Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Trennung und genauen Bestimmung lokal wirksamer Fluorophore. die in einem Objekt, beispielsweise durch ein Schichtsystem oder durch sonstige Strukturbeschaffenheit, infolge optischer Fluoreszenzanregung emittieren sowie unter Anwendung des an sich bekannten Laser- Scanning-Prinzips ausgewertet werden sollen. Mit Laser-Scanning- Anordnungen erfolgt bei Fluoreszenzmessungen eine serielle punktförmige Anregung des fluoreszierenden Objektes, wobei das punktförmig angeregte Feld konfokal in eine Feldblende abgebildet wird, die vor einem Einzeldetektor angeordnet ist. Aus dem einzeln nacheinander von jedem Bildpunkt detektierten Licht erfolgt nach Durchgang durch ein Sperrfilter der Aufbau eines zweidimensionalen Bildes des fluoreszierenden Objektes. Durch dieses konfokale Prinzip wird der Einfluss von Fluoreszenz- oder Streulicht von Schichten, die sich nicht in der Fokalebene des Anregungs- oder Abbildungssystems befinden, reduziert. In Kamerasystemen (Schweitzer et al.: "Die altersabhängige Makulopathie - Vergleichende Untersuchungen zwischen Patienten, deren Kindern und Augengesunden", Ophthalmologe 2000, 97: 84-90; Hammer et al.: "Bestimmung der Konzentrationsverteilung des Makulapigmentes aus Reflexions- und Fluoreszenzaufnahmen", Ophthalmologe 2003, 100, 8: 611 - 617), beispielsweise in einer Funduskamera zur Messung der Fluoreszenz des Augenhintergrundes, wird dieser großflächig zur Fluoreszenz angeregt, wobei zur Vermeidung des Einflusses von Fremdlicht (beispielsweise störendes Streulicht) einer dem zu untersuchenden Objekt vorgelagerten Schicht, in diesem Falle der Augenlinse, in der Aperturblendenebene des Auges das Bild einer Aperturblende vorhanden ist, die sich im Anregungsstrahlengang befindet und durch deren peripher durchlässigen Teil das Anregungslicht tritt. Im Messstrahlengang ist eine weitere Aperturblende angeordnet, die zur Gewährleistung einer fehlerarmen Abbildung zentral durchlässig ist und deren peripherer Teil das Anregungslicht sperrt. Die Aufnahme des Fluoreszenzlichtes erfolgt nach Durchgang durch ein Sperrfilter mit einem Bilddetektor.

In der Praxis ist das auszuwertende Fluorophor des Objekts häufig durch den besagten Schicht- oder sonstigen Strukturcharakter, der weitere Fluorophore enthalten kann, überlagert, welcher die Auswertung der Fluoreszenz des zu untersuchenden Fluorophors, insbesondere dessen Fluoreszenzabklingzeit, beeinflusst. Ein mögliches Anwendungsgebiet betrifft die präzise Bestimmung der zeitaufgelösten Fluoreszenz des Augenhintergrundes, wobei die auszuwertenden Fluoreszenzabklingzeiten, insbesondere durch ebenfalls mitangeregte Fluoreszenz der vorgelagerten Augenlinse beeinflusst werden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf ophthalmologische und nicht auf medizinische Anwendungen beschränkt. Mögliche Anwendungsgebiete ergeben sich auch beim Einsatz von Laser-Scanning-Mikroskopen.

Bei der Untersuchung der optischen Eigenschaften in Schichtsystemen, beispielsweise bei der Messung der zeitaufgelösten Autofluoreszenz vom Augenhintergrund, beeinflussen die Absorptions-, Streu- und Fluoreszenzeigenschaften vorgelagerter Schichten, insbesondere die Autofluoreszenz der Augenlinse, die Messungen der zeitaufgelösten Autofluoreszenz des Augenhintergrundes. Da der Augenhintergrund aus mehreren Schichten aufgebaut ist, tritt auch dort eine Überlagerung der Fluoreszenz der einzelnen Schichten auf. In Schweitzer et al.: "Tau-Mapping of the autofluorescence of the human ocular fundus" (SPIE Vol. 4164, 2000, 79-89 und DE 199 20 158 Al, "Verfahren und Anordnung zur Bestimmung von Fluorophoren an Objekten, insbesondere am lebenden Augenhintergrund") wurde gezeigt, dass die zweidimensionale Messung der zeitaufgelösten Fluoreszenz, insbesondere der Autofluoreszenz, am Augenhintergrund unter Beachtung der maximal zulässigen Lichtbelastung gegenwärtig nur mittels einer Kombination zwischen Laser Scanning Technik zur Abtastung des Objektes und zeitkorreliertem Einzelphotonenzählen als Nachweistechnik möglich ist. Die Messung der Fluoreszenzabklingzeit des Augenhintergrundes unter Anwendung einer großflächigen Beleuchtung des Augenhintergrundes mittels Funduskamera und unter Anwendung vom Messverfahren in der Frequenzdomäne erfordert Lichtbelastungen am Augenhintergrund, die dessen maximal zulässige Lichtbelastung überschreiten und damit zur Schädigung des Auges fuhren.

Im Gerät Fluorotron der Fa. Ocumetrix/USA kann die Fluoreszenz von Markern, z. B. von Natriumfluoreszin, in verschiedenen Schichten des Auges gemessen werden, indem das Volumen im Auge, das gemeinsam im Anregungsstrahlengang und im Messstrahlengang vorhanden ist, durch Verändern des Einfallswinkels des Anregungsstrahlengangs variabel gestaltet werden kann. Dieses Prinzip ist auf die Detektion der Fluoreszenz eines variablen Volumenelements längs der optischen Achse des Auges beschränkt. Durch das in der Laser Scanning Technik angewandte konfokale Prinzip zwischen Abbildung eines Leuchtpunktes auf das Objekt und dessen Abbildung auf eine Konfokalblende vor einem Detektor wird der Einfluss des Reflexionslichtes von den vorderen Medien des Auges entsprechend Gleichung (1) um den Faktor Fr reduziert:

7-r d Apertur (1) 1FeId

mit dApertur - Durchmesser der im Auge wirksamen Aperturblende und dpeid - Durchmesser der Feldblende am Augenhintergrund Bei einem Durchmesser der Augenpupille von 6 mm und einem Feldblendendurchmesser von 0,1 mm am Augenhintergrund wird das Reflexionslicht der vorderen Augenmedien um den Faktor 3600 gegenüber dem Reflexionslicht vom Augenhintergrand reduziert. Bei Messungen der Autofluoreszenz vom Augenhintergrund sind zusätzliche Betrachtungen notwendig. Das kurzwellige Anregungslicht regt nicht nur die Fluorophore am Fundus, sondern auch in den vorderen Augenmedien (Hornhaut, Linse) zur Fluoreszenz an. Die Fluoreszenzintensität ist im Allgemeinen proportional zur Absorption des Anregungslichtes. Diese ist wiederum proportional zur Extinktion. Die Extinktion ist das Produkt aus Konzentration, Schichtdicke und substanzspezifischem Extinktionskoeffizienten. Liegt eine gleiche Konzentration des gleichen Fluorophors in den vorderen Augenmedien und im Fundus vor, so verhalten sich die Fluoreszenzintensitäten wie die Schichtdicken von Fundus und vorderen Augenmedien. Bei einer Dicke der fluoreszierenden Fundusschichten von 0,1 mm und einer Linsendicke von ca. 4 mm ist die Fluoreszenzintensität der Linse um den Faktor 40 höher als die Fundusfluoreszenz. Damit ist in diesem Beispiel die Unterdrückung der Linsenfluoreszenz durch das konfokale Prinzip auf den Faktor 90 reduziert. Durch die Absorption des Anregungslichtes in den vorderen Augenmedien ist die Intensität des Anregungslichtes am Fundus weiterhin reduziert. Mit zunehmendem Alter und bei Vorliegen einer Katarakt tritt weiterhin eine Streuung des Anregungslichtes in der Linse auf, die zu einer weiteren Verringerung des Anregungslichtes am Fundus führt. Für die Anregungswellenlänge 446 nm beträgt die Transmission der Okularmedien einer 20-jährigen Person ca. 50 %. Dieser Wert verringert sich mit zunehmendem Alter (Pokorny J. et al.: Aging of the human Lens, Appl. Opt. 1987, 26, 1437-1440). Unter Berücksichtigung dieser Einflüsse ist mit einem Anteil der Linsenfluoreszenz von einigen Prozent an der vom gesamten Auge gemessenen Fluoreszenz zu rechnen. Nach eigenen Messungen liegt die monoexponentielle Abklingzeit der natürlichen Augenlinse in der Größenordnung von 4,5 ns. Die bi-exponentielle Approximation der Autofluoreszenz des Augenhintergrundes liefert eine kurze Komponente τl von einigen hundert Pikosekunden, die mit einer relativen Amplitude von ca. 95 % gegenüber der langen Komponente τ2 von einigen Nanosekunden dominiert. Es ist davon auszugehen, dass insbesondere die lange Komponente der Fundusfluoreszenz durch die Überlagerung mit der Linsenfluoreszenz beeinflusst ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, lokal und zweidimensional in einem Objekt, beispielsweise im Auge, auftretende Fluorophore weitgehend unbeeinflusst von benachbarten störenden Fluoreszenzen mit hoher Genauigkeit und möglichst geringer Strahlenbelastung des Objektes unter Anwendung des an sich bekannten Laser-Scanner- Prinzips bestimmen zu können.

Erfindungsgemäß wird in einem Laser-Scanning-System der zur Fluoreszenzanregung dienende Beleuchtungsstrahlengang durch eine zusätzliche erste Aperturblende, welche in die Ebene eines zu unterdrückenden, d. h. nicht bei der Fluoreszenzauswertung des Objekts zu berücksichtigenden, Fluorophors abgebildete wird, ausschließlich in einem ersten Teilbereich, beispielsweise seinem zentralen (achsnahen) Bereich, wirksam und im übrigen Teilbereich, beispielsweise in seinem peripheren Bereich, unwirksam gehalten. Des Weiteren wird der zur Fluoreszenzauswertung dienende Messstrahlengang durch eine in die Ebene des zu unterdrückenden Fluorophors abgebildete zweite Aperturblende lediglich in einem Teilbereich, der in der Ebene des zu unterdrückenden Fluorophors für den Beleuchtungsstrahlengang unwirksam ist, beispielsweise dem peripheren Bereich, durchlässig gehalten, jedoch im Teilbereich, welcher für den Beleuchtungsstrahlengang wirksam ist, beispielsweise dem achsnahen Bereich, unterdrückt.

Auf diese Weise gelangt nur dasjenige Fluoreszenzlicht zur Auswertung, welches im gemeinsamen Teil von Beleuchtungs- und Messstrahlengang entsteht, wobei auch bei Anwendung des an sich bekannten Laser- Scanner-Prinzips ein für die Auswertung störendes Fluoreszenzlicht (benachbartes Fluorophor des zu untersuchenden Objekts, beispielsweise das Fluorophor der Augenlinse bei der Untersuchung des Augenhinter- , grundes) eliminiert ist. Damit kann die Fluoreszenz, eines Objektes insbesondere die zeitaufgelöste Fluoreszenz des Augenhintergrundes, unbeeinflusst von der störenden Fluoreszenz benachbarter Fluorophore, insbesondere der Fluoreszenz der Augenlinse bei Fluoreszenzmessungen am Augenhintergrund, gemessen werden und daraus die für das zu bestimmende Fluorophor charakteristische Fluoreszenzlebensdauer bestimmt werden. Werden die genannten zusätzlichen Aperturblenden im entsprechenden Beleuchtungs- bzw. Messstrahlengang jeweils verschiebbar angeordnet, kann die Abbildung der Aperturblende jeweils variabel auf die Ebene des bei der Fluoreszenzauswertung zu unterdrückenden Fluorophors eingestellt und verändert werden. Die Teilbereiche des Beleuchtungs- und Messstrahlengangs können beispielsweise im Wesentlichen axial oder nicht axial durch die Aperturblenden getrennt werden. Eine nicht axiale Trennung könnte in gegenüberliegende Teilbereiche, z. B. in einen oberen und unteren Teilbereich oder in einen linken und rechten Teilbereich, erfolgen. Im Falle einer axialen Trennung der Teilbereiche kann zur Messung des Augenhintergrundes die achsnahe zentrale Beleuchtungsapertur auf Grund der hohen Leuchtdichte des Lasers beispielsweise einen Durchmesser von 1 mm aufweisen. Die Aperturblende im Messstrahlengang kann dabei als Ringblende mit einem inneren Ring von beispielsweise 2 mm und einem äußeren Ring von beispielsweise 7 mm ausgeführt sein, wodurch bei isotroper Verteilung des Fluoreszenzlichtes vom Augenhintergrund weniger als 10 % des vom Objekt (Augenhintergrund) detektierbaren Fluoreszenzlichtes ausgeblendet werden, dafür aber das Fluoreszenzlicht der Augenlinse nahezu vollständig abgeschattet ist.

Die Erfindung soll nachstehend anhand eines in der Zeichnung dargestellten Ausfuhrungsbeispiels näher erläutert werden. Es zeigen:

Fig. 1: ophthalmologische Laser-Scanning- Anordnung zur Anregung und Auswertung der Fluoreszenz des Augenhintergrundes Fig. 2: erfindungsgemäße Aperturblenden APl und AP2 im Beleuchtungs- bzw. Messstrahlengang der Anordnung gemäß Fig. 1

Fig. 1 zeigt eine ophthalmologische Laser-Scanning-Anordnung zur Anregung und Auswertung der Fluoreszenz des Augenhintergrundes AH eines Auges 1. Ein von einem Laser 2 ausgesendeter Beleuchtungsstrahlengang 3 wird über einen dichroitischen Spiegel SP auf das Auge 1 gelenkt. In diesem Beleuchtungsstrahlengang 3 befindet sich eine Feldblende FBl in der Brennebene einer Linse Ll, welche die Feldblende FBl ins Unendliche abbildet. Ein Bild FBl ' der Feldblende FBl entsteht für den Beleuchtungsstrahlengang 3 in der bildseitigen Brennebene einer Linse L2 und in der objektseitigen Brennebene einer Linse L3, welche die Feldblende ins Unendliche abbildet. Eine Augenlinse L4 des Auges 1 bildet das Bild FBl1 der Feldblende FBl als Bild FBl " aus dem Unendlichen auf den zu untersuchenden Augenhintergrund AH ab. In der objektseitigen Brennebene der Linse L2 ist eine Aperturblende APl im Beleuchtungsstrahlengang 3 angeordnet, wodurch Linse L2 diese ins Unendliche abbildet. Die Aperturblende APl, die lediglich in einem zentralen, achsnahen Bereich 4 durchlässig ist, ist im Querschnitt in Fig. 2 dargestellt. Linse L3 bildet die Aperturblende APl als Bild AP r aus dem Unendlichen in deren bildseitige Brennebene ab, in der sich die Aperturebene des Auges 1 befindet. In dieser Ebene befindet sich auch das Bild AP2' einer Aperturblende AP2, die in einem Messstrahlengang 5 des Laser-Scanning-Prinzips angeordnet ist. Wie in Fig. 2 dargestellt, ist die Aperturblende AP2 nur in einem Ringbereich 6 durchlässig. Dadurch blockt die Aperturblende AP2 das Reflexions- und Fluoreszenzlicht, das von den vorderen Augen¬ medien, insbesondere von der Augenlinse L4 stammt.

Das Fluoreszenzlicht und das diffus gestreute Licht des Augenhintergrundes AH treten durch das Bild der ringförmige Aperturblende AP 2', durchlaufen zwei Scanner Sh und Sv zur Horizontal- bzw. Vertikalablenkung und treffen auf den dichroitischen Spiegel SP. Dieser reflektiert das gestreute Licht, das die gleiche Wellenlänge wie das Anregungslicht hat. Für das langwelligere Fluoreszenzlicht, das in den Messstrahlengang 5 eintritt, hat der dichroitischen Spiegel SP eine hohe Transmission. Die Aperturblende AP2 ist in der Brennebene einer Linse L6 angeordnet. Das Bild der Aperturblende AP2 entsteht in der Brennebene einer Linse L5, in der sich auch die Brennebene der Linse L2 befindet. Die weitere Abbildung der Aperturblende AP2 in die Aperturebene des Auges erfolgt in der gleichen Weise wie für die Aperturblende APl beschrieben. Eine Feldblende FB2, die sich vor einem Detektor 7 im Messstrahlengang 5 in der Brennebene von Linse L7 befindet, wird über die Linsen L6, L5, L2 und L3 sowie die Augenlinse L4 konfokal zum Bild der Feldblende FBl auf den Augenhintergrund AH des Auges 1 abgebildet. Im Messstrahlengang 5 ist weiterhin ein Langpassfilter LF angeordnet, das zusätzlich das Anregungslicht aus dem Fluoreszenzlicht abblockt. An den Detektor 7 der Laser-Scanning-Anordnung sind eine aus Übersichtsgründen nicht in der Zeichnung dargestellte Einheit zur Messung der zeitaufgelösten Fluoreszenz sowie eine Einheit zur Bestimmung der Fluoreszenzabklingzeit angeschlossen. In einer weiteren vorteilhaften Ausführung könnte an Stelle des dichroitischen Spiegels SP ein Spiegel, insbesondere ein Oberflächenspiegel, (nicht in der Zeichnung dargestellt) angeordnet sein, der das Licht des Beleuchtungsstrahlengangs 3 auf das Auge 1 lenkt und zugleich eine Aperturblendenfunktion sowohl für den Beleuchtungsstrahlengang 3 als auch für den Messstrahlengang 5 ausübt, indem der vom ebenfalls mitangeregten störenden Fluorophor beeinflusste Teil des Messstrahlengangs 5, beispielsweise dessen zentraler (achsnaher) Bereich, ausgeblendet wird. Der Beleuchtungsstrahlengang 3 wäre in seinem Außendurchmesser zuvor so zu begrenzen, dass kein gestreutes Anregungslicht in den Messstrahlengang 5 gelangen kann.

Die in den Ausführungsbeispielen dargestellten Linsen Ll, L2, L3, L5, L6 und L7 können prinzipiell auch durch andere optische Abbildungselemente, beispielsweise durch entsprechende Spiegel, realisiert sein.

Alle in der Beschreibung, den nachfolgenden Ansprüchen und der Zeichnung dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein. Bezugszeichenliste

1 Auge 2 Laser 3 B eleuchtungsstrahlengang 4 Bereich (durchlässiger Bereich von APl) 5 Messstrahlengang 6 Ringbereich (durchlässiger Bereich von AP2) 7 Detektor AH Augenhintergrund L1, L2, L3, L5, L6, L7- Linse L4 Augenlinse SP dichroitischer Spiegel FBl, FB2 Feldblende FBr5 FBl" Bild der Feldblende FBl FB21, FB2" Bild der Feldblende FB2 APl5 AP2 Aperturblende APl' Bild der Aperturblende APl AP21 Bild der Aperturblende AP2 Sh5 Sv Scanner LF Langpassfilter