La présente invention est relative à la différenciation et au dénombrement de souches bactériennes d'intérêt présentes en mélange dans un produit alimentaire, notamment un produit laitier.

Dans la fabrication de produits fermentés, et notamment de produits laitiers, on utilise généralement en tant que ferments des mélanges de bactéries qui peuvent comprendre des bactéries de genres différents et/ou des bactéries du même genre et d'espèces ou sous-espèces différentes, et/ou des souches différentes de bactéries de la même espèce ou sous-espèce. En particulier, les produits probiotiques comprennent habituellement, outre une ou plusieurs souches probiotiques, une ou plusieurs souches dites « technologiques », qui n'ont pas nécessairement de propriétés probiotiques, mais permettent par exemple d'améliorer la croissance des souches probiotiques et/ou de conférer au produit fini les propriétés souhaitées (goût, texture, etc.).

Afin de garantir la qualité des produits fermentés, au cours de leur fabrication, à l'issue de celle-ci, et au cours du stockage, il est nécessaire de pouvoir différencier et dénombrer spécifiquement les souches bactériennes probiotiques et technologiques présentes dans ces produits, ce qui peut poser des difficultés, notamment dans les cas où au moins 2 des souches utilisées dans le produit appartiennent à des espèces voisines d'un même genre, ou à la même espèce voire à la même sous-espèce.

Il est donc souhaitable de disposer de techniques analytiques fiables et rapides à mettre en œuvre permettant le dénombrement différentiel de ces souches.

Les Inventeurs ont maintenant mis au point une méthode basée sur l'utilisation de milieux de culture sélectifs et/ou de conditions de cultures sélectives, associée à celle de différents substrats chromogènes.

La présente invention a en conséquence pour objet un procédé pour distinguer entre elles et dénombrer les souches de bactéries lactiques ou de Bifidobactéries d'un mélange connu, présentes à différentes quantités de populations dans un produit alimentaire, de préférence un produit laitier, fermenté en utilisant lesdites souches, caractérisé en ce qu'il comprend :

a) l'ensemencement d'aliquotes du produit alimentaire, optionnel lement dilué, dans une série de boites de culture contenant un milieu gélosé chimiquement défini Ml et au moins deux substrats chromogènes produisant des colorations différentes, chacun desdits substrats étant assimilé par au moins l'une desdites souches bactériennes, et n'étant pas assimilé par au moins une autre desdites souches ;

b) optionnellement, l'ensemencement d'aliquotes du produit alimentaire, optionnellement dilué, dans une série de boites de culture contenant un milieu gélosé chimiquement défini M2 permettant la croissance des souches de bactéries lactiques présentes dans le produit à tester qui ne peuvent pas croître sur le milieu Ml, et au moins un substrat chromogène assimilé par au moins l'une desdites souches bactériennes;

c) l'incubation desdites boites pendant le temps nécessaire à la formation de colonies bactériennes, et le dénombrement des colonies pour chacune des colorations observées dans chaque boîte de culture.

On entend par « mélange connu », un mélange de souches bactériennes dont on connaît la composition qualitative, c'est-à-dire la nature et les caractéristiques des différentes souches qui le constituent. Il s'agit plus spécifiquement du mélange des souches utilisé pour la fabrication du produit fermenté sur lequel porte l'analyse. Préalablement à la mise en œuvre du procédé conforme à l'invention, ces souches auront été soumises à une analyse phénotypique visant à mettre en évidence leurs caractéristiques physiologiques et métaboliques, afin d'établir un profil phénotypique propre à chaque souche. Cette analyse peut porter notamment sur l'utilisation de différents types de sources de carbone, azote, phosphate et soufre, sur celle d'additifs nutritionnels donnés, et/ou sur la résistance à différents agents stressants (sels, pH, agents-antimicrobiens, etc.).

Le terme « milieu chimiquement défini » est utilisé ici dans son sens usuel, pour désigner un milieu de culture dont tous les composants sont complètement connus et définis.

Des substrats chromogènes utilisables pour la mise en œuvre de la présente invention sont connus en eux-mêmes, il peut s'agir notamment 6-Chloro-3-indoxyl-beta-D- galactopyranoside (salmon Gai), 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucopyranoside (X- glu), 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Beta-D-Galactopyranoside (X-Gal).

Le milieu gélosé d'une partie des boites de cultures peut comprendre en outre au moins un additif favorisant sélectivement la croissance d'au moins l'une desdites souches bactériennes, et/ou le milieu gélosé d'une partie des boites de cultures peut comprendre en outre au moins un additif inhibant sélectivement la croissance d'au moins l'une desdites souches bactériennes.

Également, une partie des boîtes de culture peut être incubée dans des conditions sélectives favorables à la croissance d'au moins l'une desdites souches bactériennes, et une autre partie desdites boites de culture peut être incubée dans des conditions sélectives différentes, favorables à la croissance d'au moins une autre desdites souches bactériennes.

Le procédé conforme à l'invention est particulièrement approprié à l'analyse de produits où au moins deux des souches bactériennes présentes appartiennent à la même espèce et sous-espèce.

De préférence, au moins une des souches bactériennes présentes dans le produit à tester appartient au genre Lactobacillus et/ou au moins une des souches bactériennes présentes dans le produit à tester appartient au genre Streptococcus. Selon un mode de mise en œuvre particulier de la présente invention, le produit à tester contient au moins une souche de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, au moins une souche de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, et au moins une souche de Streptococcus thermophilus. Avantageusement, il contient en outre au moins une souche de Lactobacillus rhamnosus.

Dans le cadre de ce mode de mise en œuvre, on utilise, pour dénombrer les bactéries des espèces Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus rhamnosus, et Streptococcus thermophilus un milieu Ml dont la composition est la suivante : agar : 15 g/L ; tryptone : 2,5 g/L ; peptone pepsique de viande : 2,5 g/L ; peptone papainique de soja : 5 g/L ; glycérophosphate de sodium : 19 g/L ; lactose : 5 g/L ; extrait de levure : 2,5 g/L ; extrait de viande : 5 g/L ; sulfate de magnésium : 0,25 g/L ; acide ascorbique : 0,5 g/L ; 6-Chloro-3- indoxyl-beta-D-galactopyranoside (salmon Gai) : 0,2 g/L ; 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta- D-glucopyranoside (X-glu) : 0,1 g/L.

Pour dénombrer les bactéries de l'espèce Lactobacillus delbrueckii bulgaricus on utilise un milieu M2 dont la composition est la suivante : polypeptone : 10 g/L ; extrait de levure : 5 g/L ; extrait de viande : 10 g/L ; phosphate dipotassique : 2 g/L ; acétate de sodium : 5 g/L ; citrate d'ammonium : 2 g/L ; sulfate de magnésium : 0,2 g/L ; sulfate de manganèse : 0,05 g/L ; agar : 15 g/L ; 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Beta-D-Galactopyra- noside (X-Gal) : 0,15 g/L.

Avantageusement, pour dénombrer les bactéries des espèces Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus rhamnosus, et Streptococcus thermophilus :

- une première partie des boites contenant le milieu Ml ne comprend pas d'additif, une seconde partie desdites boites comprend, en tant qu'additif, de la vancomycine, et une troisième partie desdites boites comprend, en tant qu'additif, du rhamnose ; et/ou

- les boites ensemencées sont incubées pendant environ 48 heures en atmosphère contrôlée contenant de 6 à 16% d'0 ₂ et de 2 à 10% de C0 ₂ , une partie desdites boîtes étant incubées à environ 37°C, et une autre partie à environ 44°C.

De préférence, pour dénombrer les bactéries de l'espèce Lactobacillus delbrueckii bulgaricus, les boites de milieu M2 ensemencées sont incubées pendant environ 48 heures à environ 47°C en atmosphère contrôlée contenant moins de 1% d'0 ₂ et au moins 13% de C0 ₂ .

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la mise en œuvre d'un procédé conforme à l'invention pour différencier différentes souches de bactéries lactiques, et dénombrer des bactéries de chacune de ces souches dans des produits laitiers fermentés. EXEMPLE : DÉNOMBREMENT DIFFÉRENTIEL DE BACTÉRIES LACTIQUES DANS DES PRODUITS LAITIERS FERMENTES.

Matériels et méthodes :

Composition des produits testés

Produit 1 :

Le produit 1 est un produit fermenté contenant 5 souches bactériennes appartenant à trois espèces, à savoir :

- 1 souche probiotique de L. casei subsp. paracasei (ci-après dénommée Lactobacillus paracasei souche 1) ;

- 3 souches technologiques de S. thermophilus ;

- 1 souche technologique de L. delbrueckii subsp. bulgaricus ;

Les charges bactériennes théoriques attendues en début de vie (J4) et en fin de vie (J35) du produit sont indiquées dans le Tableau I ci-dessous.

Tableau I

Produit 2 :

Le produit 2 est un produit fermenté contenant 7 souches bactériennes appartenant à trois espèces, à savoir :

- 2 souches probiotiques de L. casei subsp. paracasei (Lactobacillus paracasei souche 1 et Lactobacillus paracasei souche 2) ;

- 1 souche probiotique de L. rhamnosus ;

- 3 souches technologiques de S. thermophilus ;

- 1 souche technologique de L. delbrueckii subsp. bulgaricus ;

Les charges bactériennes théoriques attendues en début (J4) et en fin de vie (J35) du produit sont indiquées dans le Tableau II ci-dessous.

Tableau II

Activités enzymatiques des souches :

Les différentes souches ont été testées pour leurs activités β-Glucosidase et β-Galactosidase.

Les résultats sont indiqués dans le Tableau III ci-dessous : Tableau III

Souche β-Glucosidase β-Galactosidase

Lactobacillus rhamnosus + +

Lactobacillus paracasei 1 + -

Lactobacillus paracasei 2 - -

Streptococcus thermophilus 1 - +

Streptococcus thermophilus 2 - +

Streptococcus thermophilus 3 - +

Lactobacillus bulgaricus - +

Dénombrement des bactéries dans les produits 1 et 2 :

Milieux et conditions de culture :

Les milieux et conditions de culture actuellement utilisés pour le dénombrement des souches bactériennes présentes dans les produits 1 et 2 sont résumés respectivement dans les tableaux IV et V ci-dessous. Ces milieux et conditions de culture de référence ont été utilisés à titre de témoins.

Tableau IV Tableau V

Les milieux MRS, MRS acide, et Ml 7 sont des milieux commerciaux classiques (AES CHEMUNEX).

Pour les cultures sous atmosphère contrôlée, des systèmes générateurs de gaz GASPAK ^® ont été utilisés, pour obtenir les conditions suivantes :

- anaérobiose : %0 ₂ < 1% ; %C0 ₂ > 13%

- C0 ₂ : %C0 ₂ > 2,5%

- Micro-aérobiose : 6% <%0 ₂ <16% ; 2% <%C0 ₂ < 10%

- aérobiose : air ambiant

Deux milieux chromogènes, dénommés ci-après Ml et M2 ont été préparés : la composition de ces milieux est indiquée respectivement dans les Tableaux VI et VII ci- dessous :

- romo- -c oro- -n oy- ea- -gucopyranos e -gu ,

Tableau VII

Les essais ont été effectués avec 3 lots différents de chacun des milieux Ml et M2.

Les conditions de cultures utilisées pour les produits 1 et 2 sont respectivement indiquées dans les Tableaux VIII et IX ci-dessous :

Tableau VIII

Tableau IX

Protocole opératoire :

Des échantillons ont été prélevés à deux phases de la vie des produits : début de vie, et fin de vie.

Pour le produit 1, les prélèvements de début de vie ont été effectués à 4, 5, et 6 jours après la fabrication du produit fermenté, et les prélèvements de fin de vie ont été effectués à 31, 32, et 33 jours après la fabrication ; pour le produit 2, les prélèvements de début de vie ont été effectués à 7, 8, et 9 jours après la fabrication, et les prélèvements de fin de vie ont été effectués à 28, 29, et 30 jours après la fabrication.

Pour chaque prise d'essai, une gamme de dilutions au 1/10 a été effectuée en tubes tryptone sel. Trois dilutions, choisies en fonction des populations théoriques, (cf. Tableaux I et II) ont été ensemencées sur chacun des milieux utilisés. Pour chaque dilution, 1 mL de dilution a été ensemencé dans 1 boite de Pétri, et 15 ml du milieu utilisé ont été coulés dans la boite.

Les boites ont été incubées dans les conditions et pendant les durées indiquées aux Tableaux IV, V, VIII, et IX.

Résultats :

Identification des souches :

Sur le milieu Ml :

- à 44°C, la souche de Lactobacillus rhamnosus produit des colonies de couleur bleue, et les souches de Strepîococcus thermophilus produisent des colonies de couleur magenta ; les souches 1 et 2 de Lactobacillus paracasei et la souche de Lactobacillus bulgaricus ne croissent pas.

- à 37°C avec ajout de rhamnose, la souche de Lactobacillus rhamnosus et la souche 2 de Lactobacillus paracasei produisent des colonies incolores ; la souche 1 de Lactobacillus paracasei produit des colonies de couleur turquoise, et les souches de Strepîococcus thermophilus produisent des colonies de couleur magenta. La souche de Lactobacillus bulgaricus ne croît pas.

- à 37°C avec ajout de vancomycine, la souche de Lactobacillus rhamnosus produit des colonies bleues ; la souche 1 de Lactobacillus paracasei produit des colonies de couleur turquoise, et la souche 2 de Lactobacillus paracasei produit des colonies incolores ; les souches de Strepîococcus thermophilus et la souche de Lactobacillus bulgaricus ne croissent pas.

Sur le milieu M2 :

- la souche de Lactobacillus rhamnosus produit des colonies incolores, et la souche de Lactobacillus bulgaricus produit des colonies bleues. Les souches de Strepîococcus thermophilus et les souches 1 et 2 de Lactobacillus paracasei ne croissent pas.

Ces résultats sont résumés dans le Tableau X ci-dessous : Tableau X

Produit 1 :

Le milieu Ml permet donc de dénombrer Lactobacillus paracasei et Streptococcus thermophilus, et le milieu M2 de dénombrer Lactobacillus bulgaricus.

Produit 2 :

Le milieu Ml permet donc de dénombrer :

- à 44°C : Lactobacillus rhamnosus et Streptococcus thermophilus ;

- avec ajout de rhamnose à 37°C : la souche 1 de Lactobacillus paracasei ;

- avec ajout de vancomycine à 37°C : la souche 2 de Lactobacillus paracasei.

Le milieu M2 permet de dénombrer Lactobacillus bulgaricus.

Dénombrement des bactéries :

Produit 1 :

Début de vie :

Les résultats sont illustrés dans le Tableau XL

Tableau XI

La variabilité de la méthode de dénombrement est la suivante :

- Sur milieu Ml : entre 5,7.10 ⁸ UFC/ml et 6,2.10 ⁸ UFC/ml pour

L.paracasei 1, entre 5,3.10 ⁸ UFC/ml et 6,8.10 ⁸ UFC/ml pour S. thermophilus, - Sur milieu M2 : entre 2,8.10 ⁶ UFC/ml et 3.10 ⁶ UFC/ml pour L.bulgaricus.

Des difficultés de dénombrement de L. bulgaricus sur le milieu de référence, MRS acide, sont à noter :

jour 5 : différence d'un log versus le milieu M2 et le dénombrement de J4,

jour 6 : absence de croissance.

Fin de Vie :

Les résultats sont illustrés dans le Tableau XII.

Tableau XII

Le milieu Ml permet de discriminer de façon efficace Lactobacillus paracasei et Streptococcus thermophilus présents dans le produit. Les dénombrements de L. paracasei varient entre 4.10 ⁸ UFC/ml et 4 ,5.10 ⁸ UFC/ml entre les trois lots et sur trois jours d'analyse. La charge de S. thermophilus varie entre 1,9.10 ⁸ UFC/ml et 2,2.10 ⁸ UFC/ml.

Ces essais mettent en outre en évidence l'absence de L. bulgaricus dans le produit à ce stade de vie que ce soit sur le milieu référence ou le milieu M2.

Produit 2 :

Début de vie :

Les résultats sont illustrés dans le Tableau XIII.

Tableau XIII

La variabilité de la méthode de dénombrement est la suivante :

- Sur milieu Ml : entre 1,6.10 ^s UFC/ml et 1,8.10 ⁸ UFC/ml pour

7 7

L.paracasei 1, entre 2, 3.10' UFC/ml et 3.10' UFC/ml pour L.paracasei 2, entre 8,7.10 ⁸ UFC/ml et 9,8.10 ⁸ UFC/ml pour S.thermophilus, 2,3.10 ⁸ UFC/ml pour les trois lots pour Lrhamnosus - Sur milieu M2 : entre 2,6.10 ⁵ UFC/ml et 5.10 ⁵ UFC/ml pour L. bulgaricus.

Fin de Vie :

Les résultats sont illustrés dans le Tableau XIV.

Tableau XIV

Les dénombrements sur les trois lots de milieux Ml varient entre 1,5.10 ⁸ UFC/ml et 1,6.10 ⁸ UFC/ml pour Lparacasei 1, entre 1,4.10 ⁷ UFC/ml et 2,2.10 ⁷ UFC/ml pour Lparacasei 2, entre 6,6.10 ⁸ UFC/ml et 7,5.10 ⁸ UFC/ml pour

S.thermophilus, 2,0.10 UFC/ml pour les trois lots pour Lrhamnosus.

Les essais mettent en outre en évidence l'absence de L. bulgaricus dans le produit à ce stade de vie que ce soit sur le milieu référence ou le milieu M2.

L'utilisation de la méthode décrite ci-dessus permet de discriminer les trois espèces bactériennes présentes dans le produit 1 et les quatre présentes dans le produit 2.