DESCRIPCIÓN

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se relaciona en general con el diagnóstico de cáncer y el pronóstico de los tratamientos en oncología. En particular se refiere a un método para determinar la respuesta de un cáncer frente a agentes terapéuticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La mayoría de los tratamientos utilizados en oncología, basan su mecanismo de acción en el daño que causan en el ADN, como la quimioterapia en gran parte utiliza fármacos que dañan el ADN y la radioterapia por si misma daña el ADN [1-3].

La célula responde de dos maneras al daño, bien por parada del ciclo celular que permitiría que se reparara el ADN antes de la replicación, o bien por inducción de apoptosis o muerte celular programada [4, 5]. Esta apoptosis elimina la célula que contiene daño génico y al no poder perpetuarse se elimina el riesgo. Tanto la parada del ciclo celular, como la apoptosis se encuentran reguladas por p53. p53 actúa en los llamados puntos de control Gl /S o G2/M [6-8].

La proteína p53 está mutada muy frecuentemente en casi todos los tipos de cáncer, aunque su frecuencia varía entre el 20 y el 70 por ciento. Estas mutaciones ocurren en el dominio de unión al ADN impidiendo que p53 funcione como un activador transcripcional. Se han descrito más de 10.000 mutaciones diferentes de esta proteína [9].

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) La respuesta celular de p53 frente a diversos fármacos (doxorubicina, actinomicina D, nocodazol, taxol entre otros) o radiación (luz ultravioleta o radiación ionizante) es ilustrada en la Figura 1. Células A549 procedentes de un cáncer de pulmón humano que es normal para p53 fue tratada en cultivo con actinomicina D, nocodazol, taxol o bien tratada por irradiación con luz ultravioleta-C. En todos los casos la consecuencia del estímulo fue la acumulación de la proteina p53. Esta acumulación representa la respuesta normal de una célula frente a daño genotóxico o estrés [10]. La proteína inactiva al ser no funcional no puede activar su mecanismo de autorregulación y se detecta frecuentemente como una acumulación de p53 [11, 12]. Sin embargo, la acumulación de p53 es un parámetro erróneo, ya que no se puede discriminar con técnica de Inmunohistoquímica, si la acumulación es consecuencia de una respuesta a estrés o de un una proteína no funcional.

Las protein kinasas forman una gran familia de genes que se dividen en dos grandes grupos dependiendo del residuo que fosforile (Ser, Thr o Tyr). Si fosforilan un residuo Tirosina, pertenecen al grupo de las Protein Tirosine Kinase (PTK), y si fosforilan un residuo Ser o Thr, pertenecen al grupo de Ser-Thr Kinase (STK). Dentro de este segundo grupo, se encuentran las proteínas VRK (Vaccinia Related Kinase)

Las proteínas VRK constituyen una familia de tres proteínas denominadas VRKl, VRK2 y VRK3 que tiene en su estructura primaria o secuencia de aminoácidos una región conservada con las características de proteínas con actividad Serina-Treonina kinasa, aunque su longitud total puede ser variable debido a otras regiones de la proteína. Esta región, que define a la familia, tiene una localización variable dentro de la estructura completa de las proteínas. En VRKl y VRK2 se encuentra en el próxima al extremo ammo-terminal, y en VRK3 está más centrada y localizada hacia el extremo carboxi-terminal. Este dominio tiene una longitud de 300 aminoácidos y contiene un sitio conservado de unión a ATP y otro sitio activo de actividad kinasa. Para que una proteína se considere miembro de esta familia de proteínas hay que tener en cuenta su grado de identidad y homología.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) La secuencia de las tres proteínas comparadas entre sí se muestra en la Figura 2. En esta figura se indica la localización relativa del dominio Ser-Thr que define a la familia.

Los ARN que codifican por las diferentes kinasas de la familia VRK se encuentran presentes en numerosos tipos de células, independiente de cual sea su origen. Inicialmente estos ARN se detectan en líneas celulares tumorales [13], pero también durante el desarrollo hematopoyético [14]. Pero la función biológica es realizada por la proteína. Estas proteínas pueden tener una expresión diferencial como ya se ha demostrado en el desarrollo hematopoyético embrionario [14].

La actividad kinasa de las proteínas VRK utiliza como una de sus dianas la proteína p53. Esta proteína es diana de numerosas kinasas humanas entre las que se encuentran ATM [15, 16], ATR [17, 18], CHKl [19], CHK2 [20, 21], JNK [22], y caseína kinasa I [23].

La fosforilación de la proteína p53 por VRKl y VRK2 es específica y ocurre en el residuo Treonina-18 de p53, en su región transactivadora amino-terminal. La fosforilación de treonina 18 en p53 se realiza tanto por la VRKl como por la VRK2. Esta fosforilación es específica para este residuo. Ninguna otra serina o treonina en el extremo amino-terminal de p53 es fosforilado por la VRK [24].

Uno de los problemas que existen en la terapia oncológica es que la mayoría de los fármacos basan su mecanismo de acción en el daño que producen en el ADN sin discriminar células sanas de células cancerígenas. Por lo que existe una necesidad de pronosticar la evolución de un tumor frente a un tratamiento oncológico.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Los investigadores han identificado un nuevo marcador de diagnóstico y/o pronóstico de tumores que permite a los profesionales médicos seleccionar o evaluar los tratamientos en oncología, así como una nueva diana para la modificación de la respuesta frente a los distintos agentes terapéuticos.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método para el diagnóstico de cáncer y/o pronóstico de tratamientos en oncología mediante la determinación de las proteínas de la familia VRK en general y más particularmente mediante la determinación de la proteína VRKl y/o VRK2 y/o VRK3.

Un objeto de la invención lo constituye un método para determinar la respuesta de un cáncer frente a agentes terapéuticos, en general mediante la determinación de las proteínas de la familia VRK y más particularmente mediante la determinación de la proteína VRKl y/o VRK2 y/o VRK3.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye un método para determinar la respuesta de un cáncer frente a agentes terapéuticos mediante la determinación de las proteínas de la familia VRK , donde los niveles de las proteínas de la familia VRK indican la sensibilidad o no al agente terapéutico, en concreto los niveles de la proteína VRKl y/o VRK2 y/o VRK3.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye un método para determinar la respuesta de un cáncer frente a agentes terapéuticos mediante la determinación de las proteínas de la familia VRK5 donde los niveles de las proteínas de la familia VRK identifican tumores como diferentes, en concreto los niveles de la proteína VRKl y/o VRK2 y/o VRK3.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye un método para determinar la respuesta de un cáncer frente a agentes terapéuticos mediante la determinación de las

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) proteínas de la familia VRK en una muestra biológica y/o la comparación con una muestra normal y/o una muestra de otro tumor.

Un aspecto más particular de la invención se refiere a que la determinación específica de las proteínas de la familia VRK se lleva a cabo mediante la utilización de anticuerpos específicos, más concretamente anticuerpos anti-VRKl, y/o anti-VRK2, y/o anti-VRK3 y/o anti-nueva VRK.

Un aspecto más particular de la invención se refiere a que la determinación específica de las proteínas de la familia VRK se lleva a cabo mediante ensayo de RT-PCR para un precursor genético de las proteínas de la familia VRK.

Cuando en la invención nos referimos a las proteínas de la familia VRK, en general nos referimos a cualquier proteína que por su homología y/o función pueda se considerada dentro de esta familia, más particularmente a las proteínas VRKl y/o VRK2 y/o VRK3. Cualquier proteína que se encuentre tenga una identidad en su región ser-thr de un mínimo del 31 por ciento con respecto a cualquiera de uno de los tres miembros conocidos hasta ahora habrá que considerarla como un nuevo miembro de la familia aunque su origen puede ser diferente bien por proceder de un procesamiento alternativo se su ARN mensajero generando una isoforma, pero codificada por uno de los tres genes ya identificados, o bien ser derivada de un gen aun no descubierto.

Otro aspecto de la presente invención lo constituye un método para modificar la respuesta frente a un agente terapéutico mediante la utilización de inhibidores específicos de las proteínas de la familia VRK. En particular mediante la utilización de inhibidores específicos de la proteína VRKl y/o proteína VRK2 y/o proteína VRK3.

Otro aspecto de la presente invención lo constituye un kit para el diagnóstico del cáncer y/o pronóstico de tratamientos en oncología que comprende al menos los anticuerpos específicos frente a las proteínas de la familia VRK. En particular, el kit

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) comprende al menos el anticuerpo anti- VRKl5 y/o al menos el anticuerpo anti-VRK2 y/o al menos el anticuerpo anti-VRK3 y/o al menos el anticuerpo anti-nueva VRK.

Otro aspecto de la presente invención lo constituye un kit para el diagnóstico del cáncer y/o pronóstico de tratamientos en oncología que comprende al menos los reactivos necesarios para llevar a cabo la detección de las proteínas VRK mediante RT-PCR.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 Respuesta de una línea celular a estrés inducido por diferentes agentes como actinomicina D (Act D), luz ultravioleta C (UV-C), nocodazole (Noc) y taxol. En todos los casos, la célula tratada presenta una estabilización de p53. Las células fueron Usadas en buffer y 20 microgramos de proteínas fueron cargados en un gel de poliacrilamida-SDS y sometidos a electroforesis. Tras el fraccionamiento las proteínas fueron transferidas a una membrana de Inmobilon-P. La membrana fue bloqueada con una solución de PBS con 5 % leche en polvo desnatada y posteriormente incubada con un anticuerpo específico anti-p53. Tras 1 hora se lavó la membrana y se incubó con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con peroxidas. El gel se reveló con un kit de luminiscencia que es detectada por una película de rayos X, o bien directamente en un lector digital de la señal luminosa.

Figura 2 Estructura primaria y alineamiento de las proteínas humanas de VRK conocidas hasta ahora. Los asteriscos indican identidad del aminoácido, y los puntos similitud de los mismos. La región de homología entre ambas es claramente detectada por la concentración de estos residuos. En azul está indicada la región correspondiente al dominio quinasa incluyendo tanto el sitio de unión a ATP como el sitio catalítico de la enzima.

Figura 3

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Acumulación y estabilización de p53 inducida por VRKl y colocalización de las mismas en el núcleo

A. Células de cáncer de pulmón A549 transfectadas con pHA-VRKl(rojo) y pCB+6-p53 (verde). A nivel de célula individual se ve que aquellas que han tomado los dos plásmidos la señal es solapante (amarillo) y se localiza en el núcleo. A.l: αρ53 A.2: αVrkl A.3: DAPI A.4: Merged B. Detección de la acumulación de p53 en células A549. Cuando se contrasfecta con VRKl (derecha), la señal de p53 es mucho más intensa debido a su estabilización. La proteína fue determina en un extracto total por medio de un inmunoblot. Frente a p53 se utilizó el anticuerpo DOl (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Figura 4 Detección de las isoformas de VRK2 humana por diversas técnicas. A. Detección por RT-PCR de VRK2A y VRK2B. B. Detección por inmunoblot de las dos isoformas, VRK2A y VRK2B, en extractos celulares totales. C. Detección por inmunofluorescencia de las proteínas VRK2 en células individuales.

Figura 5 Detección de VRKl humano por técnicas de Inmunohistoquímica convencional en dos biopsias de carcinoma escamoso de cabeza y cuello. La muestra A es negativa y la muestra B positiva. Ambas fotografías se tomaron a 400 aumentos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Mediante la realización de un experimento de introducción de VRKl exógena en la célula, se comprobó que los niveles de la kinasa VRKl modulaban los niveles de la proteína p53. En la figura 3 A, se muestra como la introducción de VRKl exógena (señal roja) dio lugar a una estabilización de p53 (señal verde). Este resultado se repitió utilizando distintos tipos de célula. Los investigadores llegaron al mismo resultado, analizando los extractos totales de células y determinando la proteína p53 por medio de un inmunoblot, para ello, usaron un anticuerpo monoclonal (DO-I de Santa Cruz Biotechnology) (Figura 3B).

La detección de las isoformas de VRK2 humana, se llevó a cabo mediante RT-PCR para ambas isoformas en un grupo de linfocitos normales (PBL), linfomas de Burkitt y carcinomas de colon (Figura 4A). Alternativamente, se detectaron las dos isoformas mediante un inmunoblot con anticuerpo policlonal (Figura 4B) y a nivel de célula individual por microscopía de inmunofluorescencia (Figura 4C).

La proteína se detectó también en aquellos casos donde al ARN estaba presente, esto se demostró mediante inmunoblot y mediante microscopía.

Para demostrar que la proteína VRKl podía distinguir diferencias entre tumores, se realizó un estudio en carcinomas escamosos de cabeza y cuello. Los resultados indicaron que este antígeno es capaz de distinguir tumores con alta y baja expresión (Figura 5).

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Detección de expresión de VRK murina y humana por RT-PCR, Extracción de RNA procedentes de órganos murinos embrionarios o líneas celulares humanas El ARN total procedente de microdisección de órganos y células en suspensión se obtuvo por extracción basada en métodos que usan soluciones de fenol-guanidina (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA), seguido de precipitación en etanol. La calidad de este ARN total es suficiente para RT-PCR 0.2 μg del ARN fueron usados para la

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) síntesis por RT de un cDNA para el cual se usó Superscript ® transcriptasa en reverso (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. En las células humanas HeLa procedente de un carcinoma de cervix el ARN total se extrajo utilizando (Invitrogen). La síntesis de cDNA se realizó también con Superscript ® transcriptasa en reverso (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 2: PCR amplification ofmurine VRKl, VRK2 and VRK3 La presencia de ARN especifico de VRKl, VRK2 y VRK3 se determinó por una RT- PCR semi cuantitativa. La reacción de RT utilizando ARN total se realizó como se ha descrito previamente. Una décima parte del producto de la reacción RT se usó para la PCR específica. Para la amplificación de la VRKl murina (GenBank AA815837) se usaron los amplímeros mVRKIA (5'-ATGCCCCGTGTAAAAGCAGCTC-S') y mVRKIB (5'-GAAGTACCTTGGTGTTCCTAAG-S'), que amplifican una banda de 32 nucleótidos. La amplificación de la VRK2 murina (GenBank AA914007) se realizó con los amplímeros mVRK2A (5'GGATTTGGTCTGACTGATTTCAAAGG-S'), y mVRK2B (5'-GGAGTGGCCCCATCCAGGAGGAGTG-S') que amplifican una banda de 382 nt. Esta amplificación se realizó con un ciclo inicial de 950C durante 5 minutos, seguida de veinticinco ciclos compuesto de tres pasos (950C por 40 segundos; 560C por 40 segundos; y 720C por 50 segundos), y un ciclo final de extensión a 720C por 5 minutos. Para la VRK3 (GenBank BCO 10473) los amplímeros utilizados fueron mVRK3A (5'-TGACGCCTCATGTGTCATCCGTTCC-S') y mVRK3B (5'-TTGTCCTGGTGAATGCCAAAGCCG-S') que amplifican una banda de 559 nucleótidos. Las condiciones fueron un ciclo inicial a 920C por 5 min, 30 ciclos (920C por 40 segundos, 580C por 40 segundos y 720C por 40 segundos) y un ciclo final a 720C por 10 minutes. La amplificación de β-actin se utiliza como control de la reacción y para cuantificación relativa en caso de necesidad. Todas las reacciones se realizaron con Taq DNA polimerasa (Promega, Madison, WI, de Perkin-Elmer) con MgCl22.5 mM. Los productos de la PCR fueron analizados en geles de agarosa al 2% y fotografiadas con luz ultravioleta (GelDoc, BioRad) o alternativamente transferidos a una membrana Zeta-Probe (BioRad, San Diego, CA) o Hybond-C (Amersham

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Biosciences, UK) que fueron hibridadas con la sonda correspondiente. La imagen del gel fue analizada con el programa Quantity One en un BioRad FX Imager (BioRad, San Diego, CA) [14].

Ejemplo 3: VRK2 humana: amplímeros para PCRy clonación. Para detectar el cDNA de longitud casi total (nt 130-1657) o bien del la parte carboxy terminal de VRK2 humano se usaron diferentes amplímeros basados en la secuencia humana VRK2 (GenBank AB000449) [13]. Para VRK2A: 5'- CCCGGA TCCATGCC ACC AAAAAGAAATGAAAAATAC AAACTTCC-3' (nt 130-165), este amplímero tiene el codón de iniciación y un sitio de restricción Bamϊil. VRK2X: 5'-GGGrcrΛG¿GGAATTTTGGTATCATCTTCAGAG' (nt 1652-1675 cadena antisentido), con un sitio de restricción Xbal y el codón de terminación. VRK2S: 5'-GGGGT1CG^C- GGAATTTTGGTATCATCTTCAGAG 3' (nt 1652-1675 antisentido), con el sitio Salí y codón de terminación. VRK2C: 5'- CCCGGATCC CCTGTGGCTGTGC AGACTGCT-3' (nt 899-920) con BamHl como sitio de restricción para clonación. La reacción de PCR contema 1 μl de producto de la reacción del cDNA, 2 unidades de Thermus aquaticus polimerasa, y MgCl2 1.5 mM en el tampón suministrado por el fabricante (Sigma, St. Louis, MO). La amplificación se realizó en un ciclo a 95 0C por 5 min, treinta ciclos (95 0C 30 segundos, 56 0C 30 segundos, 72 0C 30 segundos), y una elongación final a 720C durante 5 minutos. Para identificar la presencia o ausencia de un exón adicional en el mensajero de VRK2 se diseñaron amplímeros que flanqueen el exón extra. Amplímero en sentido: 5'- AGTGAGGAAGCGCTGAGTCCT-3', y amplímero antisentido: 5'- CAAGAGTCTCAAGAACCTTTG-3' que amplifican fragmentos de 135 y 179 nucleótidos específicos para las isoformas VRK2A y VRK2B respectivamente. Los productos de la reacción de amplificación se analizaron en un gel de agarosa al 1 por ciento [25]. (Figura 4A)

Ejemplo 4:

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Sobre expresión de VRKl y acumulación de p53 Las líneas celulares, 293T, H1299, A549, HeLa, HepG2, Cosí y H1299, fueron crecidas en medio DMEM complementado con 10 por ciento de suero fetal bovino conteniendo penicilina, estreptomicina y glutamina. El ADN libre de endotoxinas para las transfecciones fue preparado con un maxi-kit JetStar (Genomed, Bad Oeynhausen, Germany). Para las células Cosí las transfecciones se realizaron con fosfato calcico, 0.35xl06 células fuero sembradas en placas P60. A estas células se le añadió lOμg del plásmido phVRK2A-HA o phVRK2B-HA. Para células H1299, se sembraron 0.5 xlO células por placa, y tras 24 horas las células se transfectaron con 5μg de phVRK2A-HA o phVRK2B-HA y 25ng de pCB6-p53 con 10 μl de reactivo JetPEI (PolyTransfection, Illkirch, France) y vector GEX4T1 vacío hasta completar la cantidad de ADN. Las transfecciones con el reactivo JetPI se realizaron siguiendo las instrucciones del proveedor (PolyTransfection, Illkirch, France).

Ejemplo 5: Western blot y anticuerpos monoclonales El anticuerpo policlonal específico para las isoformas VRK2 se preparó por inmunización de un conejo con proteína de fusión GST-VRK2A. El anticuerpo monoclonal específico para el epitopo FIA fue de Covence (San Francisco, CA). El anticuerpo policlonal específico para calreticulina fue de Calbiochem (La Jolla, CA). Para p53 se utilizó el anticuerpo DOl (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Como anticuerpos secuendarios en inmunofluorescencia se utilizaron anti-IgG de ratón marcado con Cy2 (Fluorolink Cy2) o un anti-IgG de conejo marcado con Cy3 (Fluorolink Cy3), de Amersham. Luminiscence in westerns blot se desarrolló con un kit ECL (Amersham). (Figura 4B)

Ejemplo 6: Detección de VRKl por microscopía de fluorescencia Para inmunofluorescencia las células adherentes crecidas sobre un porta fueron fijadas con un 3% de paraformaldehído seguido de incubación con los anticuerpos correspondientes durante 30 minutos cada uno. Como anticuerpo primario se utilizó un policlonal frente al extremo carboxy terminal de VRKl. Para p53 se utilizó el

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) anticuerpo DOl (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Como anticuerpos secundarios se utilizaron un anti-IgG de ratón marcado con Cy2 (Fluorolink Cy2) o un anti-IgG de conejo marcado con Cy3 (Fluorolink Cy2), ambos obtenidos de Amersham Biosciences (Litlle Chalfont, UK). El análisis de miscroscopía confocal se realizó en un equipo Zeiss LSM510. (Figura 4C)

Ejemplo 7: Detección de VRKl por técnicas de Inmunohistoquímica (Figura 5) Cortes de bloques de parafina fueron procesados por técnicas rutinarias para detección por anticuerpos específicos (anti-VRKl) y revelados con anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa. La positividad alta o baja se determina por la intensidad de la coloración marrón (Figura 5).

Referencias

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