Titre : Procédé de filtration du fibrinogène

Domaine technique

[0001] La présente invention concerne un procédé de filtration du fibrinogène, ainsi que les préparations obtenues.

Technique antérieure

[0002] Le fibrinogène est une protéine essentielle de la coagulation sanguine, car sa polymérisation en fibrine insoluble formée au terme de la cascade de réactions qui gouvernent la coagulation, aboutit à la formation d'un caillot obturant la brèche vasculaire, responsable du saignement. La mise en place du caillot est ainsi essentielle pour assurer l'arrêt du saignement. De plus, la fibrine formée au niveau de la plaie constitue un réseau fibrillaire qui assure la réparation tissulaire, donc la cicatrisation.

[0003] Des déficiences congénitales en fibrinogène peuvent conduire à de graves pathologies. Pour soigner ces déficiences, il est nécessaire de disposer de concentrés de fibrinogène pouvant être administrés à des patients en traitement. D'autres pathologies peuvent également être soignées par des apports de fibrinogène, notamment en cas de pertes massives de sang, en cas de chirurgie ou de traumatismes par exemple, ou à la suite d'une coagulopathie de consommation décompensée, par exemple la CIVD (coagulation intravasculaire disséminée).

[0004] Par conséquent, la mise à disposition de compositions comprenant du fibrinogène, notamment à des fins thérapeutiques, requiert des techniques de purification conduisant à un produit non seulement suffisamment purifié de contaminants de nature diverse, tels que les protéines accompagnantes ou co- purifiées, les anticorps ou les protéases, mais de surcroît sécurisé sur le plan viral et sur le plan des ATNC couvrant le prion.

[0005] L'isolement de fractions enrichies en fibrinogène à partir du plasma est connu et a été décrit initialement par les travaux de Cohn et Nitschmann (Cohn et al, J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946 et Kistler et al, Vox Sang., 7, 1962, 414-424). Des méthodes plus récentes incorporent notamment des techniques de préparation par précipitation, chromatographie avec des étapes dédiées de sécurisation biologique.

[0006] Notamment, certains traitements d'inactivation virale classiques consistent en un traitement thermique, par exemple une pasteurisation à 60°C pendant 20h en présence de stabilisants protecteurs ou un chauffage à sec du produit lyophilisé, et/ou un traitement chimique, tel que par solvant-détergent, destinés à rendre les compositions de fibrinogène compatibles avec un usage thérapeutique. Cependant, ils ne permettent pas d’assurer une totale inactivation des virus, notamment des virus non enveloppés tels que le parvovirus B19 ou le virus de l’hépatite A ou B sans impacter la protéine. En particulier, si ces traitements ne sont pas parfaitement maîtrisés, ils peuvent entraîner la dégradation de la protéine (perte d’activité biologique, dénaturation par action enzymatique) et la formation de fragments, d’agrégats et de polymères.

[0007] Les autres méthodes de sécurisation biologique utilisent des techniques d’élimination virale, notamment à l’aide de filtrations. Néanmoins, ces techniques de filtration nécessitent des filtres de faible taille de pores (<35 nanomètres) qui sont difficilement compatibles avec le fibrinogène. La demande EP1457497 décrit une étape de nanofiltration nécessitant une étape préliminaire de congélation et de décongélation suivie d’une filtration qui doit être appliquée afin d’éliminer les agrégats, les polymères ou les contaminants indésirables tels que la fibronectine, un tel procédé nécessite également une dilution préalable de la solution à moins de 2 g/L pour limiter le colmatage précoce des filtres, ce qui représente des freins importants à l’industrialisation de tels procédés. Ainsi, les filtres de faible porosité tel que le filtre Planova 20N, qui est classiquement utilisé dans l’industrie pour la sécurisation biologique, ne permettent pas d’atteindre une charge sur le filtre suffisante pour assurer un rendement et un coût de revient industriel acceptable. Les procédés utilisant des filtres dans de telles conditions ne permettent donc pas une mise en oeuvre industrielle aisée ni une utilisation à capacité élevée, et représentent un coût rédhibitoire dans l’implémentation d’un procédé de purification à l’échelle industrielle utilisant des lots de départ de plusieurs centaines ou milliers de litres. [0008] En particulier de tels procédés ne permettent pas de traiter plus de 0,2 kg de fibrinogène par m ² de membrane de nanofiltre sans inclure une étape préliminaire de congélation/décongélation et filtration du produit à nanofiltrer. Pour l’homme du métier la mise au point d’une étape de nanofiltration du fibrinogène dans des conditions permettant sa mise en oeuvre industrielle (débit suffisant, peu colmatante, prix de revient acceptable) est donc connue comme étant une difficulté.

[0009] Par ailleurs, il est connu de l’homme du métier que les compostions de fibrinogène doivent contenir de l’arginine pour assurer leur stabilité. Les procédés d’obtention de compositions de fibrinogène utilisent ainsi l’arginine à différentes étapes du procédé, y compris lors de l’élution de chromatographie. Toutefois, la demande US2015/0366947 (exemple 7) enseigne que la nanofiltration de compositions de fibrinogène obtenues par élution de chromatographie en tampon comprenant de l’arginine ne serait pas facilitée par rapport à la nanofiltration de compositions de fibrinogène obtenues par élution de chromatographie en tampon ne comprenant pas d’arginine. En effet, selon ce procédé, l’utilisation d’un tampon d’élution de chromatographie comprenant de l’arginine entraine le colmatage du filtre et nécessite l’ajout d’une étape d’ajustement avec de l’arginine de la composition obtenue après l’étape de chromatographie, afin de surmonter l’impossibilité de nanofiltrer la composition. Un procédé plus simple à mettre en œuvre présenterait donc un avantage.

Problème technique

[0010] La Demanderesse a donc cherché à mettre au point un procédé d'élimination des virus et d'autres contaminants indésirables (tels que les polymères, agrégats ou prion) d’une composition comprenant du fibrinogène, par filtration, qui permette l'obtention d’une composition de fibrinogène hautement sécurisée, ledit procédé étant facile à mettre en œuvre à l’échelle industrielle, et présentant un bon rendement et un prix de revient industriel acceptable. ^*

Exposé de l’invention

[0011] L'invention concerne, par conséquent, un procédé de de filtration d’une composition de fibrinogène, comprenant les étapes suivantes: a) purification par chromatographie de la composition de fibrinogène à l’aide d’un tampon d’élution comprenant de l’arginine ;

b) optionnellement, au moins une étape de filtration de la composition de fibrinogène obtenue par élution de chromatographie à l’étape a), sur filtre ayant une taille de pores comprise entre 0,08 pm et 0,22 pm,

c) filtration de la composition de fibrinogène obtenue par élution de chromatographie à l’étape a), ou optionnellement obtenue en b), sur filtre symétrique ayant une taille de pores comprise entre 15 nm et 25 nm, de préférence comprise entre 18 nm et 22 nm, et

d) récupération de la solution résultante de fibrinogène,

ledit procédé de filtration étant réalisé sans ajout d’arginine après l’étape a), à une capacité d’au moins 0,2 kg de fibrinogène/m ² et ladite composition de fibrinogène n’étant pas préalablement congelée et/ou décongelée.

[0012] Une telle solution permet de résoudre les problèmes posés par les solutions connues de l’état de la technique et notamment d’obtenir une solution en fin d’étape d) hautement sécurisée biologiquement.

[0013] En effet et avantageusement, le procédé selon l’invention ne nécessite pas l’ajout d’une étape d’ajustement avec de l’arginine de la composition obtenue après l’étape de chromatographie. Il a été en effet démontré que des concentrations croissantes d’arginine dans le tampon d’élution permettent d’augmenter la capacité de filtration et n’entrainent pas de colmatage du filtre. Une étape d’ajustement ultérieur avec de l’arginine n’est donc pas nécessaire, simplifiant ainsi la mise en œuvre industrielle du procédé.

[0014] Le procédé selon l’invention permet donc avantageusement la filtrabilité, sur filtre symétrique de taille de pores d’environ 20 nm, d’une composition comprenant du fibrinogène sans étape de congélation/décongélation préalable, ni dilution préalable à partir d’une solution de fibrinogène pré-purifié par chromatographie et éluée par tampon comprenant de l’arginine, et sans ajout d’arginine après l’étape de purification par chromatographie.

Brève description des dessins [0015] D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :

Fig. 1

[0016] [Fig. 1 ] montre la capacité en g de fibrinogène/m ² de membrane en fonction du débit (L/H/m ² ) du procédé selon l’invention (filtre symétrique) comparativement à un procédé antérieur (filtre asymétrique)

Description des modes de réalisation

[0017] Les dessins et la description ci-après contiennent, pour l’essentiel, des éléments de caractère certain. Ils pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant.

[0018] Dans la présente demande, par « capacité élevée » on entend une charge de fibrinogène par surface de membrane, exprimée en kg de fibrinogène par m ² de membrane, supérieure ou égale à 0,2, de préférence supérieure ou égale à 0,25, de préférence supérieure ou égale à 0,3, de préférence supérieure ou égale à 0,35, de préférence supérieure ou égale à 0,4, de préférence supérieure ou égale à 0,45, de préférence supérieure ou égale à 0,5, de préférence supérieure ou égale à 1 , de préférence supérieure ou égale à 2, de préférence supérieure ou égale à 3, de préférence supérieure ou égale à 5 kg/m ² .

[0019] De manière particulièrement avantageuse, la capacité élevée correspond à une charge de fibrinogène par surface de membrane comprise entre 0,2 et 5 kg/m ² , encore plus avantageusement entre 0,2 et 2,5 kg/m ² .

[0020] Ainsi, la Demanderesse a trouvé qu'il était possible d'obtenir, à l'échelle industrielle, des compositions de fibrinogène, hautement sécurisées, exemptes de virus, et en particulier de virus de petite taille, notamment non enveloppés, tel que le B19, et d'autres contaminants indésirables (tels que les polymères, agrégats ou prion), par la mise en oeuvre d'un procédé de filtration flexible et simple qui permet une sécurisation avec une étape de nanofiltration du fibrinogène conservant son intégrité moléculaire à un coût de production acceptable. Un tel procédé simple, rapide et à prix de revient industriel acceptable, est aisément mis en œuvre à l'échelle industrielle, ce qui conduit à une optimisation accrue de la sécurisation biologique de compositions comprenant du fibrinogène. Enfin, un tel procédé de filtration permet une charge protéique élevée avec un rendement important après filtration.

[0021] En outre, un tel procédé est optimal, car il ne nécessite pas notamment :

- des étapes préalables de congélation/décongélation destinées à éliminer les agrégats ou contaminants indésirables,

- et/ou des étapes de dilution préalable, qui diminuent la concentration protéique et rallongent les temps de filtration,

- et/ou des étapes d’élimination de l’arginine dans les étapes précédentes de purification, ce qui permet de garder un fibrinogène stabilisé,

- et/ou une étape d’ajustement avec de l’arginine de la composition obtenue après l’étape de purification par chromatographie réalisée à l’aide d’un tampon d’élution comprenant de l’arginine.

[0022] Selon l'invention, on peut utiliser plusieurs sources de matière première contenant du fibrinogène. Le procédé selon l’invention utilise ainsi une composition de fibrinogène, notamment de différentes sources. La composition de fibrinogène peut ainsi être issue de plasma sanguin, de préférence de fractions plasmatiques, de surnageant de culture cellulaire ou de lait d’animaux transgéniques.

[0023] Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprenant du fibrinogène (ou composition de fibrinogène) soumise au procédé de l’invention est du plasma sanguin ou une fraction plasmatique, de préférence une fraction plasmatique obtenue à partir de plasma sanguin pré purifié.

[0024] Par « fraction plasmatique obtenue à partir de plasma sanguin prépurifié», on entend toute partie ou sous-partie du plasma sanguin humain, ayant fait l’objet d’une ou plusieurs étapes de purification. Lesdites fractions plasmatiques incluent ainsi le surnageant de plasma cryoprécipité, le cryoprécipité de plasma (remis en suspension), la fraction I obtenue par fractionnement éthanolique (selon la méthode de Cohn ou de Kistler & Nitschmann), les éluats de chromatographies et les fractions non adsorbées des colonnes de chromatographie, y compris des chromatographies multicolonnes, et les filtrats.

[0025] Dans un mode de réalisation de l’invention, la composition de fibrinogène soumise au procédé de l’invention subie une étape supplémentaire de chromatographie. Ainsi, selon un mode de réalisation, la composition de fibrinogène soumise au procédé selon l’invention est un éluat de chromatographie ou une fraction non adsorbée de colonne de chromatographie, y compris de chromatographie multicolonnes.

[0026] Ainsi, dans un mode de réalisation préféré de l’invention, la composition de fibrinogène soumise au procédé de l’invention est une fraction plasmatique obtenue à partir de cryosurnageant ou de cryoprécipité remis en suspension.

[0027] Selon l’invention, le « surnageant de plasma cryoprécipité », ou « cryosurnageant », correspond à la phase liquide obtenue après décongélation de plasma congelé (cryoprécipitation). Notamment, le cryosurnageant peut être obtenu par congélation de plasma sanguin à une température comprise entre - 10°C et -40°C, puis décongélation douce à une température comprise entre 0°C et +6°C, préférentiellement entre 0°C et +1 °C, suivie d’une centrifugation du plasma décongelé pour séparer le cryoprécipité et le cryosurnageant. Le cryoprécipité est un concentré en fibrinogène, fibronectine, facteur von Willebrand et facteur VIII, tandis que le cryosurnageant contient les facteurs du complément, les facteurs vitamine K dépendants tels que la protéine C, la protéine S, la protéine Z, le facteur II, le facteur Vil, le facteur IX et le facteur X, du fibrinogène, les immunoglobulines et l’albumine.

[0028] Par « composition de fibrinogène n’étant pas préalablement congelée et/ou décongelée », il est entendu que la composition de fibrinogène qui est soumise à l’étape b) si elle s’applique, ou par défaut soumise directement à l’étape c), n’est pas congelée et/ou décongelée avant cette étape b) ou c).

[0029] Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, la fraction plasmatique soumise au procédé de l’invention peut être obtenue selon le procédé décrit par la Demanderesse dans la demande EP1739093. Selon ce mode, la fraction plasmatique utilisée est de préférence obtenue comme suit : On utilise de préférence du cryosurnageant de plasma humain. Ce cryosurnageant de plasma est soumis à une précipitation éthanolique par la méthode de Cohn, selon des conditions connues de l'homme du métier, notamment de façon telle que la concentration d'éthanol dans le plasma considéré soit de 8 à 10 % (v/v).

Le surnageant et le précipité ainsi obtenus sont ensuite centrifugés. Le précipité constitue la fraction I de Cohn constituée majoritairement de fibrinogène (pureté environ 70 %).

Cette fraction I de Cohn prépurifiée est remise en suspension et lavée par dispersion.

Après centrifugation, la pâte de précipité purifié (fraction I de Cohn purifiée) est récupérée puis solubilisée.

La solution ainsi obtenue est ensuite soumise à une élimination des facteurs procoagulants par traitement au gel d'alumine à un pH de 6,9-7, 1.

Après filtration, cette solution prépurifiée est soumise à un premier traitement d'inactivation virale par solvant-détergent en présence de Tween®-TnBP.

La solution prépurifiée ainsi obtenue est injectée sur une colonne chromatographique remplie d'un gel échangeur d'anions DEAE Macroprep (Bio- Rad, France), préalablement équilibrée en tampon constitué de chlorure de sodium et de citrate trisodique, ajusté à un pH de 8,0.

L'élution du fibrinogène est effectuée par un tampon d'élution approprié, par exemple contenant du chlorure de sodium 1 M et un mélange constitué de citrate trisodique, de lysine, de glycine, d'arginine et l'isoleucine, ajusté à un pH de 7,5. L'éluat ainsi récupéré constitue la fraction plasmatique utilisée pour la nanofiltration. Dans le procédé selon l’invention, l’étape de chromatographie est effectuée par chromatographie d’affinité, mixed-mode ou échangeuse d’ions.

[0030] Dans un mode de réalisation particulier, la purification chromatographique est une chromatographie échangeuse d’ions. De préférence, elle est effectuée sur une matrice échangeuse d’ions à base de polymère naturel ou synthétique, résine ou gel, sur laquelle sont greffés des groupements échangeurs d'anions de type base faible, de préférence le DEAE. De préférence, la purification chromatographique comprend une première étape de chargement d’une composition de fibrinogène, notamment de la fraction plasmatique solubilisée, sur un échangeur d'anions de type base faible, ledit échangeur étant préalablement équilibré par un tampon de force ionique prédéterminée de pH basique. Ledit tampon est appelé tampon d’équilibrage.

[0031] Dans le procédé selon l’invention, le tampon d'élution comprend de l’arginine en arginine est préférentiellement d’au moins 200 mM, au moins 300 mM, au moins 400 mM, au moins 500mM, au moins 600 mM, au moins 700 mM, au moins 800 mM, au moins 900 mM, au moins 1 M.

[0032] Dans un mode de réalisation préféré, la concentration en arginine du tampon d’élution est préférentiellement comprise entre 200 et 800 mM, entre 200 et 700 mM, entre 200 et 600 mM, entre 200 et 500 mM, entre 200 et 400 mM, entre 200 et 300 mM.

[0033] Dans un autre mode de réalisation, la concentration en arginine du tampon d’élution est préférentiellement comprise entre 300 et 800 mM, entre 400 et 800 mM, entre 500 et 800 mM, entre 600 et 800 mM, entre 700 et 800 mM.

[0034] Dans un autre mode de réalisation, la concentration en arginine du tampon d’élution est préférentiellement comprise entre 300 et 800 mM, entre 400 et 700 mM, entre 400 et 600 mM.

[0035] Dans le procédé selon l’invention, le tampon d’élution peut également contenir d'autres excipients adaptés, tels que des sels et/ou des acides aminés par exemple du citrate trisodique, du Tris, de la lysine, de la glycine, et/ou de l'isoleucine. La concentration en protéines dans l'éluat est de l'ordre de 2 à 5 g/l.

[0036] Dans un mode de réalisation particulier, la purification chromatographique est une chromatographie d’affinité. De préférence, la purification chromatographique comprend une première étape de chargement d’une composition de fibrinogène, issue du cryosurnageant ou du cryoprécipité remis en suspension, sur une résine d’affinité, ladite résine étant préalablement équilibrée par un tampon de force ionique prédéterminée de pH adapté. Ledit tampon est appelé tampon d’équilibrage.

[0037] Ainsi, de préférence, lors de l’étape a), la fraction plasmatique solubilisée est chargée sur toute matrice d’affinité, résine ou gel, sur laquelle sont greffés des ligands chimiques ou synthétique tels que les anticorps, les fragments d’anticorps, les dérivés d’anticorps ou des ligands chimiques tels que des peptides, des peptides mimétiques, des peptoïdes, des nanofitines ou encore des ligands oligonucléotidiques tels que les aptamères. Dans un mode de réalisation particulier, le support chromatographique est disponible sous l’appellation CaptureSelect Fibrinogen (Life Technologies). Dans un autre mode de réalisation particulier, le support chromatographique est obtenu selon la méthode décrite dans la demande WO2018007530.

[0038] Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, la fraction plasmatique soumise au procédé de l’invention peut ainsi être obtenue selon le procédé décrit par la Demanderesse dans la demande WO2015/136217 ou la demande WO2018007530.

[0039] De façon avantageuse la chromatographie d’affinité peut être réalisée en chromatographie continue de type SMB (Simulated Moving Bed) par exemple avec la technologie NOVASEP SMCC (Sequential MultiColumns Chromatography). En utilisant entre 2 et 8 colonnes de petite taille réalisant plusieurs cycles de purification de manière à purifier l’ensemble du fibrinogène, la taille des colonnes et des équipements de chromatographie se trouve réduite de façon importante (de l’ordre de 10 fois). De plus en surchargeant la résine d’affinité lors de phases de chargement du fibrinogène le besoin en résine par lot de fibrinogène peut être réduit de 10 à 50% en général. Les éluats générés en chromatographie continue peuvent être soit utilisés en continu pour les étapes suivantes avec ou sans concentration en ligne en utilisant des équipements de concentration en ligne de type Cadence Pall ou équivalent d’autres fournisseurs. Une variante consiste à pooler les éluats avant la suite du procédé, avec une reconcentration possible des éluats avant leur utilisation.

[0040] Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, la chromatographie d’affinité est réalisée sur la solution de fibrinogène ayant subi le traitement d’inactivation virale, ainsi la solution d’inactivation virale se retrouve dans la fraction non adsorbée de chromatographie et est éliminée en même temps que le fibrinogène est purifié. [0041] Dans le procédé selon l’invention, le tampon d'élution comprend de l’arginine; la concentration en arginine est préférentiellement d’au moins 200 mM au moins 300 mM, au moins 400 mM, au moins 500 mM, au moins 600 mM, au moins 700 mM, au moins 800 mM, au moins 900 mM, au moins 1 M.

[0042] Dans un mode de réalisation préféré, la concentration en arginine du tampon d’élution est préférentiellement comprise entre 200 et 800mM, entre 200 et 700 mM, entre 200 et 600 mM, entre 200 et 500 mM, entre 200 et 400 mM, entre 200 et 300 mM.

[0043] Dans un autre mode de réalisation, la concentration en arginine du tampon d’élution est préférentiellement comprise entre 300 et 800 mM, entre 400 et 800 mM, entre 500 et 800 mM, entre 600 et 800 mM, entre 700 et 800 mM.

[0044] Dans un autre mode de réalisation, la concentration en arginine du tampon d’élution est préférentiellement comprise entre 300 et 800 mM, entre 400 et 700 mM, entre 400 et 600 mM.

[0045] Dans le procédé selon l’invention, le tampon d'élution peut également contenir d'autres excipients adaptés, tels que des sels et/ou des acides aminés par exemple du citrate trisodique, du Tris, de la lysine, de la glycine, et/ou de l'isoleucine.

[0046] Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, le tampon d’élution peut consister soit en une modification du pH et/ou de la force ionique.

[0047] Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, la composition comprenant du fibrinogène provient de lait d’animaux transgéniques, par exemple obtenu selon la méthode décrite dans WO00/17234 ou dans WO00/17239.

[0048] De manière avantageuse, la composition de fibrinogène soumise au procédé selon l’invention possède une pureté supérieure ou égale à 70%, de manière préférée supérieure ou égale à 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.

[0049] Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition de fibrinogène soumise au procédé selon l’invention ne comprend avantageusement pas d’autres protéines co-purifiées, avantageusement pas de FXIII et/ou de fibronectine et/ou de prothrombine (Fil) et/ou de thrombine, et/ou de plasminogène et/ou de plasmine. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition de fibrinogène soumise au procédé selon l’invention est avantageusement dépourvue de FXIII.

[0050] Selon l'invention, la composition de fibrinogène soumise au procédé selon l’invention peut également comprendre une ou plusieurs protéines accompagnantes, éventuellement co-purifiées. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition de fibrinogène soumise au procédé selon l’invention comprend avantageusement du FXIII.

[0051] Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention la composition de fibrinogène soumise au procédé selon l’invention ne comprend pas de formes multimériques de fibrinogène, avantageusement pas de polymères de fibrinogène ni d’agrégats de fibrinogène.

[0052] De manière particulièrement avantageuse, la composition de fibrinogène soumise au procédé selon l’invention est concentrée à plus de 1 g de fibrinogène/L de solution, de préférence à plus de 2g de fibrinogène/L de solution, de manière encore plus préférée à plus de 3g de fibrinogène/L de solution, à plus de 3,5g de fibrinogène/L de solution, à plus de 4g de fibrinogène/L de solution, à plus de 4,5g de fibrinogène/L de solution. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition de fibrinogène soumise au procédé selon l’invention est concentrée entre 2g et 5g de fibrinogène/L de solution. En outre, de préférence, elle est utilisée sans dilution préalable. En effet, de préférence, le procédé selon l’invention ne nécessite pas d’étape de dilution préalable de la composition de fibrinogène.

[0053] Le procédé selon l’invention comprend optionnellement une étape b), selon laquelle au moins une étape de filtration du fibrinogène, est réalisée sur filtre ayant une taille de pores comprise entre 0,08pm et 0,22pm.

[0054] De préférence, l’étape b) comprend deux étapes de filtration du fibrinogène sur filtre ayant une taille de pores comprise entre 0,08pm et 0,22pm. De préférence, la première filtration est effectuée sur filtre ayant une taille de pores comprise entre 0,15pm et 0,22pm, de préférence d’environ 0,2 pm. De préférence, la seconde filtration est effectuée sur filtre ayant une taille de pores comprise entre 0,08pm et 0,15pm, de préférence d’environ 0,1 pm.

[0055] Ces filtrations peuvent être réalisées en utilisant les filtres de polyéthersulfone (PES) commercialisés par Sartorius sous le nom Sartopore® 2 Maxicaps® ou tout autre média équivalent ayant des caractéristiques similaires.

[0056] De préférence, la séquence de filtres est, préalablement à l’étape b), équilibrée avec le tampon des étapes préalables de purification, en particulier avec le tampon d’élution de la chromatographie éventuellement supplémenté en acides aminés.

[0057] A la fin de l’étape b), on récupère une composition de fibrinogène.

[0058] Puis, le procédé selon l’invention comprend la filtration de la composition de fibrinogène optionnellement obtenue en b), sur filtre symétrique ayant une taille de pores comprise entre 15 nm et 25 nm : c’est l’étape c).

[0059] Si l’étape b) est effectuée, alors la solution de fibrinogène obtenue en b) est passée sur filtre symétrique ayant des pores de diamètre compris entre 15 nm et 25 nm, préférentiellement de 20 nm, et la solution résultante de fibrinogène est récupérée. Si l’étape b) n’est pas effectuée, alors la composition de fibrinogène obtenue par élution de chromatographie à l’étape a) est directement passée sur filtre symétrique ayant des pores de diamètre compris entre 15 nm et 25 nm, préférentiellement de 20 nm, et la solution résultante de fibrinogène est récupérée.

[0060] La nanofiltration de l’étape c) est typiquement réalisée à une pression comprise entre 200 et 4000 mbar. De manière avantageuse, la nanofiltration de l’étape b) est typiquement réalisée à une pression comprise entre 200 et 1000 mbar, ou entre 2000 et 4000 mbar.

[0061] De manière avantageuse, les filtres utilisés peuvent être définis par leur taille moyenne de pores en nm, par les virus retenus par le filtre, par un seuil de poids moléculaire ou par le type de symétrie de leur membrane. Les filtres utilisés peuvent donc être des filtres ou tout autre filtre équivalent commercialisé :

- définis par une taille moyenne de pores en nm, incluant les filtres de la gamme Planova®, constitués d’une membrane à fibres creuses formée de cellulose régénérée au cuprammonium et commercialisés par Asahi-Kasei (Planova® 15N, Planova® 20N), et ceux de la gamme Ultipor®, composés d’une membrane de polyfluorure de vinylidène modifié à la surface et sont commercialisés par Pall (Ultipor DV20, Pegasus SV4), ou tout autre filtre équivalent commercialisé ;

- dont la taille moyenne des pores est définie relativement aux virus retenus par le filtre. La taille moyenne des pores du filtre correspond alors à la taille du plus petit virus retenu par le filtre. De tels filtres, définis par les virus retenus par le filtre, incluent les filtres Planova BioEX en PVDF (rétention des parvovirus, membrane en polyvinylidène fluoride hydrophile modifié) commercialisés par la société Asahi Kasei Bioprocess, les filtres Pegasus SV4, ou Ultipor VF (rétention des parvovirus, membrane en polyvinylidène fluoride hydrophile modifié) commercialisés par Pall, les filtres Viresolve® NFP (rétention des parvorirus, membrane en polyfluorure de vinylidène modifié en surface), Viresolve Pro (rétention des parvorirus, membrane en polyéthersulfone double couche) et Viresolve® NFR (rétention des rétrovirus, membrane en polyéthersulfone) commercialisés par Millipore, et Virosart® CPV (rétention du parvovirus canin, membrane à double couche de polyéthersulfone), Virosart HC ou Virosart Fl F commercialisé par Sartorius, ou tout autre filtre équivalent commercialisé. Ces filtres, qui sont définis par les virus retenus, notamment les parvovirus, présentent une taille moyenne de pores d’environ 20 nm.

- définis par leur symétrie, par exemple

filtres asymétriques tels que les filtres de la gamme Planova®, commercialisés par Asahi-Kasei (Planova® 15N, Planova® 20N, Planova BioEx), Viresolve NFP et Viresolve Pro (commercialisés par Merck Millipore), Virosart HF (commercialisé par Sartorius Stedim).

filtres symétriques, tel que le filtre Pegasus SV4 ou Ultipor DV20 (commercialisés par Pall), le filtre Virosart CPV (commercialisé par Sartorius Stedim).

Une telle classification des filtres selon leur symétrie apparaît notamment dans Gustafsson et al., « Mille-feuille paper : a novel type of filter architecture for advanced virus séparation applications ». Materials Florizons 2016, 3, 320-337.

[0062] Par « filtre symétrique » selon l’invention on entend un filtre ayant une porosité équivalente entre la surface interne (en contact avec la solution à filtrer) et externe du filtre. Ceci vient en opposition des filtres asymétriques pour lesquels la surface interne du filtre est souvent plus poreuse que la surface externe.

[0063] Quelle que soit la manière dont est défini le filtre par le fabricant, la taille des pores en nm peut être mesurée par l’homme du métier selon des techniques connues.

[0064] Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la nanofiltration réalisée à l’étape c) est effectuée à l’aide d’un filtre de type symétrique.

[0065] De préférence, la nanofiltration de l’étape c) est effectuée en utilisant un filtre symétrique, tel que le filtre Pegasus SV4 ou Ultipor DV20 (commercialisés par Pall), le filtre Virosart CPV (commercialisé par Sartorius Stedim).

[0066] Dans un mode de réalisation particulier, le filtre symétrique est en montage plissé.

[0067] Dans un autre mode de réalisation particulier le filtre symétrique est avantageusement caractérisé par une membrane polyvinylidènedifluoride (PVDF) hydrophile.

[0068] Dans un mode de réalisation particulier, le filtre symétrique en montage plissé caractérisé par une membrane polyvinylidènedifluoride (PVDF) hydrophile est un filtre Pegasus SV4 (commercialisé par Pall).

[0069] La Demanderesse a avantageusement mis en évidence que les filtres de type symétrique, tels que des filtres similaires au filtre Pegasus SV4 ou Ultipor DV20 (commercialisés par Pall) ou Virosart CPV (commercialisé par Sartorius Stedim) permettaient de réaliser la nanofiltration du fibrinogène avec une charge d’au moins 0,2 kg de fibrinogène/m ² de membrane et ladite composition de fibrinogène n’étant pas préalablement congelée et/ou décongelée et d’obtenir de meilleurs résultats qu’avec un filtre de type asymétrique tels que les filtres de la gamme Planova®, commercialisés par Asahi-Kasei (Planova® 15N, Planova® 20N).

[0070] Comme cela est montré en exemples, cette étape c) permet de filtrer un volume conséquent de solution de fibrinogène, avec un très bon rendement, i.e. au moins égal à 90%. Ce volume conséquent correspond à une capacité d’au moins 0,2 kg de fibrinogène par m ² et peut aller jusqu’à au moins 5 kg par m ² .

[0071] Comme cela est montré dans l’exemple 7, la capacité de filtration d’une composition de fibrinogène est avantageusement augmentée en ajoutant des concentrations croissantes d’arginine dans le tampon d’élution de la chromatographie réalisée préalablement à la séquence de filtration.

[0072] Dans un mode de réalisation préféré du procédé de filtration selon l’invention, le tampon d’élution de la chromatographie réalisée à l’étape a) comprend une concentration en arginine d’au moins 200 mM et ledit procédé de filtration a une capacité d’au moins 0.25 kg/m ² .

[0073] Dans un autre mode réalisation du procédé de filtration selon l’invention, le tampon d’élution de la chromatographie réalisée à l’étape a) comprend une concentration en arginine d’au moins 200 mM et ledit procédé de filtration a une capacité d’au moins 0.30 kg/m ²

[0074] Dans un autre mode de réalisation, le tampon d’élution de la chromatographie réalisée à l’étape a) comprend une concentration en arginine d’au moins 200 mM et ledit procédé de filtration a une capacité d’au moins 0.35 kg/m ² .

[0075] Dans un autre mode de réalisation de l’invention, le tampon d’élution de la chromatographie réalisée à l’étape a) comprend une concentration en arginine d’au moins 400 mM et ledit procédé de filtration a une capacité d’au moins 0.25 kg/m ²

[0076] Dans un autre mode de réalisation de l’invention, le tampon d’élution de la chromatographie réalisée à l’étape a) comprend une concentration en arginine d’au moins 400 mM et ledit procédé de filtration a une capacité d’au moins 0.30 kg/m ² . Dans un autre mode de réalisation, le tampon d’élution de la chromatographie réalisée à l’étape a) comprend une concentration en arginine d’au moins 400 mM et ledit procédé de filtration a une capacité d’au moins 0.35 kg/m ² .

[0077] La capacité de filtration est mesurée par toute méthode connue de l’homme du métier. Typiquement, celle-ci est déterminée de la manière suivante : La solution de fibrinogène à nanofiltrer est prépurifée par chromatographie selon la méthode décrite dans EP1739093. La concentration de la solution de fibrinogène de départ est de 3g/L.

En vue de déterminer la capacité de filtration, des quantités croissantes de fibrinogène sont appliquées sur la séquence de nanofiltration.

Une séquence de filtration de cet éluat est appliquée :

- Filtre 0.2-0.1 pm polyéthersulfone

- Filtre 35 nm (de type Planova 35 N, de la société Asahi)

- Filtre symétrique 20 nm (de type Pegasus SV4 de la société Pall Life Sciences) La filtration est réalisée à une pression constante de 2.1 bar sur le filtre 20 nm.

La capacité de filtration du filtre est déterminée par l’analyse du profil de colmatage; la capacité de filtration maximale correspond à la quantité de fibrinogène associée à un débit de filtration inférieur à 25% du débit initial.

[0078] On pourra également citer la méthode décrite par Burnouf et al (Haemophilia. 2003 Jan;9(1 ):24-37).

[0079] De préférence, le procédé de filtration d’une composition de fibrinogène selon l’invention comprend les étapes suivantes:

A) obtention de la composition de fibrinogène, ladite composition de fibrinogène étant choisie parmi un surnageant de culture cellulaire, du lait d’animaux transgéniques, le surnageant de plasma cryoprécipité, le cryoprécipité de plasma remis en suspension, la fraction I obtenues par fractionnement éthanolique selon la méthode de Cohn ou de Kistler & Nitschmann, le surnageant et le précipité obtenus après précipitation d’une fraction plasmatique à l'hydroxyde d'aluminium et/ou une précipitation à basse température, et les éluats de chromatographies et les fractions non adsorbées des colonnes de chromatographie obtenus à partir d’une fraction plasmatique, d’un surnageant de culture cellulaire ou d’un lait d’animaux transgéniques,

a) passage de la composition obtenue en A) sur une chromatographie d’affinité, mixed-mode ou d’échange d’ions et élution en tampon comprenant de l’arginine b) au moins une étape de filtration de la composition de fibrinogène obtenue en a), sur filtre ayant une taille de pores comprise entre 0,08 pm et 0,22 pm,

c) filtration de la solution de fibrinogène obtenue en b), sur filtre symétrique ayant une taille de pores comprise entre 15 nm et 25 nm, et

d) récupération de la solution résultante de fibrinogène,

ledit procédé de filtration étant réalisé, sans ajout d’arginine après l’étape a), à capacité élevée et ladite composition de fibrinogène n’étant pas préalablement congelée et/ou décongelée.

[0080] De manière préférée, le procédé de filtration d’une composition de fibrinogène selon l’invention comprend les étapes suivantes:

A) obtention d’un surnageant de plasma cryoprécipité ou d’un cryoprécipité de plasma remis en suspension,

a) passage de la composition obtenue en A) sur une chromatographie d’affinité, de préférence une chromatographie d’affinité à ligands aptamères, et élution en tampon comprenant de l’arginine

b) au moins une étape de filtration de la composition de fibrinogène obtenue en a), sur filtre ayant une taille de pores comprise entre 0,08 pm et 0,22 pm,

c) filtration de la solution de fibrinogène obtenue en b), sur filtre symétrique ayant une taille de pores comprise entre 15 nm et 25 nm, et

d) récupération de la solution résultante de fibrinogène,

ledit procédé de filtration étant réalisé sans ajout d’arginine après l’étape a), à capacité élevée et ladite composition de fibrinogène n’étant pas préalablement congelée et/ou décongelée.

[0081] Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la solution de fibrinogène obtenue optionnellement en b) est passée sur filtre ayant des pores de diamètre compris entre 15 nm et 50 nm préalablement à l’étape c) : c’est l’étape b’).

[0082] De manière avantageuse, les filtres utilisés peuvent être définis par leur taille moyenne de pores en nm, par les virus retenus par le filtre, par un seuil de poids moléculaire ou par le type de symétrie de leur membrane. Les filtres utilisés peuvent donc être des filtres ou tout autre filtre équivalent commercialisé :

- définis par une taille moyenne de pores en nm, incluant les filtres de la gamme Planova®, constitués d’une membrane à fibres creuses formée de cellulose régénérée au cuprammonium et commercialisés par Asahi-Kasei (Planova® 15N, Planova® 20N), et ceux de la gamme Ultipor®, composés d’une membrane de polyfluorure de vinylidène modifié à la surface et sont commercialisés par Pall (Ultipor DV20, Pegasus SV4), ou tout autre filtre équivalent commercialisé ;

- dont la taille moyenne des pores est définie relativement aux virus retenus par le filtre. La taille moyenne des pores du filtre correspond alors à la taille du plus petit virus retenu par le filtre. De tels filtres, définis par les virus retenus par le filtre, incluent les filtres Planova BioEX en PVDF (rétention des parvovirus, membrane en polyvinylidène fluoride hydrophile modifié) commercialisés par la société Asahi Kasei Bioprocess, les filtres Pegasus SV4, ou Ultipor VF (rétention des parvovirus, membrane en polyvinylidène fluoride hydrophile modifié) commercialisés par Pall, les filtres Viresolve® NFP (rétention des parvorirus, membrane en polyfluorure de vinylidène modifié en surface), Viresolve Pro (rétention des parvorirus, membrane en polyéthersulfone double couche) et Viresolve® NFR (rétention des rétrovirus, membrane en polyéthersulfone) commercialisés par Millipore, et Virosart® CPV (rétention du parvovirus canin, membrane à double couche de polyéthersulfone), Virosart HC ou Virosart Fl F commercialisé par Sartorius, ou tout autre filtre équivalent commercialisé. Ces filtres, qui sont définis par les virus retenus, notamment les parvovirus, présentent une taille moyenne de pores d’environ 20 nm.

- définis par leur symétrie, par exemple

filtres asymétriques tels que les filtres de la gamme Planova®, commercialisés par Asahi-Kasei (Planova® 15N, Planova® 20N, Planova BioEx), Viresolve NFP et Viresolve Pro (commercialisés par Merck Millipore), Virosart HF (commercialisé par Sartorius Stedim).

filtres symétriques, tel que le filtre Pegasus SV4 ou Ultipor DV20 (commercialisés par Pall), le filtre Virosart CPV (commercialisé par Sartorius Stedim).

Une telle classification des filtres selon leur symétrie apparaît notamment dans Gustafsson et al., « Mille-feuille paper : a novel type of filter architecture for advanced virus séparation applications ». Materials Florizons 2016, 3, 320-337.

[0083] Par « filtre symétrique » selon l’invention on entend un filtre ayant une porosité équivalente entre la surface interne (en contact avec la solution à filtrer) et externe du filtre. [0084] Selon un mode particulier de mise en oeuvre du procédé, la nanofiltration de l’étape b’) est effectuée en utilisant des filtres ayant des pores de diamètre compris entre 25 nm et 50 nm, préférentiellement de 35 nm. De préférence, la nanofiltration de l’étape b’) est alors effectuée en utilisant le filtre Planova 35 N commercialisé par Asahi Kasei Bioprocess ou STyLUX par Meissner (40 nm).

[0085] Alternativement, la nanofiltration de l’étape b’) est effectuée en utilisant des filtres symétriques ayant des pores de diamètre compris entre 15 nm et 25 nm, préférentiellement de 20 nm. De préférence, la nanofiltration de l’étape b’) est alors effectuée en utilisant un filtre à membrane symétrique, tel que le filtre Pegasus SV4 ou Ultipor DV20 (commercialisés par Pall) ou Virosart CPV (commercialisé par Sartorius Stedim).

[0086] Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la nanofiltration de l’étape b’) et de l’étape c) est réalisée sur des filtres de porosité décroissante, avantageusement sur un filtre de porosité 35 nm suivi d’un filtre symétrique de porosité 20 nm. De préférence, la nanofiltration de l’étape b’) est alors effectuée en utilisant le filtre Planova 35 N commercialisé par Asahi Kasei Bioprocess puis un filtre à membrane symétrique, tel que le filtre Pegasus SV4 ou Ultipor DV20 (commercialisés par Pall) ou Virosart CPV (commercialisé par Sartorius Stedim).

[0087] Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, la nanofiltration de l’étape b’) et de l’étape c) est réalisée sur des filtres de même taille de pores, avantageusement sur 2 filtres identiques. De préférence, la nanofiltration de l’étape b’) est alors effectuée en utilisant un filtre à membrane symétrique, tel que le filtre Pegasus SV4 ou Ultipor DV20 (commercialisés par Pall) ou Virosart CPV (commercialisé par Sartorius Stedim).

[0088] La nanofiltration de l’étape b’) est typiquement réalisée à une pression comprise entre 200 et 4000 mbar. De manière avantageuse, la nanofiltration de l’étape b’) est typiquement réalisée à une pression comprise entre 200 et 1000 mbar, ou entre 2000 et 4000 mbar.

[0089] Ainsi, de préférence, l'invention concerne un procédé de filtration d’une composition de fibrinogène, comprenant les étapes suivantes:

a) purification par chromatographie de la composition de fibrinogène à l’aide d’un tampon d’élution comprenant de l’arginine :

b) au moins une étape de filtration de la composition de fibrinogène, sur filtre ayant une taille de pores comprise entre 0,08pm et 0,22pm, et récupération de la solution résultante de fibrinogène,

b’) filtration de la solution de fibrinogène obtenue en b), sur filtre ayant des pores de diamètre compris entre 15 nm et 50 nm,

c) filtration de la solution de fibrinogène obtenue en b’), sur filtre symétrique ayant une taille de pores comprise entre 15 nm et 25 nm, et

d) récupération de la solution résultante de fibrinogène.

ledit procédé de filtration étant réalisé sans ajout d’arginine après l’étape a), à capacité élevée et ladite composition de fibrinogène n’étant pas préalablement congelée et/ou décongelée.

[0090] A la fin de l’étape d), la solution obtenue comprend du fibrinogène, et est hautement sécurisée.

[0091] De manière particulièrement avantageuse, la mise en oeuvre de l’étape c) du procédé selon l’invention permet l’élimination d’au moins 2log, avantageusement d’au moins 3log, encore plus avantageusement au moins 4log, préférentiellement au moins 5 log ou au moins 6log de virus de petites tailles tel que le parvovirus B19.

[0092] De préférence, le procédé de filtration d’une composition de fibrinogène selon l’invention comprend les étapes suivantes:

A) obtention de la composition de fibrinogène, ladite composition de fibrinogène étant choisie parmi un surnageant de culture cellulaire, du lait d’animaux transgéniques, le surnageant de plasma cryoprécipité, le cryoprécipité de plasma remis en suspension, la fraction I obtenues par fractionnement éthanolique selon la méthode de Cohn ou de Kistler & Nitschmann, le surnageant et le précipité obtenus après précipitation d’une fraction plasmatique à l'hydroxyde d'aluminium et/ou une précipitation à basse température, et les éluats de chromatographies et les fractions non adsorbées des colonnes de chromatographie obtenus à partir d’une fraction plasmatique, d’un surnageant de culture cellulaire ou d’un lait d’animaux transgéniques,

a) passage de la composition obtenue en A) sur une chromatographie d’affinité, mixed-mode ou d’échange d’ions et élution en tampon comprenant de l’arginine, b) au moins une étape de filtration de la composition de fibrinogène obtenue en A), sur filtre ayant une taille de pores comprise entre 0,08 pm et 0,22 pm,

b’) filtration de la solution de fibrinogène obtenue en b), sur filtre ayant des pores de diamètre compris entre 15 nm et 50 nm,

c) filtration de la solution de fibrinogène obtenue en b’), sur filtre symétrique ayant une taille de pores comprise entre 15 nm et 25 nm, et

d) récupération de la solution résultante de fibrinogène,

ledit procédé de filtration étant réalisé sans ajout d’arginine après l’étape a), à capacité élevée et ladite composition de fibrinogène n’étant pas préalablement congelée et/ou décongelée.

[0093] De manière préférée, le procédé de filtration d’une composition de fibrinogène selon l’invention comprend les étapes suivantes:

A) obtention d’un surnageant de plasma cryoprécipité ou d’un cryoprécipité de plasma remis en suspension,

a) passage de la composition obtenue en A) sur une chromatographie d’affinité, de préférence une chromatographie d’affinité à ligands aptamères, et élution en tampon comprenant de l’arginine

b) au moins une étape de filtration de la composition de fibrinogène obtenue en a), sur filtre ayant une taille de pores comprise entre 0,08 pm et 0,22 pm,

c) filtration de la solution de fibrinogène obtenue en b), sur filtre symétrique ayant une taille de pores comprise entre 15 nm et 25 nm, et

d) récupération de la solution résultante de fibrinogène,

ledit procédé de filtration étant réalisé sans ajout d’arginine après l’étape a), à capacité élevée et ladite composition de fibrinogène n’étant pas préalablement congelée et/ou décongelée.

[0094] La solution obtenue à l’étape d) peut ensuite être concentrée, par exemple par ultrafiltration, jusqu'à des teneurs typiquement comprises entre 10 et 40, préférentiellement entre 15 et 25 g de protéines totales/l, déterminées par des mesures classiques connues de l'homme du métier.

[0095] En outre, la solution de fibrinogène obtenue, éventuellement concentrée, peut être soumise à une étape de diafiltration. Cette étape est destinée à éliminer l'excès éventuel de sel inorganique utilisé pour obtenir des solutions ayant une force ionique d'au plus 0,2 M. Cette étape peut également se révéler nécessaire afin de formuler le fibrinogène dans des conditions optimales. Le tampon est avantageusement adapté soit pour une conservation de la composition de fibrinogène sous forme liquide (formulation liquide prête à l’emploi) soit pour une conservation sous forme lyophilisée (formulation adaptée à la préservation lors de l’étape de lyophilisation et éventuellement à l’étape de chauffage à sec). Cela permet dans ce cas d'une part, un chauffage à sec du fibrinogène sans risque de dénaturation, et, d'autre part, une solubilisation rapide lorsque le fibrinogène est lyophilisé par la suite, typiquement en 3 à 8 minutes.

[0096] Les solutions respectives, éventuellement diafiltrées, éventuellement concentrées, peuvent être éventuellement lyophilisées selon des méthodes classiques et conditions habituelles. Les lyophilisats peuvent ensuite être reconstitués dans un milieu aqueux compatible avec un usage clinique, de préférence dans de l'eau purifiée pour injection (PPI), et directement injectés par voie intraveineuse.

[0097] Il peut en outre être prévu au moins une étape additionnelle d'élimination ou d'inactivation d'au moins un agent infectieux et des contaminants, comme les virus, les bactéries ou les ATNC (agents transmissibles non conventionnels) comme le prion.

[0098] Une inactivation virale comprend souvent un traitement avec des produits chimiques, par exemple par solvant et/ou détergent et/ou par la chaleur (pasteurisation et/ou chauffage à sec) et/ou par irradiation (rayons gamma et/ou UVC) Cette étape peut être effectuée par un traitement chimique classique d'inactivation virale, de préférence consistant en un traitement par solvant- détergent (appelé généralement traitement S/D). Les agents chimiques d'inactivation virale sont préférentiellement les mélanges de polysorbate et de Tri(n-butyl)phosphate (TnBP), ou les mélanges de Triton (octoxynol) et de TnBP, dont les concentrations typiques sont comprises entre 0,1 et 2% . Cette inactivation virale peut être intégrée à un stade quelconque du procédé, mais elle est judicieusement mise en oeuvre avant l'étape a) de purification chromatographique. De cette façon, celle-ci contribuera à l'élimination efficace des agents d'inactivation. [0099] Alternativement, on peut utiliser une étape additionnelle de traitement thermique d'inactivation virale à sec, effectuée sur les lyophilisats de fibrinogène obtenus après l'étape de lyophilisation. Les conditions opératoires sont classiquement d’environ 80°C pendant 72 heures.

[0100] L’élimination des agents infectieux peut également être réalisée au moyen d’une filtration en profondeur. Les filtres disponibles sont par exemple des filtres composés de cellulose régénérée, dans lesquels des adjuvants de filtration peuvent avoir été additionnés, tels que la cellite, la perlite ou des terres de Kieselguhr. De tels filtres sont notamment commercialisés par Cuno (filtres Zeta+ VR sériés), Pall-Seitz (P-series Depth Filter) ou Sartorius Sartoclear P depth filters).

[0101] Ainsi, la mise en oeuvre du procédé conduit à des solutions de fibrinogène hautement sécurisées, exempte de particules virales et/ou de contaminants de type ATNC.

[0102] L’invention a donc pour objet une solution de fibrinogène susceptible d’être obtenue par le procédé décrit ci-dessus.

[0103] La solution de fibrinogène susceptible d’être obtenue par le procédé décrit ci-dessus présente avantageusement une pureté supérieure ou égale à 95% et est avantageusement stable sans addition de protéine stabilisante telle que l’albumine.

[0104] La solution de fibrinogène susceptible d’être obtenue par le procédé décrit ci-dessus présente avantageusement une activité fibrinogène intègre avec en particulier un ratio fibrinogène coagulable / fibrinogène antigénique > 0,9, voire égal à 1 ,0.

[0105] Les exemples qui suivent illustrent un mode de réalisation de la présente invention sans toutefois en limiter la portée.

[0106]

Exemples

[0107] Exemple 1 : Evaluation de la filtration du fibrinogène sur filtre symétrique 20 nm selon l’invention

[0108] La composition comprenant du fibrinogène prépurifié est obtenue selon la méthode décrite dans la demande EP1739093. [0109] I - Objectifs

Evaluer la filtrabilité d’une composition comprenant du fibrinogène sur un filtre symétrique de nanofiltration de taille de pores d’environ 20nm.

[0110] Il - Paramètres opératoires

Séquence de filtration

- Filtre 0,2 - 0,1 pm polyéthersulfone (PES)

- Filtre symétrique 20 nm Pégasus SV4 de la société Pall Life Sciences, surface 0,00096 m ² (Pegasus VF SV4, 10MCFSV4, surface 9,6 cm ² ).

La solution comprenant le fibrinogène est concentrée à 3g/L et pure à plus de 90%

[0111] [Tableau 1 ]

[0112] III - Résultats

[0113] La pression de filtration a été maintenue constante à 2,1 Bar sur le filtre 20 nm durant toute la filtration.

[0114] La séquence de filtration est équilibrée en tampon d’élution de la chromatographie échangeuse d’ions décrite dans le brevet EP1739093 comprenant de l’arginine. Le profil de colmatage du fibrinogène sur le filtre de taille de pores 20 nm est linéaire avec une décroissance proportionnelle au volume filtré jusqu’à 181 L/m ² .

[0115] Après 10 heures 15 minutes de filtration correspondant à une utilisation optimale du filtre, un poids de 178 g de solution a été collecté ; à ce stade, le ratio du débit de filtration / débit initial est de 19%. Le débit moyen de filtration calculé de 0,3 g/min correspond à environ 17 L/h/m ² de membrane. [0116] IV - Tableau récapitulatif des résultats

[0117] [Tableau 2]

[0118] La séquence de filtration appliquée a permis de filtrer une quantité équivalente à 0,5kg de fibrinogène par m ² de membrane de taille de pores 20 nm en 6 heures. Des filtrabilités plus importantes auraient pu être atteintes en prolongeant la durée de filtration.

[0119] Grâce au procédé selon l’invention, le rendement de cette nanofiltration est supérieur à 90%.

[0120] Le procédé selon l’invention permet donc la filtrabilité, sur filtre symétrique de taille de pores d’environ 20 nm, d’une composition comprenant du fibrinogène sans étape de congélation/décongélation préalable, ni dilution préalable à partir d’une solution de fibrinogène pré-purifié par chromatographie et éluée par tampon comprenant de l’arginine.

[0121] Exemple 2 : Evaluation de la filtration du fibrinogène sur filtre symétrique 20 nm Pâli DV 20 selon l’invention

[0122] La composition comprenant du fibrinogène prépurifié est obtenue selon la méthode décrite dans la demande EP1739093.

[0123] I - Objectifs

Evaluer la filtrabilité d’une composition comprenant du fibrinogène sur un filtre symétrique de nanofiltration de taille de pores d’environ 20nm. [0124] Il - Paramètres opératoires

Séquence de filtration

- Filtre 0,2 - 0,1 pm polyéthersulfone (PES)

- Filtre symétrique 20 nm ULTIPOR VF DV20 de la société Pâli Life Sciences, surface 0,00106 m ² .

[0125] La solution comprenant le fibrinogène est concentrée à 3,1 g/L et pure à plus de 90%

[0126] [Tableau 3]

[0127] III - Résultats

[0128] La pression de filtration a été maintenue constante à 2,0 Bar sur le filtre 20 nm durant toute la filtration.

[0129] La séquence de filtration est équilibrée en tampon d’élution de la chromatographie échangeuse d’ions décrite dans le brevet EP1739093 comprenant de l’arginine. Le profil de colmatage du fibrinogène sur le filtre de taille de pores 20 nm est linéaire avec une décroissance proportionnelle au volume filtré jusqu’à 136 L/m ² .

[0130] Après 16 heures 30 minutes de filtration correspondant à une utilisation optimale du filtre, un poids de 154,7 g de solution a été collecté ; à ce stade, le ratio du débit de filtration / débit initial est de 27%. Le débit moyen de filtration calculé de 0,1 g/min correspond à environ 9 L/h/m ² de membrane.

[0131] IV - Tableau récapitulatif des résultats [0132] [Tableau 4]

[0133] La séquence de filtration appliquée a permis de filtrer une quantité équivalente à 0,4 kg de fibrinogène par m ² de membrane de taille de pores 20 nm en 15 heures. Des filtrabilités plus importantes auraient pu être atteintes en prolongeant la durée de filtration.

[0134] Exemple 3 : Evaluation de la filtration du fibrinogène sur filtre symétrique 20 nm selon l’invention avec préfiltration 20-50 nm

[0135] La composition comprenant du fibrinogène prépurifié est obtenue selon la méthode décrite dans la demande EP1739093.

[0136] I - Objectifs

Evaluer la filtrabilité d’une composition comprenant du fibrinogène sur un filtre symétrique de nanofiltration de taille de pores d’environ 20nm.

[0137] Il - Paramètres opératoires

Séquence de filtration

- Filtre 0,2 - 0,1 pm polyéthersulfone (PES)

- Filtre 35 nm (Planova 35N d’Asahi)

- Filtre symétrique 20 nm Pégasus SV4 de la société Pall Life Sciences, surface 0,00096 m ² (Pegasus VF SV4, 10MCFSV4, surface 9,6 cm ² ).

[0138] La solution comprenant le fibrinogène est concentrée à 3g/L et pure à plus de 90%

[0139] [Tableau 5]

[0140] III - Résultats

[0141] La pression de filtration a été maintenue constante à 2,1 Bar sur le filtre 20 nm durant toute la filtration.

[0142] La séquence de filtration est équilibrée en tampon d’élution de la chromatographie échangeuse d’ions décrite dans le brevet EP1739093. Le profil de colmatage du fibrinogène sur le filtre de taille de pores 20 nm est linéaire avec une décroissance proportionnelle au volume filtré jusqu’à 276 L/m ² .

[0143] Après 18 heures de filtration correspondant à une utilisation optimale du filtre, un poids de 264,8 g de solution a été collecté ; à ce stade, le ratio du débit de filtration / débit initial est de 14%. Le débit moyen de filtration calculé de 0,3 g/min correspond à environ 15 L/h/m ² de membrane.

[0144] IV - Tableau récapitulatif des résultats

[0145] [Tableau 6]

[0146] La séquence de filtration appliquée a permis de filtrer une quantité équivalente à 0,8 kg de fibrinogène par m ² de membrane de taille de pores 20 nm en 18 heures.

[0147] Grâce au procédé selon l’invention, le rendement de cette nanofiltration est supérieur à 90%.

[0148] Le procédé selon l’invention permet donc la filtrabilité, sur filtre symétrique de taille de pores d’environ 20 nm, d’une composition comprenant du fibrinogène sans étape de congélation/décongélation préalable, ni dilution préalable à partir d’une solution de fibrinogène pré-purifié par chromatographie et éluée par tampon comprenant de l’arginine.

[0149] Exemple 4 : Comparaison du procédé selon l’invention avec un procédé de l’art antérieur sur filtre asymétrique d’environ 20nm

[0150] I - Objectifs

Comparer le niveau de capacité de fibrinogène par m2 de membrane pouvant être supportée par le procédé selon l’invention et un procédé de l’art antérieur sur filtre asymétrique d’environ 20nm.

[0151] Il - Préparation de la matière première :

La composition comprenant du fibrinogène pré-purifié est obtenue selon la méthode décrite dans la demande EP1739093. L’éluat de chromatographie obtenu selon EP1739093 est élué en tampon comprenant 200 mM d’arginine.

[0152] III - Préparation du tampon d’équilibrage du filtre

Il s’agit du même tampon d’élution que celui utilisé pour la préparation de l’éluât de départ (Tp E DEAE Macroprep, ajusté à pH 7,5 ± 0,1 par acide citrique 1 M).

[0153] IV - Séquence de filtration :

1. Préfiltration :

La composition de fibrinogène est préfiltrée à l’aide d’un filtre PES (Polyéther sulfone) modèle Sartopore 2 de porosité 0,2 - 0,1 pm (100 nm).

2. Filtration :

Selon la condition opératoire testée la composition préfiltrée est alors filtrée :

à l’aide d’un filtre Pegasus SV4 (commercialisé par la société Pall Life Sciences) à 2100 ± 100 mbar, ou bien

à l’aide d’un filtre Planova 20N (commercialisé par la société Asahi) à 395 ± 23 mbar.

[0154] V - Résultats

Les résultats obtenus ont été compilés dans le graphique tel que représenté à la Figure 1 .

[0155] Pour les deux procédés, on observe que plus le débit (en L/h/m2) appliqué est faible et plus la capacité en fibrinogène supportée (en g de fibrinogène par m2 de membrane) augmente. [0156] Cependant on observe que la capacité de fibrinogène supportée par le procédé de l’art antérieur (« procédé antérieur » dans le graphique ci-après) faisant ici appel à un filtre asymétrique Planova 20N d’Asahi est bien inférieure à celle supportée par le procédé selon l’invention (« procédé invention » dans le graphique ci-après), mettant ici en oeuvre un filtre symétrique Pegasus SV4 de Pall Life Sciences.

[0157] Ainsi ces résultats illustrent que l’application du procédé de l’art antérieur sur un filtre asymétrique ne permet pas d’obtenir une capacité de filtration de 200 g/m ² de membrane, avec notamment une capacité de fibrinogène de 55 g/m2 obtenue sur membrane Planova 20N Asahi. [0158] Exemple 5 : Comparaison du procédé selon l’invention sur filtre symétrique avec les procédés de l’art antérieur sur filtre asymétrique

[0159] Dans les mêmes conditions que l’exemple 4, différents filtres asymétriques des procédés de l’art antérieur sont testés en comparaison avec le procédé selon l’invention. [0160] Les résultats sont les suivants :

[0161] [Tableau 7]

[0162] Les nanofiltres asymétriques testés sur une solution de fibrinogène prépurifiée par chromatographie ayant une concentration d’au moins 2 g/L montrent des filtrabilités inférieures à 0.1 Kg de fibrinogène par m ² tandis que le procédé selon l’invention sur filtre symétrique permet d’atteindre une filtrabilité supérieure à 0,2 Kg de fibrinogène par m ² .

[0163] Exemple 6 : Evaluation de la réduction virale

[0164] I - Objectif :

Evaluer la réduction virale obtenue à l’aide du procédé selon l’invention.

[0165] Il - Préparation de la matière première :

La composition comprenant du fibrinogène pré-purifié est obtenue selon la méthode décrite dans la demande EP1739093. [0166] III - Préparation du tampon d’équilibrage du filtre :

Il s’agit du même tampon d’élution que celui utilisé pour la préparation de l’éluât de départ (Tp E DEAE Macroprep, ajusté à pH 7,5 ± 0,1 par acide citrique 1 M).

[0167] IV - Séquence de filtration :

La composition de fibrinogène est préfiltrée à l’aide d’un filtre PES (Polyéther sulfone) modèle Minisart High flow de porosité 0,2 - 0,1 pm (100 nm).

La nanofiltration est réalisée sur le filtre Pegasus SV4 de Pall Life Sciences à une pression de 2,1 +/- 0,1 bar.

La charge virale est mesurée est produite à l’aide du produit PPV Ultrapure Gold 1 % (v/v).

Un échantillon est prélevé dans la fraction nanofiltrée après la filtration de 79,2 L/m ² de solution (volume chargé).

On observe un colmatage complet du filtre après filtration de 85,5 L chargés par m ² de membrane.

V - Résultats

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-après.

Ces résultats montrent que pour des capacités de fibrinogène de 250 g/m ² de membrane la réduction virale mesurée est de 3,78 (+/- 0,56) log10.

[0168] VI - Tableau récapitulatif des résultats

[0169] Exemple 7 : Evaluation de la capacité de filtration du fibrinogène sur filtre symétrique 20 nm en fonction de concentrations croissantes en arginine dans le tampon d’élution de l’étape de chromatographie

[0170] I - Objectifs

Evaluer la capacité de filtration du fibrinogène avec des concentrations croissantes en arginine ajoutées dans le tampon d’élution de l’étape de chromatographie préalable à la séquence de filtration. [0171] Il - Paramètres opératoires

[0172] Les compositions de fibrinogène testées sont prépurifiées par chromatographie d’affinité selon la méthode décrite dans la demande EP1739093, en utilisant un tampon d’élution comprenant 50 mM de citrate de sodium et des concentrations croissantes en arginine HCL (150mM, 200 mM, 400 mM)

[0173] Une séquence de filtration telle que décrite dans l’exemple 1 est ensuite réalisée sur l’éluat en vue d’étudier le profil de colmatage du fibrinogène sur le nanofiltre de porosité 20 nm.

[0174] III- Résultat :

[0175] Les résultats sont présentés dans le tableau ci-après

[0176] De façon inattendue, une composition éluée en chromatographie en tampon comprenant des concentrations croissantes en arginine, sans ajout supplémentaire d’arginine avant l’étape de nanofiltration, permet une augmentation de la capacité de nanofiltration 20 nm du fibrinogène.

[0177] Ainsi et avantageusement, des concentrations croissantes d’arginine dans le tampon d’élution selon l’invention n’induisent pas de colmatage du filtre et permettent d’augmenter la capacité de nanofiltration du procédé, et ce, sans ajout d’arginine après l’étape de purification par chromatographie. .