本発明者は、上記課題を解決するべく鋭� ��研究する最中、二次加工食品の製造原料か� ��常法にて切片を作製し、該切片を蛍光染色� ��にて染色した後、励起光を照射し、次いで� ��定の蛍光波長からなる観察光を複数組合わ� ��て構成される観察光を用いて染色標本(標本 ということがある)を観察した結果、または� �得られた情報をもとにして常法により画像� �形成させると、その画像は極めて鮮明な画� �であるという、驚くべき知見を得た。ここ� �特定の蛍光染色剤を用いるとより鮮明な画� �が得られるという知見も得た。さらに研究� �進め薄片化処理前の試料の不凍水含量が一� �値以下となるように調整した状態で薄片化� �理を施した試料について上記知見を適用す� �と、よりいっそう鮮明な画像が得られると� �う手法を得た。これら知見に基づき鋭意研� �を重ね、遂に本発明を完成させた。

 すなわち、特許請求の範囲の請求項1の発 明は、トリフェニルメタン骨格を有する蛍光 染色剤で染色した加工食品または加工食品の 製造原料を光励起した後、光励起した染色物 についての少なくとも三種の観察光による情 報、すなわち蛍光波長が380nm以上450nm未満の� �察光Aでの情報、蛍光波長が450nm以上560nm未満 の観察光Bでの情報、および蛍光波長がnm以上 700nm以下の観察光Cでの情報を得、ついでそれ ら情報に基づき画像を創製することを特徴と する加工食品または加工食品の製造原料の組 織構造を表す画像の形成方法である。なお、 上記少なくとも三種の観察光による情報をほ ぼ同時に観察すること、または、個別に得た 情報に基づき画像を創製することを特徴とす る加工食品または加工食品の製造原料の組織 構造を表す画像の形成方法でもある。 ここ� ��いう観察光とは、加工食品または加工食品� ��製造原料の組織構造を表す画像を形成する� ��報を収集するために用いる光をいう。本発� ��では、前記三種の観察光のほかに、さらに� ��異なる蛍光波長からなる観察光を併用する� ��とができる。併用する観察光の蛍光波長は� ��いろいろな種類があるのでまとめて説明す� ��ことが困難であるが、380nm以上700nm以下から 外れる蛍光波長でもよいし、上記380nm以上700n m以下の蛍光波長でもよい。

 請求項2の発明は、上記請求項1の発明にお� �て、加工食品または加工食品の製造原料に� �起光を照射する前の切片の不凍水含量を30重 量%以下に調整した状態で薄片化処理を施す� �とを特徴とする。より具体的には、組織構� �を表す画像を形成させようとする加工食品� �たは加工食品の製造原料を凍結することに� �り固定することで不凍水含量を30重量%以下� �調整した後、ミクロトームヤクライオスタ� �ト等により薄片化した後、蛍光染色剤で染� �する。ここでいう不凍水とは、加工食品ま� �は加工食品の製造原料を冷凍させた状態で� �、その加工食品中または加工食品の製造原� �中では凍結しない水を意味する。
 請求項3の発明は、上記請求項1または2の発� ��において、加工食品が穀類の二次加工食品� ��あり、加工食品の製造原料が穀類または穀� ��の二次加工食品の製造過程における一次加� ��食品処理物であることを特徴とする。

 請求項4の発明は、下記一般式1で表される� �光染色剤からなることを特徴とすると加工� �品または加工食品の製造原料の組織構造を� �す画像形成用蛍光染色剤である。この蛍光� �色剤を単独で使用してもよいが、混合物と� �て使用してもよい。
式1
(式中、R ₁ およびR ₂ はNH ₂ 、NHY、NY ¹ Y ² 、またはOHを示し、R ₃ はO、NH ₂ 、NHY、またはNY ¹ Y ² を示し、R ₄ 、R ₅ 、R ₆ 、R ₇ 、R ₈ 、およびR ₉ はH、C _n H _2n+1 、SO ₃ X、およびCOOXから選ばれる一つを示し、XはH� �たはアルカリ金属原子を示し、Y、Y ¹ 、およびY ² は炭素数が1から3のアルキル基または置換基� ��有してもよいフェニル基を示し、nは1~3の整 数である。)また、本発明は、上記請求項4で� ��載された蛍光染色剤からなることを特徴と� ��る加工食品または加工食品の製造原料の澱� ��、および蛋白質の組織構造可視化用、また� ��加工食品または加工食品の製造原料の澱粉� ��蛋白質、および脂肪の組織構造可視化用蛍� ��染色剤の発明でもある。

 以下、本発明を詳細に説明する。
 本発明でいう加工食品はいろいろな手段・� ��法を用いて食品原材料を処理加工した物で� ��れば特に制限されないのであるが、例えば� ��次加工食品、二次加工食品が挙げられ、特� ��二次加工食品が好ましい。一次加工食品の� ��体例としては、小麦粉、デュラム粉、ソル� ��ム粉、精麦、大麦粉、オーツ麦粉、ライ麦� ��、トウモロコシ粉、ヒエ粉、アワ粉、キビ� ��、穀類由来の澱粉、穀類由来のタンパク質� ��の穀類の一次加工食品が挙げられる。それ� ��一次加工食品にいろいろな手段・方法を適� ��して得られる二次加工食品の具体例として� ��、各種パン類、うどん、冷麦、そうめん等� ��麺類、菓子類、麩類、パスタ類、揚げ物類� ��焼き物類、蒸し物類等の穀類の二次加工食� ��が挙げられる。
 本発明でいう加工食品の製造原料としては� ��食品原材料が挙げられ、特に穀類が好まし� ��が、そのほか、二次加工食品の製造過程に� ��ける一次加工食品処理物が挙げられ、例え� ��、パン類の製造生地、茹で麺類製造用麺線� ��麩類製造用としての生地から揉み出した湿� ��(ウエットグルテン)、ビスケット等の食品� �造生地等が好適である。ここで、二次加工� �品の製造過程はすでに公知の製造過程を採� �することができる。

 本発明でいう加工食品または加工食品の� ��造原料の組織構造については、数多くの研� ��者が盛んに研究し、数多くの報告がある。� ��発明の組織構造画像はそれら報告された組� ��構造を含む加工食品または加工食品の製造� ��料の組織構造を表す画像を意味する。本発� ��は、特に穀類の二次加工食品、あるいはそ� ��二次加工食品の製造原料である穀類、また� ��穀類の二次加工食品の製造過程における一� ��加工食品処理物の組織構造画像に関する。� ��織構造の具体例としては、二次加工食品の� ��造原料の一つであるパン生地においては、� ��ン生地を構成する澱粉粒とグルテン蛋白質� ��の存在形態、あるいは澱粉粒とグルテン蛋� ��質と脂肪の存在形態が挙げられる。さらに� ��覚や食感に大きな影響を与える澱粉粒とグ� ��テン蛋白質とが絡み合う存在形態を前記組� ��構造の具体例ということもできる。なお、� ��発明での加工食品または加工食品の製造原� ��の組織構造は、上記具体例に何ら限定され� ��い。

 本発明では、前記加工食品または加工食品� ��製造原料から切片を調製し、次いでその切� ��本を蛍光染色剤で染色し、染色標本を得る� ��切片を調製する際、固定法は幾つもの方法� ��知られているが特に制限されない。この際� ��加工食品または加工食品の製造原料を固定� ��ることで不凍水含量を30重量%以下に調整し� ��後、ミクロトームやクライオスタットなど� ��より薄片化することが重要である。
 また、切片を得るための固定方法では、加� ��食品または加工食品の製造原料を冷凍保持� ��ることが好ましい。冷凍状態で保持された� ��工食品または加工食品の製造原料は適度に� ��く、適度な粘弾性を有し、それから得た切� ��あるいは標本は、その表面が平滑であり、� ��部組織を表す画像を得るという点で特に好� ��しい結果をもたらすことが出来る。
 加工食品または加工食品の製造原料を急速� ��凍処理することが好ましい。前記冷凍温度� ��特に制限されないのであるが、-18℃以下に� ��定すると、好ましい結果を得ることができ� ��が、-22℃以下に設定すると、より好ましい� ��果を得ることができる。
 その切片の調製法は特に制限されない。例� ��ば、凍結固定法、浸漬固定法、あるいはマ� ��クロウェーブ処理固定法を用いて切片を調� ��できる。例えば凍結固定法について説明す� ��。前記加工食品または加工食品の製造原料� ��らの試料をミクロトームの冷却ステージ上� ��凍結固定する。次いで凍結固定した試料を� ��定の厚みで切り出す。切り出した切片をプ� ��パラート上に載せてヒーターで乾固させ固� ��する。
 その他の調製法としてマイクロウェーブ処� ��固定法が挙げられるが、これは食品を例え� ��グルタルアルデヒド溶液に12~24時間浸漬さ� �、マイクロウェーブを10~60秒間照射し固定す る方法である。

 上記切片をトリフェニルメタン骨格を有す� ��蛍光染色剤で染色することが、本発明の幾� ��かある特徴のうちの一つである。前記トリ� ��ェニルメタン骨格を有する蛍光染色剤にお� ��るトリフェニルメタン骨格は次のような一� ��式で記載することができる。しかし、下記� ��般式に限定されないのであって、トリフェ� ��ルメタン骨格を有する蛍光染色剤であれば� ��どのような表記法を採用したかに左右され� ��に本発明では使用可能である。
 式2
    R ¹¹
    |
   -C-R ²¹         
    |
    R ³¹          または
 
 
 
 
  
式3
    R ¹²
    |
    C=R ²²   
    |
    R ³²
 (式中、R ¹¹ 、R ²¹ 、R ³¹ 、R ¹² 、R ²² 、R ³² は、NH ₂ 、NHY、NY ¹ Y ² 、OH、O、C _n H _2n+1 、SO ₃ X、およびCOOXから選ばれる基で置換されてい� ��もよいフェニル基を示し、XはHまたはアル� �リ金属原子を示し、Y、Y ¹ 、およびY ² は炭素数が1から3のアルキル基または置換基� ��有してもよいフェニル基を示し、nは1~3の整 数である。ここで、置換基としては、SO ₃ X、COOX、ハロゲン原子等が挙げられる。)

 好ましいトリフェニルメタン骨格を有する� ��光染色剤としては、下記一般式1で表される 蛍光染色剤がある。
式1
(式中、R ₁ およびR ₂ はNH ₂ 、NHY、NY ¹ Y ² 、またはOHを示し、R ₃ はO、NH ₂ 、NHY、またはNY ¹ Y ² を示し、R ₄ 、R ₅ 、R ₆ 、R ₇ 、R ₈ 、およびR ₉ はH、C _n H _2n+1 、SO ₃ X、およびCOOXから選ばれる一つを示し、XはH� �たはアルカリ金属原子を示し、Y、Y ¹ 、およびY ² は炭素数が1から3のアルキル基または置換基� ��有してもよいフェニル基を示し、nは1~3の整 数である。ここで、置換基としては、SO ₃ X、COOX、ハロゲン原子等が挙げられる。)
 上記式中、Xのアルカリ金属原子としてはナ トリウム原子またはカリウム原子が好ましく 、nは1が好ましい。また、前記R ₃ がNH ₂ のときには、R ₄ 、R ₅ 、R ₆ 、R ₇ 、R ₈ 、およびR ₉ のいずれかがSO ₃ ^- またはCOO ^- であり、染色剤は電気的に中性となるように 表記することもできる。なお、前記染色剤は トリフェニルメタン骨格を有する蛍光染色剤 として知られている染色剤であり、その化学 構造を示す表記法として、複数の表記法が知 られており、どの表記法を用いるかにより、 前記染色剤が異なる表記となることがある。 本発明は、それらの表記法により示されるト リフェニルメタン骨格を有する蛍光染色剤も 含む。

 これらの中では、とくに式1で表される化合 物においてR ₁ 、R ₂ 、およびR ₃ がNH ₂ であり、R ₄ 、R ₅ 、R ₆ 、R ₇ 、R ₈ 、およびR ₉ は上記と同じである化合物(以下、化合物Aと� ��う)、またはR ₁ およびR ₂ がOHで、R ₃ がOであり、R ₄ 、R ₅ 、R ₆ 、R ₇ 、R ₈ 、およびR ₉ は上記と同じである化合物(以下、化合物Bと� ��う)が好ましい。
 それらの化合物Aの中では、とくに、R ₁ 、R ₂ 、およびR ₃ がNH ₂ であり、R ₄ 、R ₅ 、R ₆ 、R ₇ 、R ₈ 、およびR ₉ はH、CH ₃ 、SO ₃ Naから選ばれる一つである化合物(以下、化合 物AAという)、またはR ₁ およびR ₂ がOHで、R ₃ がOであり、R ₄ 、R ₅ 、R ₆ 、R ₇ 、R ₈ 、およびR ₉ はH、CH ₃ 、COONaから選ばれる一つである化合物(以下、 化合物BBという)が好ましい。

 それらの化合物AAに属する具体的な化合物� �しては、R ₁ 、R ₂ 、およびR ₃ がNH ₂ であり、R ₆ がCH ₃ であり、R ₄ 、R ₅ 、R ₇ 、R ₈ 、およびR ₉ がHである化合物(ローズアニリン)、R ₁ 、R ₂ 、およびR ₃ がNH ₂ であり、R ₅ およびR ₆ がCH ₃ であり、R ₄ 、R ₇ 、R ₈ 、およびR ₉ がHである化合物(マゼンタII)、R ₁ 、R ₂ 、およびR ₃ がNH ₂ であり、R ₅ 、R ₆ 、およびR ₈ がCH ₃ であり、R ₄ 、R ₇ 、およびR ₉ がHである化合物(ニューフクシン)、R ₁ 、R ₂ 、およびR ₃ がNH ₂ であり、R ₄ 、R ₆ 、およびR ₉ がSO ₃ Na、R ₅ がCH ₃ 、R ₇ およびR ₈ がHである化合物(酸性フクシン)、およびR ₁ 、R ₂ 、およびR ₃ がNH ₂ であり、R ₄ 、R ₅ 、R ₆ 、R ₇ 、R ₈ 、およびR ₉ がHである化合物(パラローズアニリン)を例示 でき、化合物BBに属する具体的な化合物とし� ��は、R ₁ およびR ₂ がOHで、R ₃ がOであり、R ₄ 、R ₆ 、およびR ₈ がCOONaであり、R ₅ 、R ₇ 、およびR ₉ はHである化合物(アルミノン)を例示できが、 本発明ではそれらに限定されることはない。
 本発明は上記蛍光染色剤単独あるいは複数� ��染色剤を用いてもよい。さらに、鮮明な画� ��を形成することが出来る範囲で、他の蛍光� ��色剤あるいは非蛍光染色剤を併用してもよ� ��。

 前記染色溶液の調製法は上記蛍光染色剤� ��用いる限り、特に制限されないのであり、� ��えば、公知の溶媒を用いて通常使用される� ��度の蛍光染色剤溶液を調整し、上記試料を� ��色処理する。そのときの染色処理条件は特� ��制限されない。具体的な例としては、上記� ��片に蛍光染色剤溶液を一定時間(例えば1~30� �間、長い場合で1~3時間)反応させた後乾燥す� ��。乾燥した試料切片を軟質のカナダバルサ� ��で封入することによって、組織標本を得る� ��とができる。この方法は一例を説明するの� ��あって、この条件に本発明が何ら限定され� ��ものではない。

 かくして得られた染色標本に励起光を照射� ��るのであるが、本発明では、加工食品また� ��加工食品の製造原料、あるいは標本を冷凍� ��度に保持し、しかも標本の不凍水含量を30� �量%以下に調製することが好ましい。さらに� ��冷凍温度を-18℃以下に設定し、不凍水含量� ��25重量%以下に調製することが好ましく、冷� ��温度を-22℃以下に設定し、不凍水含量を20� �量%以下に調製することがより好ましい。こ� ��ように不凍水含量を設定すると、後に得ら� ��る組織画像がより鮮明となるのであり、極� ��て有利である。
 なお、前記不凍水とは加工食品または加工� ��品の製造原料を0℃以下に保持したときの、 加工食品または加工食品の製造原料内に存在 する自由に動き回ることができる水を意味す る。本発明でいう不凍水は、緩和時間T2が30μ s以上の運動性を持った状態の水をいい、凍� �水では30μs以下の運動性の状態の水をいう。 前記不凍水含量はいろいろな方法によって測 定することができる。本発明では、不凍水含 量を核磁気共鳴法、その中でもパルスNMR法に より測定する。より具体的に不凍水含量の測 定方法を説明すると、1H(プロトン)緩和時間T2 、1H(プロトン)存在比に関してJNM-MU25(日本電� �社製)を用いて、ソリッドエコー法(90°-τ-90° -τパルス)により、不凍水含量を測定できる� �

 前記標本に励起光を照射するのであるが、� ��ず、励起光としては、水銀ランプ(100V)、水� ��ランプ(200V)、キセノンランプ(75V)、キセノ� �ランプ(150V)、ハロゲンランプ(12V100W)、タン� �ステンランプ(6V30W)などが使用可能であるが� ��それ以外にも、キセノンランプ[波長250~1,000 nm]、タングステンランプ[波長250~1,000nm]、Cr:Li SAFランプ[波長430nm]、ヘリウム-カドミニウム� ��ーザー[波長325、442nm]、UVアルゴンレーザー[ 波長351、364nm]、アルゴンイオンレーザー[波� �488、514nm]、Nd:YAGレーザー[波長532nm]、ヘリウ� ��ネオンレーザー[波長543、594、633nm]、クリプ トンイオンレーザー[波長568、647nm]などの励� �光源が用いられる。それらの中では、とく� �UVアルゴンレーザー[波長351、364nm]など420nm以 下の励起波長であることが好ましい。
 励起光処理するときには、フィルター内に� ��起光線を透過させて、励起光の波長を揃え� ��おくことが好ましい。用いるフィルターと� ��ては励起フィルター[330~385nm]が挙げられる� �
 励起光線を照射する時間、照射量などの照� ��条件は、使用する蛍光染色剤の種類、用い� ��溶液の溶媒や蛍光染色剤の濃度などによっ� ��変動するのであり、一概に規定することが� ��きないが、例えば一例として、照射時間30� �、照射量を0.3mW/cm ² を挙げることができる。

 かくして作製され、励起光照射処理された� ��本を複数の観察光を用いて蛍光観察する。� ��なわち、特定の蛍光波長を含む観察光を複� ��組み合わせ、その組み合わさった観察光を� ��いて励起光照射処理された標本を蛍光観察� ��、その得られた観察結果を基にして常法に� ��り画像を得ることができる。本発明の一つ� ��、そして大きな特徴である観察光について� ��すでに簡単に説明してあるが、ここで詳細� ��説明する。
 前記蛍光波長が380nm以上450nm未満の観察光に は、蛍光波長が380nm以上450nm未満の範囲内で� �る観察光であれば、きわめて狭い範囲の波� �からなる観察光でも、広い範囲の波長から� �る観察光でもよい。例えば、400nm、405nm、420n m、あるいは440nmなどの蛍光波長からなる観察 光、380nm以上385nm以下などの蛍光波長からな� �観察光などが挙げられる。なお、蛍光波長� �380nm以上450nm未満を一部含む観察光、例えば3 50nm以上385nm以下などの蛍光波長からなる観察 光も上記観察光に含まれる。
 蛍光波長が450nm以上560nm未満の観察光および 蛍光波長が560nm以上700nm以下の観察光も、上� �蛍光波長が380nm以上450nm未満の観察光の説明� ��同様である。
 本発明では、前記三種の観察光のほかに、� ��らに、異なる蛍光波長からなる観察光を併� ��することができる。併用する観察光の蛍光� ��長は、上記380nm以上700nm以下から外れる蛍光 波長でもよいし、上記380nm以上700nm以下の蛍� �波長でもよい。例えば、蛍光波長が405nmから なる観察光に、蛍光波長が420nmからなる観察� ��を併用してもよいし、380~450nmに含まれる二� ��類の以上の観察光を併用することもできる� ��450nm以上560nm未満の観察光および蛍光波長が 560nm以上700nm以下の観察光も同様である。
 上記観察光は、公知の手段方法により調整� ��ることができるのであり、例えば発せられ� ��蛍光をフィルター処理して調整することが� ��きる。

 上記観察光により得られた情報を基にして� ��法により、加工食品またはその製造原料(以 下、加工食品ということがある)の組織構造� �画像として形成させることができる。この� �像を得る手段は何ら限定されるものではな� �。より具体的に説明すると、上記各観察光� �の観察結果からの情報を重ね合わせ、常法� �より画像を得ることができる。また、顕微� �を用いて結像させて画像とすることができ� �が、写真法など公知の技術を用いて画像を� �成させることもできる。さらに、得られた� �像を基に、画像処理を加えて、立体的に可� �化できる画像を形成させることもできる。� �の可視化方法はとくに制限されるのではな� �、食品の内部組織の構造を知ることができ� �程度に可視化できる限り、どのような方法� �手段も採用可能である。
 本発明では、特定の観測機器を用い、観測� ��ーターを電気信号に変換し、コンピュータ� ��処理することによって内部組織の構造を観� ��することが可能である。併用する観察光が� ��外または紫外波長の領域の観察光の場合に� ��有効である。

 かくして得られた画像を解析することに� ��り、加工食品の組織の構造を知ることがで� ��る。この解析手法はとくに制限されるもの� ��はなく、食品の内部組織の構造を知ること� ��できる限り、目視による方法のほか画像の� ��報を基に各種処理を加えて得られた情報を� ��析する方法など、どのような方法も採用可� ��である。例えば、内部組織の微細構造を立� ��的に表示でき、可視化することが可能とな� ��。また、画像をデジタル画像とし、画像解� ��することにより数値化し、定量化すること� ��可能である。