spectrométrie RMN

La présente invention concerne le domaine de la bactériologie. Plus précisément, l'invention concerne la discrimination entre les bactéries de l'espèce Escherichia coli et celles du genre Shigella.

Depuis la découverte des microbes par Pasteur, les microorganismes sont étudiés par microscopie et analyses biochimiques et quantifiés par cultures quantitatives. Ces méthodes traditionnelles sont souvent longues et fastidieuses et des alternatives analytiques ont très tôt été recherchées.

La détection rapide et l'identification précise des microorganismes et en particulier des bactéries représentent donc un enjeu majeur, tant pour le diagnostic clinique que pour le contrôle microbiologique. Le développement des technologies a permis de disposer de nouveaux outils de diagnostic. Ainsi, l'on a pu voir l'émergence de l'analyse génomique par séquençage, l'identification par spectrométrie de masse, spectrométrie infrarouge ou encore spectrométrie Raman. La spectrométrie RMN a également fait l'objet de développements dans le domaine de la microbiologie. Ainsi, Delpassand et al. [1] a décrit l'utilisation de la spectrométrie RMN du proton pour identifier différentes espèces bactériennes. En particulier, Delpassand a mis en évidence qu'il était possible d'identifier des bactéries par analyse de molécules intracellulaires, à partir d'une analyse des empreintes spectrales sur quelques suspensions bactériennes.

Plus récemment, Bourne et al. [2] a confirmé qu'il était possible d'identifier des bactéries du genre Enter ococcus, Streptococcus et Staphylococcus par analyse multivariée d'empreintes spectrales obtenues sur l'endométabolome bactérien, à partir d'une centaine de suspensions de bactéries Gram positives.

Récemment, il a été démontré que les bactéries du genre Shigella sont très proches des bactéries de l'espèce Escherichia coli [3]. En effet, Shigella appartient à la famille des Enterobacteriaceae et comprend 4 espèces. D'un point de vue génétique, les 4 espèces de Shigella (S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii et S. sonnei) et Escherichia coli appartiennent au même groupe génomique. Cette similitude est source de problématiques de santé publique et vétérinaire. En effet, les espèces de Shigella sont généralement toujours considérées comme des espèces pathogènes alors que Escherichia coli peut être pathogène ou commensale selon les souches. Leur différenciation est donc déterminante pour la mise en place d'un traitement. Il existe à ce jour des méthodes biochimiques ou sérologiques pour différencier ces deux bactéries qui sont complémentaires aux techniques de microbiologie traditionnelles. Néanmoins, ces tests complémentaires sont longs, ce qui augmente de manière significative le temps de rendu des résultats et accentue le risque pour le patient ou l'animal.

Le domaine de la microbiologie est donc dans l'attente d'une méthode permettant de différencier de manière sure et rapide, Escherichia coli de Shigella.

Les inventeurs proposent de mettre en œuvre une nouvelle méthode de différenciation Escherichia coli I Shigella basée sur l'analyse de l'exométabolome bactérien par spectrométrie RMN.

L'invention concerne de façon particulière, un procédé de différenciation par spectrométrie RMN du proton entre une bactérie de l'espèce Escherichia coli et une bactérie du genre Shigella, ledit procédé comportant les étapes consistant à :

a. Obtenir au moins un surnageant d'au moins une suspension de bactéries susceptibles d'être Escherichia coli ou Shigella ;

b. Préparer au moins un échantillon adapté à une analyse en spectrométrie RMN du proton, par mélange d'au moins une fraction du au moins un surnageant avec un tampon deutéré ;

c. Obtenir au moins un spectre RMN du au moins un échantillon,

d. Analyser les pics dudit au moins un spectre correspondant aux métabolites suivant : acétate, alanine, aspartate, éthanol, lactose, lysine, Na-acétyllysine, propionate, sérine, succinate, thréonine et valine ; e. Déterminer s'il s'agit d'une bactérie Escherichia coli ou Shigella.

Le procédé selon l'invention consiste à analyser l'exométabolome bactérien. Par exométabolome, on entend l'ensemble des métabolites d'un système biologique tel qu'une cellule, un tissu, un organe ou un organisme, excrétés dans le milieu extracellulaire ou dans le milieu de culture.

Selon un mode particulier du procédé selon l'invention, si la bactérie Escherichia coli ne métabolise pas le lactose, les pics analysés à l'étape d), sont préférentiellement ceux correspondant aux métabolites suivant : acétate, aspartate, lysine, Na-acétyllysine, propionate, sérine, succinate, thréonine.

De façon avantageuse, l'étape a) du procédé selon l'invention comporte les sous-étapes suivantes :

al) Préparer au moins une suspension de bactéries susceptibles d'être Escherichia coli ou Shigella à partir d'une ou plusieurs colonies de la même bactérie, de façon à obtenir un concentration bactérienne suffisante ; a2) Incuber la au moins une suspension de bactéries à une température et pendant une durée suffisantes pour obtenir des bactéries en phase exponentielle de croissance.

Par phase exponentielle de croissance, on entend la phase de croissance pendant laquelle les bactéries se multiplient le plus rapidement. De façon avantageuse, les conditions opératoires du procédé selon l'invention sont adaptées pour que lors de l'analyse RMN, les bactéries soient à la moitié de leur phase exponentielle de croissance

La température d'incubation est quant à elle préférentiellement de 37°C. De façon avantageuse, le temps d'incubation de suspension de bactéries est compris entre 1 et 2 heures, préférentiellement égal à une heure et demie, lorsque la température d'incubation est de 37°C. La méthode spectrométrique utilisée est la spectrométrie RMN du proton. De manière préférentielle, la fréquence de résonance utilisée est supérieure ou égale 600 mégahertz (MHz). Une fréquence particulièrement avantageuse est de 600,55 MHz. Un spectromètre RMN adapté pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention est par exemple celui commercialisé par la société Bruker sous la référence AVANCE III, couplé à une cryosonde TCI CryoProbe™ 5 millimètres (mm) et un système de gestion des échantillons haut débit SampleJet. D'autres diamètres de tubes RMN peuvent également être utilisés. Ainsi, il est possible d'utiliser des tubes de diamètre 1,7 mm ou 3 mm, en adaptant le volume d'échantillon utilisé.

Si une sonde cryogénique est préférée dans le procédé selon l'invention, il est toutefois envisageable d'utiliser d'autres types de sonde RMN, telle qu'une sonde chaude. De telles sondes sont bien connues de l'homme du métier, versé dans l'analyse RMN.

La séquence d'impulsions pour l'acquisition des spectres RMN 1D du proton préférentiellement utilisée est une séquence NOESY (nuclear Overhauser spectroscopy) avec gradients-z. Toutefois, d'autres séquences d'impulsions peuvent également être utilisées: par exemple, l'acquisition directe avec présaturation de l'eau ('zgpr'), NOESY sans gradient-z, séquence CPMG (Carr Purcell Meiboom Gill)...

La température pour l'acquisition des spectres RMN est avantageusement supérieure à 0 et peut aller jusqu'à 40°C.

Selon un mode préféré de réalisation, le composé de référence utilisé dans la procédé est l'acide 3-(trimethylsilyl)-2,2',3,3'-tetradeuteropropionique (TMSP-d4). Le procédé selon l'invention peut néanmoins fonctionner sans ajout de composé de référence, en utilisant l'un des signaux des métabolites présents dans le milieu pour calibrer les spectres (doublet du glucose à 5,23 ppm par exemple). Le traitement du signal peut être fait sans apodisation ou avec une fonction d'apodisation non exponentielle, un élargissement des raies différent, inférieur ou égal à 1Hz. La réduction des spectres peut se faire en utilisant des segments dont la largeur peut être inférieure à 0,001 ppm et aller jusqu'à 0,05 ppm. L'intégration peut être faite en considérant la résolution digitale complète des spectres, sans réduction des données.

La région exclue pour le signal de l'eau peut avantageusement aller de 4,3 à 5,1 ppm.

Les expériences peuvent être réalisées dans des conditions de pH différentes dans une gamme allant de 6,0 à 8,0. La valeur de pH préférentiellement utilisée est 7,4.

Selon l'invention, le tampon deutéré utilisé est avantageusement un tampon à base de KH ₂ PO ₄ . Toutefois, cette solution tampon peut être remplacée par une solution pure de D20 (dans cette condition, l'utilisation d'une méthode de réalignement des signaux PvMN pourra être nécessaire). De même, si selon le mode réalisation préféré, la solution tampon contient du NaN ₃ , ce composé peut, selon une alternative technique, être absent du tampon deutéré.

La concentration de la solution tampon peut être modifiée, pour une molarité du mélange final pouvant aller jusqu'à 250 mM.

La quantité de surnageant utilisée est comprise entre 200 et 550 μί, pour un volume total après dilution en solution tampon conservé, et à molarité finale du mélange équivalente. Avantageusement, le volume de surnageant utilisé est égal à 540μί.

Les données de spectrométrie RMN obtenues sont analysées en analyse multivariée supervisée. Une méthode d'analyse supervisée particulièrement adaptée est la méthode OPLS-DA (Orthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis) décrite par Trygg et Wold [4]. Toutefois, il est possible d'utiliser d'autres méthodes d'analyse supervisée, telles que la méthode PLS-DA.

La méthode OPLS-DA est utilisée pour produire un modèle robuste de classification des échantillons, qui s'associe à une signature métabolique spécifique pour chaque classe d'échantillons considérée. L'analyse OPLS-DA exploite un matrice X des données RMN réduites (N échantillons x M variables RMN considérées) ainsi qu'une matrice supplémentaire Y contenant l'information de classe des échantillons (Escherichia coli Lactose + ; Escherichia coli Lactose - ; Shigella) sur laquelle est effectuée la régression.

Les données sont visualisées sous forme de « score plots », dans lesquels chaque point représente la projection d'un unique échantillon sur les deux premières composantes du modèle (composante prédictive horizontale associée à la classification, et première composante orthogonale). Les « loadings plots » représentent la contribution des variables RMN (correspondant aux métabolites) sur la composante prédictive.

La qualité du modèle OPLS-DA obtenu est évaluée à l'aide des paramètres R ² et Q ² qui sont respectivement reliés à la proportion de variance expliquée et prédite par le modèle, calculée par validation croisée des données (par « 7-fold cross-validation » : 6/7 de l'échantillon de taille N est utilisé comme échantillon d'apprentissage et 1/7 de l'échantillon est utilisé comme échantillon test; d'autres valeurs k pour une validation croisée de type k-fold peuvent être utilisées pour valider le modèle ; d'autres méthodes classiques de validation croisée connues de l'homme du métier peuvent être utilisées). Une validation supplémentaire des modèles est effectuée en ré-échantillonnant le modèle 1000 fois, sous hypothèse nulle, par permutations aléatoires de la matrice Y.

Les analyses multivariées ont été conduites en utilisant le logiciel SIMCA-P 13 (Umetrics). D'autres plateformes de traitements statistiques équivalentes peuvent toutefois être utilisées.

L'invention sera mieux comprise à la lumière de l'exemple qui suit en lien avec les figures. Cet exemple a pour but d'illustrer l'invention mais n'a aucun caractère limitatif.

La figure 1A est un graphique permettant de comparer les données présentées sous forme de « score plots », obtenues à partir de suspensions d' Escherichia coli Lactose + et de suspensions de Shigella.

La figure 1B est un graphique permettant de comparer les données liées aux métabolites d'intérêt, présentées sous forme de « loading plots », obtenues à partir des mêmes suspensions d' Escherichia coli Lactose + et de suspensions de Shigella que pour la figure 1A.

La figure 2A est un graphique permettant de comparer les données sous forme de « score plots », obtenues à partir de suspensions d' Escherichia coli Lactose - et de suspensions de Shigella.

La figure 2B est un graphique permettant de comparer les données liées aux métabolites d'intérêt, présentées sous forme de « loading plots », obtenues à partir des mêmes suspensions d' Escherichia coli Lactose - et de suspensions de Shigella que pour la figure 2A.

Exemple :

1. Sélection des souches :

Dans cette exemple, les inventeurs ont cherché à discriminer par analyse en spectrométrie RMN du proton deux familles d' Escherichia coli, une famille à' Escherichia coli fermentant le lactose (dite « Escherichia coli Lactose + ») et une famille à' Escherichia coli ne fermentant pas le lactose (dite « Escherichia coli Lactose - »), de Shigella.

Ainsi 48 souches provenant de la souchotèque bioMérieux, (site de La Balme les Grottes, France) ont été sélectionnées :

• 16 souches d'Escherichia coli Lactose +

• 16 souches d'Escherichia coli Lactose - · 16 souches de Shigella Le tableau 1 ci-après reprend pour chaque type bactérien, le numéro et la référence bioMérieux (N° API) des souches testées :

N° de la souche Espèce N°API

1 Shigella boydii 9511152

2 Shigella boydii 9211058

3 Shigella boydii 9103021

4 Shigella boydii 8518292

5 Shigella boydii 8401004

6 Shigella flexneri 9811048

7 Shigella flexneri 9511143

8 Shigella flexneri 9211059

9 Shigella flexneri 8804032

10 Shigella sonnei 9304068

11 Shigella sonnei 9211060

12 Shigella sonnei 9103146

13 Shigella sonnei 9007037

14 Shigella sonnei 8604102

15 Shigella flexneri 8518293

16 Shigella sonnei 8807097

17 Escherichia coli Lactose + 0208040

18 Escherichia coli Lactose + 7308009

19 Escherichia coli Lactose + 8145303

20 Escherichia coli Lactose + 8147304

21 Escherichia coli Lactose + 8610007

22 Escherichia coli Lactose + 9009100

23 Escherichia coli Lactose + 9012042

24 Escherichia coli Lactose + 9030345

25 Escherichia coli Lactose + 9203096

26 Escherichia coli Lactose + 9204120

27 Escherichia coli Lactose + 9207041

28 Escherichia coli Lactose + 9306055 29 Escherichia coli Lactose + 9702027

30 Escherichia coli Lactose + 1301204

31 Escherichia coli Lactose + 1301205

32 Escherichia coli Lactose + 1301206

33 Escherichia coli Lactose - 1006021

34 Escherichia coli Lactose - 1109131

35 Escherichia coli Lactose - 9304017

36 Escherichia coli Lactose - 1307049

37 Escherichia coli Lactose - 0007027

38 Escherichia coli Lactose - 8211054

39 Escherichia coli Lactose - 8306016

40 Escherichia coli Lactose - 8312075

41 Escherichia coli Lactose - 8402177

42 Escherichia coli Lactose - 8406013

43 Escherichia coli Lactose - 8408062

44 Escherichia coli Lactose - 8410015

45 Escherichia coli Lactose - 8410016

46 Escherichia coli Lactose - 8410045

47 Escherichia coli Lactose - 8410048

48 Escherichia coli Lactose - 8410062

Tableau 1

2. Culture des bactéries et préparation de l'échantillon :

La préparation des échantillons est faite de manière à étudier l'exométabolome bactérien et donc le profil métabolique des bactéries décrites ci-dessus. Ainsi, les étapes de préparation des échantillons sont les suivantes :

• Préculture des bactéries sur gélose Columbia (Ref bioMérieux 43041) supplémentée à 5% en sang de mouton. Cette étape est réalisée à deux reprises par repiquage de colonies ; Ensemencement d'un milieu Mueller-Hilton liquide (Muller Hinton II Broth Cation Adjusted, Réf. Becton Dickinson 212322) à partir d'une ou plusieurs colonies obtenues à partir des précultures sur gélose Columbia, de manière à obtenir une concentration bactérienne finale des suspensions correspondant à une turbidité de 2 unités McFarland ;

Incubation des suspensions à 37°C pendant lh30 ;

Centrifugation des suspensions bactériennes pendant 10 min à 4000g ;

• Collecte des surnageants dans des tubes Eppendorf et stockage à -80°C.

Les 48 souches bactériennes préparées sont analysées en triplicata. Par ailleurs, un échantillon de milieu de culture Mueller Hinton sans inoculation bactérienne est également analysé en triplicata, après un temps d'incubation identique au temps d'incubation des suspensions bactériennes.

Ce qui fait un total de 147 surnageants à analyser en spectrométrie RMN.

3. Analyse RMN :

a. Préparation des échantillons pour la RMN :

Un tampon est utilisé pour réduire la dispersion de déplacement chimique des signaux RMN qui peuvent se produire du fait des variations de pH ou de force ionique entre les échantillons.

La préparation optimisée est la suivante : 60μΙ _^ d'un mélange contenant 1,25M de tampon phosphate KH ₂ P0 ₄ (pH 7,4) dans le D ₂ 0 avec 2mM de NaN ₃ et 0,1% de trimethylsilyl propionate (TMSP) est ajouté à 540 de surnageant.

Le mélange est agité vigoureusement et 550 du mélange est transféré dans un tube RMN 5mm. Chaque tube est placé dans un rack 96 tubes. L'ensemble des étapes de pipetage, de mélange et de transfert sont réalisées à l'aide d'une plateforme automatisée de gestion de liquide Freedom EVO 75, commercialisée par TECAN. Les racks sont stockés à +4°C jusqu'aux mesures en RMN. b. Mesures RMN :

Toutes les mesures sont réalisées sur un spectromètre Bruker AVANCE III fonctionnant à une fréquence de résonance protonique de 600,55 MHz, couplé à une cryosonde TCI CryoProbe™ 5 millimètres (mm) et un système de gestion des échantillons haut débit SampleJet, qui permet de maintenir la température des échantillons à +4°C jusqu'à mesure RMN proprement dite.

La température est alors régulée à 300 Kelvins (K) tout au long des mesures RMN. Une séquence d'impulsions standard de RMN 1D 1H du proton, la séquence NOESY (nuclear Overhauser spectroscopy) avec gradients-z, a été appliquée sur chaque échantillon afin de recueillir le profil métabolique correspondant. 128 acquisitions du signal de précession libre (FID : Free Induction Decays) ont été collectées pour chaque expérience sur une largeur spectrale de 20 ppm. Un délai de récupération de 4 secondes (s), un temps de mélange NOESY de 10 millisecondes (ms), ainsi qu'un gain du récepteur de 40,3 ont été utilisés. La durée de l'impulsion 90°, proche d'une valeur de 14,5 microsecondes (μβ) a été calibrée automatiquement sur chaque échantillon. Une série d'expériences de RMN bidimensionnelle ( ¹ H- ¹³ C HSQC, 'Η-'Η TOCSY et 1H J-Résolue) a été enregistrée pour un sous-ensemble d'échantillons afin de permettre l'annotation des signaux des différents métabolites. c. Analyse des données de spectres RMN 1H

Une fonction d'apodisation exponentielle, correspondant à un élargissement des raies de 0,3 Hz a été utilisée pour le traitement des signaux de précession libre, avant transformation de Fourier. Une correction de phase manuelle a été appliquée sur les spectres RMN 1H obtenus, qui ont été référencés par rapport au signal du TMSP calibré à δ = - 0,016 ppm à pH 7,4, sous Topspin 3,1 (Bruker GmbH, Rheinstetten, Allemagne).

Les spectres ont été réduits pour intégration en segments de largeur constante (0,01 ppm) sur la gamme de déplacement chimique [0,30 ; lOppm]. La région [4,50 ; 5,01 pm] correspondant au signal résiduel de l'eau a été exclue de l'analyse. Cette réduction des données a été réalisée sous le logiciel AMIX (Bruker), sans normalisation. Les données sont ensuite exportées dans SIMCA-P 13 (Umetrics, Umea,

Suède), pour analyse statistique. L'analyse par OPLS-DA est effectuée avec une répartition selon la méthode Pareto.

4. Analyse des résultats : discrimination Escherichia coli I Shigella

16 souches différentes ont été analysées par type bactérien {Escherichia coli Lactose +, Escherichia coli Lactose -, Shigella). Les variations entre les souches d'un même type pouvant être importantes, une analyse multivariée supervisée par OPLS-DA a été mise en œuvre afin de ne se focaliser que sur les différences primaires. - Discrimination Escherichia coli Lactose + / Shigella :

Comme explicité supra, la qualité du modèle OPLS-DA choisi pour l'analyse des données de RMN est évaluée et validée à l'aide des paramètres R ² , Q ² , mais également la valeur p du test CV-ANOVA. Les valeurs correspondantes ainsi que le nombre de composantes prises en compte pour l'évaluation de la qualité du modèle OPLS-SA choisi, sont regroupés dans le tableau 2 ci-dessous :

Tableau 2 Comme on peut le voir sur la figure 1 A, l'analyse par modèle OPLS-DA permet d'obtenir une bonne séparation entre les souches d'Escherichia coli Lactose + et les souches de Shigella. Lorsqu'on se reporte à la figure 1B, l'analyse « loading plot » nous permet de mettre en évidence les métabolites présents dans les surnageants de culture, et donc faisant partie de l'exométabolome bactérien, qui permettent la discrimination entre les types bactériens, car présents en quantité bien supérieure dans un type bactérien par rapport à l'autre.

L'analyse de variables (pics repérés par le déplacement chimique proton en ppm) correspondant aux métabolites discriminants pour la différenciation Escherichia coli Lactose + / Shigella est reprise dans le tableau 3 ci-dessous :

Tableau 3

Cette analyse montre que 11 métabolites sont discriminants dans la différenciation Escherichia coli Lactose + / Shigella. Ces métabolites sont : l'acétate, l'alanine, l'aspartate, Péthanol, le lactose, la lysine, la Να-acétyllysine, le propionate, le succinate, la thréonine et la valine. - Discrimination Escherichia coli Lactose - / Shigella :

Comme explicité supra, les valeurs des paramètres R ² , Q ² , mais également la valeur p du test CV-ANOVA, ainsi que le nombre de composantes prises en compte pour l'évaluation de la qualité du modèle OPLS-SA choisi pour la discrimination Escherichia coli Lactose - / Shigella , sont regroupés dans le tableau 4 ci-dessous :

Tableau 4 Comme on peut le voir sur la figure 2A, l'analyse par modèle OPLS-DA permet d'obtenir une bonne séparation entre les souches d'Escherichia coli Lactose - et les souches de Shigella.

Lorsqu'on se reporte à la figure 2B, l'analyse « loading plot » nous permet de mettre en évidence les métabolites présents dans les surnageants de culture, et donc faisant partie de Pexométabolome bactérien, qui permettent la discrimination entre les types bactériens, car présents en quantité bien supérieure dans un type par rapport à l'autre. L'analyse de variables (pics repérés par le déplacement chimique proton en ppm) correspondant aux métabolites discriminants pour la différenciation Escherichia coli Lactose - / Shigella est reprise dans le tableau 5 ci-dessous : Déplacement chimique (ppm) Métabolites Dominant chez

1 ,9 Acétate Escherichia coli

2.66; 2.67; 2.69; 2.78; 2.81 ; 3.88; 3.89; 3.90 Aspartate Shigella sp.

1.41 ; 1.42; 1.49; 1.50; 1.51 ; 1.52; 1.86; 1.87; 1.88; 1.89; 1.91 ; Lysine Shigella sp. 1.92; 3.03; 3.73; 3.74; 3.75

1.44; 1.45; 1.68; 1.69; 1.70; 2.99; 3.00; 3.02 Na-Acetyllysine Escherichia coli

1.04; 1.05; 2.15; 2.16; 2.17; 2.18 Propionate Escherichia coli

3.82; 3.83; 3.84; 3.91 ; 3.92; 3.94; 3.95; 3.96; 3.97; 3.99 Serine Shigella sp.

2.38; 2.39 Succinate Escherichia coli

1.30; 1.31 ; 1.32; 3.57; 3.58; 4.23; 4.24; 4.25 Threonine Shigella sp.

Tableau 5 Cette analyse montre que 8 métabolites sont discriminants dans la différenciation Escherichia coli Lactose - / Shigella. Ces métabolites sont : l'acétate, l'aspartate, la lysine, la Να-acétyllysine, le propionate, la sérine, le succinate et la thréonine.

Cet exemple permet donc de montrer qu'en analysant par spectrométrie RMN du proton, Γ exométabolome bactérien, et en particulier en mesurant la quantité d'un nombre réduit de métabolites issus de cet exométabolome, il est possible de différencier aisément Escherichia coli de Shigella

Le procédé selon l'invention apporte donc un réel intérêt clinique, en diminuant sensiblement le temps nécessaire habituellement pour réaliser une telle différenciation et ainsi permettre la mise en place d'un traitement antibiotique, lorsqu'il se justifie.

Références bibliographiques

[1] Escherichia S. Delpassand et al, Journal of Clinical Microbiology, May 1995, p. 1258-1262

[2] R. Bourne et al, Journal of Clinical Microbiology, August 2001, p. 2916-2923

[3] Di Martino, M.L., et al, Molecular évolution of the nicotinic acid requirement within the Shigella/EIEC pathotype. International Journal of Médical Microbiology, 2013. 303(8): p. 651-661.

[4] Johan Tryg and Svante Wold, Journal of Chemometrics, Volume 16, Issue 3, pages 119-128, March 2002