesamtaktivitat an die Beschichtung gebunden.

Nachfolgend werden Ausfuhrungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung erläutert. Hierin zeigen

Fig. 1 einen schematischen Querschnitt durch ein erstes Ausfuhrungsbeispiel einer Elektrode,

Fig. 2 einen schematischen Querschnitt durch ein zweites Ausfuhrungsbeispiel einer Elektrode,

Fig. 3 eine perspektivische Ansicht gemäß Fig. 1,

Fig. 4 eine perspektivische Ansicht eines Behalters mit Elektrode und Gegenelektrode,

Fig. 5 eine perspektivische Ansicht eines dritten Ausfuhrungsbeispiels einer Elektrode.

Ein aus Teflon hergestellter Tragerstab 1 ist mit einer leitfahigen Schicht bzw. Elektrode 2, bestehend aus einem elektrisch leitfahigen Kunststoff, versehen. Die der Losung (hier nicht dargestellt) zugewandte Flache 3 der Elektrode 2 ist mit Oligonukleotiden 4 beschichtet. Innerhalb des Tragerstabs 1 ist eine erste Leitung 5 eingegossen, die mit

der Elektrode 2 kontaktiert ist. Zwei weitere zweite Leitungen 6 (hier mit unterbrochener Linie dargestellt) können zum Beheizen ebenfalls mit der Elektrode 2 kontaktiert

Bei dem in Fig. 2 gezeigten Ausfuhrungsbeispiel ist zusätzlich zwischen der Elektrode 2 und dem Tragerstab 1 eine elektrische isolierende Zwischenschicht 7 vorgesehen. Sie trennt die Elektrode 2 von einer Heizschicht 8, die unmittelbar auf dem aus Teflon hergestellten Tragerstab 1 vorgesehen ist.

Fig. 3 zeigt eine perspektivische Ansicht des Fig. 1 beschriebenen Ausfuhrungsbeispiels . Mit 9 sind einer Losung befindliche ladungstragende erste Moleküle bezeichnet.

Fig. 4 zeigt das Ausfuhrungsbeispiel gemäß Fig. 3 perspektivischer Ansicht. Der Tragerstab 1 taucht in eine einem Behalter 10 aufgenommenen Losung ein, m der sich erste Moleküle 9 befinden. Die erste Leitung 5 ist mit einer Wechselspannungsquelle 11 verbunden. Ebenfalls mit der Wechselspannungsquelle 11 verbunden ist über eine dritte Leitung 12 eine in die Losung eintauchende Gegenelektrode 13

Fig. 5 zeigt perspektivischer Ansicht ein drittes Ausfuhrungsbeispiel einer Elektrode. An der Spitze des aus isolierendem Kunststoff hergestellten Tragerstabs 1 befindet sich die Flache 3 der Elektrode 2. Die eingegossene erste Leitung 5 ist mit einer ersten Anschlußbuchse 14 und die zweiten Leitungen 6 jeweils mit zweiten Anschlußbuchsen 15 verbunden. In die Anschlußbuchsen 14 bzw. 15 können Stecker von Anschlußkabeln eingesteckt werden.

Die Funktion der Vorrichtung ist folgende:

Um Biomolekul-Proben aus einer Losung zu gewinnen, wird eine erfmdungsgemaße Vorrichtung m die Losung getaucht. Sodann wird eine Spannung über die auf dem Tragerstab 1 vorgesehene Elektrode 2 und einer in die Losung eintauchenden Gegenelektrode 13 angelegt. Das bewirkt je nach Polarisation der Elektrode 2 eine elektrophoretische Wanderung von entgegengesetzt geladenen Biomolekulen in Richtung der Elektrode 2. Bei Erreichen der aus Oligonulkleotiden 4 bestehenden Beschichtung werden diese daran gebunden.

Im Fall von doppelstrangiger DNA wird die Polarisation der Elektrode 2 nach einem vorgegebenen Zeitabschnitt unterbrochen. Es findet dann ein Heizen der Elektrode 2 statt. Dadurch werden die an den Oligonukleotiden 4 anhaftenden DNA Doppelstrange in ihre Komponenten zerlegt. Die Einzelstrange werden durch Wiederanlegen der Polarisation an die Oligonukleotide 4 zuruckbewegt und dort gebunden. Auf diese Weise können schnell und einfach Proben aus der Losung gewonnen werden.

Bezugszeichenliste

1 Tragerstab

2 Elektrode

3 Flache

4 Oligonukleotide

5 erste Leitung

6 zweite Leitung

7 Zwischenschicht

8 Heizschicht

9 erste Moleküle

10 Behalter

11 Wechselspannungsquelle

12 dritte Leitung

13 Gegenelektrode

14 erste Anschlußbuchse

15 zweite Anschlußbuchse