Beschreibung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur optischen Abtastung einer Probe, mit einer Verstelleinheit sowie einer Abtasteinrichtung mit Optikeinheit und

10 Abtasteinheit, und mit einer Steueranlage, welche die Optikeinheit, die Abtasteinheit und die Verstelleinheit steuert, wonach die Probe mittels der von der Steueranlage beaufschlagten Verstelleinheit gegenüber der Abtasteinrichtung bewegt wird, oder umgekehrt, und wonach auf diese Weise mit der Abtasteinrichtung gewonnene Einzelbilder in der Steueranlage zu wenigstens

15 einem Gesamtbild zusammengesetzt werden.

Bei derartigen Verfahren wird eine Probe zumeist hinsichtlich ihrer Transmission untersucht, wenngleich grundsätzlich auch Reflexionsmessungen möglich sind und umfasst werden. Üblicherweise wird jedoch das Absorptions- 20 vermögen der Probe bei einem Durchscheinen mit einer (Weißlicht-)Quelle untersucht. Bei diesen Proben mag es sich um biologische Schnitte, Schnitte durch Werkstoffe etc. handeln.

Weil die Abtasteinrichtung immer nur einen bestimmten Ausschnitt der Probe 5 mit der gewünschten Auflösung erfassen kann, sorgt die Verstelleinheit dafür, dass das mit der Abtasteinheit der Abtasteinrichtung aufgenommene Einzelbild bzw. die mehreren Einzelbilder zumindest zu dem wenigstens einen Gesamtbild in der Steueranlage zusammengesetzt werden. Bei der Optikeinheit handelt es sich nicht einschränkend um ein oder mehrere Mikroskopobjektive, während die 30 Abtasteinheit bzw. Aufzeichnungseinheit als beispielsweise CCD-Chip (CCD = Charge coupled device) ausgeführt ist. Die Optikeinheit bzw. der CCD-Chip befindet sich regelmäßig in der Bildebene des jeweiligen Mikroskopobjektives, um das Einzelbild aufzunehmen und an die Steueranlage zu übergeben. Die Steueranlage liest die Aufzeichnungseinheit aus, speichert

das jeweilige Einzelbild ab und setzt die abgespeicherten Einzelbilder zu dem Gesamtbild oder zu mehreren Gesamtbildern zusammen.

Bei dem gattungsbildenden Stand der Technik, wie er beispielhaft in der US-PS 4 760 385 beschrieben wird, findet eine automatische Fokussierung der Optikeinheit statt, ohne dass nähere Einzelheiten behandelt werden. Diese pauschalierte Vorgehensweise ist mit mehreren Nachteilen verbunden. So dauert die automatische Fokussierung - wenn sie für jedes Einzelbild des Gesamtbildes vorgenommen wird - relativ lange. Das führt zu unvertretbaren Bearbeitungsdauern. Auch kann in den Prozess manuell praktisch nicht eingegriffen werden. D. h., der Bedienerwunsch nach Fokussierung ausgewählter Einzelbilder lässt sich praktisch nicht umsetzen.

Im Rahmen der US 6,620,591 B1 wird ein optisches System für eine zeilbasierte Abtastung vorgestellt. Zu diesem Zweck beinhalten die Zellen fluoreszierende Moleküle in einem Lokalisierungsbereich und werden mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskopes erfasst.

Die US-PS 5,526,258 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung mit deren Hilfe ein Zellhaufen abgebildet wird und einzelne Objekte eine Auswahl erfahren. Die einzelnen Zellobjekte können klassifiziert werden.

Schließlich ist es durch die US 5,023,917 bekannt, metallisierte Bereiche auf einem Substrat zu untersuchen. Diese Bereiche werden mit einem Vorbildmuster verglichen.

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein Verfahren der eingangs beschriebenen Ausgestaltung so weiterzuentwickeln, dass die Bearbeitungsgeschwindigkeit gesteigert ist und Bedienerwünsche problemlos berücksichtigt werden können. Außerdem soll eine besonders geeignete Vorrichtung geschaffen werden.

Zur Lösung dieser technischen Problemstellung ist ein gattungsgemäßes Verfahren im Rahmen der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass das jeweils erfasste Einzelbild mittels einer adaptiven, also anpassungsfähigen, Sensoreinheit hinsichtlich seines Kontrastes ganz oder teilweise ausgewertet wird, wobei die dadurch gewonnenen Kontrastwerte die Funktionsweise der gesamten Anlage beeinflussen.

Tatsächlich werden die Kontrastwerte jedes aufgenommenen Einzelbildes in einer adaptiven Sensoreinheit ausgewertet. In Abhängigkeit von den Kontrastwerten und ggf. weiteren Parametern, wie der Vergrößerung, der Tiefenschärfe der Optikeinheit bzw. des jeweils ausgewählten Bildes, dem gewünschten Bildausschnitt, der Auflösung der Aufzeichnungseinheit etc. wird die Anlage gesteuert. Dabei passt sich die gesamte Anlage an die oben angegebenen Vorgaben (insbesondere die Kontrastwerte, die Vergrößerung, die Tiefenschärfe usw.) an, ist also adaptiv gestaltet.

Im Detail hängt von den gewonnenen Kontrastwerten und den ggf. weiteren Parametern die Bewegung der Optikeinheit und/oder die Bewegung der Verstelleinheit mittels jeweils der Steueranlage ab. Alternativ oder zusätzlich beeinflussen die Kontrastwerte auch die von der Steueranlage aus der Abtasteinheit der Abtasteinrichtung ausgelesenen Werte. Hierbei geht die Erfindung zunächst einmal von der Erkenntnis aus, dass die Kontrastauswertung der Einzelbilder - ob nun diese Kontrastauswertung sektionsweise oder insgesamt je Einzelbild erfolgt - für die Fokussierung der Optikeinheit von entscheidender Bedeutung ist. Denn sowohl der Mittelwert für die Helligkeit als auch die mittlere quadratische Abweichung liefern Informationen über den Kontrast. Je größer die mittlere quadratische Abweichung einzelner Grauwerte Gι,j vom Mittelwert μc des Grauwertes ist, umso größer ist der Kontrast im jeweiligen Einzelbild.

Tatsächlich berechnet sich der Mittelwert μo von einem Einzelbild bzw. Graubild G mit Z-Zeilen und S-Spalten wie folgt:

1 Z-I 5-1

O - C _{l=o J=o}

Dabei gibt der Wert jeweils den Grauwert an der Position i, j im zweidimensionalen Pixelbild wieder. Anhand des vorgenannten Mittelwertes μ _G nach Gleichung φ kann nun die mittlere quadratische Abweichung eines Bildes nach der Formel

- ^~

berechnet werden. Dieser Vorgang muss bei mehrkanaligen Bildern, z. B. Farbbildern, natürlich für jeden Kanal (rot, grün, blau) getrennt durchgeführt werden. Jedenfalls lässt sich entsprechend der Gleichung © für jedes Einzelbild eine mittlere quadratische Abweichung σ _G angeben. Je größer der Wert σ _G ist, umso kontrastreicher ist das Bild gestaltet. Wenn man nun jeweils Einzelbildstapel an jeder Position oder an ausgewählten Positionen der Verstelleinheit erfasst, d. h. zu unterschiedlichen Fokussierungen gehörige Einzelbilder, so kann mit Hilfe der Gleichung φ bzw. unter Rückgriff auf die mittlere quadratische Abweichung σ _G das kontrastreichste Einzelbild des Einzelbildstapels ausgewählt werden und beispielsweise die Basis für das anschließend in der Steueranlage Zusammengesetze Gesamtbild formen.

Anstelle auf das Originalbild bzw. Einzelbild oder Graubild G zurückzugreifen, kann auch ein Gradientenbild erzeugt werden, um den Kontrast zu bestimmen bzw. zugehörige Kontrastwerte zu erzeugen und die Fokussierung der Optik- einheit vorzunehmen. Das Gradientenbild wird dabei so ermittelt, dass - ausgehend von einem Grauwert Gy - die jeweilige Differenz zu den Nachbarpixeln bestimmt, ggf. gemittelt und als neuer Wert Gi _j hinterlegt wird. Beispielsweise verfügt der Grauwert Gι,j über insgesamt vier Nachbargrauwerte Gj+i,j, Gn ₁ J; Gj, _j +i und GjJ-I Dabei werden nun die einzelnen Differenzen zu dem Grauwert Gj _j berechnet und gemittelt. Der Mittelwert bzw. Gradientenwert wird als neuer

Grauwert G,, _j hinterlegt und den vorerwähnten Rechenprozeduren zur Kontrastauswertung unterworfen.

In jedem Fall umgeht das solchermaßen erzeugte Gradientenbild die sogenannte Shadingproblematik, die sowohl in fokussierten wie unfokussierten Bildern auftritt. Hiermit ist gemeint, dass die üblicherweise durch Transmissionsmessungen erhaltenen Einzelbilder - systembedingt - keiner gleichmäßigen Bildausleuchtung durch die an dieser Stelle in der Regel eingesetzte Weißlichtquelle unterzogen werden. Dabei führt eine unterschiedliche, nicht gleichmäßige Bildausleuchtung dazu, dass ein Grauwerthistogramm beispielsweise mit einem durch das Shadingverhalten verursachten Sockel oder zusätzlichen Maxima ausgerüstet ist. Das lässt sich durch das Gradientenbild vermeiden bzw. beherrschen.

Außerdem kann aus einem Grauwerthistogramm des Gradientenbildes auf den Fokus ergänzend oder alternativ zu der zuvor beschriebenen Methode rückgeschlossen werden. Denn wenn das betreffende Grauwerthistogramm des Gradientenbildes flach ist, also über keinen ausgeprägten Sockel verfügt, befindet man sich in der Regel im Fokus. Ebenfalls kann das Ansteigen der Lichtintensität für das Erreichen des Fokus ausgewertet werden.

Im Übrigen hat es sich bewährt, wenn die Optikeinheit mittels der Steueranlage und/oder manuell fokussiert wird, wobei die Fokussiergeschwindigkeit in Abhängigkeit von den Kontrastwerten des jeweils aufgenommenen Einzelbildes von der Steueranlage vorgegeben und ggf. variiert wird. D. h., die Fokussiergeschwindigkeit ist eine Funktion des jeweiligen Fokuswertes bzw. Kontrastwertes. Außerdem hängt die Fokussiergeschwindigkeit meistens noch von den zuvor angegebenen Parametern ab. Dabei wird man in der Regel mit großen Fokussiergeschwindigkeiten für die Optikeinheit arbeiten, solange der Kontrast von Einzelbild zu Einzelbild deutlich ansteigt. Sobald dieser Anstieg des Kontrastes bzw. die Werte für die quadratische Abweichung jedoch eine nicht mehr so starke Steigung annehmen, gelangt man in den Bereich des

maximalen Kontrastes und damit der größtmöglichen Schärfe. In Abhängigkeit davon wird nun die Fokussiergeschwindigkeit verringert.

Dabei kann die Richtung der Fokussiergeschwindigkeit der Optikeinheit ggf. auch umgekehrt werden, wenn der Punkt größtmöglicher Schärfe bereits überschritten wurde. Dazu lässt sich der Kontrast in Abhängigkeit von der Fokussierung bzw. Verstellung in Z-Richtung der Optikeinheit auswerten bzw. dessen Verlauf aufnehmen und analysieren.

Jedes oder ausgewählte Einzelbilder des Einzelbildstapels können ggf. sektionsweise hinsichtlich ihres Kontrastes untersucht werden. Dabei werden die jeweils kontrastreichsten Sektionen und/oder Einzelbilder zu dem aus den kontrastreichsten Sektionen kombinierten Einzelbild respektive Gesamtbild zusammengesetzt. D. h., es ist möglich, bei einem Einzelbildstapel jedes Einzelbild in praktisch mehrere Sektionen zu unterteilen und von jedem Einzelbild die jeweils kontrastreichste Sektion auszuwählen. Wenn man diesen Vorgang für jedes Einzelbild des Einzelbildstapels fortführt, kann ein aus einzelnen besonders kontrastreichen Sektionen bzw. Pixelumgebungen oder (Pixel-)Clustern zusammengesetztes Einzelbild in der Steueranlage erzeugt und abgelegt werden.

Ähnlich mag bei der Herstellung des Gesamtbildes vorgegangen werden. Auch hier ist es denkbar, das jeweils kontrastreichste Einzelbild aus dem jeweiligen Einzelbildstapel auszuwählen und dann die Einzelbilder zu dem Gesamtbild zusammenzusetzen. Selbstverständlich kann diesem Vorgang die zuvor beschriebene Vorgehensweise vorgeschaltet werden, d. h., dass aus dem Einzelbildstapel die kontrastreichsten Sektionen ausgewählt und zu dem resultierenden Einzelbild zusammengesetzt werden und erst dann die Einzelbilder zu dem Gesamtbild kombiniert werden.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung zur optischen Abtastung einer Probe, die sich insbesondere aber nicht einschränkend zur Durchführung

des beschriebenen Verfahrens eignet. Vorteilhafte Ausgestaltungen dieser Vorrichtung sind in den Ansprüchen 9 und 10 beschrieben.

Im Ergebnis werden ein Verfahren sowie eine Vorrichtung vorgestellt, die es ermöglichen, die Abtastgeschwindigkeit deutlich zu erhöhen. Das lässt sich im Kern darauf zurückführen, dass bei der automatischen oder manuellen Fokussierung jedes Einzelbildes nicht mit einer fest vorgegebenen Fokussiergeschwindigkeit gearbeitet wird, sondern diese Fokussierge- schwindigkeit von dem jeweiligen Kontrast bzw. den aufgenommenen Kontrastwerten und weiteren Parametern abhängt. In Abhängigkeit von den Kontrastwerten wird regelmäßig die Fokussiergeschwindigkeit der Optikeinheit - ausgehend von einem vorgegebenen (Maximal-)Wert - verringert, um den Bereich maximaler Schärfe einwandfrei aufnehmen zu können. Gleichzeitig wird die Fokussiergeschwindigkeit im Allgemeinen verringert, wenn beispielsweise mit einer stärkeren Vergrößerung gearbeitet wird. Ähnliches gilt, wenn die Auflösung eine Steigerung erfährt.

Im Übrigen wird die Fokussiergeschwindigkeit an die Tiefenschärfe angepasst. Die Tiefenschärfe bezeichnet bekanntermaßen die Ausdehnung einer Raum- zone vor der Optikeinheit bzw. dem an dieser Stelle eingesetzten Objektiv, die von diesem (gerade noch) scharf abgebildet wird. Mit zunehmender Aufnahmeentfernung und Abblendung bzw. geringerer Blende nimmt die Tiefenschärfe zu, mit wachsender Objektnähe dagegen ab. Kurzbrennweitige Objektive gewähren eine größere Tiefenschärfe. Tatsächlich ist die Tiefenschärfe umge- kehrt proportional zum Quadrat der nummerischen Apertur des zugehörigen Objektives. Folglich ist auch die Fokussiergeschwindigkeit (in Z-Richtung) ebenfalls eine Funktion der nummerischen Apertur, hängt also wie die Tiefenschärfe umgekehrt proportional von dem Quadrat der nummerischen Apertur ab.

Ferner beeinflusst die Bildfeldgröße des verwendeten Objektivs bzw. dessen Feldwinkel, also letztlich die Vergrößerung, die Fokussiergeschwindigkeit.

Sämtliche vorerwähnten Größen, also die Auflösung der Abtasteinheit, die Vergrößerung der Optikeinheit, die nummerische Apertur der Optikeinheit, der Kontrast bzw. Kontrastwert des jeweils aufgenommenen Einzelbildes etc. werden von einem adaptiven Sensor als Parameter ausgewertet und geben die Fokussiergeschwindigkeit vor.

Zusätzlich kann der adaptive Sensor in Abhängigkeit von den vorerwähnten Parametern, insbesondere in Abhängigkeit von der Bildfeldgröße bzw. dem Feldwinkel des jeweils eingesetzten Objektives nicht nur die Fokussierge- schwindigkeit vorgeben, sondern auch eine Stellgeschwindigkeit für die Verstelleinheit bzw. die an dieser Stelle realisierten ein oder mehreren Stellvorrichtungen. So wird man bei einem Einsatz eines Objektives mit kleiner Bildfeldgröße bzw. kleinem Feldwinkel, beispielsweise einem Teleobjektiv, mit geringen Stellgeschwindigkeiten für die Verstelleinheit arbeiten. Wenn dagegen ein Normal- oder Weitwinkelobjektiv mit größerem Feldwinkel zum Einsatz kommt, kann auch die Stellgeschwindigkeit von dem adaptiven Sensor für die Verstelleinheit erhöht werden. Insgesamt mag die Stellgeschwindigkeit der Verstelleinheit reziproportional zur Vergrößerung gewählt werden. Je größer die Vergrößerung, desto kleiner die Stellgeschwindigkeit und umgekehrt. Die Auf- nähme der Kontrastwerte kann zusätzlich dadurch flankiert werden, dass tatsächlich nur die Bereiche der Probe eine Untersuchung erfahren, die von Interesse sind. Dazu kann zunächst ein grobes Übersichtsbild und ein zugehöriges Histogramm aufgenommen werden. Das Histogramm eines Bildes bzw. Einzelbildes macht eine Aussage über die Anzahl von Pixeln mit dem zugehörigen Grauwert. Es kann in tabellarischer Form oder grafischer Form dargestellt werden. Dazu sind auf der X-Achse bzw. Abszisse regelmäßig die Grauwerte und auf der Ordinate die Anzahl der Bildpunkte aufgetragen, die den zugehörigen Grauwert aufweisen.

Üblicherweise ist der Bereich der Probe durch ein charakteristisches Histogramm gekennzeichnet, während außerhalb davon - im probenfreien Raum - praktisch nur Grauwerte nahe von Null, d. h. weiße Bereiche,

beobachtet werden. Als Folge hiervon kann das zugehörige Histogramm mit Grauwertschwellen für eine Binarisierung genutzt werden. In diesem Fall wird das Bild in ein Bild aus schwarzen und weißen Bereichen umgewandelt bzw. werden die entsprechenden Bereiche im Speicher abgelegt.

Alternativ oder zusätzlich ist es möglich, die nicht interessierenden weißen Bereiche unterhalb der vorgegebenen Grauwertschwelle zu maskieren, so dass letztlich nur die maskenfreien Bereiche für die anschließende Analyse der Kontrastwerte zur Verfügung stehen. Jedenfalls kann zwischen probenfreien und probenbehafteten bzw. weißen und schwarzen oder maskierten und nicht maskierten Bereichen jeweils unterschieden werden. Dadurch erfolgt die beschriebene Binarisierung, d. h. die Unterteilung des Gesamtbildes in zumindest zwei Bereiche.

Jedenfalls gelingt auf diese Weise eine Festlegung dahingehend, dass nur die tatsächlich relevanten (unmaskierten) Bereiche der Probe der beschriebenen Prozedur zur Bestimmung der Kontrastwerte unterzogen werden. Hierin sind die wesentlichen Vorteile zu sehen.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand einer lediglich ein Ausführungsbeispiel darstellenden Zeichnung näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1 eine erfindungsgemäße Vorrichtung in einer Übersicht,

Fig. 2 einen Detailausschnitt aus Fig. 1 ,

Fig. 3 zwei Einzelbildstapel zur Verdeutlichung der Einzelbildauswahl,

Fig. 4 verschiedene Einzelbilder sowie die jeweils sektionsweise scharfen Bereiche in diesen Bildern,

Fig. 5 den Kontrastwert gegenüber der Verstellung der Optikeinheit in Z-Richtung,

Fig. 6 die Geschwindigkeit zur Verstellung der Optikeinheit bzw. zur Fokussierung,

Fig. 7 den Fokussiervorgang schematisch und

Fig. 8 eine Probentopologie mit zugehörigen Histogrammen zur Eingrenzung des interessierenden Bereiches.

In den Figuren ist eine Vorrichtung zur optischen Abtastung einer Probe 1 dargestellt, bei welcher es sich nicht einschränkend um einen transparenten biologischen Gewebeschnitt handelt. Dieser Gewebeschnitt bzw. die Probe 1 wird mit Hilfe einer Weißlichtquelle W durchleuchtet, die sich unterhalb einer Verstelleinheit 2, 3 befindet. Die Verstelleinheit 2, 3 setzt sich aus Stellvorrichtungen 2 sowie aus einem Tisch 3 zusammen, welcher die üblicherweise auf einem Objektträger platzierte Probe 1 hält und verfährt.

Mit Hilfe der Stellvorrichtungen 2 kann der Tisch 3 im Beispielfall in X-/Y- Richtung verschoben werden, so dass unterschiedliche Bereiche der Probe 1 zur Aufnahme bereit sind. Selbstverständlich liegt es im Rahmen der Erfindung, den Tisch 3 ggf. auch in Z-Richtung zu verstellen. Das ist jedoch nicht dargestellt. Das von der Weißlichtquelle W ausgesandte Licht durchleuchtet die Probe 1 und wird ausweislich der Fig. 2 mit Hilfe einer Abtasteinrichtung 4, 5 aufgenommen. Die Abtasteinrichtung 4, 5 setzt sich aus mehreren Objektiven 4 als Optikeinheit 4 zusammen, die wahlweise unterschiedlich große Bildausschnitte der Probe 1 auf eine Abtasteinheit bzw. Aufzeichnungseinheit 5 abbilden. Bei der Aufzeichnungseinheit 5 handelt es sich um einen CCD-Chip mit beispielsweise 1 -10 ⁶ Pixeln. Das auf dem CCD-Chip erzeugte Bild der transmittierten Probe 1 wird in einer Steueranlage 6 als Einzelbild 7 aufgenommen. Mehrere Einzelbilder 7 formen ein Gesamtbild, wie es in der

Fig. 8 dargestellt ist. Die Steueranlage 6 steuert die Stellvorrichtung 2 bzw. die Verstelleinheit 2, 3 sowie die Optikeinheit 4 und auch die Abtasteinheit 5. D. h., die Probe 1 wird durch Transmissionsmessungen untersucht.

Im Rahmen der Erfindung wird das jeweils erfasste Einzelbild 7 hinsichtlich seines Kontrastes (vgl. beispielsweise Fig. 5) ganz oder teilweise ausgewertet. D. h., das Einzelbild 7 wird im Rahmen des Ausführungsbeispiels mit einem (einzigen) Kontrastwert K identifiziert. Selbstverständlich könnten zu jedem Einzelbild 7 auch mehrere Kontrastwerte K definiert werden, dann nämlich, wenn das Einzelbild 7 entsprechend der Darstellung nach Fig. 4 in mehrere verschiedene Sektoren bzw. Sektionen 8 unterteilt wird. Denn in einem solchen Fall kann man jede Sektion 8 mit einem eigenen Kontrastwert K identifizieren.

Der Kontrastwert K entspricht im Rahmen des Ausführungsbeispiels und nicht einschränkend der mittleren quadratischen Abweichung σ% entsprechend der eingangs bereits angegebenen Gleichung Φ. Je höher der Wert σl , desto größer auch der Wert K und folglich der Kontrast des Einzelbildes 7. Über den

Kontrast bzw. den zugehörigen Kontrastwert K kann die Optikeinheit 4 automatisch fokussiert werden, denn ein fokussiertes Bild ist durch einen höheren Kontrast als ein nicht fokussiertes Bild gekennzeichnet. Das wird im

Einzelnen nachfolgend noch näher erläutert.

Tatsächlich werden die gewonnenen Kontrastwerte K der Einzelbilder 7 dazu genutzt, die Funktionsweise der gesamten dargestellten Vorrichtung zu beeinflussen. Dazu gehört zunächst einmal als eine Option die Bewegung der Optikeinheit 4, und zwar in Z-Richtung, um die Fokussierung auf die Probe 1 zu verändern. Aus den gewonnenen Kontrastwerten K können auch Rückschlüsse über die Verschiebung der Verstelleinheit 2, 3 mittels der Steueranlage 6 gewonnen werden. Schließlich beeinflussen die Kontrastwerte K die von der Steueranlage 6 von der Abtasteinheit 5 ausgelesenen Werte. Das geschieht im Detail wie folgt.

Die Probe 1 wird zur Aufnahme des Gesamtbildes zunächst einmal optional grob und mit geringer Auflösung der Abtasteinrichtung 4, 5 in der Steueranlage 6 erfasst. Dazu wird die Verstelleinheit 2, 3 zügig angesteuert, so dass der gesamte Bereich der Probe 1 einmal beispielsweise entlang einer Mäander- oder Serpentinenlinie durchfahren wird. Dabei entsteht das grobe Bild entsprechend der Fig. 8. Um nun die tatsächlich interessierenden Probenbereiche herauszufiltern, welche in einem nachfolgenden Schritt hinsichtlich ihres Kontrastes untersucht werden, wird in der Steueranlage 6 jeweils ein Histogramm des Einzelbildes 7 erzeugt, wie es beispielhaft für die beiden obersten Bilder in der Fig. 8 dargestellt ist. Das Histogramm macht in grafischer Form eine Aussage über die Anzahl der Pixel P mit dem zugehörigen Grauwert G.

Man erkennt, dass das linke obere Bild praktisch nur Pixel P mit einem geringen Grauwert G aufweist, folglich das zugehörige Einzelbild 7 "weiß" ist. Dagegen weist das Einzelbild 7 rechts daneben bereits Probenbestandteile auf und verfügt neben einem "weißen" Bestandteil in der Nähe des Ursprungs über Probenbestandteile, die im Beispiel durch im Wesentlichen zwei Grauwertmaxima gekennzeichnet sind. Wenn man nun in der Steueranlage 6 sämtliche Einzelbilder 7 ignoriert, deren Histogramm ausschließlich Grauwerte G unterhalb des Schwellwertes Go entsprechend der Fig. 8 aufweist, so werden tatsächlich nur die Einzelbilder 7 herausgegriffen und im nachfolgenden Prozess untersucht, die auch Probenbereiche abdecken. In der Fig. 8 sind die interessierenden Einzelbilder 7 jeweils leicht schraffiert dargestellt, während die probenfreien Bereiche und zugehörige Einzelbilder 7 weiß gekennzeichnet sind. Auf diese Weise kann bereits eine erhebliche Verfahrensbeschleunigung bei der Abtastung der Probe 1 erreicht werden, zu welcher auch und insbesondere die nachfolgend beschriebenen Schritte beitragen.

Um nun die jeweils interessierenden und schraffiert unterlegten Einzelbilder 7 zu einem Gesamtbild zusammenzufügen, ist es erforderlich, dass die Verstelleinheit 2, 3 die zu dem jeweiligen Einzelbild 7 zugehörige Position anfährt und

im Anschluss hieran die Abtasteinrichtung 4, 5 das betreffende Einzelbild 7 erfasst und aufnimmt. Das wird im Detail so durchgeführt, dass an der zugehörigen Position X; Y der Verstelleinheit 2, 3 jeweils ein Einzelbildstapel 9 entsprechend der Fig. 3 aufgenommen wird. Dort erkennt man aus Gründen der einfacheren Darstellung lediglich zwei Einzelbildstapel 9, wobei der eine Einzelbildstapel 9 zur Position X1 , Y1 korrespondiert, während der andere Einzelbildstapel 9 an der Stelle X2, Y2 (der Verstelleinheit 2, 3) aufgenommen worden ist. Je nach der Fokussierung der Optikeinheit 4 werden die Einzelbilder 7 des Einzelbildstapels 9 erfasst. D. h., jedes Einzelbild 7 gehört zu einem Wert der Fokussierung der Optikeinheit 4 bzw. einem Z-Wert.

Dazu wird die Optikeinheit 4 bzw. das an dieser Stelle realisierte Mikroskopobjektiv im einfachsten Fall in Z-Richtung vertikal zum Tisch 3 mittels der Steueranlage 6 bewegt, so dass mit unterschiedlichen Fokussierungen an der betreffenden Position X; Y gearbeitet wird. Diese Fokussierung kann manuell und/oder automatisch mit Hilfe der Steueranlage 6 erfolgen.

Im Beispielfall wird eine quasi halbautomatische Fokussierung realisiert, indem ein Bediener durch Beaufschlagen eines Handrades 10 an der Abtasteinrichtung 4, 5 die Vertikalposition der Optikeinheit 4 über dem Tisch 3 und folglich deren Z-Position verändert. Hierbei werden entsprechende manuelle Bewegungen jedoch nicht unmittelbar in eine Z-Verstellung der Optikeinheit 4 umgesetzt, sondern unter Zwischenschaltung der Steueranlage 6. Tatsächlich ist das Handrad 10 mit einem Drehwinkelgeber ausgerüstet, welcher die Drehwinkelposition und folglich die Verstellung des Handrades 10 an die Steueranlage 6 meldet. Aus diesem Bedienerwunsch leitet die Steueranlage 6 einen Verstellweg für die Optikeinheit 4 in Z-Richtung und auch eine Fokussiergeschwindigkeit V ab, d. h. die Geschwindigkeit, mit welcher die Einzelbilder 7 des Einzelbildstapels 9 aufgenommen werden.

Dabei wird die manuell und/oder automatisch vorgegebene Fokussiergeschwindigkeit V, also die Verstellgeschwindigkeit der Optikeinheit 4 in

Z-Richtung, nicht unmittelbar 1:1 von einer an die Steueranlage 6 angeschlossenen Verstelleinrichtung 11 in Z-Richtung umgesetzt. Vielmehr ist die Fokussiergeschwindigkeit V eine Funktion des Kontrastwertes K des jeweils aufgenommenen Einzelbildes 7 und wird in Abhängigkeit von dem jeweiligen Kontrastwert K von der Steueranlage 6 vorgegeben, welche die entsprechende Verstelleinrichtung 11 beaufschlagt. Außerdem hängt die Fokussiergeschwindigkeit V ggf. von weiteren Parametern T ab, die eingangs bereits angegeben worden sind (Vergrößerung, Tiefenschärfe der Optikeinheit 4, Auflösung der Abtasteinheit 5 etc.).

Hierbei geht die Erfindung davon aus, dass die im Beispielfall sechs Einzelbilder 7 des Einzelbildstapels 9 zu unterschiedlichen Fokuswerten K korrespondieren, wie dies in der oberen Grafik der Fig. 5 dargestellt ist. Je mehr man sich dem jeweils schärfsten bzw. kontrastreichsten Einzelbild 7 (im Beispielfall an der Stelle Xi ₁ Yi mit der Nummer 3) nähert, umso größer ist der Kontrastwert K des Einzelbildes 7. Tatsächlich folgt der Kontrastwert K einer Kurve mit einem Maximum, welches zu dem Einzelbild 7 (mit der Nummer 3) im Fokus korrespondiert. Der Kontrastwert K ist also eine Funktion der Z-Verstellung, i. e. K = K (Z) bzw. K = K (Z, T), wenn eine oder mehrere der vorgenannten Parameter T ergänzend eine Rolle spielen. Darüber hinaus hängt die Fokussiergeschwindigkeit V von K ab, es gilt also V = V (K) und demzufolge V = V (Z), wie die Fig. 6 zeigt.

Wenn man nun die Ableitung dieser Funktion, d. h. dK/dz in der Steueranlage 6 bildet, so lässt sich der Maximalwert der Kontrastwerte K mit dem Nullpunkt der Ableitung identifizieren, wie die Grafik der Ableitung in der Fig. 5 deutlich macht. Gleichzeitig erlaubt die Ableitung dK/dz Rückschlüsse dahingehend, von welcher Seite her man sich dem Maximum des Kontrastwertes K nähert. Das ist durch entsprechende Pfeile in der Fig. 5 oben dargestellt. Je nachdem, in welchem Bereich sich die Optikeinheit 4 befindet, kann selbstverständlich die Richtung der Fokussierung geändert werden. Gleichzeitig erfährt die Fokussiergeschwindigkeit V ebenfalls eine Variation bzw. Richtungsänderung.

In dem Bereich, in welchem der Kontrastwert K von Einzelbild 7 zu Einzelbild 7 stark ansteigt, wird man üblicherweise mit einer großen (konstanten) Fokussiergeschwindigkeit V arbeiten, die in der Fig. 6 im linken Teil a vorliegt (vgl. auch Fig. 5). Diese Geschwindigkeit V wird solange beibehalten, wie die Ableitung dK/dZ bestimmte Werte (beispielsweise Null) nicht unterschreitet. Sinkt jedoch die Steigung des Kontrastwertes K über die Z-Komponente, d. h. dass man sich dem Plateau der Fokussierung nähert, stellt die Steueranlage 6 auf eine geringere Fokussiergeschwindigkeit V um und verringert diese ggf. sukzessive. Das kommt in der Fig. 6 im rechten Teil b und auch in der Fig. 5 sowie in der Fig. 7 zum Ausdruck, welche die bisherige Vorgehensweise im linken Teil dem erfindungsgemäßen Verfahren rechts gegenüberstellt. Man erkennt, dass bisher mit einer konstanten Fokussiergeschwindigkeit V gearbeitet wurde, folglich die Verstellintervalle ΔZ in Z-Richtung konstant waren.

Erfindungsgemäß wird nun jedoch mit großen Intervallen in Z-Richtung ΔZ gearbeitet, die mit zunehmender Annäherung an eine Fokusebene F bzw. an das Maximum des Kontrastwertes K abnehmen. Im Beispielfall der Fig. 3 befindet sich an der Position X1 , Y1 das Bild 3 in etwa in dieser Fokusebene F. Dagegen ist an der Stelle X2, Y2 das Bild 5 in oder in der Nähe der Fokusebene F platziert (jeweils hervorgehoben durch größere Strichstärke).

Jedenfalls sind die Verstellintervalle ΔZ in Z-Richtung der Optikeinheit 4 erfindungsgemäß eine Funktion des Fokuswertes bzw. Kontrastwertes K und ggf. der Parameter T. Dabei werden die Einzelbilder 7 des jeweiligen Einzelbildstapels 9 mit einer vorgegebenen (konstanten) Fokussiergeschwindigkeit V (im Bereich a der Fig. 5 und 6) erfasst, wobei diese Fokussiergeschwindigkeit V bei zunehmenden Kontrastwerten K der jeweiligen Einzelbilder 7 verlangsamt wird, wie man im Bereich b der Fig. 5 und 6 erkennt. Dabei kann man die Fokussiergeschwindigkeit V so einstellen, dass sie bis auf Null oder nahezu Null beim Erreichen der Fokusebene F absinkt.

Anstelle die Fokussiergeschwindigkeit V zu variieren und im Bereich b der Fig. 5 und 6 zu verringern, kann auch mit konstanter Geschwindigkeit und dann vergrößertem Abstand in Z-Richtung der Einzelbilder gearbeitet werden. D. h., in diesem Fall werden die in der Fig. 5 dargestellten sechs Einzelbilder 7 nicht mit äquidistantem Abstand in Z-Richtung aufgenommen, sondern bei Annäherung an die Fokussebene F mit wachsendem Abstand in Z-Richtung. In diesem Fall sind die in der Fig. 5 dargestellten Kurven also im Bereich b "gedehnt". Dadurch wird der gleiche Effekt erzielt, als wenn man die Fokussiergeschwindigkeit V wie beschrieben verringert.

Anstelle jedes Einzelbild 7 mit nur einem Kontrastwert K zu identifizieren, kann das jeweilige Einzelbild 7 bzw. können die interessierenden und zuvor ausgewählten (schraffierten) Bereiche der Probe 1 alternativ sektionsweise untersucht werden. Dazu lässt sich das jeweilige Einzelbild 7 beispielsweise in vier Sektionen 8 entsprechend der Darstellung in Fig. 4 unterteilen. Beim Aufnehmen des Einzelbildstapels 9 wird nun nicht mehr jedes Einzelbild 7 mit einem Kontrastwert K identifiziert, sondern je Einzelbild 7 werden zu der jeweiligen Sektion 8 gehörige Kontrastwerte Ki bis K ₄ definiert. Das drückt der in Fig. 4 ebenfalls gezeichnete modifizierte Einzelbildstapel 9 aus.

Man erkennt, dass im Beispielfall die erste Sektion 8 ₁ das Maximum ihres Kontrastwertes Ki beim Einzelbild 7 mit der Nummer 4 erreicht. Dagegen korrespondiert die kontrastreichste Sektion 8 ₂ mit dem Kontrastwert K ₂ zu dem Einzelbild 7 mit der Nummer 3. Schließlich liegt die Sektion 8 ₃ beim Einzelbild 7 mit der Nummer 5 in der Nähe der Fokusebene F, während dies für die Sektion 8 ₄ mit dem Kontrastwert K ₄ beim Einzelbild mit der Nummer 2 der Fall ist.

Erfindungsgemäß werden nun diese einzelnen kontrastreichsten Sektionen 8 der zugehörigen Einzelbilder 7 mit den Nummern 4, 3, 5 und 2 zu einem kombinierten Einzelbild 7 zusammengesetzt. Dadurch kann der Einzelbildstapel 9 alternativ zur Reduzierung der Fokussiergeschwindigkeit V mit praktisch unverändert hoher Fokussiergeschwindigkeit V aufgenommen werden. In

beiden Fällen steht am Ende ein besonders kontrastreiches Einzelbild 7 zur Verfügung, wobei selbstverständlich beide Vorgehensweisen, d. h. die sektionsweise Auswahl und die Verringerung der Fokussiergeschwindigkeit V auch miteinander kombiniert werden können. Aus den solchermaßen gewonnenen Einzelbildern 7 lässt sich im abschließenden Schritt das in der Fig. 8 dargestellte Gesamtbild gewinnen, indem die Einzelbilder 7 Stoß an Stoß oder mit Überlapp zu dem Gesamtbild zusammengesetzt werden. - Für die Ermittlung der Kontrastwerte K der Einzelbilder 7 sorgt eine adaptive Sensoreinheit 12 in der Steueranlage 6 und/oder in der Abtasteinrichtung 4, 5, wie in Fig. 1 dargestellt. Je nach den Kontrastwerten K und dem jeweiligen Parameter T gibt die Sensoreinheit 12 im Beispielfall die Fokussiergeschwindigkeit V vor, indem die Sensoreinheit 12 die angeschlossene Steueranlage 6 entsprechend beaufschlagt, die ihrerseits beispielsweise die Verstelleinheit 2, 3 und/oder die Optikeinheit 4 ansteuert.

Die adaptive Sensoreinheit 12 in der Steueranlage 6 und/oder in der Abtasteinrichtung 4, 5 sorgt im Rahmen des Ausführungsbeispiels und auch ansonsten nicht nur dafür, die Fokussiergeschwindigkeit V festzulegen. Tatsächlich kann mit Hilfe der betreffenden Sensoreinheit 12 auch die Verstelleinheit 2, 3 be- einflusst werden. Beispielsweise sorgt eine geringere Vergrößerung der Optikeinheit 4 dafür, dass der Tisch 3 im Beispielfall mit einer minimierten Geschwindigkeit in X-/Y-Richtung verfahren wird. Auch zu starke Beschleunigungen der Stelleinheit 2, 3 bei einem optionalen manuellen Betrieb sowie ggf. des Objektives 4 mit Hilfe des Handrades 10 können abgefangen bzw. in dem Sinne beeinflusst werden, dass nur bestimmte maximale Beschleunigungen zugelassen werden.

Immer sorgt die adaptive Sensoreinheit 12 dafür, dass aus den Kontrastwerten K des jeweils erfassten Einzelbildes 7 Rückschlüsse für den Betrieb der gesamten Anlage gezogen werden, beispielsweise dahingehend, dass die Fokussiergeschwindigkeit V variiert wird. Daneben kann auch die Verstellgeschwindigkeit der Verstelleinheit 2, 3 gegenüber der Abtasteinrichtung

4, 5 beeinflusst werden. Diese Beeinflussung wird nicht nur von den fraglichen Kontrastwerten K vorgegeben, sondern optional auch durch die weiteren Parameter T, welche insgesamt die Bewegung der Optikeinheit 4 und/oder diejenige der Verstelleinheit 2, 3 mittels der Steueranlage 6 beeinflussen. Das Gleiche gilt alternativ oder zusätzlich für die von der Steueranlage 6 aus der Abtasteinheit 5 ausgelesenen Werte. Auch diese Auslesegeschwindigkeit kann von der adaptiven Sensoreinheit 12 sowie ggf. den angesprochenen Parametern T eine Änderung erfahren. Selbst die Frage, ob und mit welchem Überlapp die Einzelbilder 7 zu dem in der Fig. 8 dargestellten Gesamtbild zusammengesetzt werden, lässt sich in Abhängigkeit von Vorgaben der adaptiven Sensoreinheit 12 variieren. So wird man beispielsweise bei schnell aufgenommenen Einzelbildern 7 den Überlapp groß wählen, wohingegen aus einzelnen kontrastreichen Sektionen 8 zusammengesetzte Einzelbilder 7 eher einen geringeren Überlapp bei ihrer Zusammenstellung zum Gesamtbild erfordern.