Procédé pour le diagnostic d'un diabète

L'invention concerne le diabète de type 1 et notamment l'utilisation de nouveaux gènes cibles pour le diagnostic précoce d'un diabète de type 1.

Le diabète sucré est un syndrome regroupant un ensemble de maladies métaboliques ayant en commun une hyperglycémie. Il y a diabète sucré lorsque la glycémie plasmatique à jeun est égale ou supérieure à 126 mg/dl (7,0 mmol/1) ou lorsqu'en présence de symptômes cliniques, prélevée à un moment quelconque de la journée, elle dépasse 200 mg/dl (11,1 mmol/1). Autrefois appelé diabète insulino-dépendant (ou encore diabète juvénile), le diabète de type 1 (DTl) est une forme de diabète sucré qui apparaît le plus souvent de manière brutale chez l'enfant ou chez le jeune adulte. Il est l'aboutissement d'un long processus autoimmun et inflammatoire qui détruit de manière sélective les cellules β insulino-sécrétrices des îlots pancréatiques de Langerhans [Eisenbarth GS. Et al. NEJM 314 : 1360-1368, 1986]. La destruction de ces cellules situées dans le pancréas a pour conséquence une absence d'insuline dans le sang. Les diabétiques de type 1 doivent donc s'injecter de l'insuline plusieurs fois par jour tout au long de leur vie et manger de manière équilibrée. L'évolution vers un DTl passe par une longue phase pré clinique silencieuse, dite de « pré diabète », durant laquelle sont produits des autoanticorps dirigés contre ces îlots de Langerhans. Cette phase restera ainsi jusqu'à ce que 80% des cellules β soient détruites et que la sécrétion d'insuline résiduelle soit insuffisante pour maintenir l'homéostasie glucidique. L'élévation de la glycémie à jeun ou au cours d'une épreuve d'hyperglycémie par voie orale est un événement relativement tardif dans l'histoire naturelle du DTl. On peut cependant observer dans les mois précédents l'apparition de la maladie, une diminution de la riposte insulinique, en particulier de sa phase précoce, au cours d'une surcharge glucosée. Au stade clinique, les symptômes apparaissent brutalement, parfois à l'occasion de circonstances intercurrentes (par exemple, une infection). Il s'agit surtout d'une polyurie et d'une polydipsie, d'un amaigrissement (en dépit d'une polyphagie), d'une asthénie et d'une intolérance digestive. La durée des symptômes se compte en jours ou, si le diagnostic est trop retardé, en semaines.

L'évolution se fait inévitablement vers l'acidocétose si un traitement par insuline n'est pas instauré.

Il est donc important de pouvoir diagnostiquer le diabète de type 1, et cela, d'une manière la plus précoce possible, en particulier a un stade pré-diabétique. En effet, dans l'optique de traitements préventifs immunomodulateurs, il est utile pour le clinicien d'identifier les sujets à risque de développer la maladie, et ce au stade asymptomatique de la « normoglycémie ». Bien que la plupart des nouveaux cas de DTl apparaissent dans des familles « naïves » pour cette maladie, certaines populations à risque peuvent être identifiées. Les apparentés au premier degré de patients diabétiques et les sujets présentant des stigmates d' autoimmunité extra-pancréatiques sont considérés comme des groupes à haut risque pour cette maladie.

Actuellement, le dépistage des individus à risque est essentiellement basé sur la présence et le type d' autoanticorps associés au DTl tels que les anticorps anti-insuline (IAA), les anti-tyrosine phosphatase (LA-2) et les anti-glutamate decarboxylase (GAD) [voir notamment Bingley PJ. et al. Diabètes 43 : 1304-1310, 1994 ; Kulmala P. et al. J Clin Invest 101 : 327-336, 1998. Verge CF. J Autoimmun 9 : 3796383, 1996]. Le nombre de ces autoanticorps a une valeur plus prédictive que l'ordre dans lesquels ils apparaissent [Gardner SG. et al. Diabètes Care 22 :2049-2054, 1999]. De même, le risque et le temps de progression vers un diabète sont directement corrélés avec le niveau d'expression de ces autoanticorps, en plus de leur nombre [Bingley PJ. et al. Diabètes 43 : 1304-1310 1994; Bonifacio E. et al. Lancet 335 : 147-149, 1990]. Cependant, la proportion des apparentés ne développant pas de diabète en présence de multiple autoanticorps pendant de longues années [Kulmala P. et al. J Clin Invest 101 : 327-336, 1998 ; Gardner SG. et al. Diabètes Care 22 :2049-2054, 1999], montre la nécessité d'ajouter d'autres tests pour améliorer la valeur prédictive du dépistage.

La sous-classe des IgG et la spécificité d'épitopes des autoanticorps peut refléter qualitativement et quantitativement les différences dans la réponse autoimmune [King CL. et al. J Immunol 151 : 458-465, 1993 ; Butler MH. et al. J Exp Med 178 : 2097- 2106, 1993]. Ainsi, une étude a montré que le risque élevé est associé avec un niveau élevé d'IA-2A et IAA, IgG2, IgG3 et/ou IgG4 sous-classes de IA-2A et IAA, et des anticorps contre l'apparentés de la molécule IA-2 : IA-2β. Toutefois, ce modèle montre

ses limites, en classant les apparentés positifs en anticorps avec un risque de développer un DTl, de 7 à 89% sur une période de 5 ans [Achenbach P. et al. Diabètes 53 : 384-392, 2004].

Le génotype du complexe HLA a montré également qu'il peut être un contributeur significatif dans la prédiction au DTl. La combinaison de données provenant de différentes études a montré que l'haplotype DQBl*0302-Al*0301 (DQ8) confère le risque le plus élevé. De même, l'ajout supplémentaire de l'allèle DRBl*0401 peut également apporter un effet diabétogène supplémentaire. Le risque génétique le plus important est apporté par le génotype DQBl*0302-Al*0301/DQBl*0201-Al*0501 (DQ8/DQ2). Ce génotype est présent à 40 % chez les enfants développant un DTl, alors que ce pourcentage dans la population saine n'excède pas 3 %. Au contraire, d'autres allèles ont été associés avec un effet protecteur pour le DTl (HLA DQBl*0602-Al*0102 (DQ6) [Pihoker C. et al. Diabètes 54 : S52-S61, 2005]. Bien qu'aucune association exclusive entre certains allèles et autoanticorps a été démontrée, plusieurs études ont montré des corrélations entre les allèles HLA et les autoanticoprs [Graham J. et al. Diabètes 51 : 1346-1355, 2002 ; Hagopian WA. Et al. J Clin Invest 95 : 1505-1511, 1995 ; Knip M. et al. Am J Med Genêt 115 : 48-54, 2002 ; Savola K. et al. Diabetologia 41 : 424-429, 1998]. Toutefois, on note qu'une proportion non négligeable de sujets diabétiques ne présentant ni le phénotype DQ8, ni le phénotype DQ2. Parfois même, certains patients peuvent être porteurs des allèles « protecteurs ». Plusieurs études ont été réalisées sur les profils de sécrétion de cytokines chez des individus pré diabétiques provenant de jumeaux monozygotes discordants pour la maladie [Rapoport MJ. et al. Cytokine 30 : 219-227, 2005 ; Kallmann BA. et al. Diabetologia 42 : 1080-1085, 1999 ; Karlsson MG. et al. Diabetologia 43 : 742-749, 2000 ; Szelachowska A. et al. Horm Metab Res 30 : 526-530, 1998 ; Wilson SB. et al. Nature 391 : 177-181, 1998]. Wilson et al. ont isolé des clones de cellules T CD4 ^~ CD8 ^~ Vα24-JαQ à partir d'individus à risque, démontrant une augmentation de la sécrétion d'IFNγ et une diminution de IL-4 indiquant une progression vers le DTl. Kallmann et al. ont rapporté que la sécrétion de IL-4 et IL-10 par des PBMC est diminuée chez des jumeaux diabétiques, tandis qu'aucune différence n'est observée dans leur sécrétion IFNγ. Toutefois, des résultats contradictoires étaient observés chez

des pré diabétiques. Karlsson et al. ont trouvé une augmentation de la sécrétion de l'IFNγ et de l'IL-4 par les PBMC stimulés par la GAD, tandis que Szelachowska et al. ont décrit une diminution de la sécrétion de l'IL-10 et de l'IL-4 associée avec une sécrétion normale chez ces sujets.

II est donc important de disposer d'un nouvel outil de diagnostic permettant de détecter un diabète, notamment de façon très précoce, en particulier chez des patients en stade pré-diabètique.

A ce titre, l'invention présente un procédé in vitro pour le diagnostic notamment précoce d'un diabète à partir d'un échantillon biologique d'un patient caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique, b. on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique d'un gène cible choisi parmi SEQ ID N° 1 à SEQ ID N° 299; SEQ N °300 à SEQ ID N° 362. c. on détermine l'expression d'au moins un desdits gènes cibles, ladite expression étant une indication de la présence ou du risque de développer un diabète.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on met en contact lors de l'étape b) une combinaison de réactifs spécifiques pour déterminer lors de l'étape c) l'expression d'une combinaison de gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 1 à SEQ ID

N° 299, SEQ N °300 à SEQ ID N° 362. En particulier,

" lors de l'étape b), on met en contact le matériel biologique avec au moins 5,

10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 1 10, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180,

185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255,

260, 265, 270, 275, 280, 290, 295, 299, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330,

335, 340, 345, 350, 355, 360, 362 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20,

25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 1 10, 1 15, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190,

195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265,

270, 275, 280, 290, 295, 299, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 362 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 1 à SEQ ID N° 299, SEQ N °300 a SEQ ID N° 362.

" lors de l'étape c) on détermine l'expression d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 1 10, 1 15, 120, 125,

130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 290, 295, 299, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 362 desdits gènes cibles, ladite expression étant une indication de la présence ou du risque de développer un diabète.

Ces 362 gènes sont présentés dans le tableau 1 et 2.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape b, on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 6 à 63; SEQ ID N° 288 à 293 (profil 2).

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on met en contact lors de l'étape b) une combinaison de réactifs spécifiques pour déterminer lors de l'étape c) l'expression d'une combinaison de gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 6 à 63; SEQ ID N° 288 à 293. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, " lors de l'étape b), on met en contact le matériel biologique avec au moins 5,

10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 64 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 64 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 6 à 63; SEQ ID N° 288 à 293

" lors de l'étape c) on détermine l'expression d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 64 desdits gènes cibles, ladite expression étant une indication de la présence ou du risque de développer un diabète. Ce mode de réalisation est particulièrement adapté pour un diagnostic précoce du diabète, c'est à dire à un stade de pré-diabète.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape b, on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique d'un gène choisi

parmi SEQ ID N° 125 à 200; SEQ ID N° 288 à 293 (profil 4). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on met en contact lors de l'étape b) une combinaison de réactifs spécifiques pour déterminer lors de l'étape c) l'expression d'une combinaison de gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 125 à 200; SEQ ID N° 288 à 293. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention,

" lors de l'étape b), on met en contact le matériel biologique avec au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 82 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 82 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 125 à 200; SEQ ID N° 288 à 293 " lors de l'étape c) on détermine l'expression d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30,

35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 82 desdits gènes cibles, ladite expression étant une indication de la présence ou du risque de développer un diabète. Ce mode de réalisation est particulièrement adapté pour un diagnostic précoce du diabète, c'est à dire à un stade de pré-diabète.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape b, on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 201 à 287; SEQ ID N° 294 à 299 (profil 5). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on met en contact lors de l'étape b) une combinaison de réactifs spécifiques pour déterminer lors de l'étape c) l'expression d'une combinaison de gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 201 à 287; SEQ ID N° 294 à 299. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention,

" lors de l'étape b), on met en contact le matériel biologique avec au moins 5,

10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 93 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,

80, 85, 90, 93 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 201 à 287; SEQ ID N°

294 à 299

" lors de l'étape c) on détermine l'expression d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 93 desdits gènes cibles, ladite expression étant une indication de la présence ou du risque de développer un diabète.

Ce mode de réalisation est particulièrement adapté pour un diagnostic précoce du diabète, c'est à dire à un stade de pré-diabète.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape b, on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 6 à 63; SEQ ID N° 288 à 293; SEQ ID N° 125 à 200; SEQ ID N°

201 à 287; SEQ ID N° 294 à 299. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on met en contact lors de l'étape b) une combinaison de réactifs spécifiques pour déterminer lors de l'étape c) l'expression d'une combinaison de gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 6 à 63; SEQ ID N° 288 à 293; SEQ ID N° 125 à 200;

SEQ ID N° 201 à 287; SEQ ID N° 294 à 299. En particulier,

" lors de l'étape b), on met en contact le matériel biologique avec au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 1 10, 1 15, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155,

160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 6 à 63; SEQ ID N° 288 à 293; SEQ ID N° 125 à 200; SEQ ID N° 201 à 287; SEQ ID N° 294 à 299

" lors de l'étape c) on détermine l'expression d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 1 10, 1 15, 120, 125,

130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225 desdits gènes cibles, ladite expression étant une indication de la présence ou du risque de développer un diabète. Ce mode de réalisation est particulièrement adapté pour un diagnostic précoce du diabète, c'est à dire à un stade de pré-diabète.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape b, on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ N° 64 à 124; SEQ ID N° 294 à 299 (profil 3). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on met en contact lors de l'étape b) une combinaison de réactifs spécifiques pour déterminer lors de l'étape c) l'expression d'une combinaison

de gènes cibles choisis parmi SEQ N° 64 à 124; SEQ ID N° 294 à 299. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention,

" lors de l'étape b), on met en contact le matériel biologique avec au moins 5,

10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 67 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 67 gènes cibles choisis parmi

N° 64 à 124; SEQ ID N° 294 à 299

" lors de l'étape c) on détermine l'expression d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 67 desdits gènes cibles, ladite expression étant une indication de la présence ou du risque de développer un diabète. Ce mode de réalisation est particulièrement adapté pour le diagnostic du diabète.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape b, on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 306 à 321 (profil 7). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on met en contact lors de l'étape b) une combinaison de réactifs spécifiques pour déterminer lors de l'étape c) l'expression d'une combinaison de gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 306 à 321. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention,

" lors de l'étape b), on met en contact le matériel biologique avec au moins 5, 10, 15, 16 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 16 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 306 à 321.

" lors de l'étape c) on détermine l'expression d'au moins 5, 10, 15, 16 desdits gènes cibles, ladite expression étant une indication de la présence ou du risque de développer un diabète. Ce mode de réalisation est particulièrement adapté pour un diagnostic précoce du diabète, c'est à dire à un stade de pré-diabète.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape b, on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID SEQ ID N° 300, 301 ,303 et 305. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on met en contact lors de l'étape b) une combinaison de

réactifs spécifiques pour déterminer lors de l'étape c) l'expression d'une combinaison de gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 300, 301 ,303 et 305. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention,

" lors de l'étape b), on met en contact le matériel biologique avec au moins 1, 2, 3, 4 réactifs spécifiques d'au moins 1, 2, 3, 4 gènes cibles choisis parmi SEQ

ID N° 300, 301 ,303 et 305.

" lors de l'étape c) on détermine l'expression d'au moins 1, 2, 3, 4 desdits gènes cibles, ladite expression étant une indication de la présence ou du risque de développer un diabète. Ce mode de réalisation est particulièrement adapté pour un diagnostic précoce du diabète, c'est à dire à un stade de pré-diabète.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape b, on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 322 à 334 (profil 8). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on met en contact lors de l'étape b) une combinaison de réactifs spécifiques pour déterminer lors de l'étape c) l'expression d'une combinaison de gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 322 à 334. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, " lors de l'étape b), on met en contact le matériel biologique avec au moins 5,

10, 13 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 13 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 322 à 334

" lors de l'étape c) on détermine l'expression d'au moins 5, 10, 13 desdits gènes cibles, ladite expression étant une indication de la présence ou du risque de développer un diabète.

Ce mode de réalisation est particulièrement adapté pour le diagnostic du diabète.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape b, on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 335 à 362 (profil 9). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on met en contact lors de l'étape b) une combinaison de réactifs

spécifiques pour déterminer lors de l'étape c) l'expression d'une combinaison de gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 335 à 362. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention,

" lors de l'étape b), on met en contact le matériel biologique avec au moins 1, 3, 5, 7, 9 réactifs spécifiques d'au moins 1, 3, 5, 7, 9 gènes cibles choisis parmi

SEQ ID N° 335 à 362.

" lors de l'étape c) on détermine l'expression d'au moins 1, 3, 5, 7, 9 desdits gènes cibles, ladite expression étant une indication de la présence ou du risque de développer un diabète. Ce mode de réalisation est particulièrement adapté pour un diagnostic précoce du diabète, c'est à dire à un stade de pré-diabète.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique prélevé chez le patient est un échantillon sanguin. Ce mode de réalisation est très pratique d'un point de vue clinique car facile d'accès.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique extrait lors de l'étape a) comprend des acides nucléiques.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le au moins un réactif spécifique de l'étape b) comprend au moins une sonde d'hybridation. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la au moins une sonde d'hybridation est immobilisée sur un support.

L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un réactif spécifique d'un gène cible choisi parmi SEQ ID N° 1 à 299, SEQ N °300 a SEQ ID N° 362. pour le diagnostic notamment précoce d'un diabète. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on utilise une combinaison de réactifs spécifiques d'un gène cible choisi parmi SEQ ID N ⁰ I a 299, SEQ N °300 a SEQ ID N° 362. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on utilise au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 1 10, 1 15, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220,

225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 290, 295, 299 , 300, 305,

310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 362 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 1 15, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 290, 295, 299 , 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355,

360, 362 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 1 à SEQ ID N° 299, SEQ N °300 a SEQ ID N° 362 pour le diagnostic notamment précoce d'un diabète. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on utilise au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 6 à 63; SEQ ID N° 288 à 293 (profil T). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on utilise une combinaison de réactifs spécifiques d'un gène cible choisi parmi SEQ ID N° 6 à 63; SEQ ID N° 288 à 293. Ce mode de réalisation est particulièrement adapte pour un diagnostic précoce du diabète, c'est à dire à un stade de pré-diabète. Préférentiellement, on utilise au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 64 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 64 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 6 à 63;

SEQ ID N° 288 à 293

Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, on utilise au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 125 à 200; SEQ ID N° 288 à 293 (profil 4). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on utilise une combinaison de réactifs spécifiques d'un gène cible choisi parmi SEQ IDN° 125 à 200;

SEQ ID N° 288 à 293. Ce mode de réalisation est particulièrement adapté pour un diagnostic précoce du diabète, c'est à dire à un stade de pré-diabète. Préférentiellement, on utilise au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 82 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 82 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 125 à 200; SEQ ID N°

288 à 293.

Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, on utilise au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 201 à 287; SEQ ID N° 294 à 299 (profil 5). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on utilise une combinaison de réactifs spécifiques d'un gène cible choisi parmi SEQ ID N° 201 à

287; SEQ ID N° 294 à 299. Ce mode de réalisation est particulièrement adapte pour un

diagnostic précoce du diabète, c'est à dire à un stade de pré-diabète. Préférentiellement, on utilise au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 93 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 93 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 201 à 287; SEQ ID N° 294 à 299.

Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, on utilise au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ N° 64 à 124; SEQ ID N° 294 à 299 (profil 3). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on utilise une combinaison de réactifs spécifiques d'un gène cible choisi parmi SEQ N° 64 à 124; SEQ ID N° 294 à 299. Ce mode de réalisation est particulièrement adapté pour le diagnostic du diabète. Préférentiellement, on utilise au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 67 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 67 gènes cibles choisis parmi N° 64 à 124; SEQ ID N° 294 à 299.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on utilise au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 306 à 321 (profil 7). Préférentiellement, on utilise au moins 5, 10, 15, 16 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 16 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 306 à 321.Ce mode de réalisation est particulièrement adapté pour un diagnostic précoce du diabète, c'est à dire à un stade de pré-diabète.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on utilise au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID SEQ ID N° 300, 301 ,303 et 305.

Préférentiellement, on utilise au moins 1, 2, 3, 4 réactifs spécifiques d'au moins 1, 2, 3,

4 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 300, 301 ,303 et 305.

Ce mode de réalisation est particulièrement adapté pour un diagnostic précoce du diabète, c'est à dire à un stade de pré-diabète. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on utilise au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 322 à 334 (profil 8). Préférentiellement, on utilise au moins 5, 10, 13 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 13 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 322 à 334

Ce mode de réalisation est particulièrement adapté pour le diagnostic du diabète.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on utilise au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 335 à 362 (profil 9). Préférentiellement, on utilise au moins 1, 3, 5, 7, 9 réactifs spécifiques d'au moins 1, 3, 5, 7, 9 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 335 à 362. Ce mode de réalisation est particulièrement adapté pour un diagnostic précoce du diabète, c'est à dire à un stade de pré-diabète.

L'invention concerne également un kit de diagnostic notamment précoce d'un diabète comprenant au moins un réactif spécifique d'au moins un gène cible choisi parmi l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 299, SEQ N °300 a SEQ ID N° 362. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le kit comprend une combinaison de réactifs spécifiques d'un gène cible choisi parmi SEQ N° 1 à 299. Préférentiellement, le kit comprend au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 1 10, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260,

265, 270, 275, 280, 290, 295, 299, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 362 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 1 15, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 290, 295, 299 , 305, 310, 315, 320, 325,

330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 362 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 1 à SEQ ID N° 299 , SEQ N °300 a SEQ ID N° 362.

L'invention concerne également un kit de diagnostic précoce d'un diabète comprenant au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 6 à 63; SEQ ID N° 288 à 293 (profil T). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le kit comprend une combinaison de réactifs spécifiques d'un gène cible choisi parmi SEQ ID N° 6 à 63; SEQ ID N° 288 à 293. Préférentiellement, le kit comprend au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 64 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 64 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 6 à 63; SEQ ID N ⁰ 288 à 293.

L'invention concerne également un kit de diagnostic précoce d'un diabète comprenant au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 125 à 200; SEQ ID N° 288 à 293 (profil 4). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le kit comprend une combinaison de réactifs spécifiques d'un gène cible choisi parmi SEQ ID N°125 à 200; SEQ ID N° 288 à 293. Préférentiellement, le kit comprend au moins

5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 82 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 82 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 125 à 200; SEQ ID N° 288 à 293. L'invention concerne également un kit de diagnostic précoce d'un diabète comprenant au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 201 à 287; SEQ ID

N° 294 à 299 (profil 5). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le kit comprend une combinaison de réactifs spécifiques d'un gène cible choisi parmi SEQ ID N° 201 à 287; SEQ ID N° 294 à 299. Préférentiellement, le kit comprend au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 93 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,

90, 93 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 201 à 287; SEQ ID N° 294 à 299. L'invention concerne également un kit de diagnostic d'un diabète comprenant au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 64 à 124; SEQ ID N° 294 à 299 (profil 3). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le kit comprend une combinaison de réactifs spécifiques d'un gène cible choisi parmi SEQ

ID N° 64 à 124; SEQ ID N° 294 à 299. Préférentiellement, le kit comprend au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 67 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 67 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 64 à 124; SEQ ID N° 294 à 299. L'invention concerne également un kit de diagnostic précoce du diabète comprenant au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 306 à 321 (profil 7). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le kit comprend une combinaison de réactifs spécifiques d'un gène cible choisi parmi SEQ ID N° 306 à 321. Préférentiellement, le kit comprend au moins 5, 10, 15, 16 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 15, 16 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 306 à 321.

L'invention concerne également un kit de diagnostic précoce du diabète comprenant au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 300, 301 ,303 et 305. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le kit comprend une combinaison de réactifs spécifiques d'un gène cible choisi parmi SEQ ID N° 300, 301, 303 et 305. Préférentiellement, le kit comprend au moins 1, 2, 3, 4 réactifs spécifiques d'au moins 1, 2, 3, 4 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 300, 301 ,303 et 305. L'invention concerne également un kit de diagnostic du diabète comprenant au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 322 à 334 (profil 8). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le kit comprend une combinaison de réactifs spécifiques d'un gène cible choisi parmi SEQ ID N° 322 à 334 (profil 8). Préférentiellement, le kit comprend au moins 5, 10, 13 réactifs spécifiques d'au moins 5, 10, 13 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 322 à 334.

L'invention concerne également un kit de diagnostic précoce du diabète comprenant au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi SEQ ID N° 335 à 362 (profil 9). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le kit comprend une combinaison de réactifs spécifiques d'un gène cible choisi parmi SEQ ID N° 335 à 362. Préférentiellement, le kit comprend au moins 1, 3, 5, 7, 9 réactifs spécifiques d'au moins 1, 3, 5, 7, 9 gènes cibles choisis parmi SEQ ID N° 335 à 362.

Les définitions suivantes permettront de mieux comprendre l'invention.

Par diagnostic notamment précoce d'un diabète, on entend un diagnostic d'un diabète de type 1, à un stade précoce, c'est à dire à un stade de pré-diabète, ou à un stade avancé. Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique, tout échantillon prélevé chez un patient, et susceptible de contenir un matériel biologique tel que défini ci après. Cet échantillon biologique peut être notamment un échantillon de sang, de sérum, de salive, tissu, de cellules circulantes du patient. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique prélevé chez le patient est un échantillon sanguin.

Lors de l'étape a) du procédé selon l'invention, on extrait le matériel biologique de l'échantillon biologique par tous les protocoles d'extraction et de purification d'acides nucléiques ou de protéines bien connus de l'homme du métier.

Au sens de la présente invention, on entend par matériel biologique, tout matériel permettant de détecter l'expression d'un gène cible. Le matériel biologique peut comprendre notamment des protéines, ou des acides nucléiques tels que notamment les acides desoxyribonucléiques (ADN) ou les acides ribonucléiques (ARN). L'acide nucléique peut être notamment un ARN (acide ribonucléique). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique extrait lors de l'étape a) comprend des acides nucléiques, préférentiellement, des ARN, et encore plus préférentiellement des ARN totaux. Les ARN totaux comprennent les ARN de transfert, les ARN messagers (ARNm), tel que les ARNm transcrits du gène cible, mais également transcrits de tout autre gène et les ARN ribosomaux. Ce matériel biologique comprend du matériel spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits du gène cible ou les protéines issues de ces ARNm mais peut comprendre également du matériel non spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits d'un gène autre que le gène cible, les ARNt, les ARNr issus d'autres gènes que le gène cible. A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléique peut être réalisée par : - une étape de lyse des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les cellules du patient. A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrites dans les demandes de brevet: o WO 00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, o WO 99/53304 sur la lyse électrique, o WO 99/15321 sur la lyse mécanique.

L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US 5,234,809). - une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques, et peut être adaptée à la purification

d'ADN ou d'ARN. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US 4,672,040 et US 5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet: WO-A-97/45202 et WO-A-99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes (Boom R. et al, J. Clin. Microbiol, 1990, n°28(3), p. 495-503) ou magnétiques (Merck: MagPrep ^® Silica, Promega: MagneSil™ Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison PR et al, J. Chromatography, 1998, p. 337- 344). Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique (société Xtrana: matrice Xtra-Bind™). Lorsque l'on souhaite extraire spécifiquement l'ADN d'un échantillon biologique, on peut notamment réaliser une extraction par du phénol, du chloroforme et de l'alcool pour éliminer les protéines et précipiter l'ADN avec de l'éthanol 100%. L'ADN peut alors être culoté par centrifugation, lavé et remis en solution .

Lorsque l'on souhaite extraire spécifiquement les ARN d'un échantillon biologique, on peut notamment réaliser une extraction par du phénol, du chloroforme et de l'alcool pour éliminer les protéines et précipiter les ARN avec de l'éthanol 100%. Les ARN peuvent alors être culotés par centrifugation, lavés et remis en solution. Dans le cas de l'extraction de protéines, la première étape consiste généralement, comme pour les acides nucléiques en la lyse des cellules. Un choc osmotique peut suffire à briser la membrane cellulaire de cellules fragiles, qui peut être réalisé en présence d'un détergent. Une action mécanique peut aussi être ajoutée au processus (homogénéisateur à piston par exemple). La lyse peut être induite également par ultrasons, par une lyse mécanique utilisant des billes de verre. L'extraction des protéines d'intérêt peut s'effectuer ensuite par chromatographie, telle que notamment

sur colonne de chromatographie sur gel, remplie d'une résine consistant en des billes creuses et poreuses. La taille des pores de ces billes est telle que les protéines sont séparées en fonction de leur taille. On peut citer également la chromatographie sur colonne à échange d'ions, qui permet l'extraction de protéines selon leur affinité électrostatique à des groupements chargés de la résine.

Lors de l'étape b), et au sens de la présente invention, on entend par réactif spécifique, un réactif qui, lorsqu'il est mis en contact avec du matériel biologique tel que défini précédemment, se lie avec le matériel spécifique dudit gène cible. A titre indicatif, lorsque le réactif spécifique et le matériel biologique sont d'origine nucléique, la mise en contact du réactif spécifique et du matériel biologique permet l'hybridation du réactif spécifique avec le matériel spécifique du gène cible. Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques se lient avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques pour former un complexe double brin. Ces liaisons hydrogènes se forment entre les bases complémentaires Adénine (A) et thymine (T) (ou uracile (U)) (on parle de liaison A-T) ou entre les bases complémentaires Guanine (G) et cytosine (C) (on parle de liaison G-C). L'hybridation de deux fragments nucléotidiques peut être totale (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu lors de cette hybridation comprend uniquement des liaisons A-T et des liaisons C-G. Cette hybridation peut être partielle (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences suffisamment complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu comprend des liaisons A-T et des liaisons C-G permettant de former le complexe double brin, mais également des bases non liées à une base complémentaire. L'hybridation entre deux fragments nucléotidiques dépend des conditions opératoires qui sont utilisées, et notamment de la stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases des deux fragments nucléotidiques, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux fragments nucléotidiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la

concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des fragments nucléotidiques que l'on souhaite hybrider, la température d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70 ⁰ C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. Une séquence, ou fragment nucléotidique, ou oligonucléotide, ou polynucléotide, est un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphoriques, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment nucléotidique, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique. Un motif est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P.E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification. Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification, un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléiques, préférentiellement de 15 à 30 motifs nucléiques permettant l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction d'amplification enzymatique. Par réaction d'amplification enzymatique, on entend un processus

générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes :

PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US 4,683,195, US 4,683,202 et US 4,800,159,

LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP 0 201 184,

RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO 90/01069, - 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO

90/06995,

NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO 91/02818, et

TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US 5,399,491. Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR, le réactif spécifique comprend au moins 2 amorces d'amplification, spécifiques d'un gène cible, permettant l'amplification du matériel spécifique du gène cible. Le matériel spécifique du gène cible comprend alors préférentiellement un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse d'ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible) ou un ARN complémentaire obtenu par transcription des

ADNc spécifiques d'un gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible).

Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR réalisée après une réaction de transcription reverse, on parle de RT-PCR.

Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de l'étape b) comprend au moins une sonde d'hybridation.

Par sonde d'hybridation, on entend un fragment nucléotidique comprenant au moins 5 motifs nucléotidiques, tel que de 5 à 500 motifs nucléiques, notamment de 10 à 100 motifs nucléiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec le matériel spécifique d'un gène cible. Dans la présente invention, le matériel spécifique du gène cible peut être

une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ARNm spécifique du gène cible), une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse dudit ARN messager (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible), ou encore une séquence nucléotidique comprise dans un ARN complémentaire obtenu par transcription dudit ADNc tel que décrit précédemment (on parlera alors d'ARNc spécifique du gène cible). La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une détection indirecte par une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al, Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458 ou Keller G.H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173- 249]. Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal que l'on peut détecter. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la beta galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme ³² P, ³⁵ S ou ¹²⁵ I. Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de détection. Dans ce cas, la sonde dite de détection est marquée au moyen d'un marqueur tel que défini précédemment. La sonde de détection peut être notamment une sonde de détection « molecular beacons » telle que décrite par Tyagi & Kramer (Nature biotech, 1996, 14 :303-308). Ces "molecular beacons" deviennent fluorescentes lors de l'hybridation. Elles possèdent une structure de type tige-boucle et contiennent un fluorophore et un groupe "quencher". La fixation de la séquence de boucle spécifique

avec sa séquence complémentaire d'acide nucléique cible provoque un déroulement de la tige et l'émission d'un signal fluorescent lors de l'excitation à la longueur d'onde qui convient.

Pour la détection de la réaction d'hybridation, on peut utiliser des séquences cibles marquées, directement (notamment par l'incorporation d'un marqueur au sein de la séquence cible) ou indirectement (notamment par l'utilisation d'une sonde de détection telle que définie précédemment) la séquence cible. On peut notamment réaliser avant l'étape d'hybridation une étape de marquage et/ou de clivage de la séquence cible, par exemple en utilisant un désoxyribonucléotide triphosphate marqué lors de la réaction d'amplification enzymatique. Le clivage peut être réalisé notamment par l'action de l'imidazole et de chlorure de manganèse. La séquence cible peut aussi être marquée après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde de détection selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO 91/19812. Un autre mode particulier préférentiel de marquage d'acides nucléiques est décrit dans la demande FR2 780 059.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la sonde de détection comprend un flurophore et un quencher. Selon un mode encore plus préféré de réalisation de l'invention, la sonde d'hybridation comprend un flurophore FAM (6-carboxy- fluorescein) ou ROX (6-carboxy-X-rhodamine) en son extrémité 5' et un quencher (Dabsyl) en son extrémité 3'.

La sonde d'hybridation peut être également une sonde dite de capture. Dans ce cas, la sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption. Comme support solide, on peut utiliser des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide

peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO-A-94/12670, d'une particule. On peut également immobiliser sur le support plusieurs sondes de capture différentes, chacune étant spécifique d'un gène cible. En particulier, on peut utiliser comme support une biopuce sur laquelle peut être immobilisé un grand nombre de sondes. Par biopuce, on entend un support solide de dimension réduite où est fixée une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées. Le concept de biopuce, ou puce à ADN, date du début des années 90. Il repose sur une technologie pluridisciplinaire intégrant la micro-électronique, la chimie des acides nucléiques, l'analyse d'images et l'informatique. Le principe de fonctionnement repose sur un fondement de la biologie moléculaire: le phénomène d'hybridation, c'est-à-dire l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences d'ADN et/ou d'ARN. La méthode des biopuces repose sur l'emploi de sondes de capture fixées sur un support solide sur lesquelles on fait agir un échantillon de fragments nucléotidiques cibles marqués directement ou indirectement avec des fluorochromes. Les sondes de capture sont positionnées de manière spécifique sur le support ou puce et chaque hybridation donne une information particulière, en relation avec le fragment nucléotidique cible. Les informations obtenues sont cumulatives, et permettent par exemple de quantifier le niveau d'expression d'un gène ou de plusieurs gènes cibles. Pour analyser l'expression d'un gène cible, on peut alors réaliser un support comprenant une multitude de sondes, qui correspondent à tout ou partie du gène cible, qui est transcrit en ARNm. Au sens de la présente invention, on entend par support de basse densité, un support comprenant moins de 50 sondes. Au sens de la présente invention, on entend par support de moyenne densité, un support comprenant de 50 sondes à 10 000 sondes. Au sens de la présente invention, on entend par support de haute densité, un support comprenant plus de 10 000 sondes.

On hybride alors par exemple les ADNc ou les ARNc spécifiques d'un gène cible que l'on souhaite analyser sur des sondes de capture spécifique. Après hybridation, le support ou puce est lavé(e), et les complexes ADNc ou ARNc marquées / sondes de capture sont révélés par un ligand de forte affinité lié par exemple à un marqueur de type fluorochrome. La fluorescence est lue par exemple par un scanner et l'analyse de la fluorescence est traitée par informatique. On peut citer à titre indicatif, les puces à

ADN mises au point par la société Affymetrix ("Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays", M. Chee et al, Science, 1996, 274, 610-614. "Light- generated oligonucleotide arrays for rapide DNA séquence analysis", A. Caviani Pease et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026), pour les diagnostics moléculaires. Dans cette technologie, les sondes de capture sont généralement de tailles réduites, autour de 25 nucléotides. D'autres exemples de biopuces sont donnés dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 1998, n°16, p. 40-44 ; F. Ginot, Human Mutation, 1997, n°10, p.1-10; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1996, n°l(3), p.183-200 ; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 1994, n° 22(15), p. 2915- 2921 ; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 1998, n° 16, p. 541-546 ou dans les brevets US-A-4,981,783, US-A-5,700,637, US-A-5,445,934, US-A-5,744,305 et US-A- 5,807,522. La caractéristique principale du support solide doit être de conserver les caractéristiques d'hybridation des sondes de capture sur les fragments nucléotidiques cibles tout en générant un bruit de fond minimum pour la méthode de détection. Pour l'immobilisation des sondes sur le support, on distingue trois grands types de fabrication.

Il y a, tout d'abord, une première technique qui consiste en un dépôt de sondes pré-synthétisées. La fixation des sondes se fait par transfert direct, au moyen de micropipettes, de micro-pointes ou par un dispositif de type jet d'encre. Cette technique permet la fixation de sondes de taille allant de quelques bases (5 à 10) jusqu'à des tailles relativement importantes de 60 bases (impression) à quelques centaines de bases (micro-déposition) :

L'impression est une adaptation du procédé utilisé par les imprimantes à jet d'encre. Elle repose sur la propulsion de très petites sphères de fluide (volume <1 ni) et à un rythme pouvant atteindre 4000 gouttes/secondes. L'impression n'implique aucun contact entre le système libérant le fluide et la surface sur laquelle il est déposé.

La micro-déposition consiste à fixer des sondes longues de quelques dizaines à plusieurs centaines de bases à la surface d'une lame de verre. Ces sondes sont généralement extraites de bases de données et se présentent sous forme de produits amplifiés et purifiés. Cette technique permet de réaliser des puces dénommées microarrays portant environ dix mille spots, dit zones de reconnaissance, d'ADN sur

une surface d'un peu moins de 4 cm2. Il ne faut toutefois pas oublier l'emploi de membranes de Nylon, dites « macroarrays », qui portent des produits amplifiés, généralement par PCR, avec un diamètre de 0,5 à 1 mm et dont la densité maximale est de 25 spots/cm2. Cette technique très flexible est utilisée par de nombreux laboratoires. Dans la présente invention, cette dernière technique est considérée comme faisant partie des biopuces. On peut toutefois déposer en fond de plaque de microtitration un certain volume d'échantillon dans chaque puits, comme c'est le cas dans les demandes de brevet WO-A-00/71750 et FR 00/14896, ou déposer au fond d'une même boîte de Pétri un certain nombre de gouttes séparées les unes des autres, selon une autre demande de brevet FR00/14691.

La deuxième technique de fixation des sondes sur le support ou puce est appelée la synthèse in situ. Cette technique aboutit à l'élaboration de sondes courtes directement à la surface de la puce. Elle repose sur la synthèse d'oligonucléotides in situ (voir notamment les demandes de brevet WO 89/10977 et WO 90/03382), et est fondée sur le procédé des synthétiseurs d'oligonucléotides. Elle consiste à déplacer une chambre de réactions, où se déroule la réaction d'élongation d'oligonucléotides, le long de la surface de verre.

Enfin, la troisième technique est appelée la photolithographie, qui est un procédé à l'origine des biopuces développées par Affymetrix. Il s'agit également d'une synthèse in situ. La photolithographie est dérivée des techniques des microprocesseurs. La surface de la puce est modifiée par la fixation de groupements chimiques photolabiles pouvant être activés par la lumière. Une fois illuminés, ces groupes sont susceptibles de réagir avec l'extrémité 3' d'un oligonucléotide. En protégeant cette surface par des masques de formes définies, on peut illuminer et donc activer sélectivement des zones de la puce où l'on souhaite fixer l'un ou l'autre des quatre nucléotides. L'utilisation successive de masques différents permet d'alterner des cycles de protection/réaction et donc de réaliser les sondes d'oligonucléotides sur des spots d'environ quelques dizaines de micromètre carré (μm2). Cette résolution permet de créer jusqu'à plusieurs centaines de milliers de spots sur une surface de quelques centimètres carré (cm2). La photolithographie présente des avantages : massivement parallèle, elle permet de créer une puce de N-mères en seulement 4 x N cycles. Toutes

ces techniques sont utilisables avec la présente invention. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le au moins un réactif spécifique de l'étape b) définie précédemment comprend au moins une sonde d'hybridation, qui est préférentiellement immobilisée sur un support. Ce support est préférentiellement un support de basse , haute ou moyenne densité tel que définie précédemment.

Ces étapes d'hybridation sur support comprenant une multitude de sondes peuvent être précédées d'une étape de réaction d'amplification enzymatique, telle que définie précédemment, pour augmenter la quantité de matériel génétique cible.

A titre indicatif, lorsque le réactif spécifique et le matériel biologique sont d'origine protéique, le réactif spécifique comprend des anticorps spécifiques de la protéine traduite du gène cible. La mise en contact du réactif spécifique et du matériel biologique permet la formation d'un complexe dit antigène-anticorps entre le réactif spécifique et matériel spécifique du gène cible. Par anticorps, on entend tant un anticorps entier qu'un fragment d'anticorps.

Les anticorps recombinants, spécifiques de la protéine traduite du gène cible peuvent être obtenus selon des procédés classiques connus de l'homme du métier, à partir d'organismes procaryotes, tels que bactéries, ou à partir d'organismes eucaryotes, tels que levures, cellules de mammifères, de plantes, d'insectes ou d'animaux, ou par des systèmes de production extra-cellulaire.

Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés selon les techniques classiques connues de l'homme du métier telles que la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après. Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris, (ou des cellules en culture dans le cadre d'immunisations in vitro) avec un antigène cible d'intérêt, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre ledit antigène. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (murines dans l'exemple) pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone,

chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis de l'antigène d'intérêt pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert en une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatographie d'affinité.

Des fragments d'anticorps peuvent par exemple être obtenus par protéolyse. Ainsi, ils peuvent être obtenus par digestion enzymatique, résultant en des fragments de type Fab (traitement à la papaïne ; Porter RR, 1959, Biochem. J., 73 : 119-126) ou de type F(ab)'2 (traitement à la pepsine ; Nisonoff A. et al, 1960, Science, 132 : 1770-1771). Ils peuvent également être préparés par voie recombinante (Skerra A., 1993, Curr. Opin. Immunol., 5 : 256-262). Un autre fragment d'anticorps qui convient aux fins de l'invention comprend un fragment Fv qui est un dimère constitué de l'association non covalente du domaine variable léger (VL) et du domaine variable lourd (VH) du fragment Fab, donc de l'association de deux chaînes polypeptidiques. Afin d'améliorer la stabilité du fragment Fv due à la dissociation des deux chaînes polypeptidiques, ce fragment Fv peut être modifié par génie génétique en insérant un lien peptidique adapté entre le domaine VL et le domaine VH (Huston P. et al., 1988, Proc. Natl.Acad. Sci.USA, 85 : 5879-5883). On parle alors de fragment scFv (« single chain Fragment variable ») car il est constitué d'une seule chaîne polypeptidique. L'utilisation d'un lien peptidique composé préférentiellement de 15 à 25 acides aminés permet de relier l'extrémité C-terminale d'un domaine à l'extrémité N-terminale de l'autre domaine, constituant ainsi une molécule monomérique dotée de propriétés de liaison similaires à celles de l'anticorps sous sa forme complète. Les deux orientations des domaines VL et VH conviennent (VL-lien-VH et VH-lien-VL) car elles présentent des propriétés fonctionnelles identiques. Bien entendu, tout fragment connu de l'homme du métier et présentant les caractéristiques immunologiques définies ci-dessus convient aux fins de l'invention.

Lors de l'étape c) la détermination de l'expression d'un gène cible peut être réalisée par tous les protocoles connus de l'homme du métier.

D'une manière générale, l'expression d'un gène cible peut être analysée par la détection des ARNm (ARN messagers) qui sont transcrits du gène cible à un instant donné ou par la détection des protéines issues de ces ARNm.

L'invention concerne préférentiellement la détermination de l'expression d'un gène cible par la détection des ARNm issus de ce gène cible selon tous les protocoles bien connus de l'homme du métier. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on détermine simultanément l'expression de plusieurs gènes cibles, par la détection de plusieurs ARNm différents, chaque ARNm étant issus d'un gène cible. Lorsque le réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification, on peut, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:

1) après avoir extrait comme matériel biologique, les ARN totaux (comprenant les ARN de transfert (ARNt), les ARN ribosomaux (ARNr) et les ARN messagers (ARNm)) d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse afin d'obtenir les ADN complémentaires (ou ADNc) desdits ARNm. A titre indicatif, cette réaction de transcription reverse peut être réalisée à l'aide d'une enzyme reverse transcriptase qui permet d'obtenir, à partir d'un fragment d'ARN, un fragment d'ADN complémentaire. On peut utiliser notamment l'enzyme reverse transcriptase provenant de l'AMV (Avian Myoblastosis Virus) ou de MMLV (Moloney Murine Leukaemia Virus). Lorsque l'on souhaite plus particulièrement obtenir uniquement les ADNc des ARNm, on réalise cette étape de transcription reverse en présence de fragments nucléotidiques comprenant uniquement des bases thymine (polyT), qui s'hybrident par complémentarité sur la séquence polyA des ARNm afin de former un complexe polyT-polyA qui sert alors de point de départ à la réaction de transcription reverse réalisée par l'enzyme reverse transcriptase. On obtient alors des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible).

2) on met en contact la ou les amorces d'amplification spécifiques d'un gène cible avec les ADNc spécifique du gène cible et les ADNc non spécifique du gène cible. La ou les amorces d'amplification spécifiques d'un gène cible s'hybrident avec

les ADNc spécifique du gène cible et on amplifie spécifiquement une région prédéterminée, de longueur connue, des ADNc provenant des ARNm issus du gène cible. Les ADNc non spécifiques du gène cible ne sont pas amplifiés, alors qu'on obtient alors une grande quantité d'ADNc spécifiques du gène cible. Au sens de la présente invention, on parle indifféremment d' « ADNc spécifiques du gène cible » ou d' « ADNc provenant des ARNm issus du gène cible ». Cette étape peut être réalisée notamment par une réaction d'amplification de type PCR ou par toute autre technique d'amplification telle que définie précédemment. En PCR, on peut également amplifier simultanément plusieurs ADNc différents, chacun étant spécifique de différents gènes cibles par l'utilisation de plusieurs couples d'amorces d'amplification différents, chacune étant spécifique d'un gène cible: on parle alors d'amplification en multiplex.

3) on détermine l'expression du gène cible en détectant et quantifiant les ADNc spécifiques du gène cible obtenus lors de l'étape 2) ci dessus. Cette détection peut être réalisée après migration par électrophorèse des ADNc spécifiques du gène cible en fonction de leur taille. Le gel et le milieu de migration peuvent comprendre du bromure d'éthydium afin de permettre la détection directe des ADNc spécifiques du gène cible lorsque le gel est placé, après un temps de migration donné, sur une table lumineuse à rayons UV (ultra violet) par l'émission d'un signal lumineux. Ce signal est d'autant plus lumineux que la quantité des ADNc spécifiques du gène cible est importante. Ces techniques d'électrophorèse sont bien connues de l'homme du métier. Les ADNc spécifiques du gène cible peuvent également être détectés et quantifiés par l'utilisation d'une gamme de quantification obtenue par une réaction d'amplification conduite jusqu'à saturation. Afin de tenir compte de la variabilité d'efficacité enzymatique qui peut être observée lors des différentes étapes (transcription reverse, PCR...), on peut normaliser l'expression d'un gène cible de différents groupes de patients, par la détermination simultanée de l'expression d'un gène dit de ménage, dont l'expression est similaire chez les différents groupes de patients. En réalisant un rapport entre l'expression du gène cible et l'expression du gène de ménage, c'est à dire en réalisant un rapport entre la quantité d'ADNc spécifiques du gène cible, et la quantité d'ADNc spécifiques du gène de ménage, on corrige ainsi toute variabilité entre les différentes expérimentations. L'homme du métier pourra se référer notamment aux publications

suivantes : Bustin SA, JMoI Endocrinol , 2002, 29 : 23-39 ; Giulietti A Methods, 2001, 25 : 386-401.

Lorsque le réactif spécifique comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:

1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible).

2) on met en contact tous les ADNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ADNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ADNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. La réaction d'hybridation peut être réalisée sur un support solide qui inclut tous les matériaux tels qu'indiqués précédemment. Selon un mode préféré de réalisation, la sonde d'hybridation est immobilisée sur un support. Préférentiellement, le support est un support de basse , haute ou moyenne densité tel que définie précédemment. La réaction d'hybridation peut être précédée d'une étape d'amplification enzymatique des ADNc spécifique du gène cible telle que décrite précédemment pour obtenir une grande quantité d'ADNc spécifiques du gène cible et augmenter la probabilité qu'un ADNc spécifiques d'un gène cible s'hybride sur une sonde de capture spécifique du gène cible. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de clivage des ADNc spécifiques du gène cible telle que décrite précédemment, par exemple en utilisant un désoxyribonucléotide triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le clivage peut être réalisé notamment par l'action de l'imidazole et de chlorure de manganèse. L'ADNc spécifique du gène cible peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812. D'autres modes particuliers

préférentiels de marquage et/ou clivage d'acides nucléiques sont décrits dans les demandes WO 99/65926, WO 01/44507, WO 01/44506, WO 02/090584, WO 02/090319.

3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybrides les sondes de capture spécifiques du gène cible avec les ADNc spécifiques du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ADNc spécifique du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur.

Lorsque le au moins un réactif spécifique mis en contact l'étape b) du procédé selon l'invention comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut également déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:

1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les ADNc des ARNm du matériel biologique. On réalise ensuite la polymérisation de l'ARN complémentaire du ADNc par l'utilisation d'une enzyme polymérase de type T7 polymérase qui fonctionne sous la dépendance d'un promoteur et qui permet d'obtenir, à partir d'une matrice d'ADN, l'ARN complémentaire. On obtient alors les ARNc des ADNc des ARNm spécifiques du gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible) et les ARNc des ADNc des ARNm non spécifiques du gène cible.

2) on met en contact tous les ARNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ARNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ARNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. Lorsque l'on souhaite analyser simultanément l'expression de plusieurs gènes cibles, on peut immobiliser sur le support plusieurs sondes de capture différentes, chacune étant spécifique d'un gène cible. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de clivage des ARNc spécifiques du gène cible telles que décrites précédemment.

3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybridées les sondes de capture spécifiques du gène cible avec l'ARNc spécifique du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ARNc spécifique du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur. L'utilisation d'ARNc est particulièrement avantageux lorsqu'on utilise un support de type biopuce sur lequel est hybride un grand nombre de sondes. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les étapes B et C sont effectuées en même temps. Ce mode préféré peut être notamment mise en oeuvre par « NASBA en temps réel » qui regroupe en une étape unique la technique d'amplification NASBA et la détection en temps réel qui fait appel à des "molecular beacons". La réaction NASBA intervient dans le tube, produisant de l'ARN simple brin avec lequel les "molecular beacons" spécifiques peuvent s'hybrider simultanément pour donner un signal fluorescent. La formation des nouvelles molécules d'ARN est mesurée en temps réel par contrôle continu du signal dans un lecteur fluorescent. Contrairement à une amplification par RT-PCR, l'amplification en NASBA peut se faire en présence d'ADN dans l'échantillon. Il n'est donc pas nécessaire de vérifier que l'ADN a bien été complètement éliminé lors de l'extraction des ARN. A titre indicatif, lorsque le réactif spécifique et le matériel biologique sont d'origine protéique, l'étape c) peut être notamment effectue par Western Blot ou ELISA, ou toute autre méthode connue de l'homme du métier.

A titre indicatif, la technique ELISA est une technique biochimique de référence utilisée en immunologie pour détecter la présence d'un anticorps ou d'un antigène dans un échantillon. La technique utilise deux anticorps, l'un d'entre eux étant spécifique à l'antigène et l'autre étant couplé à une enzyme.

A titre indicatif, la technique Western Blot est un test pour détecter une protéine spécifique dans un échantillon à l'aide d'un anticorps spécifique de cette protéine comprenant les étapes suivantes : La première étape est une électrophorèse sur gel, qui permet de séparer les protéines de l'échantillon selon leur taille

Les protéines dans le gel sont alors transférées sur une membrane (nitrocellulose, PVDF...) par pression ou par application d'un courant électrique, les protéines se fixant à la membrane grâce à des interactions hydrophobes et ioniques.

Après saturation des sites d'interactions non spécifiques, un premier anticorps, spécifique de la protéine a étudier (anticorps primaire) est incubé avec la membrane.

La membrane est ensuite rincée afin d'enlever les anticorps primaires non liés, puis incubée avec des anticorps dits secondaires, qui vont se lier aux anticorps primaires. Cet anticorps secondaire est habituellement lié à une enzyme qui permet l'identification visuelle de la protéine étudiée sur la membrane. Comme pour les techniques ELISA, l'ajout d'un substrat de l'enzyme engendre une réaction colorée qui est visible sur la membrane.

L'analyse de l'expression d'un gène cible choisi parmi l'une quelconque des SEQ ID N° l à 299, 300 à 362 permet alors de disposer d'un outil pour le diagnostic notamment précoce d'un diabète.

On peut par exemple analyser l'expression d'un gène cible chez un patient dont on ne connaît pas son statut, et comparer avec des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients témoins, de patients pre diabétiques, et diabétiques. Plus précisément, l'analyse de l'expression d'un gène cible choisi parmi l'une quelconque des SEQ ID N° 6 à 63; SEQ ID N° 288 à 293; SEQ ID N° 125 à 200; SEQ ID N° 201 à 287; SEQ ID N° 294 à 299 ; SEQ ID N° 306 à 321 ; SEQ ID N° 300, 301 ,303 et 305; SEQ ID N° 335 à 362 permet alors de disposer d'un outil très adapté pour le diagnostic précoce d'un diabète.

Les figures permettront de mieux comprendre l'invention.

La figure 1 représente un clustering hiérarchique sur 30 échantillons (10 DTl, 10 PDTl et 10 C) réalisé sur 355 probe sets correspondant à 299 gènes. Chaque colonne correspond à un échantillon et chaque ligne à un gène. Le blanc représente les faibles niveaux d'expression, le gris les niveaux intermédiaires et le noir les niveaux forts. La hauteur des branches du dendrogramme indique l'indice de similarité entre les individus (dendrogramme du haut) ou entre les gènes (dendrogramme de gauche).

La figure 2 et 3 représentent les résultats du K-means clustering sur les données d'expression (K=5) basés sur les 355 probes sets correspondants à 299 gènes (figure 2) et (K=4) basés sur les 63 probe sets correspondants à 63 gènes (figure 3). L'axe des ordonnées représente les médianes d'expression normalisées pour chaque probe set et l'axe des abscisses indique les différents groupes étudiés.

Les exemples ci après sont donnés à titre explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention.

EXEMPLES

Sélection des patients :

La participation à ce protocole de recherche clinique a été proposée aux patients reçus en consultation et traités au sein de divers services pédiatriques hospitaliers des Hospices Civiles de Lyon. Afin de faciliter sa bonne réalisation, les prélèvements se sont intercalés consécutivement à un bilan sanguin indépendant de l'étude. Ainsi, 2 séries de trois groupes ont été sélectionnés pour la réalisation de cette étude, formant ainsi un groupe test et un groupe de confirmation :

- Groupe test : - Groupe de 10 patients diabétiques (DTl) moyenne d'âge de 9,1 ± 2,8 ans

- Groupe de 10 pré diabétiques (PDTl) moyenne d'âge de 11,4 ± 3,4 ans

- Groupe contrôle (C) de 10 individus moyenne d'âge de 8,1 ± 3 ans

- Groupe de confirmation : - Groupe de 9 patients diabétiques (DTl) moyenne d'âge de 11,2 ± 3,73 ans

- Groupe de 11 pré diabétiques (PDTl) moyenne d'âge de 9,7 ± 6,37 ans

- Groupe contrôle (C) de 10 individus moyenne d'âge de 9,3 ± 4,72 ans

Dans les 2 séries, les patients diabétiques ont été prélevés dans les 48 heures qui suivaient la première injection d'insuline. Ces patients présentaient une hyperglycémie et une positivité pour les anticorps GAD et/ou IA2. Les sujets pré diabétiques collectés présentaient une glycémie normale et une positivité pour les anticorps GAD et/ou IA2. Le troisième groupe représenté par les individus contrôles était exempt de toute maladie auto-immune et/ou infectieuse, négatif pour les anticorps GAD et IA2 et présentait une glycémie normale.

Collecte des échantillons sanguins et isolement des ARN

Des échantillons de sang périphérique ont été collectés dans des tubes PAXgene™ Blood RNA (PreAnalytix, Hilden, Allemagne). Après le prélèvement, les tubes PAXgene ont été laissés à température ambiante 2 h, puis conservés à -20 ⁰ C jusqu'à l'extraction du matériel biologique. Les ARN totaux ont été isolés en utilisant le kit PAXgene Blood RNA kit® (PreAnalytix) en respectant les recommandations du fabriquant. Brièvement, les tubes ont été centrifugés (10 min, 3000 g) afin d'obtenir un culot d'acides nucléiques. Ce culot a été lavé et repris dans un tampon contenant de la protéinase K nécessaire à la digestion des protéines (10 min à 55°C). Une nouvelle centrifugation (5 min 19 000g) a été effectuée pour éliminer les débris cellulaires et de l'éthanol a été ajouté afin d'optimiser les conditions de fixation des acides nucléiques. Les ARN totaux ont été spécifiquement fixés sur les colonnes PAXgene RNA spin column et, avant l'élution de ceux-ci, une digestion de l'ADN contaminant a été effectuée à l'aide du RNAse free DNAse set (Qiagen Ltd, Crawley, UK). Ensuite, la quantité des ARN totaux a été évaluée par spectrophotométrie. Quant à leur intégrité, elle a été estimée en utilisant les puces RNA 6000 et le Bioanalyzer Agilent suivant le protocole recommandé par le constructeur (Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne). Ainsi, l'algorithme RNA Integrity Number (RTN) a été utilisé pour estimer l'intégrité des ARN totaux à partir du tracé electrophorétique de l'échantillon d'ARN [Schroeder A. BMC Mol Biol 2006].

Synthèses d'ADNc, synthèse et marquage des ARNc, hybridation des puces et obtention des contrôles qualité

Afin d'analyser l'expression des gènes cibles selon l'invention, les ADN complémentaires (ADNc) des ARNm contenus dans les ARN totaux ont été synthétisés à l'aide du kit One-Cycle cDNA Synthesis kit (Affymetrix, Santa Clara, CA). Les ADNc ont été synthétisés à partir de 3 μg d'ARN totaux par l'utilisation de 200 unités de l'enzyme de transcription reverse SuperScriptlI et 100 pmol d'amorce poly-T contenant le promoteur de la T7 polymérase (T7-oligo(dT)24-primer). Cette synthèse d'ADNc de l'échantillon s'est faite, mélangée avec un cocktail d'ARN bactérien (B. subtilis) obtenu à partir du kit Eukaryotic PoIy-A RNA Control kit (Affymetrix) qui a servi de contrôle exogène positif du processus de marquage. Les ADNc ainsi obtenus ont ensuite été purifiés en utilisant les colonnes ADNc du kit GeneChip® Sample Cleanup Module (Affymetrix). Ensuite, la transcription in vitro a permis d'obtenir l'ARNc à partir d'ADNc. Les ARNc ont été générés par transcription in vitro grâce à une T7 polymérase et marqués par incorporation d'un ribonucléique biotinylé (pseudouridine). Cette étape de marquage de 16h à 37°C a été effectuée en utilisant le kit IVT de marquage GeneChip® Expression 3 '-Amplification Reagents for IVT Labeling (Affymetrix). Les ARNc purifiés par les colonnes ARNc du kit GeneChip® Sample Cleanup Module (Affymetrix) ont ensuite été quantifiés par spectrophotométrie et contrôlés sur puces RNA 6000 avec le Bioanalyzer (Agilent). Une fois la concentration d'ARNc ajustée à une concentration de 1 μg/μl d'ARNc, celui-ci a été fragmenté dans un tampon de fragmentation fourni dans le kit GeneChip® Sample Cleanup Module (Affymetrix) pendant 35 min à 94°C. Le succès d'une telle fragmentation a été vérifié sur puces RNA 6000 avec le Bioanalyzer (Agilent).

Puis, 20 μg d'ARNc fragmentés issus de chaque échantillon ont été ajoutés à un tampon d'hybridation (Affymetrix) et 200 μl de cette solution ont été mis en contact pendant 16 h à 45°C sur une puce d'expression Human Génome U133Plus 2.0 GeneChip® (Affymetrix). Cette puce comporte 54675 groupes de sondes représentant environs 38500 gènes selon le protocole d' Affymetrix tel que décrit sur le site internet d' Affymetrix. Afin d'enregistrer les meilleures performances d'hybridation et de

lavage, des ARN qualifiés de « contrôle » biotinylés (bioB, bioC, bioD et cre) et des oligonucléotides (oligo B2) ont également été inclus dans le tampon d'hybridation. Après l'étape d'hybridation, la solution d'ARNc biotinylée et hybridée sur la puce, a été révélée par l'utilisation d'une solution de streptavidine-phycoerythrine et le signal a été amplifié par l'utilisation d'anticorps anti-streptavidine. L'hybridation a été réalisée dans une étuve d'hybridation « GeneChip Hybridisation oven » (Affymetrix), et le protocole EukGE-WS2v5 du protocole d'Affymetrix a été suivi. Les étapes de lavage et de révélation ont été réalisées sur une station « Fluidics Station 450» (Affymetrix). Chaque puce U133Plus 2.0 a ensuite été analysée sur un scanner « GeneChip Scanner 3000 » (Affymetrix). Ce scanner permet la détection du signal émis par les molécules fluorescentes après excitation par un laser argon en utilisant la technique du microscope à épifluorescence. On obtient ainsi pour chaque position, un signal proportionnel à la quantité de ARNc fixés. Le signal a ensuite été analysé par le logiciel GenChip Operating Software (GCOS 1.2, Affymetrix). Afin de prévenir les variations obtenues par l'utilisation de différentes puces, il a été réalisé une approche de normalisation globale utilisant le logiciel GCOS 1.2 (Affymetrix), qui, grâce à un algorithme statistique, permet de définir si un gène était exprimé ou non. Chaque gène représenté sur la puce U133Plus 2.0 était couvert par 11 couples de sondes de 25 oligonucléotides. Par couple de sondes, on entend une première sonde qui s'hybridait parfaitement (on parle alors de sondes PM ou perfect match) avec un des ARNc issus d'un gène cible, et une deuxième sonde, identique à la première sonde à l'exception d'un mésappariement (on parle alors de sonde MM ou mismatched) au centre de la sonde. Chaque sonde MM servait à estimer le bruit de fond correspondant à une hybridation entre deux fragments nucléotidiques de séquence non complémentaire. (Affymetrix technical note "Statistical Algorithme Référence Guide" ; Lipshutz, et al (1999) Nat. Genêt. 1 Suppl, 20-24). Ainsi, la qualité des 59 puces hybridées, correspondantes aux 59 échantillons, a été vérifiée grâce aux contrôles qualité proposés par Affymetrix. Le ratio 375' des gènes de la glyceraldehyde-3 -phosphate déshydrogénase (GAPDH) et de la β-actine (HSA) étaient inférieurs à 2. Le pourcentage détecté de gènes présents par l'algorithme du logiciel était supérieur à 33,5% et la moyenne du bruit de fond inférieure à 100 . Le scaling factor différait d'un

facteur inférieur à 3 entre les puces (Affymetrix technical note "Statistical Algorithme Référence Guide").

Analyse des données d'expression de gènes Afin de pouvoir comparer les puces entres elles, les données brutes (fichier « .CEL ») ont été normalisées suivant la méthode RMA (Robust Multichip Average) en considérant uniquement des sondes PM [Irizarry RA NAR 2003 ; Irizarry RA Biostatistics 2003 ; Bolstad BM Bioinformatics 2003]. Cette analyse a été réalisée en utilisant le package Siggenes de BioConductor (http:/www.bioconductor.org) sous le logiciel R (http://lib.stat.cmu.edu/R/CRAN).

Les gènes différemment exprimés entre les trois groupes ont été identifiés après application de la méthode statistique de « Significant Analysis of Microarrays » (SAM) [Tusher PNAS 2001]. Ainsi, par cette méthode d'analyse, le concept de permutation testé (n = 1000) a permis l'identification de gènes discriminants entre les groupes. Une première analyse réalisée sur le groupe test a mis en évidence une première série de gènes associés à un taux d'erreur (FDR) < 0,01. Ensuite, une deuxième analyse a été réalisée en combinant les résultats obtenus sur le groupe test et le groupe de confirmation. Cette dernière a donné une seconde liste associée à un FDR < 0,05 qui comprenaient à la fois des gènes issus de la première analyse mais également des nouveaux gènes.

Pour visualiser les profils d'expression des gènes et étudier les relations entre ces profils et les individus, des méthodes de clustering ont été utilisées et réalisées à partir du logiciel Spotfire (Spotfire, Gothenburg, Sweden). Tout d'abord, une analyse par clustering hiérarchique a été réalisée sur l'ensemble des gènes identifiés dans la première analyse du groupe test, suite à l'analyse statistique (SAM, FDR 1%). Les indices de similarité entre les gènes et les patients ont été calculés en utilisant le test de corrélation de Pearson, et l'organisation des patients et des gènes a été réalisée en appliquant la méthode de clustering des moyennes non pondérées (UPGMA). Afin de tenir compte des différences constitutives d'expression entre les gènes, les niveaux d'expression de chaque gène ont été normalisés en appliquant une loi normale centrée réduite. Ensuite, les gènes ont été catégorisés en groupes correspondant aux différents

profils d'expression. Une analyse utilisant la méthode des K-means a été réalisée sur la base des médianes d'expression des gènes sélectionnés. De la même façon que précédemment, ces médianes ont subi une normalisation en appliquant une loi normale centrée réduite. L'initialisation du clustering a été faite sur la méthode de « data centroid based search » et les mesures de similarité ont été calculées par la méthode des distances euclidiennes.

Dans le cadre de la première analyse, un total de 355 groupes de sondes correspondant à 299 gènes distincts ont été identifiés différemment exprimés entre les groupes des PDTl, DTl et des contrôles avec un taux d'erreur associé de 0,01 (figure 1). Pour chaque gène, les ratios des médianes (Rmed) d'expression entre les 3 groupes (Rmed DT1/C, Rmed DT1/PDT1 et Rmed PDT1/C) sont également représentés dans le tableau 1. Ainsi, par exemple, le gène cible de SEQ ID N° 6 est très pertinente pour discriminer les trois groupes de patients, car la différence d'expression de ce gène est très marquée entre les groupes. Les résultats des gènes de la seconde analyse (groupe test + confirmation) sont disponibles dans le tableau 2. Cette analyse supplémentaire a permis également de mettre en évidence les gènes de SEQ ID No300 a 362 .

L'analyse de la distribution des profils d'expression a également été réalisée par la méthode des K-means clustering, et a permis de réunir ces profils en un nombre limité de groupes. Ainsi, une répartition des profils d'expressions a pu être réalisée en 5 groupes (K = 5) dans la première analyse (groupe test, figure 2) et en 4 groupes (K = 4) dans la deuxième analyse (groupe test + confirmation, figure 3). Cette répartition permettait d'identifier encore plus précisément les gènes pertinents pour un diagnostic précoce, ou pour un diagnostic plus avancé. Une diminution de l'expression des gènes a été observée dans le profil 1 (n = 5 gènes ; SEQ ID N° 1 à 5) entre les groupes C, PDTl et DTl : plus le diabète était avancé, plus l'expression était diminuée.

Le profil 2 (n = 64 gènes ; SEQ ID N° 6 à 63; SEQ ID N° 288 à 293), profil 7 (n = 16 gènes ; SEQ ID N° 306 à 321) et une partie du profil 6 (n = 4 gènes ; SEQ ID N° 300, 301 ,303 et 305) montraient une sur-expression des gènes dans le groupe des PDTl par rapport aux groupe DTl et le groupe Contrôle C, dont l'expression était comparable.

Le profil 4 (n = 82 gènes ; SEQ ID N° 125 à 200; SEQ ID N° 288 à 293) montrait également une sur-expression des gènes dans le groupe des PDTl par rapport aux groupe DTlet le groupe Contrôle C. Par contre, l'expression des gènes était plus élevée dans le groupe DTl comparé au groupe C. Le profil 3 (n = 67 gènes ; SEQ ID N° 64 à 124; SEQ ID N° 294 à 299) et le profil 8 (n = 13 gènes ; SEQ ID N° 322 à 334) montraient une sur-expression dans le groupe DTl par rapport aux groupe PDTl et le groupe Contrôle C.

Enfin, le profil 5 (n = 93 gènes ; SEQ ID N° 201 à 287; SEQ ID N° 294 à 299) et le profil 9 (n = 28 gènes ; SEQ ID N° 335 à 362) montraient une faible expression dans le groupe PDTl par rapport au groupe DTlet au groupe Contrôle C.

Ces résultats démontrent que les gènes des profils 2, 4, 5, 6, 7 et 9 sont particulièrement adaptés pour un diagnostic précoce du diabète, alors que les gènes du profil 3 et 8 sont plutôt adaptés à un diagnostic plus avancé.

Tableau 1 - Liste des gènes différentiellement exprimés chez les patients C, PDTl, et DTl

Tableau 2 - Liste des gènes différentiellement exprimés chez les patients C, PDTl, et DTl