Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enantioselek- tiven Reduktion von 3,5-Dioxocarbonsäuren sowie deren Salze und Ester.

Homochirale 3t5-Dihydroxycarbonsäurederivate der Formel 1 sind Intermediate in der Synthese einer Vielzahl von Natur-und Wirkstoffen.

Formel 1 X = eine Komponente aus der Gruppe Wasserstoff, Halo- gen, Alkyl, Aryl, CH=CHR2, C-CR3 (mit R"=R außer Metall- kation und R3=R) E : H oder Schutzgruppe für die Hydroxylfunktion.

R : H, Metallkation, Alkyl-, Aryl-, Aralkyl oder Cy- cloalkyl-Rest.

Je nach absoluter Konfiguration an den Stereozentren C-3 und C-5 können sie zielgerichtet bei der Synthese chiraler Naturstoffe, wie Mevinsäuren oder syntheti- scher HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren eingesetzt werden.

Andere Natur-oder Wirkstoffe verlangen andere Konfigu- rationen der stereogenen Zentren in Position C-3 und

C-5. Es besteht daher ein großes Interesse, alle mögli- chen Stereoisomere der 3,5-Dihydroxycarbonsäurederivate nach Formel 1 in optisch reiner Form darstellen zu kön- nen. Eine vorteilhafte Methode zur Herstellung dieser Verbindungen ist die katalytische enantioselektive Re- duktion der prochiralen 3,5-Dioxocarbonsäurederivaten nach Formel 2.

Formel 2 Bei Anwendung dieser Methode entfallen kostenintensive und umweltbelastende Racemat-, Scalemat-oder Diaste- reomerentrennungen. Die in einer diastereoselektiven Synthese erforderliche Anbindung und Abspaltung einer stöchimetrischen Menge einer homochiralen Hilfsgruppe wird vermieden. Weiterhin ist das Kohlenstoffgerüst der 3,5-Dihydroxycarbonsäureester nach Formel 1 in den Aus- gangsverbindungen nach Formel 2 bereits komplett, d. h. die Stereozentren werden erst zu einem späten Zeitpunkt in der Gesamtsynthesesequenz eingeführt, wodurch der Verlust an homochiralem Material niedrig gehalten wird.

Die europäische Patentanmeldung 0 569 998 A2 offenbart ein mikrobielles Verfahren zur Reduktion von in 6-Posi- tion oxyalkyl-und oxyaralkylsubstituierten Diketo- estern, welches enantioselektiv ist.

Die WO 97/00968 offenbart ein Verfahren zur Reduktion von 3-Oxo-5-hydroxy-Carbonsäureestern mittels Redukta- sen von Beauveria, Candida, Kluyveromycis, Torulaspora oder Pichia.

Die DE 196 10 984 A1 offenbart ein stabiles mikrobiel- les Enzym mit Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität, ein Ver- fahren zu dessen Gewinnung sowie dessen Verwendung zur enantioselektiven Reduktion/Oxidation von organischen Ketoverbindungen/Hydroxyverbindungen, wobei je nach Art der Ausgangsverbindungen R-oder S-Hydroxyverbindungen erhalten werden.

Die Veröffentlichung"Enantioselective microbial reduction of 3,5-dioxo-6- (benzyloxyl) hexanoic acid, ethyl ester"in Enzyme Microb. Technol. (1993), 15 (12), 1014-21 ff zeigt die Reduktion von 3,5-Dioxo-6- (benzyloxy) hexansäure-Ethylester mittels einer Reduk- tase.

Aus terminologischen Gründen soll hier eine Begriffsde- finition als Arbeitsbegriff eingeführt werden, welche innerhalb der Offenbarung Gültigkeit haben soll : Formel 3 : In Formel 3 tritt die OH-Gruppe in 5-Position aus der Papierebene hervor, während die Ketten mit der Carbon- säurefunktion bzw. Esterfunktion sowie mit dem Rest X in der Papierebene liegen. Das Wasserstoffatom an C-5 fällt somit hinter die Papierebene. Nach der CIP (RS)- Nomenklatur würde für dieselbe räumliche Konfiguration der OH-Gruppe aus der Papierebene nach vorne je nach Priorität der Kette welche mit X substituiert ist eine R-oder S-Bezeichnung verwendet werden. Im Sinne der Erfindung soll nun für eine Anordnung der Substituen-

ten, bei der die OH-Gruppe in 5-Position aus der Pa- pierebene nach vorne heraustritt, der Wasserstoff in 5- Position unter die Papierebene tritt und bei der die mit der Carbonsäure-oder Esterfunktion ausgestattete Seitenkette auf der rechten und die mit dem Substituen- ten X augestattete Seitenkette auf der linken Seite des fünften C-Atoms liegt, die Bezeichnung r-Konfiguration benutzt werden. Für die Fälle in denen die mit der Car- bonsäurefunktion oder Esterfunktion ausgestattete rechte Seitenkette eine höhere Priorität hat als die mit dem Substituenten X ausgestattete linke Seitenkette entspricht dies der klassischen R-Konfiguration. Sind die Prioritäten der eben genannten Ketten (z. B. durch die Wahl X = Halogen) vertauscht so wurde der Zielver- bindung die klassische S-Konfiguration zugeschrieben werden. Beide Fälle sollen jedoch von der Definition r- Konfiguration umfaßt werden.

Es ist die Aufgabe der Erfindung bei einer enzymati- schen Reduktion von 3,5-Dioxocarbonsäurederivaten re- gioselektiv in der 5-Position eine r-Konfiguration der Hydroxylgruppe einzuführen.

Weiterhin ist es die Aufgabe der Erfindung ein neues Verfahren zur Bereitstellung enantiomerenreiner 3,5- Dihydroxycarbonsäurederivate zur Verfügung zu stellen, also ein Verfahren zu schaffen, mit dem in der 3-Posi- tion zur 5-Position zielgerichtet eine syn-oder anti- Reduktion der Ketogruppe erfolgen kann, so daß das 3,5- Dihydroxycarbonsäurederivat eine maßgeschneiderte abso- lute Konfiguration in Bezug auf C-3 aufweist, die wunschgemäß hergestellt werden kann.

Weiterhin ist es die Aufgabe der Erfindung ein verbes- sertes Verfahren zur Synthese von 3,5-Dioxocarbonsäure- estern nach Formel 4 zur Verfügung zu stellen, die als Edukte für die enzymatische Reduktion eingesetzt werden können.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Auf- gabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr mög- lich, 3,5-Dioxocarbonsäuren sowie deren Ester hochenan- tioselektiv zu reduzieren und somit Verbindungen zu er- halten, welche weiterhin in einer Synthese von Natur- und Wirkstoffen eingesetzt werden können, die in dem 3,5-Dihydroxycarbonsäure-Strukturelement eine defi- nierte absolute Konfiguration haben.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteranspürchen angegeben.

Im folgenden soll die Erfindung in allgemeiner Form be- schrieben werden.

Erfindungsgemäß wird eine Verbindung gemäß Formel 4

Formel 4 mit R'= eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylal- kyl, Wasserstoff oder Metallkation und X = eine Komponente aus der Gruppe Wasserstoff, Halo- gen, Alkyl, Aryl, CH=CHR2, C-CR3 (mit R2=R1 außer Me- tallkation und R3=Rl) mittels einer Alkoholdehydroge- nase unter Zusatz von NADPH oder eines anderen Cofak- tors umgesetzt.

Unter Alkyl sind sowohl geradkettige als auch verzweig- te gesättigte Kohlenstoffketten zu verstehen. Beispiel- haft können Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, t-Butyl, Pentyl, i-Pentyl, n-Hexyl, i-Hexyl genannt werden. Mit Alkenyl sind geradkettige und verzweigte ungesättigte Kohlenwasserstoffe bezeichnet, für die beispielhaft Vinyl, 1-Propenyl, Allyl, Butenyl, i-Butenyl genannt werden können. Von dem Begriff Cycloalkyl werden gesät- tigte ringförmige Kohlenwasserstoffketten umfaßt, die aus drei, vier, fünf, sechs oder sieben Kohlenstoff- atomen bestehen. Cycloalkenyl bezeichnet ungesättigte ringförmige Kohlenwasserstoffe, mit 5,6,7 oder 8 Koh- lenstoffatomen. Unter Aryl sind aromatische Systeme, eingeschlossen Heteroaromaten und substituierte aroma- tische Systeme, wie Phenyl, p-Tolyl, Furanyl zu ver- stehen. Unter Aralkyl sind Arylreste zu verstehen, die über Alkylgruppen angebunden sind, wie zum Beispiel ein Benzylrest. Unter den Begriff Cycloalkylalkyl fallen Cycloalkylreste, die über Alkylgruppen gebunden sind.

Unter den Halogenen sind Fluor und Chlor bevorzugt.

Die Alkoholdehydrogenase ist bevorzugt rekombinant und stammt aus Lactobacillus, insbesondere Lactobacillus brevis (rekLBADH). Besonders vorteilhaft an diesem En- zym ist, daß es rekombinant überexprimiert werden und somit in großen Mengen verfügbar gemacht werden kann.

Dies eröffnet auch den Einsatz in größerem technischem Maßstab. Die Reaktion kann dabei sowohl in wäßrigem Me- dium mittels des Enzyms, als auch intrazellulär in einem Mikroorganismus stattfinden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die rekLBADH aus Lactobacillus brevis eingesetzt, die rekombinant in Escherichia coli überexprimiert wurde.

Ein weiterer Vorteil der rekLBADH ist die Eigenschaft des Enzyms, den benötigten Cofaktor NADPH substratge-

koppelt regenerieren zu können, das heißt, NADPH muß nicht in stöchiometrischer Menge eingesetzt werden.

Weiterhin kann damit die Zugabe eines zweiten Enzyms zur Regeneration des NADPH vermieden werden. Hierdurch werden letztendlich auch Kosten gesenkt. Bei dieser Transferhydrierung kann als Wasserstoffdonor ein Alko- hol, bevorzugt Isopropanol eingesetzt werden. Die Akti- vität der rekLBADH kann durch die Zugabe von Mg2+ ge- steigert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden, da das Enzym rekLBADH vorteilhaf- terweise eine hohe Thermostabilität aufweist. Dies hat auch zur Folge, daß für einen gewünschten Umsatz weni- ger Enzym benötigt wird, wodurch Kosten gespart werden können. Auf aufwendige Kühlmaßnahmen kann verzichtet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann jedoch auch bei für enzymatische Reaktionen üblichen Temperaturen zwischen 0°C und 70°C durchgeführt werden. Bevorzugt ist der Bereich zwischen 20°C und 50°C.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei einem pH-Wert von 5,5 durchgeführt werden, da das bevorzugte Enzym bei pH 5,5 ein Stabilitätsmaximum aufweist. Dies ist von Vorteil, da viele Estersubstrate nach Formel 4 bei diesem pH-Wert eine höhere Stabilität aufweisen als bei höheren pH-Werten, die normalerweise in enzymatischen Reaktionen eingehalten werden müssen. Die Reaktion kann jedoch auch in einem pH-Wert-Bereich von 5,5 bis 9 durchgeführt werden, bevorzugt in einem Bereich zwi- schen 5,5 bis 6,5.

Zur Sicherstellung eines geeigneten pH-Wertes kann jede für eine enzymatische Reaktion geeignete Puffersubstanz eingesetzt werden. Diese sind zum Beispiel : Trietha- nolamin (TEA), Phosphatpuffer oder TRIS-Puffer. Die Konzentrationsbereiche für die Puffer liegen vorteil- hafterweise zwischen 50 und 500 mmol/l.

Das Reaktionsprodukt mit der r-Konfiguration ist in Formel 5 wiedergegeben, in der die Substituenten R1 und X dieselbe Bedeutung haben, wie in Formel 4.

Formel 5 Die Enantiomerenüberschüsse können für diese Reaktionen mit 2 98W-100k angegeben werden.

In einer Fortbildung der Erfindung wird die Ketogruppe der Verbindung in Formel 5 in Position 3 diastereose- lektiv zu einer OH-Gruppe reduziert, welche dann in syn-oder anti-Stellung zur OH-Gruppe in 5-Position steht.

Die Umsetzung der Verbindung nach Formel 5 zu dem Reak- tionsprodukt 6a, b kann mit Methoden erfolgen, die für die Synthese von syn- (6a) und anti-Diolen (6b) bekannt sind.

Diese sind für die Herstellung von syn-Diolen (6a) aus -Hydroxycarbonylverbindungen zum Beispiel Natriumbor- hydrid-Reduktion in Gegenwart von Trialkyl-oder Alkoxydialkylboranen (1 : K. Narasaka, F. C. Pai, Tetrahedron 1984,40,2233-2238.

2 : K. M. Chen, G. E. Hardtmann, K. Prasad, 0. Repic, M. J. Shapiro, Tetrahedron Lett. 1987,28,155-158.) und für anti-Diole (6b) aus-Hydroxycarbonylverbin- dungen zum Beispiel Reduktion mit Tetramethylammonium- triacetoxyborhydrid (D. A. Evans, K. T. Chapman, E. M. Carreira, J. Am. Chem. Soc. 1988,110,3560- 3578.).

Generell kommen für den zweiten Schritt sowohl chemi- sche als auch enzymatische Reduktionen in Frage. Die enzymatische Reduktion der 3-Position kann beispiels- weise mit den folgenden Mikroorganismen oder deren iso- lierten Reduktasen durchgeführt werden : Beauveria bassiana ATCC 7159, Candida humicola CBS 1897, Candida diddensiae ATCC 20213, Candida frieddrichii ATCC 22970, Candida solani CBS 1908, Hansenula nonfementans CBS 5764, Kluyveromyces drosophilarum CBS 2105, Pichia angusta NCYC 495, Pichia angusta NCYC R320, Pichia angusta NCYC R322, Pichia haplophila CBS 2028, Pichia membranefaciens DSM 70366, Pichia pastoris BPCC 260, Pichia pastoris BPCC 443, Pichia pastoris NCYC R321, Torulaspora hansenii ATCC 20220, Candida pelliculosa ATCC 2149, Hansenula anomola CBS 2230, Neurospora crassa ATCC 9277, Pichia trehalo- phila CBS 5361, Mortierella alpina MF 5534 (ATCC8979).

Es können auch die Reduktasen aus Saccharomyces, insbe- sondere Saccharomyces cerevisiae sowohl in der Zelle als auch in isolierter Form eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren kann vor- teilhafterweise in einem kontinuierlichen Prozeß in

einem Enzym-Membranreaktor, wie er beispielhaft in der DE-PS 39 37 892 beschrieben ist durchgeführt werden.

Die enantioselektive Reduktion von 3,5-Dioxocarbonsäu- reestern an der C-5-Position kann mit Wildtypenzymen und/oder rekombinant überexprimierten Enzymen und mit ganzen Zellen stattfinden. Bevorzugt ist jedoch die extrazelluläre Umsetzung mit einem Zellrohextrakt, da hierbei höhere Enantiomerenüberschüsse erzielt werden.

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird das zur Synthese benötigte Substrat nach einer Methode dargestellt, die im Gegensatz zu anderen etablierten Verfahren zur Synthese von 3,5-Dioxocarbonsäurederiva- ten nach Formel 4 mit besonders preisgünstigen und ein- fachen Ausgangsstoffen auskommt. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist die unkomplizierte Reaktionsfüh- rung.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren be- schrieben, mit dem 3,5-Dioxocarbonsäureester nach For- mel 2 durch Acylierung von Bisenolaten nach Formel A mit R4 = Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylalkyl oder Metallkation Formel A mit leicht zugänglichen und billigen Carbonsäureestern nach Formel B, in welcher X die gleiche Bedeutung wie in Formel 2 hat, und in welcher R5 für einen Alkylrest steht,

Formel B in hohen Ausbeuten dargestellt werden können.

Gemäß bekannter Arbeitsmethoden wird aus einem ß-Ke- toester mit einer Lithiumverbindung in einem organi- schen Lösungsmittel in situ ein Bisenolat nach Formel A erzeugt. Dieses Bisenolat nach Formel A wird an- schließend unter Kontrolle der Innentemperatur des Re- aktionsgefäßes durch Zugabe eines Carbonsäureesters nach Formel B acyliert, wobei bevorzugt a-Halogencar- bonsäureester zum Einsatz kommen. Besonders bevorzugt sind die Methylester der Chloressigsäure und der Fluor- essigsäure. Es erfolgt anschließend eine saure wäßrige Aufarbeitung in Anwesenheit eines organischen Lösungs- mittels, das nicht mit Wasser mischbar ist, wie z. B.

Essigsäureethylester oder Diethylether.

Die erfindungsgemäße Reaktion wird bevorzugt unter einer Inertgasatmosphäre und wasserfreien Bedingungen durchgeführt. Als Inertgas kommen z. B. Stickstoff oder Argon in Frage. Als Lösungsmittel kommen inerte organi- sche Lösungsmittel wie Ether, Alkane oder Cycloalkane (C5-C7), Toluol oder Benzol in Frage. Bevorzugt sind aprotische koordinierende Lösungsmittel aus der Verbin- dungsklasse der Ether, wie z. B. Diethylether, Dime- thoxyethan oder Tetrahydrofuran (THF). THF ist beson- ders bevorzugt.

Die Lithiumverbindung ist bevorzugt stark basisch, aber wenig nucleophil. Bevorzugt sind Lithiumamide, wie z. B. Lithiumdiisopropylamid (LDA), Lithiumdicyclohe- xylamid, Lithiumcyclohexylisopropylamid, Lithium- 2,2,6,6-tetramethylpiperidin (LiTMP) oder Lithium-bis- (trimethylsilyl)-amid (LiHMDS). LDA ist besonders be- vorzugt. Möglich sind auch Organolithiumverbindungen wie z. B. Mesityllithium oder t-Butyllithium. Das be- vorzugte molare Verhältnis zwischen Lithiumbase undß- Ketoester zur Erzeugung des Bisenolates ist 2 : 1 bis 4 : 1, besonders bevorzugt ist ein molares Verhältnis von 2,1 : 1.

Die Acylierung des in situ erzeugten Bisenolats nach Formel A durch Zugabe eines Carbonsäureesters nach For- mel B erfolgt bevorzugt bei einer Innentemperatur des Reaktionsgefäßes von-100° bis +25°C, am günstigsten zwischen-80° und-40°C. Besonders bevorzugt ist der Bereich zwischen-72° und-65°C. Das molare Verhältnis von Carbonsäureester zu Bisenolat liegt bevorzugt zwi- schen 0,5 : 1 und 2 : 1. Besonders bevorzugt ist ein Verhältnis von 1 : 1.

Die Aufarbeitung des stark basischen Reaktionsgemisches erfolgt bevorzugt zwei bis 120 Minuten nach Zugabe der letzten Portion des Carbonsäureesters nach Formel B, am günstigsten nach 15-30 Minuten. Dazu wird der Inhalt des Reaktionsgefäßes auf eine eisgekühlte und kräftig gerührte Mischung aus einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z. B. Essigsäureethyl- ester oder Diethylether, und einer wäßrigen Lösung einer Säure, wie z. B. verdünnte Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure oder Ammoniumchlorid-Lösung, gekippt. Bevor-

zugt werden hierfür zweimolare Chlorwasserstoffsäure und Essigsäureethylester verwendet.

Diese Vorgehensweise ist im Zusammenhang mit der Acy- lierung von Bisenolaten nach Formel A mit Carbonsäure- estern nach Formel B eine Verbesserung bestehender Me- thoden, da ein Überschuß an Base bzw. Bisenolat vermie- den wird, ebenso wie die Verwendung spezieller teurer Acylierungsreagenzien, Katalysatoren oder Cosolventien.

(a) M. Yamaguchi, K. Shibato, H. Nakashima, T. Minami, Tetrahedron 1988,44,4767-4775. b) N. S. Narasimhan, R. K. Ammanamanchi, J. Org. Chem. 1983,48,3945-3947. c) S. N. Huckin, L. Weiler, Can. J. Chem. 1974,52, 1343-1351.) Ein weiterer Vorteil ist die unkomplizierte Reaktionsführung, da die Komponenten nicht wie bei Huckin et al. in Intervallen abwechselnd zugegeben wer- den müssen, sondern die benötigten Volumina in einer Portion zugefügt werden können. Mit dem erfindungsge- mäßen Verfahren kommt es nicht zur Bildung von nennens- werten Mengen an Nebenprodukten. Mit dem erfindungsge- mäßen Verfahren wurden verschiedene 3,5-Dioxocarbonsäu- reester nach Formel 2 dargestellt, von denen exempla- risch die Verbindungen dimethylethylester und dimethylethylester genannt seien. Beide Verbindungen sind neu.

Beispiele : Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren in be- vorzugten Ausführungsformen beispielhaft dargestellt.

Jedoch ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf die Beispiele beschränkt.

Beispiel 1 (3R, 5S)-6-Chlor-3,5-dihydroxyhexansaure-l, l-dimethyl- ethylester a) Die folgende Reaktion wird in einer ausgeheizten Stan- dardglasapparatur (Dreihalskolben, Tropftrichter) unter Ausschluß von Feuchtigkeit und Luft durchgeführt (N2-Schutzgasatmosphäre). Die Apparatur ist mit Septen versehen, durch die die Reagenzien, die allesamt kom- merziell erhältlich sind, mittels Kanülen unter Luft- ausschluß zugegeben werden können. Die im Text erfol- genden Temperaturangaben beziehen sich auf die Innen- temperatur des Reaktionsgefäßes. Dementsprechend ist die Apparatur mit einem Innenthermometer versehen. Das Reaktionsgemisch wird zu jedem Zeitpunkt der Reaktions- durchführung gut gerührt (Magnetrührer).

In die soeben beschriebene Apparatur werden 250- 300 ml absolut wasserfreies THF und 10,63 g (105 mmol) Diisopropylamin gegeben. Nachdem der Kolbeninhalt mit einem Eis-Kochsalz-Kältebad auf-15°C gekühlt wurde, läßt man über den Tropftrichter 64 ml (ca. 105 mmol) einer n-Butyllithium-Lösung in n-Hexan (ca. 1,6 molar) langsam unter Rühren zutropfen, wobei eine Temperatur von 0°C nicht überschritten werden soll. Nach beendeter Zugabe verbleibt der Kolben im Kältebad und es wird noch 10 Minuten gerührt. Anschließend werden langsam 7,91 g (50 mmol) 3-Oxobutans,iure-1, 1-dimethylethylester

zugetropft, wobei eine Temperatur von-5°C nicht über- schritten werden soll. Der Kolben wird nach beendeter Zugabe etwas aus dem Kältebad gehoben, und das Reakti- onsgemisch noch 10 Minuten bei-10° bis maximal-5°C gerührt. Hiernach wird das Eis-Kochsalz-Kältebad gegen ein Kältebad ausgetauscht, das aus Aceton, Trockeneis und etwas flüssigen Stickstoff besteht. Nach Abkühlung der Reaktionslösung auf-72°C werden 5,43 g (50 mmol) Chloressigsäuremethylester so langsam zugetropft, daß eine Temperatur von-65°C nicht überschritten wird.

Nach beendeter Zugabe läßt man noch 25 Minuten bei Tem- peraturen zwischen-70°C bis maximal-65°C rühren und kippt die Reaktionslösung anschließend auf eine kräftig gerührte und mit einem Eis-Kältebad auf 4°C gekühlte Mischung aus 150 ml Essigsäureethylester und 150 ml zweimolarer Chlorwasserstoffsäure. Das Gemisch wird un- mittelbar danach in einen Scheidetrichter überführt und gut durchgeschüttelt. Die Phasen werden getrennt, und die wäßrige Phase wird noch zweimal mit jeweils 150 ml Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten orga- nischen Phasen werden mit 150 ml NaHC03-Lösung (5 %) gewaschen. Falls es an dieser Stelle Probleme mit der Phasentrennung gibt, werden 40 g Kochsalz zugelöst. Die organische Phase wird anschließend mit 150 ml gesättig- ter Kochsalz-Lösung gewaschen, mit Natriumsulfat ge- trocknet, filtriert und im Membranpumpenvakuum am Rota- tionsverdampfer bei maximal 40°C soweit wie möglich eingeengt. Es verbleiben 11 g öliges Rohprodukt (94%), das gemäß einer 1H-NMR-Analyse zu ca. 95% aus dem ge- wünschten Produkt besteht. Ein Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel ; Essigsäureethylester : i-Hexan 3 : 7 ; Ent- wicklung durch Fluoreszenzlöschung oder Bedampfung mit Iod) zeigt geringe Anteile einer polareren und einer unpolareren Verunreinigung.

Die Reinigung des Produktes kann durch Kugelrohrde- stillation bei max. 75°C und einem Vakuum von minde- stens 0.01 mbar erfolgen. Auf diese Weise wurde aus 1,12 g des Rohproduktes 0,83 g analytisch reines Pro- dukt isoliert. Alternativ kann eine Flash-Chromatogra- phie mit säuregewaschenem, metallfreien Kieselgel durchgeführt werden (kommerziell erhältliches Kieselgel (Standardqualität) wird vor der Chromatographie 24 Stunden in zweimolarer Chlorwasserstoffsäure suspen- diert, filtriert, mit deionisiertem Wasser gewaschen bis die Waschflüssigkeit einen pH-Wert von 5.5 auf- weist, und anschließend mindestens 24 Stunden bei 105°C und Normaldruck getrocknet. Siehe auch : J. S. Hubbard, T. M. Harris, J. Org. Chem. Mit dieser Methode wurden aus 3,81 g des Rohproduktes 2,72 g analytisch reines Produkt und 0,24 g einer Mischfraktion erhalten (Säule mit 6 cm Durchmesser, 220 g Kieselgel, Essigsäureethylester : i-Hexan 2 : 8, 60 ml Fraktionen). Die Verbindung kann bei-20°C über mehrere Monate gelagert werden.

H-NMR (300 MHz, CDC13,22°C) 1.) Enolform b : 14.76 (s, 1H, OH, br), 5.97 (s, 1H, H4), 4.06 (s, 2H, H6), 3.31 (s, 2H, H2), 1.48 (s, 9H, 3 x CH3).-2.) Ketoform 8 : 4.21 (s, 2H, H6), 3.92 (s, 2H, H4), 3.49 (s, 2H, H2), 1.47 (s, 9H, 3 x CH3).-Keto : Enol = 12 : 88.-13C-NMR (75.5 MHz, CDC13, es werden nur die Signale der Enol- form angegeben) 8 : 28.14 (C (CH3) 3), 44.35 (C6), 46.03 (C2), 82.56 (OC (CH3) 3), 98.89 (C4), 166.48 (COOtBu), 187.05,187.34 (C3, C5).- b) (S)-6-Chlor-5-hydroxy-3-oxohexansäure-1,1-dimethyl- ethylester

Die folgende enzymatische Reaktion wird mit der Oxido- reduktase rekLBADH durchgeführt. Es wird ein Zellrohex- trakt verwendet, der durch Naßvermahlung von Feucht- zellmasse eines rekombinanten E. coli Stammes (recADHHB101+) hergestellt wird. Die Kultivierungsbe- dingungen und die Einzelheiten des Zellaufschlusses sind in der Literatur beschrieben (B. Riebel, Disserta- tion, Heinrich-Heine-Universität-Düsseldorf, 1996 ; siehe auch : Deutsche Patentanmeldung 19610984. 1,1996).

Aus 1 g Feuchtzellmasse werden nach dieser Methode ca.

3 ml Zellrohextrakt erhalten. Die Aktivität dieser En- zympräparation beträgt ca. 1100 U/ml unter folgenden Bedingungen : photometrische Bestimmung bei 340 nm (£NADPH = 6.22 cm2/pmol) ; Substrat : Acetophenon (10 mM), NADPH (0,25 mM), MgCl2 (1 mM), Phosphat-Puffer (100 mM, pH 6,5), limitierende Enzymmenge ; 1 ml Gesamtvolumen ; Tem- peratur : 25°C ; Messung über 1 Minute. Eine Enzymeinheit (U) ist definiert als die Enzymmenge, die 1 Rmol NADPH pro Minute unter den angegebenen Bedingungen oxidiert.

Im Folgenden wird die einfachste Form der Reaktionsfüh- rung beschrieben (Satzreaktor, einphasig). Als Reakti- onsgefäß dient ein Rundkolben geeigneter Größe. Während der enzymatischen Reduktion wird der Kolbeninhalt lang- sam (ca. 60 rpm) mit einem Magnetrührer gerührt.

Zu 470 ml Phosphat-Citrat-Puffer (250 mM Na2HP04,125 mM Citronensäure, mit NaOH auf pH 5,5 eingestellt) wird eine Lösung aus 2,21 g (9,4 mmol) des in Schritt a)

hergestellten 6-Chlor-3,5-dioxohexansäure-1, 1-dimethyl- ethylester in 5,66 g (94 mmol) Isopropanol (zur Cofak- torregenerierung) gegeben. Zur Beschleunigung des Lö- sungsvorganges kann eine kurze Ultraschallbehandlung angewendet werden. Weiterhin werden zu dieser Lösung 1,92 g (9,4 mmol) Magnesiumchlorid-Hexahydrat und 401 mg (0,47 mmol) Triphosphopyridinnucleotid Natrium- salz (NADP+, 90%, z. B. FLUKA Nr. 93210) gegeben. Die erhöhte Konzentration an Magnesiumionen ist in diesem speziellen Anwendungsbeispiel beabsichtigt. Anschlies- send wird die Reaktion durch die Zugabe von 1000 U (s. o.) rekLBADH gestartet, und der Reaktionskolben wird mit einem Stopfen verschlossen. Die Temperatur der Reaktionslösung wird während der Reaktion auf 25°C ge- halten. Nach 16 Stunden wird der Kolbeninhalt filtriert und in einen Scheidetrichter überführt und mit 400 ml Essigsäureethylester extrahiert. Zur Erleichterung der Phasentrennung werden 135 g Natriumchlorid zugelöst.

Die Phasen werden getrennt, und die wäßrige Phase wird noch zweimal mit jeweils 400 ml Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Membran- pumpenvakuum am Rotationsverdampfer bei maximal 40°C soweit wie möglich eingeengt. Man erhält 1,97 g öliges Rohprodukt (88%), das gemäß 1H-NMR zu mindestens 90% aus dem gewünschten Produkt besteht. Als Verunreini- gunge kann im Kernresonanzspektrum eine geringe Mengen eines Cyclisierungsproduktes (2- (t-Butyloxycarbonyl)- methyl-3 (2H)-furanon) ausgemacht werden. Der Anteil an Cyclisierungsprodukt steigt, wenn die Reaktion bei hö- heren pH-Werten durchgeführt wird. Die Reinigung des gewünschten Produktes erfolgt durch Flash-Chromatogra- phie (Säule mit 5 cm Durchmesser, 148 g Kieselgel, Es- sigsäureethylester : i-Hexan 4 : 6,50 ml Fraktionen) und ergibt 1,67 g analytisch reines Produkt (75%) neben

0,16 g einer Mischfraktion mit dem oben erwähnten Cy- clisierungsprodukt.

H-NMR (300 MHz, CDC13,22°C, es werden nur die Signale der Ketoform angegeben) 8 : 4.31 (m, 1H, CHOH), 3.62 (dd, J = 11.2,5.1 Hz, 1H, H6), 3.57 (dd, J = 11.2, 5.0 Hz, 1H, H6), 3.41 (s, 2H, H2), 3.10 (s, 1H, OH, br), 2.90 (dd, J = 17.5,5.0 Hz, 1H, H4), 2.83 (dd, J = 17.5,7.3 Hz, 1H, H4), 1.47 (s, 9H, 3 x CH3).-Keto.

Enol = ca. 95 : 5.-13C-NMR (75.5 MHz, CDC13, es werden nur die Signale der Ketoform angegeben) 8 : 28.13 (3 x CH3), 46.57 (C6), 48.43 (C4), 51.31 (C2), 67.58 (C5), 82. 73 (OC (CH3) 3), 166. 22 (COOtBu), 202. 93 (C3).- a bd =-24,9 (CHC13, c = 1,35) Die Bestimmung der optischen Reinheit und der Konfigu- ration erfolgt durch Vergleich der spezifischen Drehung des Produktes mit der spezifischen Drehung einer mög- lichst enantiomerenreinen Probe derselben Verbindung.

Dazu wird nach einem bekannten Verfahren (J. K.

Thottathil, Y. Pendri, W. S. Li, D. R. Kronenthal, US 5, 278, 313,1994), ausgehend von einer kommerziell er- hältlichen enantiomerenreinen Verbindung ((S)-4-Chlor- 3-hydroxybutansäureethylester, 96%, ALDRICH Nr. 460524, > 97% ee (Herstellerangaben), gemessen : a 25D =-21,7 (CHC13, c = 2,33), Lit. : [a] 21D = +20,9 (CHC13, c = 7,71), 97% ee, (R)-Enantiomer (M. Kitamura, T. Ohkuma, H. Takaya, R. Noyori, Tetrahedron Lett. 1988,29,1555- 1556)), eine authentische Probe des Produktes (S)-6- Chlor-5-hydroxy-3-oxohexansäure-1,1-dimethylethylester hergestellt. Die Reinigung des so erhältlichen Rohproduktes erfolgt nach der oben angegebenen Methode.

Das 1H-und 13C-Spektrum dieser Vergleichsverbindung stimmt exakt mit den oben angegebenen Daten überein.

Die spezifische Drehung der gereinigten authentischen Probe beträgt : a 25D =-23,0 (CHC13, c = 1.52) Ein Vergleich der beiden spezifischen Drehungen zeigt, daß die oben beschriebene enzymatische Reduktion ein Produkt höchster optischer Reinheit liefert. Die Über- einstimmung der Vorzeichen der spezifischen Drehung be- weist, daß das Produkt in der (S)-Konfiguration vor- liegt. c) (3R, SS)-6-Chlor-3, 5-dihydroxyhexansäure-l, l- dimethylethylester Ausgehend von dem in Schritt b) hergestelltem Rohpro- dukt kann die gewünschte Zielverbindung durch Reduktion mit Natriumborhydrid in Anwesenheit von Diethylmethoxy- boran dargestellt werden. Dieses Verfahren ist speziell für das hier vorliegende Anwendungsbeispiel in der Li- teratur beschrieben (J. K. Thottathil, Y. Pendri, W. S. Li, D. R. Kronenthal, US 5, 278, 313,1994).

Beispiel 2 (3R,5R)-Dihydroxyhexansäure-1,1-dimethylethylester a)

Diese prochirale Ausgangsverbindung wird nach einem in der Literatur beschriebenen Verfahren durch Alkoholyse und Decarboxylierung von acetoacetylierter Meldrumsäure dargestellt (F. Yuste, F. K. Brena, H. Barrlos, R. San- chez-Obregon, B. Ortiz, F. Walls, Synth. Commun. 1988, 18,735-739). b) (R)-5-Hydroxy-3-oxohexansäure-1,1-dimethylethylester Für diese enzymatische Reaktion wird ein Zellrohextrakt verwendet, wie er bei Beispiel 1 Schritt b) beschrieben ist.

Zu 260 ml Phosphat-Puffer (125 mM Na2HP04,125 mM NaH2PO, mit HC1 auf pH 6,6 eingestellt) wird eine Lö- sung aus 1,04 g (5,17 mmol) des in Schritt a) herge- stellten 3,5-Dioxohexansäure-1, 1-dimethylethylester in 3,1 g (52 mmol) Isopropanol (zur Cofaktorregenerierung) gegeben. Weiterhin werden zu dieser Lösung 53 mg (0,26 mmol) Magnesiumchlorid-Hexahydrat und 220 mg (0,26 mmol) Triphosphopyridinnucleotid Natriumsalz (NADP+, 90%, FLUKA Nr. 93210) gegeben. Anschließend wird die Reaktion durch die Zugabe von 215 U rekLBADH gestartet, und der Reaktionskolben wird mit einem Stop- fen verschlossen. Die Reaktionslösung wird langsam (ca.

60 rpm) mit einem Magnetrührer gerührt. Die Temperatur der Reaktionslösung wird während der Reaktion auf 25°C gehalten. Nach 28 Stunden wird der Kolbeninhalt durch

eine Glasfritte (Porengröße 4) filtriert. Das Filtrat wird in einen Scheidetrichter überführt und mit 150 ml Essigsäureethylester extrahiert. Zur Erleichterung der Phasentrennung werden 75 g Natriumchlorid zugelöst. Die Phasen werden getrennt, und die wäßrige Phase wird noch zweimal mit jeweils 150 ml Essigsäureethylester extra- hiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Membranpum- penvakuum am Rotationsverdampfer bei maximal 40°C so- weit wie möglich eingeengt. Man erhält 0,96 g öliges Rohprodukt (92%), das gemäß 1H-NMR zu mindestens 90% aus dem gewünschten Produkt besteht. Als Verunreinigung kann im Kernresonanzspektrum eine geringe Menge des Eduktes ausgemacht werden. Die Reinigung des Produktes kann durch Vakuum-Kugelrohrdestillation (55°C, 0,02 mbar) erfolgen, oder aber durch Flash-Chromatographie.

Mit der letzteren Methode können 0,82 g (78 %) des ana- lytisch reinen Produktes gewonnen werden (Säule mit 3 cm Durchmesser, 45 g Kieselgel, Essigsäureethylester : n-Hexan 4 : 6,20 ml Fraktionen). Die NMR-Daten stimmen mit den Literaturangaben überein (L. Shao, H. Kawano, M. Saburi, Y. Uchida, Tetrahedron 1993,49,1997-2010).

1H-NMR (300 MHz, CDC13,22°C, es werden nur die Signale der Ketoform angegeben) 8 : 4. 27 (m, 1H, CHOH), 3.38 (s, 2H, H2), 2.91 (s, 1H, OH, br), 2.74 (dd, J = 17.7,3.2 Hz, 1H, H4), 2.64 (dd, J = 17.7,8.5 Hz, 1H, H4), 1.48 (s, 9H, 3 x CH3), 1.21 (d, J = 6.4 Hz, 3H, H6).-Keto : Enol = ca. 95 : 5.-13C-NMR (75.5 MHz, CDC13, es werden nur die Signale der Ketoform angegeben) b : 22.59 (C6), 28.13 (3 x CH3), 51.19,51.29 (C2, C4), 63.93 (C5), 82.44 (OC (CH3) 3), 166.42 (COOtBu), 204.38 (C3).- a D =-40.5 (c = 1.15, CHC13)

Durch Vergleich der spezifischen Drehung des Produktes aus der enzymatischen Reduktion mit dem Literaturwert für das enantiomerenreine Produkt ist ersichtlich, daß die vorliegende Reaktion ein (R)-konfiguriertes Produkt höchster optischer Reinheit liefert (Lit. : a 26D = -39.6 (c = 2, CHC13), 99% ee (P. F. Deschenaux, T. Kallimopoulos, H. S. Evans, A. Jacot-Guillarmod, Helv. Chim. Acta 1989,72,731-737). c) (3R, 5R)-Dihydroxyhexansäure-1,1-dimethylethylester Ausgehend von dem in Schritt b) hergestellten (R)-5-Hy- droxy-3-oxohexansäure-1,1-dimethylethylester kann die gewünschte Zielverbindung durch Reduktion mit Natrium- borhydrid in Anwesenheit von Diethylmethoxyboran darge- stellt werden. Dieses Verfahren ist speziell für das hier vorliegende Anwendungsbeispiel in der Literatur beschrieben (C. Masoni, P. F. Deschenaux, T. Kallimo- poulos, A. Jacot-Guillarmod, Helv. Chim. Acta 1989,72, 1284-128).