Область техники

Изобретение относится к области иммунологии и медицины и касается искусственных конструкций - микро/наночастиц типа "ядро/оболочка", содержащих в ядре экстракты природных аллергенов или рекомбинантные аллергены, конъюгированные с хитозаном, и покрытых дополнительной оболочкой из альгината натрия; капсулированные аллергены не распознаются IgE антителами при проведении аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) и не вызывают побочных реакций, ограничивающих применение стандартных экстрактов аллергенов для АСИТ; капсулированные аллергены при введении вызывают контролируемый протективный гуморальный IgG-опосредованный иммунный ответ против аллергена, что приводит к постепенному замещение патогенного IgE- опосредованного иммунного ответа.

Капсулированные аллергены являются безопасной заменой экстрактов аллергенов для проведения АСИТ.

Областью медицинского применения являются все виды пыльцевой, пищевой, грибной и бытовой аллергии.

Биомишенью капсулированных аллергенов является адаптивный (антиген- специфический) иммунный ответ, включающий антиген-представляющие клетки (макрофаги, дендритные и В-клетки), Т и В клетки.

Предшествующий уровень техники

Прямые аналоги отсутствуют. Известна гетерологичная конструкция на основе пептидов аллергенов, иммобилизованных на оболочке НЧ с включением в ядро НЧ гетерологичного пептида из ряда распространенных патогенов (пептида капсидного белка Е2 вируса Эпштейн-Барр). Недостатком данной конструкции является использование гетерологичных пептидов, сложных в получении, и иммобилизация их на оболочке НЧ. (РФ No 2480479).

Известен способ применения аллергена и адъюванта (не хитозана или альгината), состоящего из кислородсодержащих солей металлов, для производства жидкой композиции для орально-мукозного лечения аллергии. В приведенном способе отсутствует как упаковка аллергенов, так и основные полимеры - хитозан и альгинат, используемые в данной заявке. (WO2006034707 А1/СА2581815 А1)

Известен способ введения (п/к, и/н, per/os) хитиновых микрочастиц в процессе АСИТ, проводимой экстрактами аллергенов (амброзии, гриба A.fumigatus, клещей домашней пыли D. pteronyssinus). В рамках данного способа не осуществляется упаковка аллергенов и используется хитин как адьювант. (WO2003086454 А1)

Известен способ получения микрочастиц, содержащих биодеградируемый полимер и катионный полисахарид (не хитозан) для использования в иммуногенных композициях (не аллергены). (WO2007100699 А2)

Известен способ получения микрочастиц хитина для медицинского применения, в особенности для лечения инфекций, вызванных бактериями рода Streptococcus. (US8551501 В2) Аналогичен заявке WO2003086454 А1.

Известен способ получения вакцин, представляющих собой твёрдые микро/наночастицы размером менее 5 мкм, состоящие из коарцевата полимерного катиона и полианиона - нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, для применения в области иммунологии и аллергических заболеваний. Конструкция направлена на индукцию адаптивного иммунитета и может быть протективной. В данной заявке не используются белковые аллергены, хитозан, альгинат. (WO1999036090 А1)

Раскрытие изобретения Аллергия I типа характеризуется формированием антител Е класса к безвредным объектам, попадающим в организм из окружающей среды, таким как пыльца деревьев и трав, фрагменты бытовых микроорганизмов, яд насекомых и т. д. Единственным способом патогенетического лечения аллергии вот уже более 100 лет остаётся аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ), состоящая из длительного (до 3-х лет) курсового введения малых доз экстрактов аллергенов [Jacobsen L, Wahn U, Bilo BM. Allergen-specific immunotherapy provides immediate, long-term and preventive clinical effects in children and adults: the effects of immunotherapy can be categorised by level of benefit -the centenary of allergen specific subcutaneous immunotherapy. Clin Transl Allergy. 2012, 13;2(1):8]. После окончания курса АСИТ наблюдается положительный долгосрочный эффект, ассоциированный с формированием IgG4 антител, который предотвращает развитие гиперчувствительности при новых провокациях аллергенами и замедляет прогресс в тяжёлые формы аллергии бронхиальную астму и атопический дерматит [Ravetch JV. Fc receptors. Curr Opin Immunol. 1997; 9(1): 121-5].

Исторически для АСИТ используются экстракты аллергенов, при введении которых возникают побочные реакции, которые могут быть летальными при анафилактическом шоке [Cooper PJ. Interactions between helminth parasites and allergy. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2009; 9(1):29-37]. Поскольку такие вакцины представляют собой комплексные смеси белков, гликозилированных белков и небелковых соединений, для них обязательной является процедура стандартизации, чтобы охарактеризовать меняющийся от партии к партии состав вакцин. Из-за недостаточной корреляции между аллергенностью экстрактов и содержанием основных белков в них, стандартизуют экстракты на основании их способности связываться с общим иммуноглобулином Е in vitro. Основной целью при разработке новых лекарственных средств для АСИТ является поиск возможности предотвращения перекрёстного связывания вакцин с IgE-антителами во избежание риска развития побочных реакций.

Уменьшить риск и повысить эффективность СИТ позволяет изменение поверхностной структуры аллергенов, которое может быть достигнуто различными способами. Препараты, теряющие способность взаимодействовать с IgE-антителами, значительно более безопасны и могут использоваться в дозах, многократно превышающих дозы для стандартных экстрактов аллергенов [Akdis СА, Akdis М. Mechanisms of allergen-specific immunotherapy and immune tolerance to allergens. World Allergy Organ J. 2015; 14;8(1): 17].

Положительный эффект АСИТ зависит от нескольких возможных механизмов, которые продолжают изучаться до настоящего времени. Наиболее часто регистрируемый результат АСИТ - это индукция аллерген-специфичных блокирующих антител, в основном субкласса G4 [Ravetch JV. Fc receptors. Curr Opin Immunol. 1997; 9(l): 121-5], и постепенное снижение титров аллерген-специфичного иммуноглобулина Е [ibid]. Хотя уровень IgE снижается незначительно, после лечения с помощью СИТ предотвращается его резкое сезонное увеличение.

Развитие сенсибилизации является следствием переключения В-клеток на синтез IgE антител, что происходит при контакте В-клеток с интерлейкином-4 (ИЛ- 4), связывающимся в В-клетках с фактором транскрипции STAT6.

Одним из путей остановить развитие аллергии может быть включение адаптивного иммунитета в распознавание аллергена, что происходит при повышении доз аллергена, попадающих в контакт с иммунной системой. Как правило, IgE формируются против основных аллергенов, например, при аллергии на гриб A. fumigatus от 50% до 65% IgE антител направлены к двум аллергенам Asp f 2 и Asp f 3, и большая часть оставшихся антител связывается с Asp f 13 и 18 [Kurup VP, Knutsen АР, Moss RB, Bansal NK. Specific antibodies to recombinant allergens of Aspergillus fumigatus in cystic fibrosis patients with ABPA. Clin Mol Allergy. 2006 Jul 21 ;4: 1 1.

Для диагностики и иммунотерапии аллергических заболеваний можно использовать рекомбинантные аналоги природных аллергенов, позволяющие стандартизовать препараты для СИТ. Иммунизация (вакцинация) рекомбинантными белками приводит к выраженному IgGl и IgG4 гуморальному ответу и индукции ИЛ-10-продуцирующих регуляторных Т-клеток, что было показано в ходе клинических испытаний [Hales BJ, Martin AC, Pearce LJ, Laing IA, Hayden CM, Goldblatt J, Le Souef PN,Thomas WR. IgE and IgG anti-house dust mite specificities in allergic disease. J Allergy Clin Immunol. 2006 Aug;l 18(2):361-7]. Тем не менее, основным недостатком рекомбинантных аллергенов является экспрессия полноразмерными белками всех IgE эпитопов, характерных для их природных аналогов. В настоящее время много внимания уделяется разработке гипоаллергенных конструкций [Yang L, Hirose S, Suzuki К, Hiroi T, Takaiwa F. Expression of hypoallergenic Der f 2 derivatives with altered intramolecular disulphide bonds induces the formation of novel ER-derived protein bodies in transgenic rice seeds. J Exp Bot. 2012 May;63(8):2947-59].

Существенным признаком изобретения являются экранирование IgE связывающих эпитопов аллергенов (как нативн х в составе экстрактов, так и рекомбинантных аналогов основных белков аллергенов, а также смеси природных экстрактов с рекомбинантными аллергенами или их фрагментами) с помощью полимерной небелковой оболочки. Схема закрытия IgE эпитопов аллергенов представлена фигурой 1. Характеристика компонентов вакцины показана на фигурах 2-4. Закрытие эпитопов осуществляется способом капсулирования аллергенов в микро/наночастицы (НЧ) типа "ядро/оболочка". Ядро конструкции представляет собой НЧ размером 80-150 нм, сформированых из М-лаурил-]чГ-сукциноилхитозана, способного за счёт присутствия остатков жирной кислоты к самосборке в НЧ; N- лаурил-1М'-сукциноилхитозан ковалентно связан с белками-аллергенами. Ядро покрыто дополнительной оболочкой из альгината натрия, формирующейся за счёт электростатических взаимодействий между положительно заряженными амино- группами хитозана и отрицательно заряженными карбоксильными группами альгината натрия. Формирование дополнительной оболочки необходимо и достаточно для предотвращения связывания IgE антител с капсулированным аллергеном (Фиг. 5-6). Иммунизация подкожно мышей такими микро/наночастицами приводит к формированию гуморального IgG- опосредованного иммунного ответа против конкретного аллергена (Фиг. 7). Протективный ответ формируется через 3 иммунизации и сохраняется пожизненно (у мышей 1.5 года).

Техническим результатом изобретения является: 1) отсутствие связывания капсулированных аллергенов с IgE в условиях in vitro, что обеспечивает безопасность вакцинации; 2) способность НЧ вызывать формирование IgG б опосредованного гуморального ответа, что обеспечивает эффективность вакцинации; 3) возможность безопасного введения высокой дозы капсулированного аллергена, что обеспечивает сокращение курса, необходимого для достижения протективного эффекта; 4) сокращение сроков вакцинации повышает комплаентность терапии, что позволит проветси терапию на ранней стадии сенсибилизации и остановить прогрессирование аллергии.

Изобретение решает задачу безопасного замещения патогенного IgE- опосредованного иммунного ответа и формирования протективного IgG иммунного ответа в ходе короткого курса заместительной иммунотерапии аллергии.

Поставленная задача решается за счет маскирования IgE эпитопов аллергенов с помощью двойного капсулирования в полисахаридн ю оболочку, полученную на основе производного хитозана и альгината натрия.

Варианты осуществления предложения

Пример 1. Получение и характеристика микро/наночастиц типа «ядро-оболочка», содержащих рекомбинантные белки Der f 1 и Der f 2

Структура и стадийный процесс получения микро/наночастиц, содержащих ядро из модифицированного хитозана с включенными аллергенами Der f 1/Der f 2 или экстракта клещей, покрытое оболочкой альгината натрия, приведены на фигуре 1. На стадии 1 антигены иммобилизуют на лаурилсукциноилхитозане (ЛСХ) (1 : 1 : 15) карбодиимидным способом. Частицы формируются в процессе диализа самосборкой при переходе из органической фазы в водную. На стадии 2 полученные частицы смешивают с раствором альгината натрия, при этом формируется полиэлектролитный комплекс, имеющий суммарный отрицательный заряд.

В данном примере в качестве матрицы для получения «ядра» используют образцы хитозана с молекулярной массой 40 кДа. Предварительно проводят модификацию полимера с целью оптимизации гидрофильно-липофильных и кислотно-основных свойств. Для введения остатков жирной кислоты в хитозан используют Ν-гидроксисукцинимидный эфир лауриновой кислоты. Реакцию проводят в расчете на степень замещения 13 остатков на 100 молекулярных звеньев (МЗ). Далее хитозан модифицируют остатками янтарной кислоты из расчета 60-65 молекул на 100 МЗ. Схема реакции ацилирования хитозана представлена на Фиг.5; степень замещения определяют способом Ή-ЯМР (Фиг. 2). ЛСХ обладает амфифильными свойствами, что позволяет получать частицы по механизму гидрофобного взаимодействия между остатками лауриновой кислоты.

Для получения «ядер» проводят иммобилизацию рекомбинантных белков Der f 1 и Der f 2 на ЛСХ, используя водорастворимый карбодиимид для активации карбоксильных групп на хитозане. Частицы формируются методом самосборки в процессе диализа. Для определения выхода микро/наночастиц и анализа соотношения ЛСХ:белок, которое составило 45-50 к 1, используют массу сухой навески микро/наночастиц (Таблица 1). Частицы имеют слабый положительный заряд и диаметр 80 нм, что определяют методом динамического светорассеяния (Фиг. 3; Таблица 1).

Для формирования оболочки целевой конструкции используют альгинат натрия (полианион), способный образовывать полиэлектролитный комплекс с хитозаном за счет электростатических взаимодействий с его положительно заряженными группами. Комплекс формируется при добавлении альгината натрия к суспензии полученных ранее микро/наночастиц. Количество альгината натрия подбирают с целью формирования отрицательно зараженных микро/наночастиц. В результате получают микро/наночастицы типа «ядро-оболочка» с включенными внутрь ядер белками КДП Der f i n Der f 2, дополнительно покрытыми пленкой из альгината натрия. Размер частиц составляет около 250-300 нм (Фиг. 4), частицы имеют заряд -13 мВ (Табл. 1).

Пример 2. Анализ распознавания аллергена в составе микро/наночастиц IgE антителами

Для анализа способности микро/наночастиц связываться с антителами Е класса из сывороток больных с аллергией на КДП используют иммуноферментный анализ. Ранее мы показали, что бактериальный белок Der f 1 имеет неприродную конформацию и не распознается IgE антителами из сывороток больных в отличие от рекомбинантного Der f 2 [Д.Ю. Рязанцев, П.Е. Дробязина, СВ. Хлгатян, и др. Экспрессия аллергенов клещей домашней пыли Der f 1 и Der f 2 в листьях Nicotiana benthamiana. Биоорганическая химия, 2014 том 40, No 4, с. 468-478]. Поэтому при анализе сывороток используют в качестве контроля рекомбинантный белок Der f 2.

При нанесении белков, покрытых оболочкой из положительно заряженного хитозана (ядра) и отрицательно заряженного комплекса хитозан-альгинат, связывание может отличаться от связывания чистого белка. Поэтому проверяют наличие связанного белка в свободной форме и в составе ядер и микро/наночастиц с помощью сывороток мышей, иммунизированных белком Der f 2. Ядра и частицы прикрепляются к пластику так же хорошо, как и чистый белок, поскольку иммунные сыворотки распознают антиген с равным титром (Фиг. 5). Контрольные сыворотки интактных мышей не распознают антиген.

Для анализа связывания IgE отбирают сыворотки больных с высоким титром IgE. Инкубация со свободным белком приводит к достоверному связыванию (Фиг. 6). Белок в составе ядер распознается достоверно хуже, чем в свободном виде (р<0.01). Связывание белка в составе микро/наночастиц достоверно снижается (р<0.01) по сравнению с ядрами и свободным белком и не отличается от среднего значения, полученного для сывороток доноров без аллергии (р<0.05). Капсулирование аллергенов в двухслойную полимерную оболочку препятствует связыванию с IgE антителами и, как следствие, не вызывает дегрануляцию тучных клеток. Использование двух слоев полимера является необходимым и достаточным условием для предотвращения распознавания аллергена IgE антителами.

Пример 3. Иммуногенность белков в составе микро/наночастиц

Капсулированные белки сохраняют иммуногенность. После трехкратной (раз в 4 дня, 50, 100, 200 или 400 мкг/инъекцию) в/б иммунизации мышей линии СВА чистыми белками или конструкциями, содержащими разное количество белка, формировался IgG ответ (Фиг. 7). Ответ на белок был достоверно выше, чем при иммунизации конструкциями (рО.01), но достоверно регистрировался по сравнению с интактными животными (ρθ.01), что показывает иммуногенность белка в составе конструкций. Различий между ответом на Der f 2 в составе ядер и в составе микро/наночастиц нет (р>0.05).

Изобретение иллюстрируют графические материалы

Фигура 1. Стадийный процесс получения микро/наночастиц, содержащих ядро из модифицированного хитозана с включенными аллергенами Der f 1/Der f 2 или экстракта клещей, покрытое оболочкой альгината натрия. На стадии 1 антигены иммобилизуют на ЛСХ (1 : 1 : 15) карбодиимидным методом. Частицы формируются в процессе диализа самосборкой при переходе из органической фазы в водную. На стадии 2 полученные частицы смешивают с раствором альгината натрия, при этом формируется полиэлектролитный комплекс, имеющий суммарный отрицательный заряд.

Фигура 2. Схема модификации хитозана янтарной и лауриновой кислотами.

Фигура 3. 1Н-ЯМР-спектр лаурилсукциноилхитозана.

Фигура 4. Диаграммы динамического светорассеяния: размер ядер 60 нм, размер микро/наночастиц 250-300 нм.

Фигура 5. Распознавание белка Asp f 3 в составе ядер и микро/наночастиц (НЧ) высокоаффинными IgGl антителами (черные столбики) и контрольной сывороткой (серые столбики). Анализ проводили методом ИФА с нанесенными на подложку белком Asp f 3, ядрами, содержащими Asp f 3, и микро/наночастицами, содержащими ядра с Asp f 3. Все препараты микро/наносили в равной концентрации по белку Asp f З.а

Фигура 6. Распознавание сыворотками больных с аллергией на клещей домашней пыли полноразмерного белка Der f 2, ядер и микро/наночастиц (НЧ), содержащих аналогичное количество Der f 2. Контролем является сыворотка донора без аллергии. Фигура 7. Продукция IgG при иммунизации мышей линии СВА рекомбинантными белками Der f 1 и Der f 2 в присутствии адъюванта, ядрами и микро/наночастицами. В качестве подложки использовали белок Der f 2.

Промышленная применимость

Предложенный способ может быть применим в области иммунологии и медицины.