Das Auflösungsvermögen optischer Abbildungssysteme wird oft entscheidend durch die objektseitige Apertur einer Objek- tivlinse und deren Brechzahl bestimmt. Von einem Objekt aus- gehendes Licht kann nur erfasst werden, wenn es innerhalb des Akzeptanzwinkels des Objektivs auf dieses trifft. Je höher das Auflösungsvermögen ist, desto höhere Orts-oder Raumfre- quenzen der abzubildenden Objektstruktur können erfasst wer- den. Die Erfassung der Raumfrequenzen wird durch die lichtop- tische Transferfunktion oder Modulationsübertragungsfunktion (im Folgenden : OTF) des optischen Systems beschrieben. Die OTF gibt an, welche Raumfrequenzen, aus denen sich das. Objekt mittels Fouriertransformation zusammengesetzt konstruieren lässt, bei der optischen Abbildung erhalten bleiben, bzw. wie Raumfrequenzanteile geschwächt werden. Das Auflösungsvermögen des optischen Systems (z. B. eines Lichtmikroskops) ist durch den Bereich bestimmt, in dem die OTF des Systems nicht ver- schwindet. Verschwindet die OTF in Abschnitten des reziproken Raumes vollständig, so ist es unmöglich, ohne zusätzliche An- nahmen über die Objektstruktur (z. B. räumliche Beschränkt- heit, Positivität) die entsprechenden Raumfrequenzen in einer Objektabbildung zu rekonstruieren. Es besteht allgemein ein Interesse an der Ausdehnung der OTF auf einen möglichst gro- ßen Bereich im reziproken Raum, um die Auflösung des opti- schen Systems zu erhöhen.

Herkömmliche Verfahren zur Erhöhung des Auflösungsvermögens sind insbesondere auf eine geeignete Wahl der Objektbeleuch- tung gerichtet. So wird bspw. beim konfokalen Mikroskop mit einem fokussierten Lichtstrahl das Objekt von einer Seite möglichst punktweise beleuchtet und gleichzeitig abgetastet (gescannt), wobei oft die Detektion mittels einer Blende auf einen kleinen Bereich des Objekts begrenzt wird (siehe z. B.

US-A 4 631 581).

Bei dem in EP 0 491 289 beschriebenen 4Pi-Mikroskop wird von beiden Objektseiten kohärent beleuchtet und je nach Ausfüh- rung auch detektiert. Beim Wellenfeldmikroskop wird üblicher- weise mit kohärenten ebenen Lichtwellen von gegenüberliegen- den Seiten beleuchtet (siehe z. B. US-A 4 621 911 ; F. Lanny et al. in"Bioimaging", Band 1,1993, Seite 187 ff. ; US-A 5 801 881). Beim I5M-Mikroskop wird sowohl kohärent von beiden Seiten beleuchtet, als auch kohärent detektiert, indem die beiden Bilder des Objekts auf einem ortsauflösenden Detektor zur Interferenz gebracht werden (siehe US-A 5 671 085 ; M. G. L.

Gustafsson et al. in"Proceedings of SPIE", Band 2655,1996, Seite 62 ff.). Von E. H. K. Stelzer et al. in"Opt. Commun" Band 111,1994, Seite 536 ff. und S. Lindeck et al. in"Hand- book of Biological Confocal Microscopy", Herausgeber J. B.

Pawley, Plenum Press, New York 1995, Kapitel 26, Seite 417 ff. wird ein Theta-Mikroskop beschrieben, bei dem Licht von drei Seiten detektiert wird, wobei mit konfokaler oder 4Pi- ähnlicher Beleuchtung gearbeitet wird. Da bei der seitlichen Detektion in der Objektebene die Auflösung entlang der opti- schen Achse der Beleuchtung besonders groß ist, erhält man insgesamt ein verkleinertes Fokusvolumen.

Es ist auch bekannt, in stereomikroskopischen Oberflächento- pographie-Verfahren eine räumlich variierende Beleuchtung (z.

B. sinus-förmig variierend) zu verwenden. Durch Verrechnung der gemessenen Bilder kann auf die Oberflächenstruktur des Objekts rückgeschlossen werden (siehe z. B. US-A 4 525 858 ; R. Windecker et al. in"Optical Engineering", Band 36,1997, Seite 3372 ff.).

Ein Verfahren zur hochauflösenden dreidimensionalen Bildge- bung durch Erfassung optischer Schnitte des Objekts ähnlich zur konfokalen Mikroskopie ist in WO 97/31282 beschrieben. Es basiert auf der Aufnahme mehrerer Bilder mit jeweils unter- schiedlichen Mustern aus Beleuchtungslochblenden und zugehö- rigen Detektionslochblenden. Durch geeignete Rekonstruktions- verfahren lässt sich aus den aufgenommenen Daten ein Bild be- rechnen, das dem eines konfokalen Mikroskops äquivalent ist.

Dieses Verfahren wird auch als"Aperture Correlation Micros- copy"bezeichnet (siehe auch R. Juskaitis et al. in"Nature" Band 383,1996, Seite 804 ff., T. Wilson et al. in"Procee- dings of the SPIE", Band 2984,1997, Seite 21 ff.). Aus WO 98/45745 ist ein Verfahren bekannt, das auf der Beleuchtung unter Abbildung eines Beugungsgitters oder mit zwei interfer- rierenden Laserstrahlen beruht (siehe auch T. Wilson et al. in"Cell Vision", Band 4,1997, Seite 231 ff.). In der Publi- kation von R. Heintzmann et al. in"Proceedings of SPIE"Band 3568,1999, Seite 185 ff. wird ein ähnliches Verfahren zur lateralen Erhöhung des Auflösungsvermögens eingesetzt.

Die herkömmlichen Techniken besitzen die folgenden Nachteile.

Die Abbildungsverfahren sind mit einem relativ großen techni- schen Aufwand verbunden. So ist insbesondere bei den 4Pi-, I5M-und Theta-Mikroskopen die Justierung besonders schwie- rig. Die Verfahren sind außerdem nur schwer zu realisieren, da sie lediglich mit großem Aufwand in vorhandene Mikro- skopsysteme integrierbar sind. Beim Wellenfeldmikroskop ist es ein großes Problem, dass die OTF in axialer Richtung Be- reiche aufweist, an denen sie verschwindet. Außerdem liefert das Wellenfeldmikroskop bzw. das 4Pi-Mikroskop in lateraler Richtung, verglichen mit der herkömmlichen Epi-Fluoreszenz- Mikroskopie bzw. der konfokalen Fluoreszenz-Mikroskopie, kei- nen Auflösungsgewinn.

Des Weiteren sind viele Verfahren (insbesondere die konfokale Laserscanning-4Pi-und Theta-Mikroskopie) mit einem punktwei- sen Abrastern des Objekts verbunden. Dies ist zeitaufwendig und vor allem bei der Bildgebung zeitabhängiger Vorgänge pro- blematisch. Abtastende Verfahren benötigen sehr schnelle De- tektoren (z. B. Photomultiplier), die jedoch gegenüber lang- sameren Detektoren mit Ortsauflösung (z. B. CCD s) oft eine deutlich niedrigere Detektionseffizienz besitzen. Bei der Fluoreszenz-Mikroskopie kommt noch erschwerend hinzu, dass die sinnvolle Beleuchtungsstärke durch die maximale Anre- gungsrate der Farbstoffe im Fokus beschränkt ist. Dies be- grenzt die maximale Abtastgeschwindigkeit zusätzlich.

Es sind auch mikroskopische Abbildungsverfahren auf der Basis nicht-linearer Effekte bekannt. So wird bspw. in US-A-5 034 613, US-A-5 777 732, US-A-5 828 459 und US-A-5 796 112 die sog. Mehrphotonen-Mikroskopie beschrieben. Der konfokale Ef- fekt wird dabei durch die gleichzeitige Absorption mehrerer Photonen an bestimmten Objektorten erzielt. Andere Techniken basieren auf der stimulierten Emission (siehe US-A-5 731 588, DE-OS 44 16 558) oder dem Entvölkern des Grundzustandes von Fluoreszenz-Molekülen, indem diese gezielt in den längerlebi- gen Triplettzustand gepumpt werden (siehe S. W. Hell et al. in "Applied Physics B", Band 60,1995, Seite 495 ff.).

Mit den Verfahren auf der Grundlage nicht-linearer optischer Effekte konnte bisher keine erhebliche Erhöhung des Auflö- sungsvermögens erreicht werden. Dies hängt insbesondere damit zusammen, dass zur Erzielung von Mehrphotonen-Absorptionen die einzelnen Photonen relativ geringe Energien und somit große Wellenlängen besitzen müssen. Außerdem ist die Obertra- gungseffienz bei hohen Raumfrequenzen im Allgemeinen sehr schlecht, weil typischerweise nur ein sehr kleiner Teil des Beleuchtungsmusters hohe Raumfrequenzen enthält.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Abbil- dungsverfahren mit einem hohen Auflösungsvermögen anzugeben.

Das Verfahren soll insbesondere die o. g. Nachteile herkömm- licher Mikroskopie-Verfahren überwinden, mit einem verein- fachten technischen Aufwand realisierbar sein, eine schnelle Bildaufnahme auch zeitabhängiger Vorgänge erlauben und mit herkömmlichen optischen Systemen kompatibel sein. Das erfin- dungsgemäße Verfahren soll des Weiteren ermöglichen, bekannte mikroskopische Verfahren unter Beibehaltung ihrer jeweiligen Vorteile so zu erweitern, dass das Auflösungsvermögen zusätz- lich gesteigert wird. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, ein optisches System zur Durchführung derart verbesserter Verfahren anzugeben.

Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren und ein optisches System mit den Merkmalen gemäß den Patentansprüchen 1 bzw. 14 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Verwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Die Grundidee der Erfindung ist es, zur Gewinnung einer Ob- jektabbildung (Bild einer Objektstruktur) mindestens zwei Teilbilder eines Objekts unter jeweils verschiedenen Objekt- bedingungen aufzunehmen, die am Objekt mit räumlichen Mustern ausgebildet sind, wobei jeweils für einen Objektpunkt eine nicht-lineare Abhängigkeit des vom Objektpunkt her detektier- ten Lichtes von den am Objektpunkt gegebenen Objektbedingun- gen besteht und die Teilbilder unterschiedliche Beiträge ver- schiedener Raumfrequenzanteile der Objektstruktur enthalten, und aus den Teilbildern durch Rekonstruktion der Raumfre- quenzanteile die gewünschte Objektabbildung zu gewinnen. Die Einstellung von Objektbedingungen mit verschiedenen räumli- chen Mustern zur Erfassung der verschiedenen Teilbilder be- sitzt den Vorteil, dass virtuell nieder-und höherfrequente Raumfrequenzanteile im Muster der Objektbedingungen erzeugt werden, an die die Raumfrequenzanteile der Objektstruktur ge- koppelt sind. Durch diese Kopplung werden die Raumfrequenzan- teile der Objektstruktur in Bezug auf das Raumfrequenzinter- vall verschoben, das entsprechend der lichtoptischen Trans- ferfunktion (OTF) für eine Bilderfassung offen ist. Aus den Teilbildern kann die vollständige Objektabbildung mit einem entsprechend erweiterten Raumfrequenzbereich rekonstruiert werden.

Durch Ausnutzung eines nicht-linearen Zusammenhangs zwischen vom Objekt ausgehenden Licht und dem lokalen, objektpunktbe- zogenen Wert einer weiteren räumlichen veränderlichen Größe (z. B. der lokalen Einstrahlungs-oder Beleuchtungsintensi- tät) lässt sich der vom Gesamtsystem effektiv übertragene Raumfrequenzbereich beträchtlich erweitern. Durch lokale Va- riation der Einflussgröße und die Aufnahme mehrerer Teilbil- der lässt sich eine Objektabbildung rekonstruieren, deren Auflösung aufgrund der Nicht-Linearität fundamental höher als die durch das Abbe-Limit gegebene Auflösung ist. Zur Erzeu- gung nicht-linearer Effekte können verschiedene Möglichkeiten anwendungsabhängig gewählt werden. Ebenfalls ist die Gewin- nung der Objektabbildung aus den Teilbildern anwendungsabhän- gig mit verschiedenen Arten der Datenauswertung möglich.

Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist die Einstellung vor- bestimmter Objektbedingungen mit verschiedenen räumlichen Mu- stern. Am Objekt werden entsprechend dem jeweiligen Muster punktweise Objektbedingungen eingestellt, von denen das er- fasste Licht nicht-linear abhängig ist. Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung ist die Einstellung vorbestimm- ter Objektbedingungen die Bildung eines räumlichen Musters mindestens einer Objektbedingung, von der die erfasste Licht- menge jeweils nicht-linear abhängig ist. Gemäß einer abgewan- delten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Einstellung vorbestimmter Objektbedingungen die Erzeugung eines räumli- chen Musters von mindestens zwei verschiedenen Objektbedin- gungen, wobei eine Abhängigkeit der erfassten Lichtmenge von einer multiplikativen Verknüpfung der Objektbedingungen und eine lineare oder eine nicht-lineare Abhängigkeit der erfass- ten Lichtmenge von jeder der Objektbedingungen besteht. All- gemein wird von einer multi-linearen Abhängigkeit des erfass- ten Lichtes (z. B. der erfassten Lichtintensität oder Licht- phase) gesprochen.

Die Zahl der Teilbilder ist abhängig von der Zahl der bei der Bildrekonstruktion meßbaren und anwendungsabhängig zu berück- sichtigenden Raumfrequenzanteile im Muster des vom Objekt ausgesandten Lichtes. Diese Zahl ist insbesondere von der verwendeten Objektbedingung zur Einführung der Nicht- Linearität und von der Qualität des realisierten Abbildungs- verfahrens abhängig. Beträgt die Anzahl der genannten Raum- frequenzanteile Z, so sind in der Regel mindestens Z Teilbil- der aufzunehmen. Es kann aber fallabhängig auch ausreichend sein, weniger Teilbilder aufzunehmen, wenn genügend Informa- tionen zur Rekonstruktion der Objektabbildung vorliegen. Die Zahl der Teilbilder wird fest eingestellt oder automatisch in Abhängigkeit von der Qualität der gewonnenen Objektabbildung und/oder manuell vom Nutzer des optischen Systems einge- stellt.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt insbesondere die fol- genden Schritte : (a) Anpassung der im Objekt herrschenden Be- dingungen, die das von einem Objektpunkt ausgehende Licht zu beeinflussen imstande sind derart, daß eine nicht-lineare Ab- hängigkeit der von einem Objektpunkt detektierten Lichtinten- sität von dem Wert eines in mindestens einer Objektbedingung enthaltenen räumlichen Musters in mindestens einem detektier- ten Wert hervorgerufen wird oder eine jeweils zu einem Wert lineare Abhängigkeit der von diesem Objektpunkt detektierten Lichtintensität von den Werten mindestens zweier räumlicher Muster hervorgerufen wird, (b) Aufzeichnung mindestens eines Einzelbildes unter diesen Objektbedingungen, (c) Ändern der Objektbedingungen derart, daß unterschiedliche durch das Auf- nahmeverfahren abgebildete Raumfrequenzanteile des Objekts sich in ihrer Amplitude und/oder Phasenbeziehung zueinander verändern, (d) Aufzeichnung wenigstens eines weiteren Einzel- bildes unter jeweils gemäß (c) veränderten Objektbedingungen, und (e) Auswertung der gemessenen Bilder, indem die sich in den Einzelbildern unterschiedlich ausprägenden Objektbedin- gungen genutzt werden, um Informationen über das Objekt zu- rückzugewinnen, die zu Raumfrequenzen des Objekts gehören, welche durch eine einfache Abbildung mit dem Aufnahmeverfah- ren nicht zugänglich wären.

Ein erfindungsgemäßes optisches System zur Objektabbildung zeichnet sich insbesondere durch einen Mustergenerator, der zur Einstellung und Veränderung vorbestimmter räumlicher Mu- ster von Objektbedingungen eingerichtet ist, von denen das von einem Objekt detektierte Licht nicht-linear abhängig ist, und einen Bildgenerator zur Rekonstruktion der Objektabbil- dung aus den erfassten Teilbildern aus.

Die Erfindung besitzt die folgenden Vorteile. Die Gewinnung von Objektabbildungen ist relativ einfach realisierbar. Die Justierung des optischen Systems beschränkt sich auf einen minimalen Justierungsaufwand. Die Erfindung kann durch Nach- rüstung bestehender Abbildungssysteme implementiert werden.

Von besonderem Vorteil ist, dass hohe Raumfrequenzen, die in Abbildungsobjektiven ggf. stark unterdrückt werden, nun durch die Verschiebung im Frequenzraum effizienter detektiert wer- den können. Zusätzlich zum lateralen Auflösungsgewinn ergibt sich auch ein axialer Auflösungsgewinn und die Möglichkeit, zur optischen Achse senkrecht stehende Ebenen in axialer Richtung zu diskriminieren. Damit liefert die e Erfindung vor- teilhafte Verwendungen wie die Konfokalmikroskopie. Auch in axialer Richtung ergibt sich bei Ausnutzung der nicht- linearen Abhängigkeit der erfassten Lichtmenge von den Ob- jektbedingungen die Möglichkeit zu einem erheblichen Auflö- sungsgewinn.

Die Erfindung ist mit Vorteil in Kombination mit herkömmli- chen Abbildungsverfahren, insbesondere Mikroskopieverfahren, anwendbar. Dies betrifft insbesondere die o. g. Techniken und die Absorptionsmikroskopie, die Reflektionsmikroskopie, die ortsaufgelöste Abbildung von Fluoreszenzlebensdauern (sog.

"Fluorescence Lifetime Imaging"), die Mehrphotonenmikrosko- pie, Interferenzmikroskopie, Konfokalmikroskopie usw..

Das erfindungsgemäße Abbildungsverfahren besitzt eine hohe Geschwindigkeit der Bildaufnahme. Die Bildgebung kann z. B. mit einer CCD-Kamera an allen Objektpunkten in der Bildebene gleichzeitig erfolgen und ist daher deutlich schneller mög- lich, als bei abtastenden Verfahren.

Die Erfindung ist unter Verwendung der verschiedenartigsten nicht-linearen Effekte realisierbar. Bspw. kann in einem Fluoreszenzmikroskop die Beleuchtung mit einer derartigen In- tensität erfolgen, dass Fluoreszenzfarbstoffe im Objekt ge- sättigt werden. Dies ermöglicht auch, verschiedene Farbstoffe oder Farbstoffe in verschiedenen Umgebungen (z. B. in ver- schiedenen Bindungsgzuständen), die sonst schlecht zu unter- scheiden wären, aufgrund verschiedener nicht-linearer Eigen- schaften (Sättigungseigenschaften) zu diskriminieren.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden im Folgenden aus der Beschreibung der beigefügten Zeichnungen ersichtlich. Es zeigen : Figur 1 eine Illustration der Objektbeleuchtung im reziproken Raum bei sinusförmiger Beleuch- tung mit geringer Intensität, Figur 2 eine Illustration der Objektbeleuchtung im reziproken Raum bei einem nicht-linear ver- zerrten Anregungsmuster, Figur 3 eine Blockdarstellung eines erfindungsgemä- ßen optischen Systems, Figur 4 Einzelheiten eines optischen Systems gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung, Figur 5 Einzelheiten eines optischen Systems gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfin- dung, Figuren 6 und 7 Simulationsergebnisse zur Illustration eines erfindungsgemäßen Verfahrens, Figur 8 eine Kurvendarstellung zur Illustration des lateralen Auflösungsvermögens, Figur 9 eine Kurvendarstellung der effektiven Ge- samt-OTF eines erfindungsgemäßen optischen Systems (mit Rekonstruktion), und Figur 10 Beispiele vom Objektabbildungen.

Die Erfindung wird im Folgenden zunächst anhand der theoreti- schen Grundlagen und anschließend an verschiedenen Beispielen erläutert. Die Erfindung ist nicht auf die gegebenen Ausfüh- rungsbeispiele beschränkt. Insbesondere im Rahmen der folgen- den Begriffsbestimmung sind abgewandelte Ausführungsformen unter entsprechend variierten Objektbedingungen anwendungsab- hängig realisierbar.

Der bei einer optischen Abbildung zu erfassende Gegenstand oder Teilabschnitte des Gegenstands werden im Folgenden all- gemein als"Objekt"bezeichnet. Objekte sind insbesondere al- le Formen von biologischen oder synthetischen Proben, wie sie mit herkömmlichen Abbildungsverfahren und ortsauflösenden Analyseverfahren, insbesondere Mikroskopie und Spektroskopie- Verfahren, untersucht werden. Anwendungen ergeben sich z. B. in der Biologie, Medizin, Chemie, Halbleitertechnik, Einzel- molekülspektroskopie u. dgl.. Das Objekt kann fest, flüssig oder auch gasförmig sein.

Unter, Objektbedingungen" werden allgemein alle Parameter und/oder Bedingungen am Ort des Objektes verstanden, mit de- nen eine oder mehrere Eigenschaften des vom Objekt ausgehen- den Lichtes beeinflussbar sind. Zu diesen Eigenschaften zäh- len insbesondere die Intensität, der Polarisationszustand, die Phase, die Farbe, die Pulsform, die Pulslänge, der Kohä- renzgrad, die Photonenkorrelation und dergleichen. Objektbe- dingungen können inhärente physikalische oder chemische Ei- genschaften des Objekts, wie z. B. eine bestimmte stoffliche Zusammensetzung, eine Temperaturverteilung oder eine Druck- verteilung, oder von außen aufgeprägte Parameter, wie z. B. die Beleuchtungsintensität auf der Objektoberfläche oder im Objekt, umfassen.

Die Ausbildung der Objektbedingungen mit einem räumlichen Mu- ster bedeutet, daß die Objektbedingungen mit einer bestimmten Ortsabhängigkeit beschrieben werden können. Das Muster kann durch eine Struktur (z. B. ein Punkt-oder Strichmuster) cha- rakterisiert sein oder auch strukturlos sein (für alle Ob- jektpunkte gelten die gleichen Objektbedingungen). Die Auf- nahme von Teilbilder unter verschiedenen Objektbedingungen bedeutet, daß zwischen den Aufnahmen das Muster an sich (z.

B. mit einem DMD-Reflektor, s. u.), die Position und/oder Orientierung des Musters relativ zur Probe (z. B. mit einem verschiebbaren Beugungsgitter, s. u.) und/oder eine Intensi- tätseigenschaft des Musters (z. B. mit einer Variation der Intensität der Objektbeleuchtung, s. u.) verändert wird.

Eine"nicht-lineare Abhängigkeit"des vom Objekt ausgehenden bzw. mit einem Detektor erfassten oder detektierten Lichtes ist gegeben, wenn dessen Lichtintensität von der jeweiligen Objektbedingung Ort der Lichtaussendung (oder-streuung oder dergleichen) messbar keinem einfachen linearen Modell folgt.

In einer Funktionenentwicklung, z. B. Taylor-Entwicklung (siehe unten), des detektierten Lichts treten Terme höherer Ordnung auf. Gemäß den o. g. Ausführungsformen der Erfindung kann eine nicht-lineare Abhängigkeit der Lichtintensität je- weils von einer Objektbedingung oder eine lineare Abhängig- keit der Lichtintensität von mehreren Objektbedingungen gege- ben sein. Im letzteren Fall treten in der Funktionenentwick- lung Mischterme auf, die die unten erläuterte Erweiterung der detektierbaren Objekt-Raumfrequenzen erlauben.

Die"detektierte Lichtintensität", die die vom Detektor ge- messene Lichtintensität ist, kann anwendungsabhängig je nach Funktionalität des Detektors von der am Ort des Detektors herrschenden mittleren Lichtintensität abweichen, wenn z. B. zeitlich moduliert detektiert wird oder ein rohes Detektorsi- gnal mit anderen Signalen korreliert wird (z. B. durch Lock- In-Technik).

Unter einem"Teilbild"oder"Einzelbild"werden allgemein Bilddaten verstanden, die mit einem in weitesten Sinne abbil- denden lichtoptischen Verfahren aufgenommen wurden. Es kann sich dabei um einen einzelnen Datenpunkt, mehrere an ein oder verschiedenen Objektpunkten aufgenommene Datenpunkte oder Da- tenpunktbereiche in ein, zwei, drei oder mehr Dimensionen handeln. Die erfindungsgemäße Änderung von Objektbedingungen bei Aufnahme verschiedener Teilbilder kann sich auf eine An- derung oder Modulierung bei jedem Datenpunkt, für Abschnitte oder Gruppen von Datenpunkten oder für ganze zwei-oder drei- dimensionale Bilder oder sogar Zeitserien vorgesehen sein.

Unter"detektierbaren Raumfrequenzanteilen"werden allgemein die Anteile des Frequenzraums der Fouriertransformierten des Objekts verstanden, die mit dem jeweils angewendeten Abbil- dungsverfahren prinzipiell detektierbar sind.

Die Erfindung erlaubt nicht nur eine Objektabbildung mit er- höhtem Auflösungsvermögen, sondern auch die Gewinnung von "Informationen über das Objekt". Hierunter werden insbesonde- re die räumliche Verteilung einer oder mehrerer Eigenschaften des Objekts oder auch andere Parameter, wie z. B. die Positi- on eines von seiner Struktur her bekannten Teilobjekts im Raum oder die Zusammensetzung des Objekts, verstanden.

Grundlagen der Bilderfassung Die Bildaufnahme wird im Folgenden am Beispiel der Fluores- zenzmikroskopie erläutert. In der Fluoreszenzmikroskopie wer- den Objekte abgebildet, die mit Fluoreszenzfarbstoffen mar- kiert sind oder selbstständig fluoreszieren. Je nach Objekt- struktur und/oder Markierungstechnik sammeln sich z. B. Mar- kierungsfarbstoffe in bestimmten Teilbereichen (z. B. im Zellkern einer biologischen Zelle). Zur Bildaufnahme wird das Objekt mit einer geeigneten Anregungswellenlänge bestrahlt und die emittierte Fluoreszenzstrahlung detektiert. Fluores- zenzfarbstoffe emittieren mit einer Intensität, die in ersten Näherung proportional zur Intensität des am Ort des Farb- stoffs eingestrahlten Lichtes ist. Die Emission erfolgt im Unterschied zur Absorptionsmikroskopie, Reflektionsmikrosko- pie oder auch Phasenkontrastmikroskopie im allgemeinen inko- härent zueinander. Unter Annahme einer Proportionalität zwi- schen der an einem Objektpunkt ausgestrahlten Fluoreszenzin- tensität zur dort eingestrahlten Lichtintensität des Anre- gungslichts lässt sich ein detektiertes Bild Im (x) (rücküber- setzt in Objektraumkoordinaten x) wie folgt beschreiben. Die ortsabhängige Beleuchtungsintensität (Bel (x)) wird mit der am jeweiligen Objektpunkt vorhandenen Farbstoffkonzentration Obj (x) (Objektstruktur) multipliziert und das Ergebnis mit der Punktbildfunktion ("Point Spread Function", PSF) des ab- bildenden Systems gefaltet (siehe Gleichung (1)).

Im (x) = PSF (x) @ (Bel (x) Obj (x)) (1) Im reziproken Raum übersetzt sich dies in die Faltung der fouriertransformierten Beleuchtungsfunktion F (Bel (x)) mit der fouriertransformierten Objektfunktion F (Obj (x)) und anschlie- ßende Multiplikation mit der lichtoptischen Transferfunktion OTF (k) (F bezeichnet hier und im Folgenden die Fourierforma tion, die Koordinaten im reziproken Raum werden mit k be- zeichnet). Analog zu Gleichung (1) ergibt sich : F(Im(x)) = OTF(k) # (F(Bel(x)) # F(Obj(x))) Verallgemeinert auf andere Mikroskopieverfahren bedeutet Obj (x) den jeweiligen Wert oder die Dichte der Eigenschaften des Objekts, die zu erfassen ist, und PSF (x) die effektive Punktbildfunkion des gesamten Systems (Bildaufnahme und-re- konstruktion). Auch bei iterativen oder nicht-linearen Rekon- struktionsverfahren gilt dies oft noch näherungsweise.

In herkömmlichen abbildenden Systemen ist der im Wert von Null verschiedene Bereich der OTF, der auch als"Träger"be- zeichnet wird, durch die numerische Apertur und die Wellen- länge des abzubildenden Lichts auf einen gewissen Raumfre- quenzbereich eingeschränkt (siehe auch US-A-5 671 085). Glei- chermaßen ist auch die Fouriertranformierte der Beleuchtungs- funktion F (Bel (x)) in der Ausdehnung ihres Trägers durch die Lichtwellenlänge und ggf. Aperturen des Beleuchtungssystems eingeschränkt.

Erfindungsgemäß ist nun vorgesehen, den effektiven Bereich von detektierbaren Raumfrequenzen des Objekts F (Obj (x)) ("Ob- jekt-Raumfrequenzen") auf der Grundlage der folgenden Überle- gungen zu erweitern. Bei Einführung einer nicht-linearen Ab- hängigkeit der erfassten Lichtintensität von den Objektbedin- gungen ist der rechte Teil von Gleichung (1) verallgemeinert gemäß den Ausdrücken (2) bzw. (3) zu schreiben : PSF (x) @ Iem (Obj (X) b (X)) (2) OTF (k)'F (l (obj (x), b (x))) (3) Entsprechend dem Ausdruck (2) wird kein linearer Zusammenhang zwischen der von einem Objektpunkt ausgehenden Lichtintensi- tät Iem (x) und der dort eingestrahlten Lichtintensität (ent- halten in b (x)) vorausgesetzt. Vielmehr ist nun Iem (x) eine allgemeine Funktion des Wertes der zu erfassenden Objekt- struktur und anderer Faktoren b (x), die die nicht-linearen Bedingungen repräsentieren. Der Vektorpfeil über b soll an- deuten, dass es sich um mehrere Bedingungen oder Eigenschaf- ten bi handeln kann. Ein wichtiger Faktor bi ist die am Ort x eingestrahlte Lichtintensität Bel (x). Andere Faktoren werden unten beispielhaft genannt. Gemäß Gleichung (4) wird Iem (x) als Taylor-Reihe mit konstanten Koeffizienten ci angenähert ausgedrückt : Iem(x) = c0 + c1 # Obj(x) + c2 # b1(x) + c3 # Obj(x) # b1(x) + c4 # Obj (x)'bi (x) + c5 # Obj(x) # b1(x)² + ...

+ c6 Obj (x) b1 (x) 3 +... (4) Zur vereinfachten Darstellung wird in Gleichung (4) nur auf eine nicht-lineare Bedingung bi (x) Bezug genommen. Anwen- dungsabhängig können weitere Bedingungen in den Prozess der Aussendung von Licht vom jeweiligen Objektpunkt involviert sein. In diesem Fall treten entsprechende Terme auch in der Entwicklung gemäß Gleichung (4) auf, so insbesondere auch Mischterme wie z. B. c5b # Obj(x) # b1(x) # b2(x). Der Term nach C3 ist gerade der in Gleichung (1) genannte Ausdruck, wenn als nicht-lineare Objektbedingung b1 (x) = Bel (x) angenommen wird.

Die Fouriertransformierte der ausgesandten Lichtintensität F (Iem (Obj (x), b (x))) enthält demnach analog zu Gleichung (1) den TermC3 # F(Bel(x)) # F(Obj(x)).

Die Fouriertranformierte der Beleuchtungsintensität F (Bel (x)) ist als Summe einer Vielzahl von einzelnen 8-Funktionen dar- stellbar. Je nach dem aktuellen Beleuchtungsmuster werden al- so Teile der fouriertransformierten Objektfunktion F (Obj (x)) durch die Faltung mit der fouriertransformierten Beleuch- tungsfunktion verschoben und mit entsprechendem Gewicht auf- addiert. Dies ist in Figur 1 illustriert.

Figur 1 zeigt die Struktur der Anregungsverteilung im rezi- proken Raum bei sinusförmig verteilter, geringer Beleuch- tungsintensität entsprechend einer herkömmlichen, räumlich gemusterten Beleuchtung. Die nach oben gerichteten Pfeile be- zeichnen die Maxima, die aus der sinusförmigen Anregung her- rühren (Fouriertransformierte der Sinusfunktion). Zusätzlich ist die an das Maximum kb"gekoppelte"Struktur der Fourier- transformierten der Objektfunktion F (Obj+1 (k)) eingezeichnet.

Die an die anderen Maxima gekoppelten Fouriertransformierten der Objektfunktion sind aus Übersichtlichkeitsgründen nicht eingezeichnet. Tatsächlich ist jedoch, da Obj (k) mit den vir- tuellen Raumfrequenzteilen im Muster der Objektbedingungen im reziproken Raum zu falten ist, Obj (k) an jedes virtuelle Ma- ximum"gekoppelt". Nur der mittlere Teil an emittierten Raum- frequenzen (als Träger der OTF eingezeichnet) ist der Detek- tion zugänglich.

In Figur 1 ist beispielhaft illustriert, wie aus der Summe entsprechend der genannten Faltung durch die optische Abbil- dung (Multiplikation mit der raumfrequenzbegrenzten OTF) der detektierbare Bereich festgelegt ("ausgestanzt") wird. Der Bereich detektierbarer Objekt-Raumfrequenzen wird bei Be- leuchtung mit einem bestimmten Muster deutlich gegenüber dem Fall einer gleichmäßigen Beleuchtung erweitert. Mit den unten erläuterten Rekonstruktionsverfahren lassen sich die verscho- benen Objekt-Raumfrequenzen wieder zu einem konsistenten Bild zusammensetzen.

Entsprechend Gleichung (4) liefern im nicht-linearen Fall aber auch Terme höherer Ordnung in b (x) Beiträge zu Iem wie z. B. die Terme mit den Faktoren c5 bzw. c6. Die Fourier- transformierten dieser Terme sind auch in F (Iem (Obj (x), b (x))) enthalten. Mit b1 (x) = Bel (x) erhält man im Ausdruck (2) auch den Term cs [F (Bel (x)) @ F (Bel (x »] @ F (Obj (x)). Mit einem gewissen Anteil im Bild ist es jetzt möglich, Raumfrequenzen des Ob- jekts zu messen, die vorher noch nicht zugänglich waren, da sie durch die Faltung mit der raumfrequenzbegrenzten Funktion F (Bel (x)) noch nicht in den mittels OTF detektierbaren Bereich geschoben werden konnten. Die Ausdehnung des Trägers von F (Bel (x)) 0F (Bel (x)) kann nun aber entsprechend größer sein, wo- durch sich auch höhere Raumfrequenzen in den der OTF entspre- chenden Bereich verschieben und so in der Abbildung messbar sind. Weitere höhere Ordnungen wirken sich entsprechend in weiteren Faltungen mit den Fouriertransformierten der bi (x) aus, so dass noch höhere Objekt-Raumfrequenzen detektierbar sind. Im Prinzip ist es möglich, beliebig hohe Raumfrequenzen des Objekts zu detektieren und damit die Auflösung beliebig zu erhöhen, soweit entsprechende Koeffizienten in der Rei- henentwicklung gemäß Gleichung (4) vorhanden sind. In der Praxis wird die bei der Rekonstruktion erzielbare Auflösung jedoch oft durch das bei den hohen Objekt-Raumfrequenzen er- reichbare Signal-Rausch-Verhältnis begrenzt.

Das effektive Auftreten nieder-und höherfrequenter Komponen- ten des Beleuchtungsmusters im reziproken Raum ist in Figur 2 am Beispiel der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt. Wird das Objekt mit einer genügend hohen Beleuchtungsintensität be- strahlt, so ergibt sich eine nicht-lineare Abhängigkeit der Fluoreszenzemission von der Anregungsintensität (Sättigung der Fluoreszenz) und damit ein Muster der Anregbarkeit von Fluoreszenz (im Folgenden : Anregungsmuster) eines bestimmten Farbstoffes, das grundsätzlich aus unendlich vielen (virtuel- len) Maxima im reziproken Raum besteht, deren absolute Höhe allerdings mit steigendem kschnell abnimmt. Wie oben am Beispiel der relativ schwachen Anregungsintensität (linearer Fall, Figur 1) erläutert, ist die Objektfunktion an jede der Komponenten der Beleuchtungsfunktion gekoppelt. In einem als Teilbild Iem aufgenommenem Detektorsignal sind also alle In- formationen, insbesondere über die interessierenden hochfre- quenten Ortsfrequenzen der Objektfunktion enthalten. Die Rückgewinnung dieser Informationen wird unten in Zusammenhang mit der Bildrekonstruktion beschrieben.

Figur 2 illustriert die Struktur der Anregungsverteilung im reziproken Raum bei einem nicht-linear verzerrten Anregungs- muster. Zu dem virtuellen Maximum n = +2 entsprechend 2kb ist eine gekoppelte Struktur der Fouriertransformierten der Ob- jektfunktion eingezeichnet (Obj+2 (k)). Praktisch ist Obj (k) wie- derum an jedes Maximum gekoppelt (aus Übersichtlichkeitsgrün- den nicht dargestellt) und mit verschobenen, unterschiedlich intensiven und phasengedrehten Versionen von sich selbst überlagert. Nur der mittlere Teil an emittierten Raumfrequen- zen (Träger der OTF) ist der Detektion zugänglich.

Das Ziel der optischen Abbildung ist die Gewinnung einer Ob- jektabbildung, d. h. der das Objekt beschreibenden Funktion Obj (x). Diese Funktion muss aus den gemessenen Teilbildern Im rekonstruiert werden. Die Rekonstruktion der Objektabbildung basiert darauf, dass die Faktoren bi (x) aus den Teilbildern Im extrahiert werden oder unabhängig von der Bildaufnahme be- kannt sind. Die erfindungsgemäße Unterscheidung der Faktoren bi (x) von der das Objekt beschreibenden Funktion Obj (x) er- folgt, indem die Faktoren bi, d. h. die oft räumlich gemu- sterten Objektbedingungen, variiert werden.

Die Variation der Objektbedingungen kann auf verschiedene Ar- ten erfolgen. Eine erste Möglichkeit besteht darin, bi (x) als ein räumliches Muster auszubilden, das am Objekt zur Aufnahme verschiedener Teil-oder Einzelbilder jeweils verschoben wird. Alternativ ist es aber auch möglich, die Stärke des Mu- sters (Kontrast der eingestellten Objektbedingungen am gesam- ten Objekt) oder die Form des Musters jeweils für die Aufnah- me von Teilbildern zu verändern. In jeden Falle werden die in der Entwicklung gemäß Gleichung (4) gezeigten Komponenten un- terscheidbar.

Die Bilderfassung des erfindungsgemäßen Erfahrens basiert auf der Aufnahme von mindestens zwei Teilbildern mit verschiede- nen Objektbedingungen, unter denen die Faktoren bi (x), mit denen die erfasste Lichtintensität in nicht-linearem Zusam- menhang steht, variiert werden. Die Rekonstruktion der Ob- jektabbildung aus den Teilbildern wird im Folgenden erläu- tert.

Rekonstruktion der Objektabbildung Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die in der Taylor-Entwicklung gemäß Gleichung (4) enthaltenen Terme, soweit sie einen messbaren Einfluss besitzen, durch das Lösen eines Gleichungssystems ermittelt und so voneinan- der getrennt. Das Gleichungssystem, dessen Ermittlung unten im Einzelnen erläutert ist, lässt sich trotz der Multiplika- tion mit der OTF an jedem Punkt im Bereich des Trägers der OTF im reziproken Raum bestimmen und im Prinzip lösen. Durch Verschiebung in Fourierraum (oder durch Multiplikation mit exp (iOkx) im Ortsraum, Ak : Frequenzraum-Verschiebevektor) können die individuellen Komponenten dann so zusammengesetzt werden, dass sich ein hochauflösendes Bild ergibt. Dieses kann ggf. mit weiteren Dekonvolutionstechniken verarbeitet werden, um die Bildqualität weiter zu steigern.

Wie schon aus US-A-5 671 085 bekannt ist, ergibt die Beleuch- tung des Objekts mit einem Muster aus möglichst hohen Raum- frequenzen eine Auflösungserhöhung gegenüber der herkömmli- chen Lichtmikroskopie. Durch die erfindungsgemäße Ausnutzung eines nicht-linearen Zusammenhangs zwischen der Stärke eines Musters, z. B. Werten bestimmter Objektbedingungen, an einem Objektpunkt und der von diesem Objektpunkt ausgehenden (emit- tierten bzw. gestreuten) Lichtintensität ist es möglich, ein Bild mit einer noch höheren Ortsauflösung zu berechnen.

Ein Beispiel für die Bildung eines Musters von Objektbedin- gungen ist bei der Anregung von Fluoreszenz mit einer ortsab- hängigen Verteilung intensiven Anregungslichts gegeben. Die nicht-lineare Abhängigkeit des vom Detektor erfassten Lichts kann z. B. durch die Sättigung der Anregung von im Objekt vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffen entstehen. Besitzt das An- regungslicht eine genügend hohe Intensität, so erhält man ei- ne nicht-linearen Zusammenhang zwischen der eingestrahlten und der emittierten Lichtintensität am betrachteten Objekt (siehe z. B. D. R. Sandison et al. in"Handbook of Biological Confocal Microscopy", Plenum Press, New York and London, 2.

Auflage, 1995, Kapitel 3, Seiten 47 bis 50 ; und R. Y. Tsien et al. im genannten"Handbook of Biological Confocal Microsco- py", Kapitel 16). Das detektierte Licht enthält nun auch In- formationen über Raumfrequenzen des Objekts, die sonst nicht zugänglich wären. Allerdings enthält jedes so aufgenommene Bild eine Mischung von Anteilen hoher Raumfrequenzen, die aber dann durch Aufnahme unter unterschiedlichen Bedingungen und Verrechnung mehrerer Teilbilder getrennt und zu einem konsistenten, hochauflösenden Bild zusammengesetzt werden können.

Das Gleichungssystem zur Trennung der Komponenten der Taylor- Entwicklung gemäß Gleichung (4) wird bspw. im Fall der Fluo- reszenzmikroskopie bei Beleuchtung mit einer einem Liniengit- ter ähnlichen Struktur mit den folgenden Schritten ermittelt.

Die Intensitätsverteilung des Anregungslichts wird bei diesem Beispiel annähernd durch eine in den positiven Bereich ver- schobene Sinusfunktion beschrieben. Als Fouriertransformierte ergeben sich im Idealfall punktförmige Maxima bei k =0, k = + kb und k =-kb (siehe Figur 1). Diese Maxima be- sitzen je nach Modulationsgrad eine bestimmte Energie und ei- nen bestimmten Phasenwinkel in der komplexen Ebene, der von der Position bzw. der Verschiebung (Lage) des Musters des An- regungslichts abhängt. Durch den Einfluss der nicht-linearen Abhängigkeit der Fluoreszenzemission von der Anregungsinten- sität (Sättigung der Fluoreszenz) ergibt sich das in Figur 2 gezeigte Muster mit nieder-und höherfrequenten Komponenten im reziproken Raum, bspw. als Anregbarkeitsmuster für einen bestimmten Fluorophortyp.

Zur Rekonstruktion der Objektbildung genügt es, dass nähe- rungsweise bei einem endlichen Raumfrequenzwert kmaX =-mkb abgebrochen wird und in der Rechnung nur Maxima mit kleineren Raumfrequenzen berücksichtigt werden.

Wird das Anregungslichtmuster gegenüber dem Objekt verscho- ben, so ändern sich die jeweiligen komplexen Phasenlagen der einzelnen punktförmigen Maxima im Fourieraum. Berücksichtigt man m Anregungs-Maxima und das Maximum bei k=0, so benö- tigt man Z = 2m + 1 unter verschiedenen Bedingungen aufgenom- mene Bilder, um die einzelnen durch das Mikroskop abgebilde- ten Komponenten des Objekts, die mit dem jeweiligen Maximum gefaltet (also verschoben) sind, separieren zu können (in Fi- gur 2 ist nur eine Komponente dargestellt). Es kann z. B. vorgesehen sein, dass Z = 5 Maxima berücksichtigt werden. Der Phasenwinkel der Maxima im Frequenzraum des Anregungsmusters bewegt sich bei Verschiebung des Musters proportional zu da eine Verschiebung im Raum um Ax einer Multiplikati- on im Frequenzraum mit exp (ikAx) entspricht. Dabei entspricht n der Nummer des jeweiligen Raumfrequenzanteils (siehe Figur 2). Werden also verschiedene Bilder (Teilbilder) In (k) = F (In (x)) des Objekts mit jeweils um ein Fünftel des Grundmusters ge- geneinander verschobener Phasenlage des Beleuchtungsmusters (also auch des Anregungsmusters) aufgenommen, so ergibt sich das folgende Gleichungssystem : rob :. (k) ri Obj (k) I, (k) Obj+ lk M Ob j l (k) = const I2 (k) Ob j+2 (k) I3 (k) °bi-2 (k I4 (k) In diesem Gleichungssystem bezeichnen die Objn (k) die zum n.

Maximum des Anregungsmuster gehörenden, verschobenen kom- plexwertigen Komponenten des fouriertransformierten Objekts (Objekt-Raumfrequenz), die dann durch die OTF des abbildenden Systems transmittiert werden.

Die Lösung des Gleichungssystems liefert die individuellen Objektkomponenten, die zum jeweiligen Maximum des Anregungs- musters gehören. Die Lösung kann z. B. durch Invertieren der Matrix M erfolgen. Durch Multiplikation der inversen Matrix (M-1) mit dem rechts stehenden Vektor der gemessenen Intensi- täten In (k) werden die individuellen transmittierenden Objekt- komponenten ermittelt. Liegen mehr Messdaten vor als zur Lö- sung der Rekonstruktionsaufgabe nötig sind, so kann z. B. ei- ne analoge, nicht quadratische oder rechteckige Matrix aufge- stellt werden. Für die Berechnung der Lösung ist dann z. B. das Verfahren der pseudoinversen Matrix anwendbar, das es er- laubt, eine Lösung im Sinne der kleinsten Fehlerquote zu er- mitteln.

Die Rechnung wird aufgrund der Linearität der Fouriertrans- formation vorzugsweise bildpunkt-oder pixelweise im Realraum ausgeführt.

Die komplexwertigen Komponenten Obj (k) können nun um den Vek- tor Ak im Fourieraum (oder durch die o. g. entsprechende Multiplikation im Realraum) verschoben werden, so dass die jeweilige Raumfrequenz k dort zu liegen kommt, wo sie bei musterfreier, gleichmäßiger Beleuchtung gemessen werden wür- de. Ak ist hier also-nkb.

In einem weiteren Schritt ist eine Korrektur der Komponenten Objn (k) in ihrer komplexen Phasenlage je nach gegenseitiger Phasenlage fn der Frequenzraum-Anregungsmaxima im Bild Io vorgesehen (Multiplikation mit exp (-ifn)) Anschließend wer- den die Komponenten Objn (k), ggf. durch eine gewichtete Addi- tion, zu einem konsistenten Bild (der gewünschten Objektab- bildung) vereinigt. Damit wird eine Ausdehnung des Trägers der Gesamt-OTF auf einen relativ zur linearen Abbildung deut- lich vergrößerten Bereich und damit eine Erhöhung des Auflö- sungsvermögens ermöglicht.

Die illustrierte Verschiebung von Raumfrequenzkomponenten kann in verschiedenen Raumrichtungen durchgeführt werden.

Dies kann nacheinander durch unterschiedliche Orientierung des Beleuchtungsmusters oder simultan durch Beleuchtung mit einer mehrdimensionalen Struktur erfolgen. Das Auflösungsver- mögen ist in ein, zwei oder drei Dimensionen vergrößerbar.

Die Gesamttransferfunktion kann im Anschluss daran oder bei Zwischenschritten noch durch entsprechendes Filtern und/oder Anwenden von an sich bekannten Entfaltungstechniken verändert werden.

Die Rekonstruktion der Objektabbildung ist nicht auf die be- schriebene Lösung des Gleichungssystems mit der Matrix- Methode beschränkt. Alternativ können z. B. Quadratur- Techniken (analog zu WO 98/45745) oder algebraische bzw. ite- rative Rekonstruktionsverfahren (Maximum Likelihood/Expecta- tion Maximization, Maximum Entropie, Algebraic Reconstruction und dergleichen) verwendet werden.

Die Erfindung ist nicht auf die nicht-lineare Anregung von Fluoreszenzemission beschränkt. Die Verfahrensweise ist ent- sprechend auch mit beliebig anderen Faktoren bi implementier- bar, die geeignet sind, allein für sich oder im Zusammenwir- ken untereinander, insbesondere im Zusammenwirken mit der Be- leuchtungsintensität, die Intensität des vom Objekt ausgehen- den Lichts zu beeinflussen.

Ausführungsbeispiele erfindungsgemäßer optischer Systeme Ein erfindungsgemäßes optisches System ist in Figur 3 darge- stellt. Die an sich bekannten Komponenten eines herkömmlichen Mikroskops sind mit gestrichelten Rahmen eingezeichnet. Das optische System 100 ist mit einer Beleuchtungseinrichtung 10, mindestens einem Mustergenerator einer Be- leuchtungsoptik 30, einer Abbildungsoptik 50, einer Detek- toreinrichtung 60 und einem Bildgenerator 70 aufgebaut. Das Bezugszeichen 40 bezieht sich auf die mit dem System 100 zu untersuchende Probe. Die Komponenten 10,30,50 und 60 können durch optische Bauteile bereitgestellt werden, wie sie aus der Lichtmikroskopie und aus der optischen Mess-und Analyse- technik, z. B. der Spektroskopie, bekannt sind. Anwendungsab- hängig können die Komponenten 30 und/oder 50 entfallen oder durch ein gemeinsames Bauteil gebildet werden. Es kann auch vorgesehen sein, dass die Komponenten 20 und 30 durch ein ge- meinsames optisches Bauteil gebildet werden.

Der Mustergenerator 20,20 und/oder 20 ist allgemein eine Einrichtung zur Bildung von Objektbedingungen mit einem vor- bestimmten räumlichen Muster am Objekt 40. Anwendungsabhängig kann der Mustergenerator 20 eine Maske mit einer bestimmten ein-oder zweidimensionalen Übertragungscharakteristik ent- sprechend dem gewünschten Muster sein. Die Maske kann insbe- sondere durch ein Beugungsgitter (siehe Figur 4) (oder Pha- sengitter) oder eine Matrixanordnung aus einzeln ansteuerba- ren Reflektor-oder Transmissionspixeln gebildet werden. Im letzteren Fall werden DMD-Einrichtungen ("Digital Mirror De- vice") bzw. LCD-Matrixanordnungen verwendet. Der Mustergene- rator kann auch eine Spiegelanordnung zur Erzeugung eines In- terferenzmusters (siehe Figur 5) oder eine Einrichtung zur unmittelbaren physikalischen oder chemischen Beeinflussung des Objekts 40 (z. B. eine Heizeinrichtung oder einen Ultra- schallgeber) umfassen. Abweichend von der Komponente 20 in Figur 3 kann der Mustergenerator auch zwischen der Beleuch- tungsoptik 30 und dem Objekt 40 (Komponente 20) oder unmit- telbar am Objekt 40 vorgesehen sein (Komponente 20).

Der Bildgenerator enthält eine Einrichtung zur Rekonstruktion der Objektabbildung entsprechend den oben erläuterten Prinzi- pien. Als Bildgenerator kann ein speziell ausgelegter Schalt- kreis oder auch ein entsprechend programmierter Computer ver- wendet werden. Der Bildgenerator kann zusätzlich Speicher-, Steuer-und/oder Anzeigekomponenten enthalten.

Figur 4 zeigt Einzelheiten eines erfindungsgemäßen optischen Systems am Beispiel eines Epifluoreszenzmikroskops 100. Die Beleuchtungseinrichtung 10 wird durch eine intensive Licht- quelle gebildet. Da zur Ausnutzung nicht-linearer Effekte ho- he Lichtintensitäten benötigt werden, wird vorzugsweise eine gepulste Lichtquelle, wie z. B. ein Pulslaser oder eine Blitzlampe verwendet. Die Beleuchtungseinrichtung kann aber auch durch eine Hochdruckdampflampe (z. B. Quecksilber- dampflampe) gebildet werden. Als Mustergenerator 20 (Maske) ist beispielhaft ein verstellbares und ggf. drehbares und/oder verschiebbares Beugungsgitter 22 vorgesehen, das entsprechend der Position 21 der Bildfeldblende in einer kon- jugierten Objektebene angeordnet ist. Das Beugungsgitter 22 ist ein Transmissionsgitter mit einem Gitterabstand von z. B.

30 um. Das Beugungsgitter 22 ist an einem (nicht dargestell- ten) Stellantrieb angeordnet.

Die Beleuchtungsoptik 30 weist einen Anregungsfilter 31, ei- nen dichroitischen Spiegel 32 zum Einkoppeln des Anregungs- lichts in eine Mikroskopsäule und Objektivlinsen 33. Am Ort des Objekts 40 wird ein Bild des Beugungsgitters 22 als Be- leuchtung für die zu untersuchende Probe in der entsprechen- den Fokusebene gebildet. Die Abbildungsoptik 50 wird wiederum durch die Objektvlinsen 33, einen Emissionsfilter 51 und ei- ner optional vorgesehenen Optik 52 zur Bildvergrößerung ge- bildet. Die Detektoreinrichtung 60 ist ein CCD-Detektor, von dem auf den (nicht dargestellten) Bildgenerator Daten über- tragen werden.

Beim Aufbau gemäß Figur 4 kann das Beugungsgitter 22 durch eine DMD-Einrichtung oder eine LCD-Matrixanordnung ersetzt werden, die im Lichtweg zwischen der Beleuchtungseinrichtung 10 und dem Objekt 40 angeordnet ist. In diesem Fall ist zwi- schen den Komponenten 20 und 40 eine zusätzliche Verkleine- rungsoptik vorgesehen. Eine DMD-Einrichtung umfaßt z. B. rd.

450 600 Reflektorelemente mit einer Pixelgröße von rd.

17 17 um2.

Für die erfindungsgemäße Aufnahme mehrerer Teilbilder mit un- terschiedlichen Phasenlagen wird das Beugungsgitter 22 in kleinen Schritten gegenüber dem Objekt 40 verschoben. Die Schrittweite ist von der Strukturdimension der Maske und der Zahl der aufzunehmenden Teilbilder abhängig und beträgt z. B. bei 30 um Strukturdimension und 7 Teilbildern 30/7 um). Al- ternativ kann auch bei einem feststehenden Beugungsgitter 22 eine Verschiebung des Objekts 40 vorgesehen sein, wobei dies jedoch zusätzliche Schritte der Bildkorrektur bei der Rekon- struktion der Objektabbildung erfordert. Alternativ ist es auch möglich, die Phase der verschiedenen Beugungsmaxima di- rekt durch geeignete optische Elemente zu beeinflussen. Die minimale Anzahl der für die Rekonstruktion des Gesamtbildes notwendigen Aufnahmen von Teilbildern ergibt sich durch die Anzahl der Unbekannten des zugehörigen Gleichungssystems (siehe oben). Es sind mindestens zwei Teilbildaufnahmen vor- gesehen.

Um die Auflösung in allen Raumrichtungen zur erhöhen, wird das Objekt 40 mit Mustern unter verschiedenen Winkeln nach- einander oder mit einer Maske wie bspw. mit der DMD-oder LCD-Einrichtung mit einem zweidimensionalen Muster, das Beu- gungsmaxima in mehreren Richtungen der Ebene hervorruft, in verschiedenen Phasenlagen in jeder Dimension beleuchtet.

Durch Erstellen von Fokusserien kann man noch zusätzliche In- formationen über die axiale Struktur des Objekts gewinnen und damit dreidimensionale Objektabbildungen ableiten. Dies wird einerseits durch die inkohärente Lichtquelle und andererseits durch das Vorhandensein der Nullpunkt-Beugungsordnung des Gitters noch zusätzlich erleichtert. Ein weiterer Auflösungs- gewinn kann durch Drehen des Objekts um eine auf der opti- schen Achse senkrecht stehende Achse unter dem optischen Sy- stem erreicht werden.

Das Objekt 40 wird mit derart Momentanintensitäten beleuchtet bzw. angeregt, dass die Farbstoffe in der Probe gesättigt werden, so dass sich die gewünschten nicht-linearen Effekte zur Erhöhung des Auflösungsvermögens ergeben. Die gesuchten Anteile der sich überlagernden individuellen Ordnungen können aus den Bildern bei verschiedenen Phasenlagen der Anregungs- struktur errechnet werden. Es ist auch möglich, aus Aufnahmen von Teilbildern mit verschiedener Beleuchtungsintensität hoch auflösende Bilder zu rekonstruieren. Unterdrückt man (z. B. durch Ausblenden) die Nullpunkt-Beugungsordnung des Beugungs- gitters 21, so erhöht man damit in vorteilhafter Weise den Modulationsgrad der Beleuchtungsfunktion und damit die rela- tive Intensität in höheren Anregungsordnungen. Außerdem kann die Energie in höhere Raumfrequenzbereiche geschoben werden.

Bei dem abgewandelten Aufbau eines Epifluoreszenzmikroskops 100 gemäß Figur 5 wird die Probe (das Objekt) 40 mit Laser- licht beleuchtet. Die Lichtquelle 10 ist vorzugsweise ein Pulslaser (z. B. mit einem optisch-parametrischen Oszillator, der mit einem frequenzverdreifachten NdYAG-Laser gepumpt ist, oder mit einem Ti-Saphir-Laser), kann aber auch durch eine andere genügend intensive Lichtquelle gebildet werden. Der Mustergenerator 20 wird durch eine Gruppe ebener Spiegel 23- 27 gebildet, die dazu eingerichtet sind, das Anregungslicht von der Lichtquelle 10 auf verschiedene Strahlengänge zu zer- legen, die aus verschiedenen Richtungen auf das Objekt 40 treffen. Das Anregungslicht wird mit dem teildurchlässigen Spiegel 23 und die voll reflektierenden Spiegel 25-27 von zwei entgegengesetzten Seiten auf das Objekt 40 gerichtet.

Optional kann der zweite teildurchlässige Spiegel 24 vorgese- hen sein, um einen dritten Anregungslichtweg zum Objekt 40 zu bilden. Es ergeben sich drei miteinander interferierende An- regungs-Lichtstrahlen, die eine Verwendung des Mikroskops 100 in der höchstauflösenden 3D-Mikroskopie erlauben. Für zweidi- mensionale Anwendungen kann auf den Spiegel 24 verzichtet werden. Die Strahlen interferieren über einen Bereich der in der Größenordnung der Kohärenzlänge der Lichtquelle 10 liegt.

Zur Veränderung der Objektbedingungen (Interferenzmuster am Objekt 40) zur Aufnahme verschiedener Teilbilder sind minde- stens zwei Spiegel verschiebbar angeordnet. Bspw. ist vorge- sehen, dass die Spiegel 24 und 25 zur Änderung des Interfe- renzmusters verschiebbar sind. Alternativ ist zur Veränderung der Objektbedingungen mindestens ein elektrooptisches Element zur Änderung der Phasenlage des Beleuchtungslichts in einem der Teil-Lichtwege vorgesehen.

Die Beleuchtungsoptik 30 ist in Figur 5 aus Übersichtlich- keitsgründen nicht dargestellt, kann aber ggf. bauformabhän- gig ohnehin weggelassen werden. Die Abbildungsoptik 50 um- fasst die Objektivlinsen 53, den Emissionsfilter zur Absorp- tion des Anregungslichts 51 und optional eine Optik 52 zur Bildvergrößerung. Als Detektor ist wiederum ein CCD-Detektor 60 vorgesehen.

Um ein gute axiale Diskriminierung zu erhalten, kann das An- regungslicht zugleich noch aus einer oder mehreren Richtungen durch das (nicht dargestellte) Objektiv und/oder von der dem Objektiv abgewandten Seite auf das Objekt 40 fallen, das sich im Differenzbereich der Anregungslichtstrahlen (kreuz schraf- fierte Region) befindet. Die durch Nicht-Linearitäten erziel- bare zusätzlich Auflösungserhöhung kann wiederum durch Benut- zung entsprechend starker Laser bzw. gepulster Laser mit ho- hen Momentanintensitäten erreicht werden. Auch die Verwendung anderer intensiver Lichtquellen (z. B. Blitzlicht) ist mög- lich und ggf. vorteilhaft.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden meh- rere Teilbilder jeweils mit verschiedenen Interferenzmustern am Objekt 40 aufgenommen und nach den oben erläuterten Prin- zipien zur Gewinnung der Objektabbildung verarbeitet.

Die erläuterten Ausführungsbeispiele basieren auf der Ausnut- zung der nicht-linearen Abhängigkeit des erfassten Lichtes von der Intensität des Anregungslichts durch Sättigung von Fluoreszenzfarbstoffen. Alternative nicht-lineare Effekte sind durch die Sättigung der Absorption von Anregungslicht unter intensiver Beleuchtung, die Abhängigkeit der Phase des emittierten oder gestreuten Lichts von der im Objekt vorhan- denen Beleuchtungsintensität, die sich im Detektor (z. B. über Interferenz) oder vor diesem in einer nicht-linearen In- tensitätsabhängigkeit umsetzt, SHG-oder THG-Prozesse, eine Abhängigkeit der Lichteigenschaften der Ramanstreuung vom Wert einer oder mehrerer Objektbedingungen, zeitlich kohären- te Effekte (z. B. Rabi-Oszillationen) an Atomen oder Molekü- len im Objekt, CARS-Prozesse, Mehrphotonen-Absorptionen, sti- mulierte Emissionen im Objekt, die Besetzung langlebiger An- regungszustände oder chemisch veränderter Zustände in den Fluorophoren vor oder während der Beleuchtung, strahlungslose Energietranferprozesse und/oder physikalische oder chemische Objektbedingungen gegeben.

Insbesondere zur Ausnutzung zeitlich kohärenter Effekte (Ra- bi-Oszillationen) an Atomen oder Molekülen oder Fluorophoren im Objekt (in Lösung, in Festkörpern, in Gasen oder auch un- ter Vakuumbedingungen) werden vorzugsweise Beleuchtungsein- richtungen mit extrem kurzen Pulslängen (z. B. <100 fs) ver- wendet. Basiert der nicht-lineare Effekt auf der stimulierten Emission so wird diese gleichzeitig oder in zeitlicher Abfol- ge induziert. Die stimulierte Emission kann bei der selben Wellenlänge wie der des Anregungslichts oder auch bei anderen Wellenlängen, z. B. bei einer typischen Fluoreszenzwellenlän- ge, induziert werden. Die Ausnutzung von Energietransferpro- zessen bedeutet, dass Energie der Anregungsstrahlung stahlend oder strahlungslos von Fluorophoren auf benachbarte Fluoro- phor-Moleküle übertragen wird und dadurch eine multi-lineare Abhängigkeit der emittierten Lichtintensität von der am Nach- barort eingestrahlten Intensität entsteht.

Zu den physikalischen oder chemischen Änderungen der Objekt- bedingungen zählt insbesondere die Ausnutzung der nicht- linearen Abhängigkeit des von den Objektpunkten ausgehenden Lichts von einem räumlich inhomogenen elektrischen oder ma- gnetischen Feld oder vom am Objektpunkt herrschenden Druck, Scherkräften oder mechanischen Spannungsverhältnissen. Es kann auch ein am Objekt gebildeter Temperaturgradient ent- sprechend einem bestimmten Muster vorgesehen sein, der die gewünschte multi-lineare Abhängigkeit des vom Objektpunkt ausgehenden Lichts von der jeweils herrschenden Temperatur herstellt. Es kann auch eine multi-lineare Abhängigkeit des vom Objektpunkt ausgehenden Lichts von den dort herrschenden chemischen Bedingungen (z. B. pH-Wert) verwendet werden. Zu- sätzlich kann eine Objektbestrahlung mit Radiowellen, Mikro- wellen, Infrarotlicht, Röntgenstrahlung oder auch Schallwel- len oder Ultraschallwellen ausgenutzt werden.

Zur Realisierung der genannten Effekte ist der Mustergenera- tor entsprechend angepasst. Bspw. kann der Mustergenerator eine zusätzliche Bestrahlungseinrichtung umfassen, deren Emission auf das Objekt fokussiert ist.

Die Figuren 6 und 7 illustrieren Simulationsergebnisse zum Einsatz eines Fluoreszenzmikroskops gemäß Figur 4. Die Licht- intensität ist hier als Schwärzung dargestellt. Aus druck- technischen Gründen ist die Bildqualität eingeschränkt. Zur besseren Sichtbarmachung der Beleuchtung wurde im Objekt (Fi- gur 6a, 7a) eine konstante Hintergrundfluoreszenz angenommen.

Figur 6a zeigt das simulierte Objekt, dessen Beleuchtung mit dem beschriebenen Verfahren und Abbildung mit einem Epifluo- reszenzmikroskop simuliert wurde. Die Teilbilder b-h reprä- sentieren Simulationen von jeweils mit verschiedenen Phasen des beleuchtenden Streifenmusters aufgenommenen Teilbildern.

Figur 6i zeigt ein Beispiel, bei dem auch die Richtung des beleuchtenden Musters verändert wurde. Die Anregungsintensi- tät war bei diesen Simulationen um den Faktor 5 größer als die Sättigungsintensität. Die maximal erwartete Photonenzahl betrug 560 Photonen/Pixel in den Einzelbildern. Figur 7 zeigt die zugehörigen Rekonstruktionsergebnisse. Figur 7a wieder- holt das Originalbild der Simulation. Nach Faltung mit der Punktbildfunktion eines simulierten Mikroskops und einer Poisson-verteilten Verrauschung (Max = 560 Photonen) ergibt sich das Bild Figur 7b. Die erfindungsgemäße Rekonstruktion aus Teilbildern, die analog zu den Figuren 6b bis 6h mit Be- leuchtungsmustern unter 3 Drehwinkeln simuliert wurden, ist in Figur 7c gezeigt. Dabei ist keine Verstärkung hoher Raum- frequenzen vorgenommen wurden. Erfolgt zusätzlich die dem Sy- stem eigene Hochfrequenzverstärkung, so ergibt sich aus Figur 7c das Bild gemäß Figur 7e. Die Anwendung einer entsprechen- den Hochfrequenzverstärkung bei dem (konventionellen) Bild gemäß Figur 7b würde lediglich ein Bild mit gemäß Figur 7d ergeben. Der Vergleich der Bilder Figur 7e und Figur 7d zeigt die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens der Rekon- struktion hoher Raumfrequenzen aus der Aufnahme mehrerer Teilbilder. Figur 7f illustriert den zugehörigen simulierten Träger der mit dem Verfahren erreichten OTF bei einer berück- sichtigten Anzahl von Z=7 Maxima.

Figur 8 illustriert die Verbesserung des Auflösungsvermögens mit dem erfindungsgemäßen Verfahren. Es ist die Intensität auf einer Bezugslinie entlang der zweiten senkrechten Spalte in der Punktmatrix (links oben im Originalbild) in den Figu- ren 7d und 7e dargestellt. Die durchgezogene Linie entspricht dem Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Einzel- punkte sind deutlich als Maxima erkennbar. Mit dem herkömmli- chen Verfahren (Epifluoreszenz mit nachfolgender Hochfre- quenzverstärkung) ist nur der erste Punkt (teilweise) und ein Maximum zwischen den beiden untersten Punkten erkennbar. Bei der simulierten Abbildung eines Punktes ergibt sich eine Ver- besserung des Auflösungsvermögens um einen Faktor von mehr als 3.

Figur 9 zeigt einen lateralen Schnitt durch die simulierte effektive optische Transferfunktion des Gesamtsystems gemäß Figur 4. Der Gitterabstand des Beugungsgitters wurde hier so gewählt, dass nur die Beugungsordnungen 0, +1 und-1 des Beu- gungsgitters durch das Objektiv übertragen werden können.

Durch die teilweise Sättigung der beteiligten Farbstoffe er- gibt sich eine nicht-lineare Beziehung zwischen der Anre- gungsintensität und der Wahrscheinlichkeit der Anregung eines Farbstoffmoleküls an einem Punkt im Objektraum. Diese räum- lich variierende Anregungswahrscheinlichkeit wird auch als Anregungsmuster bezeichnet. Wenn man annimmt, dass die Anre- gungswahrscheinlichkeit für ein bestimmtes Farbstoffmolekül eine Funktion der Anregungsintensität ist, so führt eine Nicht-Linearität dieser Funktion dazu, dass im Emissionsmu- ster auch räumlich höhere Harmonische des Anregungsmusters auftreten. Maxima im reziproken Raum, die jenseits der durch die Abbe-Grenze gegebenen Raumfrequenzbegrenzung liegen, kön- nen dann im Anregungsmuster auftreten. Die raumfrequenzbe- grenzte Abbildung der Multiplikation der Farbstoffverteilung mit dem Anregungsmuster enthält nun Komponenten analog zu ei- ner linearen Anregung mit einem Muster, welches höhere Raum- frequenzen enthält.

In Figur 9 ist im Einzelnen zu erkennen, dass die Transfer- funktion bei einer herkömmlichen Abbildung mit einem Mikro- skopobjektiv (mit nachfolgender Anwendung einer Hochfrequenz- verstärkung) entsprechend der durchgezogenen Linie relativ schmal ist, wohingegen die Transferfunktion bei Anwendung der gesättigten Beleuchtung (mit einer Hochfrequenzverstärkung) erheblich erweitert wird (gestrichelt gezeichnet).

Figur 10 zeigt eine simulierte Anwendung des erfindungsgemä- ßen Verfahrens auf ein mittels Elektronenmikroskopie aufge- nommenes Schnittbild des Zellkerns einer embryonalen Bovin- Zelle. Figur 10a illustriert den invertierten elektronenmi- kroskopischen Ausschnitt nahe der Kernhülle mit der Kernma- trix ("Nuclear Matrix"). Die simulierte epifluoreszenz- mikroskopische Aufnahme mit Entfaltung ergibt das in Figur 10b gezeigt herkömmliche Bild. Bei Anwendung des erfindungs- gemäßen Verfahrens ergibt sich das in Figur 10c gezeigte Bild. Das mit der Methode der gesättigten lateralen Modulati- on aufgenommene und ausgewertete und anschließend entfaltete Bild (Maximum : 560 Photonen im Einzelbild) ist gegenüber dem herkömmlichen Bild deutlich verbessert und mit dem elektro- nenmikroskopischen Originalbild vergleichbar.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirkli- chung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.