Der Wirkung eines Arzneimittels liegt in der Regel die Entfaltung einer biolo- gischen Funktion des in dem Arzneimittel enthaltenen Wirkstoffs in dem Zie- lorganismus zugrunde. Diese geht überwiegend auf die möglichst zielge- richtete Beeinflussung körpereigner Erkennungsstrukturen wie beispiels- weise Enzyme, Kanäle, Rezeptoren oder Signalproteine sowie Nukleinsäu- ren zurück. Demzufolge kann die Entwicklung neuer Arzneimittel entweder an dem Auffinden neuer Erkennungsstrukturen (drug targets) oder an der Bereitstellung bekannter Wirkstoffe mit optimierten Eigenschaften ansetzen.

In vielen Fällen greifen beide Ansätze auch ineinander ein.

Traditionell wird für die Entwicklung neuer Arzneimittel auf in der Natur auf- gefundene Stoffe oder Stoffgemische sowie auf zunächst eher wahllos er- zeugte Substanzen zurückgegriffen, die in standardisierten Screeningver- fahren in Zellkulturen und/oder Tierversuchen auf eine potentielle biologi- sche oder chemische Aktivität getestet werden. Die dabei als erfolgverspre- chende Kandidaten identifizierten Substanzen (sog. Leitverbindungen) kön- nen anschließend schrittweise modifiziert werden, wobei die durch die jewei- ligen Modifikationen bewirkten Änderungen der biologischen oder chemische Aktivität erfaßt werden. Diese Form der Suche neuer Arzneimittel aus und in der Natur-das sog. bioprospecting-stellt auch heutzutage noch eine wich- tige Basis der Arzneimittelforschung dar (Cragg GM, Newman DJ, Yang SS.

Nature. 1998 Apr 9 ; 392 (6676) : 535-7,539-40 : Bioprospecting for drugs ; Balick MJ. Ciba Found Symp 1994 ; 185 : 4-18 ; discussion 18-24 : Ethnobotany, drug development and biodiversity conservation--exploring the linkages).

Obwohl diese traditionelle"blinde Suche"nach wirkungsvollen Substanzen insbesondere durch die Automatisierung der Screeningverfahren (sog. High Throughput Screening, HTS) sowie die zunehmenden Kenntnisse über eine zielgerichtete Modifikation der aufgefundenen Stoffe an Effizienz gewonnen hat (Rosell S. Lakartidningen 1997 Dec 17 ; 94 (51-52) : 4938-41 : An entire rain forest can be screened at pharmaceutical industry's laboratories), bleibt diese Vorgehensweise in der Kosten-Nutzen Relation nach wie vor unbefrie- digend : Auf einen tatsächlich entwickelten neuen Wirkstoff kommt eine kaum vertretbar hohe Anzahl untersuchter, dann aber doch verworfener Stoffe (Grabley S., Thiericke R. : "Bioactive agents from natural sources : trends in discovery and application", Adv Biochem Eng Biotechnol 1999 ; 64 : 101-54 ; Landro JA et al. : "HTS in the new millenium : the role of pharmacology and flexibility", J Pharmacol Toxicol Methods 2000 Jul-Aug ; 44 (1) : 273-89). Zudem stellt sich oftmals erst zu einem späteren Zeitpunkt heraus, daß eine Sub- stanz eine besondere Wirkung für eine Indikation zeigt, die bei ihrer erstma- ligen Synthese und Untersuchung allerdings gar nicht beachtet wurde.

Eine-wenn auch begrenzte-Verbesserung dieser Form der Arzneimit- telentwicklung bringt der Einsatz der sog. kombinatorischen Chemie. Diese basiert auf einer systematisch variierten Kombination von Bausteinen zu ei- ner hohen Anzahl-bis zu mehreren Millionen-verwandter Verbindungen, bei denen aufgrund der Eigenschaften der Ausgangsbestandteile zu erwar- ten ist, daß zumindest einige-wenn auch in unterschiedlicher Ausprägung- die gewünschte Aktivität zeigen (Gayo LM :"Solution-phase library genera- tion : methods and applications in drug discovery", Biotechnol Bioeng 1998 Spring ; 61 (2) : 95-106 ; Bradley EK et al. : "A rapid computational method for lead evolution : description and application to alpha (1) -adrenergic antago- nists", J Med Chem 2000 Jul 13 ; 43 (14) : 2770-4).

Von diesem Ansatz der"blinden Suche"unterscheidet sich die planmäßige Suche nach neuen Wirkstoffen (sog. rational drug developement). Diese Vorgehensweise fußt auf der vorherigen Kenntnis der molekularen Mecha- nismen der zu behandelnden Krankheit und dem gezielten Entwurf einer mit dem verantwortlichen drug target auf molekularer Ebene wechselwirkenden Substanz. Dabei kombiniert das rational drug development vor allem bio-und chemo-informatische Methoden zur gezielten Suche nach geeigneten Wirk- stoffkandidaten (Bajorath J. :"Rational drug discovery revisted : interfacing experimental programs with bio-and chemo-informatics", Drug Discov Today 2001 Oct 1 ; 6 (19) : 989-995). Daher setzt diese Methode zunächst die Identi- fikation der an der Pathogenese beteiligten biochemischen Strukturen-in der Regel Proteine-und ggf. ihrer genetischen Ursachen voraus. Sind die die relevanten Proteine kodierenden Gene identifiziert, können letztere bei- spielsweise in Vektoren, Mikroorganismen, Pflanzen-oder Tiermodelle ein- gebracht werden, um in diesen Modellen die Beziehung zwischen der Struktur des jeweiligen Proteins und seiner Funktion zu untersuchen. Zur Charakterisierung insbesondere der maßgeblichen Bindungsstelle (n) der Proteine können röntgenkristallographische Strukturanalysen hinzutreten.

Die Informationen über die Eigenschaften des targets ermöglicht anschlie- ßend die gezielte Suche und Optimierung eines dazu passenden Liganden als späteren Wirkstoff. Dies läßt sich durch das sog. strukturbasierte Design, das auf der Basis eines rechnergestützen dreidimensionalen Modells des targets (oder seiner Bindungsstelle (n)) und den Kenntnissen der Eigen- schaften bekannter Moleküle und Strukturelemente eine sog. Leitstruktur für den an das target optimal angepaßten Liganden ableitet oder mit anderen beispielsweise auf Affinitätsselektion aus Peptid codierenden Genbibliothe- ken basierenden Methoden erreichen.

Dieser Weg des rational drug developements ist gerade aufgrund der Not- wendigkeit der vorherigen Kenntnis der der Pathogenese zugrunde liegen- den molekularen Mechanismen langwierig und daher kostenintensiv.

Die Entschlüsselung des menschlichen Genoms sowie der enorme Zuwachs an Kenntnissen über das Genom häufig verwendeter Versuchsmodelle in Verbindung mit den nunmehr überwiegend vollautomatisierten Untersu- chungsmethoden hat in den letzten Jahren neue Hoffnungen auf eine schnellere und effizientere Arzneimittelentwicklung geweckt. Diese bedient sich vermehrt des methodischen Ansatzes der vergleichenden Genomana- lyse (comparative genomics).

Ein mögliches Einsatzgebiet der vergleichenden Genomanalyse bei der Arzneimittelentwicklung setzt zunächst die Identifizierung eines an der Pa- thogenese beteiligten Gens, beispielsweise beim Menschen, voraus. An- schließend wird durch eine vergleichende Recherche in einer Gen-Daten- bank ein orthologes Gen in einem Tiermodell (z. B. Maus) ermittelt. Die ge- zielte genetische Manipulation und Modifikation des Tiermodells erlaubt dann ggf. Rückschlüsse auf die molekularen Mechanismen der Pathogenese beim Menschen. Dabei liefern insbesondere knock-out-Modelle detaillierte Informationen über die molekularen Eigenschaften potentieller drug targets (Harris S., Foord SM. : "Transgenic gene knock-outs : functional genomics and therapeutic target selection.", Pharamcogenomics 2000 Nov ; 1 (4) : 433- 43).

Altenativ zu dieser Vorgehensweise-also von einem im Menschen identifi- zierten Gen auszugehen und dies in einem Tiermodell mit orthologem Gen zu validieren-kann ebenso die Identifikation eines für die Pathogenese rele- vanten Gens im Tiermodell voranstehen, das nachfolgend in einer verglei- chenden Genomanalyse zur Identifikation eines orthologen Gens im Men- schen genutzt wird. Das entsprechende Genprodukt kann nachfolgend als target dienen oder selber den Ausgangspunkt einer weiterführenden Wirk- stoffentwicklung darstellen.

Eine derartige Vorgehensweise ist aus WO 00/45848 bekannt, die die Ver- wendung des zuvor aus entwicklungsbiologischen Tiermodellen (Drosophila, Huhn) bekannten hedgehog-Proteins als Therapeutikum zur Behandlung von Knochen-und Knorpelschäden sowie neuronaler Defekte beim Menschen beschreibt. Dazu wurde zunächst das zu dem tierischen hedgehog-Protein orthologe Genprodukt im Menschen identifiziert und anschließend über be- kannte Verfahren zu einem Arzneimittelwirkstoff optimiert.

Obwohl die Möglichkeiten der vergleichenden Genomanalyse der Arznei- mittelentwicklung in den letzten Jahren einen neuen Impuls gegeben haben, indem sie den Weg zum Verständnis der molekularen Hintergründe verkür- zen können, wurden die Hoffnungen bisher enttäuscht. Dies ist zu einem nicht unerheblichen Teil darauf zurückzuführen, daß auch bei Kenntnis der molekularen Mechanismen einer Erkrankung die gezielte Entwicklung, bzw. das Auffinden eines geeigneten Wirkstoffes nach wie vor Schwierigkeiten bereitet.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, das ein erleichtertes gezieltes Auffinden biologisch, insbesondere im Menschen akti- ver Substanzen ermöglicht.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß den unabhängigen Ansprüchen. Vorteilhafte Weiterentwicklungen sind jeweils Gegenstand von Unteransprüchen.

Der Kern des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Suche und Identifi- kation eines Referenzorganismus mit einer bestimmten Funktion und dem anschließenden genomischen Vergleich mit einem Zielorganismus. Die Su- che nach einem geeigneten Referenzorganismus setzt dabei als ersten Schritt die Definition der gewünschten physiologischen Funktion, d. h. der biologischen oder chemischen Wirkung voraus. In einem zweiten Schritt wird ein die gesuchte Funktion aufweisender Organismus ermittelt, der eben diese Wirkung (oder Aktivität) natürlicherweise in Anpassung an seine spezi- fische Lebensweise-also zur Lösung des durch seine Lebensweise be- dingten bestimmten physiologischen Problems-ausgebildet hat. Dieser Re- ferenzorganismus ist folglich ein solcher, der physiologische Mechanismen entwickelt hat, die der Lösung eben desselben Problems dienen, das auch durch den aufzufindenden Wirkstoff gelöst werden soll. Alternativ kann als Ausgangspunkt auch eine bereits identifizierte Funktion dienen.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die vergleichende Genomanalyse also nicht-wie dies in den bekannten Verfahren zur rational drug develop- ment in der Regel üblich ist-zur Untersuchung der molekularen Mechanis- men der Erkrankung eingesetzt, sondern dient mittelbar dem gezielten Auf- finden neuer körpereigener wirkstoffrelevanter Strukturen zuvor definierter Funktion im Zielorganismus.

Der besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der deutli- chen Verkürzung des für das Auffinden und die Entwicklung eines neuen Wirkstoffs benötigten Zeitraums, da ein vorheriges Verständnis der moleku- laren Mechanismen der Pathogenese und der beteiligten Strukturen für das Design des Wirkstoffs nicht notwendigerweise erforderlich ist. Die aufgefun- denen körpereigenen Wirkstoffe oder wirkstoffrelevanten Strukturen weisen zudem üblicherweise eine hohe Spezifität auf und reduzieren mögliche un- erwünschte Nebenwirkungen eines Arzneimittels.

Der erste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt demnach in der Auswahl eines Referenzorganismus, der in Anpassung an seine natürlichen Lebensbedingungen genau diejenigen (physiologischen) Merkmale aufwei- sen muß, die die gesuchte Substanz möglichst ebenso erfüllen sollte.

Als Referenzorganismus kommen insbesondere tierische Organismen, ebenso beispielsweise aber auch Pflanzen oder Mikroorganismen in Be- tracht. Gleichermaßen können auch spezialisierte Gewebe des Zielorganis- mus ebenso wie einzelne Subpopulationen unter den Begriff des "Referenzorganismus"subsummiert werden. Diese können beispielsweise in besonderer Weise vorteilhafte allelische Varianten (single nucleotide poly- morphisms, SNPs) eines gewünschten Merkmals ausprägen. Zur Ermittlung geeigneter Referenzorganismen kann vorteilhafterweise auf Datenbanken aus den Bereichen der Zoologie, Botanik und Mikrobiologie, der Physiologie, Biochemie, Genetik und Medizin zurückgegriffen werden.

Geeignete Datenbanken hierfür sind z. B."Biological AbstractsO","BIOSIS Previews@","CABCD","Current Contents SearchtD","Life Science Collec- tion","Medline"und"Plant-Gene". Als weitere Datenquelle tritt selbstver- ständlich fachspezifische Literatur, Filme, Mikrofilme und akkustische und elektronische Datenträger hinzu.

Nach Ermittlung mindestens eines geeigneten Referenzorganismus werden die zur Ausprägung des bevorzugten Merkmals wesentlichen Gene aus dem Referenzorganismus (oder entsprechender spezialisierter Gewebe) identifi- ziert. Im ersten Teil der Analyse kann mittels differential display oder micro- arrays das Expressionsmuster hierfür interessanter Gewebe untersucht wer- den ; hiermit ist in der Regel bereits eine Eingrenzung auf potentiell interes- sante Gene verbunden. Anschließend kann mit Hilfe moderner Hochdurch- satz DNA-Sequenziertechnologie z. B. in Kombination mit ESI- MS/Massenspektroskopie von Proteinen, die mit hochauflösenden Techni- ken aufgetrennt worden sind, ein Abbild des Zustands der Genexpression von Geweben oder Zellen des ausgewählten biologischen Models erzeugt werden. Aus dieser Expressionsbibliothek kann mit Hilfe etablierter Metho- den eine cDNA Bibliothek hergestellt werden.

Anschließend kann beispielsweise ein genomischer Vergleich dieser cDNA Bibliothek mit den genetischen Informationen des Zielorganismus erfolgen, die in Gendatenbanken vorliegen. Dazu kann sich der Fachmann beispiels- weise der Softwareprogramme bedienen, die von der Bioinformatik für ge- nomische Vergleiche entwickelt wurden. Ausgehend von dem im Zielorga- nismus ermittelten orthologen Gen kann dann die Identifikation des Genpro- dukts erfolgen. Die Identifikation wird dabei insbesondere über den Vergleich von ESTs (Expresses Sequence Tags) ermöglicht. Das-beispielsweise humane-Genprodukt kann nachfolgend unmittelbar als Wirkstoff eingesetzt werden. Es kann aber auch vorteilhaft sein, zuvor Modi- fikationen oder Modulationen an der identifizierten Gensequenz vorzuneh- men, beispielsweise bei einem inaktiv vorliegenden Gen oder daß Genrodukt zur Entwicklung eines Wirkstoffs zu verwenden.

Die Vornahme funktioneller Modifikationen und deren Auswirkungen auf die Proteinstruktur ebenso wie das weitere down stream development können vorzugsweise durch die Anwendung von strukturanalytischen Methoden und molecular modelling unterstützt werden.

Alternativ oder ergänzend können die mittels des aufgefundenen biologisch aktiven Wirkstoffs gewonnenen Kenntnisse verwendet werden bzw. dazu führen, ein neues drug target und ggf. eine damit wechselwirkende Leitstruktur zu identifizieren.

In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird zum Auffin- den einer orthologer Substanz oder einem Zielmolekül (drug target) im Ziel- organismus zunächst eine EST-Bibliothek von relevanten Geweben des ausgewählten Referenzorganismus erzeugt. Diese Gewebe befinden sich zum Zeitpunkt der Erzeugung der Bibliothek vorzugsweise in einem physio- logischen Zustand, der-in Anpassung an die aktuelle und tatsächliche Le- benssituation des Referenzorganismus-die Expression eines Peptids oder Proteins mit einer funktionalen Eigenschaft wahrscheinlich sein läßt, die derjenigen der gewünschten biologisch aktiven Substanz im Zielorganismus- zumindest weitgehend-entspricht. Die relevanten Peptide oder Proteine können nachfolgen identifiziert werden. Anschließend können die derart ge- wonnenen EST-Bibliotheken und Erkenntnisse im Vergleich mit Genomana- lysen des Zielorganismus zur Identifikation entsprechender orthologer Strukturen, beispielsweise im Menschen, verwendet werden. Dabei kann es sich beispielsweise um pharmakologisch wirksame Substanzen, Leitstruktu- ren oder Zielmoleküle (drug targets) handelt.

Ausführungsbeispiele : l Humanes BPP Die Kontrolle des Blutdrucks erfolgt beim Menschen zu einem wesentlichen Teil über das sogenannte Renin-Angiotensin-Aldosteron-System, das unter anderem bei einem Abfall des Blutdrucks aktiviert wird : Beim Gesunden steigen Adrenalin und Noradrenalin bei körperlicher Bela- stung aus Gründen der Kreislaufanpassung rasch an. Bei der akut auftreten- den Herzinsuffizienz sinkt der arterielle Blutdruck in Folge einer starken Ab- nahme des Herzzeitvolumens. Reflektorisch wird im Rahmen der neuroho- mogralen Gegenregulation die Noradrenalin-Ausschüttung aus dem Neben- nierenmark über den Barorezeptorenreflex und über sympathische Nerven- fasern stimuliert, zusätzlich wird ein geringer Teil des als Neurotransmitter wirksamen Noradrenalins aus dem synaptischen Spalt freigesetzt und ge- langt in den Kreislauf. Durch die vermehrte adrenerge Stimulation wird die Natrium-, und damit auch die Flüssigkeitsrückresorption an der Niere erhöht.

Die vermehrt zirkulierenden Plasmakatecholamine führen durch eine Stimu- lation der ß-Rezeptoren des juxtaglomerulären Apparates zu einer vermehr- ten Reninausschüttung. Ebenso führt bereits der Abfall des arteriellen Blut- drucks oder eine verminderte Natriumkonzentration im Plasma zu einer er- höhten Reninfreisetzung.

Renin bewirkt durch die katalytische Abspaltung einer Eiweißkette die Frei- setzung von Angiotensin I aus dem Angiotensinogen. Das Angiotensin I wird seinerseits durch das Angiotensin-Konversions-Enzym (ACE) in Angiotensin II umgewandelt. Dieses führt durch die Aktivierung spezifischer Angiotensin «-Rezeptoren zu einer starken Vasokontraktion, die bei erniedrigtem Herz- zeitvolumen den peripheren Widerstand erhöht und somit den arteriellen Blutdruck steigen läßt.

Daneben hat Angiotensin II an den Rezeptoren des zentralen Nervensy- stems die Wirkung eines Neurotransmitters, der das Durstzentrum stimuliert und somit eine vermehrte Flüssigkeitsaufnahme zur Folge hat. Zudem stimu- liert das Angiotensin II die Freisetzung des Steroidhormons Aldosteron aus der Nebennierenrinde, das zu einer vermehrten Natriumreabsorption zu Un- gunsten von Kalium führt.

Somit führt die Stimulation des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems vor allem zu zwei dem arteriellen Blutdruckabfall entgegen wirkenden regulatori- schen Mechanismen : zum einen wird durch eine vermehrte Flüssigkeits-und Natriumretention die Vorlast des Herzens erhöht, welches bei insuffizienten Herzen zu einer Erhöhung des Schlagvolumens führt ; zum anderen trägt der erhöhte periphere Widerstand zu einer Normalisierung des arteriellen Blut- drucks unter vermindertem Herzzeitvolumen bei, damit die lebenswichtigen Organe ausreichend durchblutet werden können.

Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System erlaubt somit die Aufrechterhal- tung eines stabilen Blutdrucks selbst unter Bedingungen einer erhöhten kör- perlichen Belastung oder Diarrhöe, wenn das Blutvolumen reduziert ist und der Blutdruck abfällt. Bei einzelnen Individuen ist dieses Regulationssystem jedoch überaktiviert, so daß der Blutdruck in pathologischem Maße erhöht ist. Der erhöhte Blutdruck kann zu Schädigung an den Blutgefäßen und so- mit langfristig z. B. zu Herzschäden oder zum Gehirnschlag führen.

Die Suche nach einem geeigneten Therapeutikum für die pathologische Hy- pertension zielte daher auf eine biologisch aktive Substanz ab, die als Inhi- bitor des Renin-Angiontensin-Aldosteron-Systems fungieren kann.

Nach der Definition dieser physiologisch bevorzugten Eigenschaft der ge- suchten Substanz-nämlich die Hemmung des Renin-Angiotensin-AI- dosteron-Systems-war die Auswahl eines geeigneten Referenzorganismus, der in Anpassung an seine natürliche Lebensweise eine biologisch aktive Substanz mit dieser bevorzugten Eigenschaft aufweist, maßgeblich für den Erfolg der weiteren Suche.

Bei der Suche nach diesem geeigneten Referenzorganismus konnte auf Be- richte aus den 60iger Jahren zurückgegriffen werden, die den durch einen Biß der Viper Bothros jararaca verursachten Zusammenbruch brasilianischer Plantagenarbeiter schilderten, der-wie ein britisches Forscherteam später herausfand-auf die Wirkung von im Gift der Schlange enthaltene Peptide zurückzuführen war. Diese Peptide erhöhen die Effekte des Kinins Bradyki- nin, so daß ihnen die Bezeichnung Bradykinine potentiating peptids (BPP) zugeordnet wurde.

BPPs verstärken die vasodilatorischen und natriuretischen Effekte des kör- pereigenen Bradykinins und führen so zu einer Senkung des Blutdrucks (Fig.

8). Diese Wirkung beruht zu einem erheblichen Teil auf einer Hemmung des Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE), so daß die Bildung des die Hy- pertension (mit)-verursachenden Angiotensins II unterbleibt. Da Angiotensin II den hydrolytischen Abbau des Bradykinins katalysiert, geht mit der Hem- mung des ACE gleichzeitig die Verlängerung der Halbwertzeit des anderen- falls schnell abgebauten Bradykinins-und somit als Effekt eine Verstärkung des dilatatorischen Effekts des Bradykinins-einher.

In den folgenden Jahren führten Sequenz-und Strukturanalysen der Peptide andere Schlangen-und Echsengifte mit Bradykinin potenzierenden Effekten (z. B. aus Bothrops insularis, Bothrops jararaca, Agkistrodon halys blomhoffi und Agkistrodon halys pallas ; Fig. 1) zu der Ableitung folgender allgemeiner Strukturmerkmale von BPPs : Bei den bekannten BPPs handelt es sich um Oligopeptide von bis zu 13 Aminosäureresten mit einer prolinreichen Sequenz und der zyklischen Ami- nosäure Pyroglutamat. am N-Terminus, die genetisch als Glutamin kodiert wird. C-terminal befindet sich-mit wenigen Ausnahmen-das Tripeptid Iso- leucyl-Prolyl-Prolin-abweichend im Einzelfall auch ein Seryl-Prolyl-Prolin- dessen Terminus immer von der freien Säure-COOH gebildet wird.

In einem weiteren Schritt wurde in vergleichenden Datenbank-Analysen in Verbindung mit einer vergleichenden Literaturrecherche ermittelt, daß die BPPs aus Schlangen-und Echsengiften übereinstimmend in einer Tandem- anordnung in einer Precursorsequenz kodiert werden, an deren C-Terminus jeweils ein Peptid mit natriuretischer Wirkung angeordnet ist. So handelt es sich bei der Sequenz 256 aa von Bothrops jararaca um das BPP-Precursor- Protein, das N-terminal nach einer Signalsequenz ein BPP kodiert, während sich C-terminal das natriuretische Peptid des C-Typus anschließt (CNP ; Fig.

2).

Im Einzelnen lagen diesen Erkenntnissen folgende Überlegungen und Schritte zugrunde : Bei Hochdurchsatzsequenzierung einer cDNA-Bank aus der Speicheldrüse von Heloderma horridum wurde folgende cDNA-Sequenz gefunden : helo all. 0.630 (natriuretic peptide precursor) (SEQ. ID No 1) 1 cgttcccgga ggatccagca cagactgtgg tgggcggcag cacaaagatg 51 aatcccagac tcgcctgetc cacttggetc ccgctgctcc tggtgctgtt 101 cactctcgat caggggaggg ccaatccagt ggaaagaggc caggaatatc 151 ggtccctgtc taaacggttc gacgacgatt ctaggaaact gatettagag 201 ccaagagcct ctgaggaaaa tggtcctcca tatcaaccct tagtcccaag 251 agcttccgac gaaaatgttc ctcctgcatt tgtgccctta gtcccgagag 301 cttccgacga aaatgttcet cctcctcctc tgcaaatgcc cttaatcccg 351 agagcttccg atgaaaatgt tcctcctcct cctetgcaaa tgcccttaat 401 cccgagagec tccgagcaaa aaggtcctcc atttaatcct ccgccatttg 451 tggactacga gccaagagcc gecaatgaaa atgctcttcg gaaactcatc 501 aagcgctctt tegagaggtc cocagggagg aacaaaaggc tcagtcccgg 551 agacggctgc tttggtcaga aaattgaccg gatcggagcc gtgagtggga 601 tgggatgtaa tagtgtaagc tcacagggga aaaaataata gaaggggatg 651 cctgaatcct caaaaaatcc atataattga agcaaaggtc tgcaaggttg 701 tattttaaaa aataaaaaat actcctgcca actgaa Der Vergleich dieser cDNA-Sequenz mit Sequenzen in öffentlichen Daten- banken brachte folgendes Ergebnis : ! ! SEQUENCE LIST 1.0 BLASTP 1.4. 8 [1-Feb-95] [Build 15 : 31 : 04 Feb 10 1997] Reference : Altschul, Stephen F., Warren Gish, Webb Miller, Eugene W. Myers, and David J. Lipman (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol.

Biol.

215 : 403-10.

Query=/home/izm/sg37645/helo630. pep (196 letters) Database : swplus 239,439 sequences ; 76,635, 939 total letters.

Smallest Sum High Probability Sequences producing High-scoring Segment Pairs : Score P (N) N SW : ANF CHICK ! P18908 gallus gallus (chicken). atrial nat... 96 3.7e-07 2 SW : SSGPVOLCA ! P21997 volvox carteri. sulfated surface g... 110 1.3e-06 1 SPOV : P79799 ! P79799 micrurus corallinus. natriuretic pe... 103 6.7e-06 1 SW : ANF HUMAN ! P01160 homo sapiens (human). atrial natriu... 82 8.3e-06 3 SP HUM : Q13766 ! Q13766 homo sapiens (human). atrial natri... 82 1. le-05 3 SW : ANFB RAT ! P13205 rattus norvegicus (rat). brain natri... 99 2. 1e-05 1 SPPL : P93797 ! P93797 volvox carteri. pherophorin-s precu... 100 3.5e-05 1 SW : ANFV ANGJA ! P22642 anguilla japonica (japanese eel).... 88 5.4e-05 1 SW : N075 SOYBN ! P08297 glycine max (soybean). early nodul... 83 5.9e-05 2 SW : ANFCHUMAN ! P23582 homo sapiens (human). c-type natri... 82 8.2e-05 2 Aus diesem Ergebnis wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß die aufgefun- dene cDNA-Sequenz aus H. horridum für ein Precursor-Protein eines natriu- retischen Peptides codiert. Zudem war aus der Literatur bekannt, daß in Schlangengiften natriuretische Peptide vorkommen können (Schweitz H, Vigne P, Moinier D, Frelin C, Lazdunski M. A new member of the natriuretic peptide family is present in the venom of the green mamba (Dendroaspis angusticeps ; J Biol Chem. 1992 Jul 15 ; 267 (20) : 13928-32. ), deren Precur- sor-Sequenz auch für BPPs codiert (Murayama N, Hayashi MA, Ohi H, Fer- reira LA, Hermann W, Saito H, Fujita Y, Higuchi S, Fernandes BL, Yamane T, de Camargo AC. Cloning and sequence analysis of a Bothrops jararaca cDNA encoding a precursor of seven bradykinin-potentiating peptides and a C-type natriuretic peptide. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Feb 18 ; 94 (4) : 1189-93.) Die folgende Sequenz zeigt die Prepro-Form des Precursors für ein natriure- tisches Peptid aus Heloderma horridum. heloall. 0.630 (natriuretic peptide precursor) (SEQ. ID. No 2) signal peptide 1 MNPRLACSTW LPLLLVLFTL DQGRANPVER GQEYRSLSKR FDDDSRKLIL 51 EPRASEENGP PYQPLVPRAS DENVPPAFVP LVPRASDENV PPPPLQMPLI 101 PRASDENVPP PPLQMPLIPR ASEQKGPPFN PPPFVDYEPR AANENALRKL 151 IKRSFERSPG RNKRLSPGDG CFGQKIDRIG AVSGMGCNSV SSQGKK natriuretic peptide In dieser Sequenz sind N-terminal vom potentiellen natriuretischen Peptid (über Homologie bestimmt) Sequenzabschnitte erkennbar, die untereinande- rer identisch oder sehr ähnlich sind. Die Annahme ist, dass in Analogie zu bekannten Precursor-Sequenzen für natriuretische Peptide und BPPs (Bradykinin-potenzierende Peptide) aus Schlangen, diese Sequenzab- schnitte für Peptide codieren, die die physiologischen Effekte von Bradykinin potenzieren können und wie BPPs aus Schlangen, auch ACE (Angiotensin- Converting Enzyme) hemmen.

Um zu testen, ob diese Peptide ACE-Inhibitoren darstellen, wurden zwei Peptide synthetisiert (S682 und S683-Sequenz s. unten). Als C-Terminus wurde Prolyl-Prolin, wie er auch in BPPs aus Schlangengiften vorkommt, gewählt. Im Precursor-Protein sind drei Sequenzabschnitte identisch. Diese AS-Sequenz wurde für ein Peptid gewählt (S683). Das zweite Peptid (S682) enthält die gleiche Sequenz, nur N-terminal verlängert um fünf Aminosäuren.

Bei diesem Peptid wurde das N-terminale Glutamin durch Pyroglutamat er- setzt. Pyroglutamat ist als Glutamin codiert und wird erst durch enzymatische Modifikation gebildet. Da alle bekannten Schlangen-BBPs Pyroglutamat als N-Terminus besitzen, wurde dieses auch für Heloderma vermutet.

Die beiden Heloderma-Peptide wurden auf ihre ACE-inhibitorische Aktivität getestet (Assay wie bei humanen BPPS ; siehe unten).

Die IC5o-Werte für die Inhibition von ACE aus Schweineniere sind in der fol- genden Tabelle (Tab. 6) dargestellt : Tab. 6 Inhibitor Structure ICSO-value CH,"q Captopril | Hs c X o 0. 0014 pM 0 HO ho BPP9a pGlu-WPRPQIPP 0. 097 jiM S682 pGlu-MPLIPRASDENVPP 150 JIM (SEQ : ID. No 3) S683 PRASDENVPP 65, uM (SEQ. ID. No4) Ausgehend von diesen Kenntnissen wurde in einem nächsten Schritt die (Pro) Precursor-Sequenzen humaner natriuretischer Peptide im Hinblick auf diese allgemeinen Strukturmerkmale untersucht. Dabei zeigte sich bei dem (Pro) Precursor-Protein des atrialen natriuretischen Peptids (ANP) ein prolin- reiches Sequenzmotiv, das das gleiche Prolinmuster wie Schlangen-BPP aufweist, nämlich C-terminal ein Prolyl-Prolin von zwei weiteren Prolinresten in Richtung N-Terminus : ANF human atrial natriuretic factor precursor (ANF) sequence 153 aa ; 16708 MW signal 1.... 25 signal peptide peptide 26.... 55 cardiodilatin-related pep- tide (CDP) peptide 73.... 82 human BPP peptide 124... 151 atrial natriuretic peptide (ANP) disulfid 130... 146 by similarity variant 152... 153 missing (in one of the two genes) 1 MSSFSTTTVS FLLLLAFQLL GQTRANPMYN AVSNADLMDF KNLLDHLEEK 51 MPLEDEVVPP QVLSEPNEEA GAALSPLPEV PPWTGEVSPA QRDGGALGRG 101 PWDSSDRSAL LKSKLRALLT APRSLRRSSC FGGRMDRIGA QSGLGCNSFR 151 YRR Eine Übersicht über das humane ANP-Proprecursor-Protein zeigt Fig. 3.

Nach der Abspaltung der Signalsequenz verbleibt die Precursor-Sequenz pANP, die um 25 Aminosäuren verkürzt ist.

In diesem kurzen Sequenzabschnitt ist das charakteristische Prolinmuster von BPPs aus Schlangengiften mit mehr als 10 Aminosäuren wiederzufin- den : Amino acids identity : 100 >= 75 >= 50 < 50 1 AHB_PB-----------QGLPPRPLIPP 11 2 BIP3------QLGPPRPQIPP 11 3 AHPBPP1-----------QGRPPGPPIPP 11 4 AHBPA-----------QGRPPGPPIPP 11 5 BJV9---------QGGWPRPGPEIPP 13 6 BJIV-----------QWPRPYPQIPP 11 7 AHBPE-------QKWDPPPVSPP 11 8 BPP ANP QVLSEPNEEAGAALSPLPEVPP 22 Die Nummern 1-7 sind BPPs aus Schlangengiften. Nummer 8 ist ein 22 AS Sequenzabschnitt aus dem humanen proANP ; AS-Position 61 bis 82.

Ausgehend von der aufgefundenen Aminosäuresequenz des humanen pANP (Precursor ANP) wurden Peptide synthetisiert, die übereinstimmend Prolyl-Prolin am C-Terminus tragen und nur in der Sequenzlänge von 7-15 Aminosäuren variieren. Die Sequenzen dieser Peptide sind in Tabelle 1 auf- geführt.

Tab. 1 Peptide Sequence S541 EEAGAALSPLPEVPP 48 uM (SEQ. ID No 5) S542 EAGAALSPLPEVPP 38 µM (SEQ. ID No 6) S543 AGAALSPLPEVPP 25 µM (SEQ. ID No 7 S544 GAALSPLPEVPP 29 µM (SEQ. ID No 8) S494 AALSPLPEVPP 9 µM (SEQ. ID No 9) S545 ALSPLPEVPP 2. 4 NM SEQ. ID No 10) S546 LSPLPEVPP 3. 5 uM (SEQ. ID No 11 S547 SPLPEVPP 27 µM (SEQ. ID No 12) S548 PLPEVPP 2 21, uM (SEQ. ID No 13) Dabei wurde die Sequenzlänge von 15 Aminosäuren nicht überschritten, da bei darüber hinaus gehenden Sequenzlängen bereits Sekundärstrukturen ausgebildet werden können, die nachweislich in Versuchen mit Schlangen- BPPs zu einem Aktivitätsverlust führten. Zu Kontrollzwecken wurde auch ein Peptid mit 22 Aminosäuren synthetisiert.

Diese Peptide wurden in einem in vitro-ACE-Inhibitor-Assay mit einem aus Schweinenieren gewonnen Angiotensin-Converting-Enzym auf ihre inhibito- rische Wirkung untersucht. Als Substrat diente Hippuryl-Histidyl-Leucin. Eine schematische Darstellung des Assays zeigt Fig. 4 ; eine beispielhafte grafi- sche Bestimmung der IC5o-Werte ist Gegenstand der Fig. 5. Eine konkrete Versuchsbeschreibung ist unten aufgeführt. Die jeweiligen IC50-Werte sind aus Tab. 1 zu entnehmen.

Neben den im Auftrag durch die Firma Biosyntan synthetisierten Peptiden wurden zum Vergleich BPP9a (von Sigma gekauft) aus Bothrops jararaca und Captopril (Sigma) -dem ersten synthetischen ACE-Inhibitor aus der For- schung mit Schlangen-BPPs-auf ihre Fähigkeit zur Hemmung von ACE getestet.

Tab. 2 Inhibitor Structure tCso CH3"Nq ! \/ e N- Captopril HS õ HO 0. 0014 uM nô 1 1 0 HO 1 1 BPP9a Pyr-WPRPQIPP 0. 097 pM S492 pGlu-VLSEPNEEAGAALSPLPEVPP > 300 pM (SEQ. ID. No 14) S493 pGlu-ALSPLPEVPP 20, uM (SEQ. ID. No. 15) S494 AALSPLPEVPP 9, uM Es läßt sich zusammenfassen, daß das Decapeptid S545 bereits bei einer 2,4 uM Konzentration in dem ACE-Assay eine halbmaximale Hemmwirkung zeigte. Eine weitere Verkürzung des Peptids auf 9 AS, 8 AS oder 7 Ami- nosäurereste führte zu einem Anstieg der IC5o-Werte ; gleiches gilt für eine Verlängerung der Peptidkette auf 15 Aminosäurereste. So liegt der IC50-Wert des BPPs S541 bei 48 uM. Eine Verlängerung des Peptids bis auf 22 Ami- nosäuren einschließlich einer Modifikation des N-Terminus zum Pyrogluta- mat zeigte sich in-vitro mit einem IC50-Wert von über 300 uM praktisch inaktiv (Tab. 2). Die Einzelergebnisse sind den Tabellen 5a-5K und Fig. 5a- 9k.

Das Deca-Peptid S545 (entspricht S605) mit der höchsten Aktivität wurde in weiteren Experimenten zum Nachweis der Bradykinin-potenzierende Wir- kung eingesetzt. Diese Experimente wurden mit normotensiven Ratten durchgeführt, bei denen die durch Bradykinin ausgelöste kurzzeitige Absen- kung des Blutdrucks (hervorgerufen durch Vasodilation) gemessen wurde. In diesen Experimenten konnte ein konzentrationsabhängiger Bradykinin-po- tenzierender Effekt für dieses Peptid gezeigt werden. Daneben wurde S545 (entspricht auch proANP48-57) auch in in vivo Untersuchungen an an hy- pertensiven Ratten getestet (Fig. 7).

Bei den in vivo Untersuchungen an normotensiven Ratten wurden diese zu- nächst betäubt und nach der Stabilisierung des Blutdrucks mit einer kon- stanten Menge Bradykinin behandelt. Anschließend wurde entweder Capto- pril oder humanes BPP gefolgt wiederum von einer konstanten Menge von Bradykinin verabreicht. Danach wurde der maximale Blutdruckabfall ermittelt sowie der Potenzierungsfaktor unter Zugrundelegung des Bradykinins als 1 errechnet. Die Ergebnisse finden sich in den Tabellen 3a und 3b. Ebenso wurden der systolische sowie der diastolische Blutdruck, der prozentuale Mitteldruckabfall und die Zeit zum Erreichen des Ausgangswerts gemessen (siehe Tabellen 4a bis 4j). Für eine konkrete Versuchsbeschreibung siehe unten.

Interessanterweise wird von hBPP für einen Bradykinin-potenzierenden Ef- fekt in vivo nur die 10fache molare Konzentration des Captoprils benötigt, während im ACE-Assay zum Erreichen des Captopril-Effekts die 1000-fache Konzentration eingesetzt werden muß. Das läßt den Schluss zu, daß es in vivo außer der ACE-Inhibition noch eine zweite Aktivität geben muss, die eine Potenzierung des Bradykinin-Effektes zur Folge hat.

Die Erklärung dafür ist, daß BPPs in Wechselwirkung mit einem membran- ständigen Rezeptor treten, z. B. als allosterischer Regulator am Bradykinin B2-Rezeptor (Fig. 6). Demnach können die Kenntnisse aus den Untersu- chungen mit den erfindungsgemäßen Peptiden der Validierung eines neuen drug targets-nämlich des membranständigen Rezeptors-und somit letztlich auch der Entwicklung neuartiger Therapeutika zur Behandlung des Blut- hochdrucks dienen.

Versuchsdurchführung : 1. ACE-Inhibierungs-Assay Das Prinzip des ACE-Inhibierungs-Assays basiert auf Arbeiten von Chejung, H. S., Cushmann, D. W. :"Inhibition of homogeneous angiotensin converting enzyme of rabbit lung by synthetic venom peptides of Bothrops jararaca."in Biochimica et Biophysica Acta 293,451-563 (1973).

Die in dem Assay verwendeten Peptide wurden im Auftrag durch Biosynthan (Berlin) hergestellt und wiesen eine HPLC-Reinheit von mehr als 92% auf.

Captopril und das bekannte Schlangen-BPP BPP9a wurden bei Sigma er- worben.

Der Assay wurde in 96 Well HTRF-Platten von Packard durchgeführt. Pro Well wurde 1 mU ACE aus Schweinenieren (EC 3.4. 15.1 (Sigma)) in 30 pl Assay-Puffer (25 mM HEPES, 0,3 M NaCI, pH 8,2) und 20 ul in Assay-Puffer gelöster Hemmstoff (0, 35-200 uM) verwendet. Die Reaktion wurde gestartet durch das Hinzufügen von 50 p12 mM Hippuryl-Histidyl-Leucin (Sigma) in Assay-Puffer. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur (22°C) für 30 Minu- ten durchgeführt und durch 50 pl 1-M NaOH gestoppt. Anschließend wurden 50 ul einer 0,5% igen ortho-phtaldialdehyd (Sigma) in Methanol hinzugefügt, dem nach weiteren 5 Minuten 50 ul einer 2,5 M HCI-Lösung zur Stabilisie- rung des entwickelten Fluoreszenzprodukts zugefügt wurden. Die Fluores- zenz wurde innerhalb der nächsten 15 Minuten mit einem 1420 Victor Multi- labelcounter (Wallac) mit einer Einregung von B= 355 30 nm und einer Emission von X = 515 nm gemessen.

Die Versuchsergebnisse wurden umgerechnet in % Hemmung und die IC50- Werte wurden grafisch aus einer Dosisreaktionskurve ermittelt.

Zur Minimierung der durch Zeit bedingten Fehler wurden alle Pipettierungs- schritte in einem präzisen Zeitablauf durchgeführt.

II Blutdruckmessungen an normotensiven und hypertensiven Ratten Die Versuche wurden an betäubten weiblichen normotensiven Wister-Ratten mit einem Gewicht von 210 bis 240 g durchgeführt.

Das Peptid pANP4857 wurde für die in vivo Versuche von Biosynthan (Berlin) mit einer HPLC-Reinheit von 98% hergestellt.

Die Betäubung erfolgte durch eine i. p. -Verabreichung von 1 ml/kg 1 : 1 Ketavit (100 mg/ml) + Rampun (2%).

Zur Messung des Blutdrucks wurde ein Polyethylen-Katheter in die Aorta femuralis eingeführt und mit einem Druck-Transducer verbunden. Ein Stat- ham-P23A Druck-Transducer wurde mit einem Gould Polygraphen verbun- den und zur Erfassung des arteriellen Blutdrucks verwendet. Das System wurde gegen ein Hg-Manometer kalibriert.

Alle Substanzen wurden gelöst und verdünnt in einer physiologischen Koch- salzlösung und durch einen Katheter in die Vena jugularis verabreicht.

Nach der Stabilisierung des Blutdrucks (nach etwa 10 Minuten) wurde zu- nächst ein mg/kg einer 2, 5 uM Bradykinin-Lösung (Sigma) verabreicht. Nach einem Intervall von 5 Minuten folgte eine Dosis einer 1 mg/kg Captopril (Sigma) oder pANP48-57-Lösung, die unmittelbar gefolgt wurde von 1 ml/kg einer 2, 5 uM Bradykinin-Lösung.

Der Mitteldruck wurde aus dem gemessenen diastolischen (Pd) und systoli- schen (ps) Blutdruck mit Hilfe folgender Formel : pm = (ps-PD) x 0,42 + Pd er- mittelt.

Die Durchführung der Versuche an den hypertensiven Ratten entsprach denjenigen an normotensiven Wistar-Ratten (siehe Fig. 6). Es wurden Wi- star-Kyoto Ratten verwendet. Diese Ratten wurden durch Einengung der linken Nierenarterie hypertensiv gemacht. Dieses klassische Hochdruckmo- dell (two kidney-one-cliprenovascular hypertension) ist unabhängig vom verwendeten Rattenstamm.

11. Exendine In den vergangenen 20 Jahren wurden eine Reihe von Peptiden (Helodermin, Helospectine, Exendin 3 und Exendin 4) im Gift der Echsenfa- milie Helodermatidae (mit den Arten Heloderma suspectum und Heloderma horridum) entdeckt, die in Geweben von Säugern mit Zellmembranrezepto- ren interagieren. Exendin-3 (Ser2-Asp3) unterscheidet sich durch 2 Ami- nosäuren von Exendin-4 (Gly2-Glu3). Dieser strukturelle Unterschied bewirkt auch einen Unterschied in der Aktivität. Exendin-3 interagiert mit VIP-Re- zeptoren und GLP-1 Rezeptoren. Exendin-4 nur mit GLP-1 Rezeptoren.

Diese Peptide mit glucagon-ähnlicher Wirkung führen zu definierten physio- logischen Reaktionen, wie z. B. die vermehrte Insulinbildung und Stimulation der Pankreas-Inselzellen durch Exendin-4 bei diabetischen Nagern.

Die Untersuchung der Aktivität dieser Peptide hat zur Entdeckung neuer Re- zeptoren und Rezeptorantagonisten geführt und das Verständnis der Säu- gerphysiologie erweitert. Bemerkenswert ist die Ähnlichkeit der Echsenpep- tide mit Peptiden der Glucagon/Vasoactive Intestinal Peptide (VIP)/Secretin Superfamilie.

Im Rahmen der Hochdurchsatzsequenzierung einer cDNA-Bank aus der Speicheldrüse von Heloderma horridum wurden folgende cDNA-Sequenzen identifiziert : >heloall. 0.1085 (exendin-1) 1 cttcagacgt cactgctgaa acctctgctc tgagtttggt gtctgtgcag 51 aagaggagat gaaaagcatc ctttggctgt gtgtttttgg gctgctcatt 101 gcaactttat tccctgtcag ctggcaaatg gctatcaaat ccaggttatc 151 ttctgaagac tcagaaacag accaaagatt gcttgagagt aagcgacatt 20, 1 ctgatgcaac atttactgcg gagtattcga agcttctagc aaagttggca 251 ctacagaagt atcttgagag cattcttgga tccagtacat caccacgtcc 301 gccatcgcgt taaggtcttt gagttgtgga acacgacaca catctgatgt 351 ttgacgacca ttttgaagaa aagtttcggg caatatgtta catgtctttg 401 tttccaatta gtgagctaca aaggctttct caattaaaaa aaaattgaag 451 tcatgcaa >heloall. 0.564 (exendin-3) 1 ctggctggtc ttcagaagtc actgctcaaa tctctattct gaatttggtg 51 cctgtgcaaa ggagaagatg aaaatcatcc tgtggctgtg tgttttcggg 101 ctgttccttg caactttatt ccctgtcagc tggcaaatgc ctgttgaatc 151 tgggttgtct tctgaggatt ctgcaagctc agaaagcttt gcttcgaaga 201 ttaagcgaca tagtgatgga acatttacca gtgacttgtc aaaacagatg 251 gaagaggagg cagtgcggtt atttattgag tggcttaaga acggaggacc 301 aagtagcggg gcacctccgc catcgggtta aggtctttca attgtggaac 351 aagacacaca cctgatgttt gatgaccatt ttaaagaaat gtttccagca 401 atacgtcaca tgtctttgtt tccaattagt gagcgacaca gcctttctta 451 attaaaaaat tgaagtcatg c Der Vergleich dieser Sequenzen mit bekannten Sequenzen in öffentlichen Datenbanken bringt folgendes Ergebnis : 1. für heloall. 0.1085 (exendin-1) BLASTX 2.1. 3 [Apr-1-2001] Reference : Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST : a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402.

Query=/homes/ts/heloderma/exendine/HEL01085. SEQ (458 letters) Database : ncbinr 1,632, 343 sequences ; 523,647, 861 total letters Score E Sequences producing significant alignments : (bits) Value.

NR : GI-1916067 Begin : 1 End : 71 ! (U77613) exendin 4 [Heloderma suspectum] 74 3e-12 NR : GI-2851623 Begin : 1 End : 71 ! EXENDIN-4 PRECURSOR 74 3e-12 NR : GI-69269 Begin : 1 End : 28 texendin-l-Mexican beaded lizard 42 0.014 NR : GI-119675 Begin : 1 End : 28 ! EXENDIN-1 (HELOSPECTINS I AND II) 42 0.014 NR : GI-556438 Begin : 115 End : 155 ! (L36641) vasoactive intestinal peptide [Meleagris g... 38 0.21 NR : GI-487633 Begin : 115 End : 155 ! (U09350) vasoactive intestinal peptide [Gallus gallus] 38 0.21 NR : GI-1353216 Begin : 115 End : 155 ! VASOACTIVE INTESTINAL PEPTIDE PRECURSOR (VIP) 38 0.21 NR : GI-1174967 Begin : 115 End : 155 ! VASOACTIVE INTESTINAL PEPTIDE PRECURSOR (VIP) 38 0.21 NR : GI-14549660 Begin : 111 End : 158 ! (AF321243) growth hormone-releasing hormone/pitui... 36 0.60 NR : GI-1352710 Begin : 110 End : 157 ! GLUCAGON-FAMILY NEUROPEPTIDES PRECURSOR [CONTAINS :... 36 0.60 2. für heloall. 0.564 (exendin-3) Reference : Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST : a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402.

Query=/homes/ts/heloderma/exendine/HEL0564. SEQ (471 letters) Database : ncbinr 1,632, 343 sequences ; 523,647, 861 total letters Score E Sequences producing significant alignments : (bits) Value..

NR : GI-1916067 Begin : 1 End : 75 ! (U77613) exendin 4 [Heloderma suspectum] 116 4e-25 NR : GI-2851623 Begin : 1 End : 75 ! EXENDIN-4 PRECURSOR 116 4e-25 NR : GI-279624 Begin : 1 End : 28 ! exendin-3-Mexican beaded lizard 61 2e-08 NR : GI-119677 Begin : 1 End : 28 ! EXENDIN-3 61 2e-08 NR : GI-17942697 Begin : 1 End : 28 ! Chain A, Solution Structure Of Exendin-4 In 30-Vo... 58 2e-07 NR : GI-279625 Begin : 1 End : 28 ! exendin-4-Gila monster 58 2e-07 NR : GI-248418 Begin : 1 End : 28 ! exendin-4 [Heloderma suspectum, venom, Peptide, 39 aa] 58 2e-07 NR : GI-121471 Begin : 9 End : 79 ! GLUCAGON II PRECURSOR [CONTAINS : GLICENTIN-RELATED... 45 0.001 NR : GI-121471 Begin : 87 End : 115 ! GLUCAGON II PRECURSOR [CONTAINS : GLICENTIN-RELATED...

NR : GI-279617 Begin : 9 End : 79 Die Ergebnisse der Sequenzvergleiche zeigen, dass helo all. 0.1085 für das bisher unbekannte Precursor-Protein von Exendin-1 (=Helospectin) und helo all. 0.564 für das bisher unbekannte Precursor-Protein von Exendin-3 aus Heloderma horridum kodiert.

Weiterhin existiert eine Ähnlichkeit dieser Sequenzen mit VIP und Glucagon, die in folgender Abbildung deutlich zu erkennen ist : human Glucagon HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT human GLP-1 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR exendin-3 HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS human GLP-2 HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD Consensus Ha#GtFts#. s.. $#.. aardF !. WL.. t. human VIP HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN exendin-1 HSDATFTAEYSKLLAKLALQKYLESILGSSTSPRPPSS Consensus HSDAtFTa#YsrLraq$AlqKYL#SILn Exendin-1 soll ursprünglich aus H. suspectum-Gift isoliert worden sein. Die Ergebnisse zeigen aber, das Exendin-1 von H. horridum produziert wird. Die Giftproben wurden von der Arbeitsgruppe damals von Sigma bezogen. Ver- mutlich wurden dort Proben vertauscht, oder sogar vermischt, so dass solch eine falsche Zuordnung zustande kam.

Eine Suche mit den beiden cDNA-Sequenzen aus H. horridum in einer hu- manen cDNA-Bank liefert als Ergebnis cDNA-Clone, die für die Precursor- Proteine der oben genannten humanen Peptide kodieren.