Pilze der Gattung Blakeslea sind als Produktionsorganismen bekannt. So wird z. B. Blakeslea trispora als Produktionsorganismus für ß-Carotin (Ciegler, 1965, Adv Appl Microbiol. 7 : 1) und Lycopin verwendet (EP 1201762, EP 1184464, WO 03/038064). Daneben kommt Blakeslea zur Produktion anderer lipophiler Substanzen in Frage wie z. B. andere Carotinoide und deren Vorstufen, Phospholipide, Triacylglyceride, Steroide, Wachse, fettlösliche Vitamine, Provitamine und Cofaktoren oder zur Produktion hydrophiler Substanzen wie z. B. Eiweiße, Aminosäuren, Nukleotide und wasserlösliche Vitamine, Provitamine und Cofaktoren.

Die hohen Produktivitäten für ß-Carotin und Lycopin machen Blakeslea, insbesondere Blakeslea trispora attraktiv für die wirtschaftliche fermentative Herstellung von Carotinoiden und deren Vorstufen.

Allerdings ist es auch von Interesse, die Produktivitäten der bisher natürlicherweise produzierten Carotine und deren Vorstufen weiter zu steigern und die Herstellung weiterer Carotinoide, wie z. B. Xanthophylle zu ermöglichen, die von Blakeslea bisher nicht oder nur in sehr geringem Maße gebildet und isoliert werden können.

Carotinoide werden Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Nahrungsergänzungsmitteln, Kosmetika und Arzneimitteln zugesetzt. Die Carotinoide dienen vor allem als Pigmente zur Färbung. Daneben werden

die antioxidative Wirkung der Carotinoide und andere Eigenschaften dieser Substanzen genutzt. Man unterteilt die Carotinoide in die reinen Kohlenwasserstoffe, die Carotine und die sauerstoffhaltigen Kohlenwasserstoffe, die Xanthophylle. Xanthophylle wie Canthaxanthin und Astaxanthin werden beispielsweise zur Pigmentierung von Hühnereiern und Fischen eingesetzt (Britton et al. 1998, Carotinoids, Vol 3,. Biosynthesis and Metabolism). Die Carotine ß-Carotin und Lycopin werden vor allem in der Humanernährung eingesetzt. ß-Carotin wird beispielsweise als Getränkefarbstoff verwendet. Lycopin hat eine krankheitsvorbeugende Wirkung (Argwal und Rao, 2000, CMAJ 163 : 739- 744 ; Rao und Argwal 1999, Nutrition Research 19 : 305-323). Die farblose Carotinoidvorstufe Phytoen kommt vor allem für Anwendungen als Antioxidans in Frage.

Der überwiegende Teil der Carotinoide und deren Vorstufen, die als Zusatzstoffe für die oben genannten Anwendungen eingesetzt werden, wird durch chemische Synthese hergestellt. Die chemische Synthese ist mehrstufig, technisch sehr aufwendig und verursacht hohe Herstellkosten.

Fermentative Verfahren sind demgegenüber technisch verhältnismäßig einfach und basieren auf kostengünstigen Einsatzstoffen. Fermentative Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden können dann wirtschaftlich attraktiv und wettbewerbsfähig zur chemischen Synthese sein, wenn die Produktivität der bisherigen fermentativen Verfahren gesteigert würde oder neue Carotinoide auf Basis der bekannten Produktionsorganismen hergestellt werden könnten.

Ein Verfahren zur gentechnischen Veränderung von Blakeslea trispora ist erforderlich insbesondere, wenn Blakeslea zur Herstellung von Xanthophyllen genutzt werden soll, weil diese Verbindungen natürlicherweise von Blakeslea nicht synthetisiert werden.

Von Blakeslea trispora sind bisher verschiedene DNA-Sequenzen bekannt insbesondere die DNA-Sequenz, die für die Gene der Carotinoidbiosynthese von Geranylgeranylpyrophosphat bis ß-Carotin codiert (WO 03/027293).

Allerdings sind bisher keine Methoden zur gentechnischen Veränderung von Blakeslea, insbesondere Blakeslea trispora bekannt.

Als Methode zur Herstellung von gentechnischen veränderten Pilzen wurde in einigen Fällen die Agrobacterium-vermittelte Transformation erfolgreich eingesetzt. So sind z. B. folgende Organismen durch Agrobakterien transformiert worden : Saccharomyces cerevisiae (Bundock et al., 1995, EMBO Journal, 14 : 3206-3214), Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani pisi, Neurospora crassa, Trichoderma reesei, Pleurotus ostreatus, Fusarium graminearum (van der Toorren et al., 1997, EP 870835), Agraricus bisporus, Fusarium venenatum (de Groot et al., 1998, Nature Biotechnol. 16 : 839-842), Mycosphaerella graminicola (Zwiers et al.

2001, Curr. Genet. 39 : 388-393), Glarea lozoyensis (Zhang et al., 2003, Moi. Gen. Genomics 268 : 645-655), Mucor miehei (Monfort et al. 2003, FEMS Microbiology Lett. 244 : 101-106).

Von Interesse ist besonders eine homologe Rekombination, bei der zwischen der einzuführenden DNA und der Zell-DNA möglichst viele Sequenzhomologien bestehen, so dass eine ortsspezifische Einführung bzw. Ausschaltung von genetischer Information im Genom des Empfängerorganismus möglich ist. Andernfalls wird die Spender-DNA durch illegitime bzw. nicht-homologe Rekombination ins Genom des Empfängerorganismus integriert, was nicht ortsspezifisch erfolgt.

Eine durch Agrobacterium vermittelte Transformation und anschließende homologe Rekombination der transferierten DNA wurde bisher bei folgenden Organismen nachgewiesen : Aspergillus awamori (Gouka et al.

1999, Nature Biotech 17 : 598-601), Glarea lozoyensis (Zhang et al., 2003, Mol. Gen. Genomics 268 : 645-655), Mycosphaerella graminicola (Zwiers et al. 2001, Curr. Genet. 39 : 388-393).

Als weitere Methode zur Transformation von Pilzen ist die Elektroporation bekannt. Die integrative Transformation von Hefe durch Elektroporation wurde von Hill, Nucl. Acids. Res. 17 : 8011 gezeigt. Für filamentöse Pilze wurde die Transformation durch Chakaborty und Kapoor beschrieben (1990, Nucl. Acids. Res. 18 : 6737).

Eine"biolistische"Methode, d. h. die Übertragung von DNA durch Beschuss von Zellen mit DNA-beladenen Partikeln wurde beispielsweise für Trichoderma harzianum und Gliocladium virens beschrieben (Lorito et al. 1993, Curr. Genet. 24 : 349-356).

Diese Methoden konnten bisher jedoch nicht erfolgreich zur gezielten genetischen Veränderung von Blakeslea und insbesondere Blakeslea trispora eingesetzt werden.

Eine besondere Schwierigkeit bei der Herstellung von gezielt genetisch veränderten Blakeslea und Blakeslea trispora ist die Tatsache, dass deren Zellen in allen Stadien des sexuellen und des vegetativen Zellzyklus mehrkernig sind. In Sporen von Blakeslea trispora Stamm NRRL2456 und NRRL2457 wurden z. B. im Durchschnitt 4,5 Kerne pro Spore nachgewiesen (Metha und Cerdä-Olmedo, 1995, Appl.. Microbiol.

Biotechnol. 42 : 836-838). Dies hat zur Folge, dass die gentechnische Veränderung in aller Regel nur in einem oder wenigen Kernen vorliegt, die Zellen also heterokaryotisch sind.

Sollen die genetisch veränderten Blakeslea-Arten, insbesondere Blakeslea trispora zur Produktion eingesetzt werden, so ist es insbesondere bei einer Gendeletion wichtig, dass in den Produktionsstämmen die gentechnische Veränderung in allen Kernen vorliegt, so dass eine stabile und hohe Syntheseleistung ohne Nebenprodukte möglich wird. Die Stämme müssen folglich in Bezug auf die gentechnische Veränderung homokaryotisch sein.

Lediglich für Phycomyces blakesleeanus ist ein Verfahren beschrieben worden, um homokaryotische Zellen zu erzeugen (Roncero et al., 1984, Mutat. Res. 125 : 195). Durch Zugabe des mutagenen Agens MNNG (N- Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin) werden nach dem dort beschriebenen Verfahren Kerne in den Zellen eliminiert, so dass statistisch eine gewisse Anzahl von Zellen mit nur noch einem funktionellem Kern vorliegt. Die Zellen werden dann einer Selektion unterzogen, in der nur einkernige Zellen mit einem rezessiven Selektionsmarker zu einem Mycel auswachsen können. Die Nachkommen dieser selektierten Zellen sind mehrkernig und homokaryotisch. Ein rezessiver Selektionsmarker für Phycomyces blakesleanus ist z. B. dar. Dar+-Stämme nehmen das toxische Riboflavin-Analog 5-Carbon-5-deazariboflavin auf ; Dar--Stämme dagegen nicht (Delbrück et al. 1979, Genetics 92 : 27). Die Selektion von rezessiven Mutanten erfolgt durch Zugabe von 5-Carbon-5-deazariboflavin (DARF).

Allerdings ist dieses Verfahren nicht für Blakeslea, insbesondere Blakeslea trispora bekannt und insbesondere nicht mit im Zusammenhang mit einer Transformation beschrieben worden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem eine gentechnische Veränderung von Blakeslea-Stämmen,

insbesondere Blakeslea trispora möglich ist. Darüber hinaus ist es Aufgabe der Erfindung ein Verfahren bereitzustellen, das die Herstellung homokaryotischer genetisch veränderter Stämme erlaubt. Ferner ist es eine Aufgabe der Erfindung entsprechend gentechnisch veränderte Zellen bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung eines gentechnisch veränderten Organismus der Gattung Blakeslea gelöst, umfassend (i) Transformation mindestens einer der Zellen, (ii) ggf. Homokaryotisierung der aus (i) erhaltenen Zellen, so dass Zellen entstehen, in denen die Kerne in einem oder in mehreren genetischen Merkmalen alle gleichartig verändert sind und diese genetische Veränderung zur Ausprägung bringen, und (iii) Selektion der gentechnisch veränderten Zelle oder Zellen.

Mit der erfindungsgemäßen Methode ist es möglich, mehrkernige Zellen der Pilze Blakeslea gezielt und stabil genetisch zu verändern, um so Mycel aus Zellen mit einheitlichen Kernen zu gewinnen. Vorzugsweise handelt es sich Zellen von Pilzen der Art Blakeslea trispora.

Unter Transformation wird die Übertragung einer genetischen Information in den Organismus, insbesondere Pilz verstanden. Darunter sollen alle dem Fachmann bekannten Möglichkeiten zur Einschleusung der Information, insbesondere DNA fallen, z. B. Beschuss mit DNA-beladenen Partikeln, Transformation mittels Protoplasten, Mikroinjektion von DNA, Elektroporation, Konjugation oder Transformation kompetenter Zellen, Chemikalien oder Agrobakterien vermittelte Transformation. Als genetische Information werden ein Genabschnitt, ein Gen oder mehrere

Gene verstanden. Die genetische Information kann z. B. mit Hilfe eines Vectors oder als freie Nukleinsäure (z. B. DNA, RNA) und auf sonstige Weise in die Zellen eingebracht und entweder durch Rekombination ins Wirtsgenom eingebaut oder in freier Form in der Zelle vorliegen.

Besonders bevorzugt ist hierbei die homologe Rekombination.

Bevorzugte Transformationsmethode ist die Agrobacterium tumefaciens- vermittelte Transformation. Hierzu wird zunächst die zu transferierende Spender-DNA in einen Vektor eingefügt, der (i) flankierend zu der zu transferierenden DNA die T-DNA-Enden trägt, der (ii) einen Selektionsmarker enthält und der (iii) ggf. Promotoren und Terminatoren für die Genexpression der Spender-DNA aufweist. Dieser Vektor wird in einen Agrobacterium-tumefaciens-Stamm übertragen, der ein Ti-Plasmid mit den vir-Genen enthält. vir-Gene sind für den DNA-Transfer in Blakeslea verantwortlich. Mit diesem Zwei-Vektor-System wird die DNA von Agrobacterium in Blakeslea übertragen. Hierzu werden die Agrobakterien zunächst in Gegenwart von Acetosyringone inkubiert.

Acetosyringone induziert die vir-Gene. Anschließend werden Sporen von Blakeslea trispora zusammen mit den induzierten Zellen von Agrobacterium tumefaciens auf Acetosyringone-haltigem Medium inkubiert und dann auf Medium übertragen, das eine Selektion der Transformanten, d. h. der gentechnisch veränderten Stämme von Blakeslea ermöglicht.

Der Begriff Vector wird in der vorliegenden Anmeldung als eine Bezeichnung für ein DNA-Molekül verwendet, das zum Einschleusen und ggf. zur Vermehrung von Fremd-DNA in eine Zelle dient (siehe auch "Vector"in Römpp Lexikon Chemie-CDROM Version 2.0, Stuttgart/New York : Georg Thieme Verlag 1999). In der vorliegenden Anmeldung sollen unter dem Begriff"Vector"Plasmide, Cosmide usw. verstanden werden, die diesem Zweck dienen.

Unter Expression wird in der vorliegenden Anmeldung die Übertragung einer genetischen Information ausgehend von DNA oder RNA in ein Gen- Produkt (hier vorzugsweise Carotinoide) verstanden und soll auch den Begriff der Überexpression beinhalten, womit eine verstärkte Expression gemeint ist, so dass ein bereits in der nicht transformierten Zelle (Wildtyp) hergestelltes Produkt verstärkt produziert wird oder einen großen Teil des gesamten Gehaltes der Zelle ausmacht.

Unter gentechnischer Veränderung soll die Einschleusung genetischer Information in einen Empfängerorganismus, so dass diese stabil exprimiert und bei der Zellteilung weitergegeben wird, verstanden werden. Danach wird gegebenenfalls die Homokaryontisierung durchgeführt, d. h. die Herstellung von Zellen, die nur einheitliche Kerne enthalten, d. h. Kerne mit gleichem genetischem lnformationsgehalt.

Diese Homokaryotisierung ist insbesondere notwendig, wenn die durch Transformation eingeführte genetische Information rezessiv vorliegt, d. h. nicht zur Ausprägung gelangt. Führt die Transformation aber zu einem dominanten Vorliegen der genetischen Information, d. h. wird sie ausgeprägt, so ist eine Homokaryotisierung nicht unbedingt nötig.

Vorzugsweise wird zur Homokaryotisierung eine Selektion der einkernigen Sporen durchgeführt. Von Natur aus ist ein geringer Anteil der Sporen von Blakeslea trispora einkernig, so dass sich diese ggf. nach spezifischer Markierung z. B. Färbung der Zellkerne aussortieren lassen. Dies wird bevorzugterweise mittels FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) anhand der geringeren Fluoreszenz der einkernigen Zellen durchgeführt.

Alternativ kann zur Homokaryotisierung zunächst eine Kernreduktion durchgeführt werden. Hierzu kann ein mutagenes Agens eingesetzt werden, wobei es sich insbesondere um N-Methyl-N'-nitro-nitrosoguanidin

(MNNG) handelt. Auch die Verwendung von energiereichen Strahlen, wie UV-oder Röntgen-Strahlen zur Kernreduktion ist möglich. Anschließend kann zur Selektion auf das FACS Verfahren oder rezessive Selektionsmarker zurückgegriffen werden.

Unter Selektion wird die Auswahl von Zellen verstanden, deren Kerne dieselbe genetische Information beinhalten, d. h. Zellen die die gleichen Eigenschaften aufweisen, wie Resistenzen oder die Herstellung bzw. vermehrte Herstellung eines Produktes. In der Selektion werden neben der FACS Methode bevorzugt 5-Carbon-5-deazariboflavin (darf) und Hygromycin (hyg) oder 5'-Fluororotat (FOA) und Uracil eingesetzt.

Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector kann derart gestaltet sein, dass die im Vector enthaltene genetische Information in das Genom mindestens einer Zelle integriert wird. Dabei kann genetische Information in der Zelle ausgeschaltet werden.

Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector kann aber auch derart ausgestaltet sein, dass die im Vector enthaltene genetische Information in der Zelle exprimiert wird, d. h. genetische Information eingefügt wird, die im korrespondierenden Wildtyp nicht vorhanden ist oder die durch die Transformation verstärkt bzw. überexprimiert wird.

Der Vector kann beliebige genetische Informationen zur genetischen Veränderungen von Organismen der Gattung Blakeslea enthalten.

Unter"genetischer Information"werden vorzugsweise Nukleinsäuren verstanden, deren Einbringung in den Organismus der Gattung Blakeslea zu einer genetischen Veränderung in Organismen der Gattung Blakeslea, also beispielsweise zu einer Verursachung, Erhöhung oder Reduzierung von Enzymaktivitäten im Vergleich zum Ausgangsorganismus führen.

Der Vector kann beispielsweise genetische Information zur Herstellung lipophiler Substanzen enthalten wie z. B. Carotinoide und deren Vorstufen, Phospholipide, Triacylglyceride, Steroide, Wachse, fettlösliche Vitamine, Provitamine und Cofaktoren oder genetische Information zur Herstellung hydrophiler Substanzen wie z. B. Eiweiße, Aminosäuren, Nukleotide und wasserlösliche Vitaminen, Provitamine und Cofaktoren.

Bevorzugterweise enthält der eingesetzte Vector genetische Informationen zur Herstellung von Carotinoiden oder Xanthophyllen oder deren Vorstufen.

Bevorzugterweise enthält der Vektor genetische Information, die eine Lokalisierung der Carotinoidbiosynthese-Enzyme in dem Zellkompartiment bewirkt, in dem die Carotinoidbiosynthese stattfindet.

Besonders bevorzugt sind genetische Informationen zur Herstellung von Astaxanthin, Zeaxanthin, Echinenon, ß-Cryptoxanthin, Andonixanthin, Adonirubin, Canthaxanthin, 3-und 3'-Hydroxyechinenon, Lycopin, Lutein, ß-Carotin, Phytoen oder Phytofluen. Ganz besonders bevorzugt sind genetische Informationen zur Herstellung von Phytoen, Bixin, Lycopin, Zeaxanthin, Canthaxanthin und Astaxanthin.

Entsprechend werden in einer bevorzugten Variante der Erfindung Organismen hergestellt und kultiviert, die über eine erhöhte Syntheserate für Zwischenprodukte der Carotinoidbiosynthese verfügen und folglich eine erhöhte Produktivität für Endprodukte der Carotinoidbiosynthese aufweisen. Zur Erhöhung der Syntheserate für Zwischenprodukte der Carotinoidbiosynthese werden insbesondere die Aktivitäten der Enzyme 3- Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A-Reduktase,

Isopentenylpyrophosphat-Isomerase und Geranylpyrophosphatsynthase gesteigert.

Entsprechend werden in einer besonders bevorzugten Variante der Erfindung Organismen hergestellt und kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität aufweisen.

Unter HMG-CoA-Reduktase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer HMG- CoA-Reduktase (3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A-Reduktase) verstanden.

Unter einer HMG-CoA-Reduktase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl- Coenzym-A in Mevalonat umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter HMG-CoA-Reduktase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein HMG-CoA-Reduktase umgesetzte Menge 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A bzw. gebildete Menge Mevalonat verstanden.

Bei einer erhöhten HMG-CoA-Reduktase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein HMG-CoA-Reduktase die umgesetzte Menge 3-Hydroxy-3-Methyl- Glutaryl-Coenzym-A bzw. die gebildete Menge Mevalonat erhöht.

Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100%, bevorzugter mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens 500%, insbesondere mindestens 600% der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität des Wildtyp.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der HMG- CoA-Reduktase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase indem man ein Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend eine Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase in den Organismus einbringt, deren Expression in dem Organismus, verglichen mit dem Wildtyp, einer reduzierten Regulation unterliegt.

Unter einer reduzierten Regulation verglichen mit dem Wildtyp, wird eine im Vergleich zum vorstehend definierten Wildtyp verringerte, vorzugsweise keine Regulation auf Expressions-oder Proteinebene verstanden.

Die reduzierte Regulation kann vorzugsweise durch einen im Nukleinsäurekonstrukt mit der kodierenden Sequenz funktionell verknüpften Promotor erreicht werden, der in dem Organismus verglichen mit dem Wildtyp-Promoter einer reduzierten Regulation unterliegt.

Beispielsweise unterliegen die Promotoren ptef1 aus Blakeslea trispora und pgpdA aus Aspergillus nidulans nur einer reduzierten Regulation und sind daher insbesondere als Promotoren bevorzugt.

Diese Promotoren zeigen eine annähernd konstitutive Expression in Blakeslea trispora, so dass die transkriptionelle Regulation nicht mehr über die Intermediate der Carotinoidbiosynthese abläuft.

Die reduzierte Regulation kann in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dadurch erreicht werden, dass man als Nukleinsäure

codierend eine HMG-CoA-Reduktase eine Nukleinsäure verwendet, deren Expression in dem Organismus, verglichen mit der Organismus eigenen, orthologen Nukleinsäure, einer reduzierten Regulation unterliegt.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung einer Nukleinsäure, die nur den katalytischen Bereich der HMG-CoA-Reduktase kodiert (trunkierte (t- ) HMG-CoA-Reduktase). Die für die Regulation verantwortliche Membran- Domäne fehlt. Die verwendete Nukleinsäure unterliegt somit einer reduzierten Regulation und führt zu einer Erhöhung der Genexpression der HMG-CoA-Reduktase.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man Nukleinsäuren in Blakeslea trispora ein, welche die Sequenz SEQ ID. NO.

75 enthalten.

Weitere Beispiele für HMG-CoA-Reduktasen und damit auch für die auf den katalytischen Bereich reduzierten t-HMG-CoA-Reduktasen bzw. die kodierenden Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Homologievergleiche der Sequenzen aus Datenbanken mit der SEQ ID.

NO. 75 leicht auffinden.

Weitere Beispiele für HMG-CoA-Reduktasen und damit auch für die auf den katalytischen Bereich reduzierten t-HMG-CoA-Reduktasen bzw. die kodierenden Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID. NO. 75 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungs-und PCR- Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die reduzierte Regulation dadurch erreicht, dass man als Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase eine Nukleinsäure verwendet, deren Expression in

dem Organismus, verglichen mit der Organismus eigenen, orthologen Nukleinsäure, einer reduzierten Regulation unterliegt und einen Promotor verwendet, der in dem Organismus, verglichen mit dem Wildtyp-Promoter einer reduzierten Regulation unterliegt.

Entsprechend wird in einer bevorzugten Variante der Erfindung durch die Transformation die Genexpression der Phytoendesaturase ausgeschaltet, so dass das von den Organismen produzierte Phytoen gewonnen werden kann. Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector umfasst daher in einer Ausführungsform der Erfindung bevorzugterweise eine Sequenz codierend für ein Fragment des Gens der Phytoendesaturase, insbesondere carB aus Blakeslea trispora mit der SEQ ID NO : 69.

Entsprechend wird in einer bevorzugten Variante der Erfindung durch Transformation die Genexpression der Lycopincyclase ausgeschaltet, so dass das von den Organismen produzierte Lycopin gewonnen werden kann. Der in der Transformation eingesetzte Vektor umfasst daher in einer Ausführungsform der Erfindung bevorzugterweise eine Sequenz codierend für ein Fragment des Gens der Lycopincyclase, insbesondere carR aus Blakeslea trispora s. (WO 03/027293).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Organismen der Gattung Blakeslea beispielsweise in die Lage versetzt Xanthophylle, wie beispielsweise Zeaxanthin oder Astaxanthin herzustellen, indem die genetisch veränderten Organismen der Gattung Blakeslea im Vergleich zum Wildtyp eine Hydroxylase-Aktivität und/oder eine Ketolase-Aktivität besitzen.

Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector enthält also in einer weiteren, bevorzugten Variante der Erfindung genetische Informationen, die nach Expression eine Ketolase-und/oder Hydroxylase-Aktivität

entfalten, so dass die Organismen Zeaxanthin oder Astaxanthin produzieren.

Unter Ketolase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Ketolase verstanden.

Unter einer Ketolase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, am, gegebenenfalls substituierten, ß-lonon-Ring von Carotinoiden eine Keto-Gruppe einzuführen. insbesondere wird unter einer Ketolase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Canthaxanthin umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter Ketolase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Ketolase umgesetzte Menge ß-Carotin bzw. gebildete Menge Canthaxanthin verstanden.

Unter dem Begriff"Wildtyp"wird erfindungsgemäß der entsprechende nicht genetisch veränderte Ausgangsorganismus der Gattung Blakesleaa verstanden.

Je nach Zusammenhang kann unter dem Begriff"Organismus"der Ausgangsorganismus (Wildtyp) der Gattung Blakesleaa oder ein erfindungsgemäßer, genetisch veränderter Organismus der Gattung Blakesleaa oder beides verstanden werden.

Vorzugsweise wird unter"Wildtyp"für die Verursachung der Ketolase- Aktivität und für die Verursachung der Hydroxylase-Aktivität jeweils ein Referenzorganismus verstanden.

Dieser Referenzorganismus der Gattung Blakeslea ist Blakeslea trispora ATCC 14271 oder ATCC 14272, die sich lediglich im Paarungstyp unterscheiden.

Die Bestimmung der Ketolase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Organismen der Gattung Blakesleaa und in Wildtyp-bzw.

Referenzorganismen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen : Die Bestimmung der Ketolase-Aktivität in Organismen der Gattung Blakeslea erfolgt in Anlehnung an die Methode von Fraser et al., (J. Biol.

Chem. 272 (10) : 6128-6135,1997). Die Ketolase-Aktivität in Extrakten wird mit den Substraten beta-Carotin und Canthaxanthin in Gegenwart von Lipid (Sojalecithin) und Detergens (Natriumcholat) bestimmt.

Substrat/Produkt-Verhältnisse aus den Ketolase-Assays werden mittels HPLC ermittelt.

Der erfindungsgemäße genetisch veränderte Organismus der Gattung Blakesleaa weist in dieser, bevorzugten Ausführungsform im Vergleich zum genetisch nicht veränderten Wildtyp eine Ketolase-Aktivität auf und ist somit vorzugsweise in der Lage, transgen eine Ketolase zu exprimieren.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verursachung der Ketolase-Aktivität in den Organismen der Gattung Blakesleaa durch Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Ketolase.

In dieser bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verursachung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Ketolase vorzugsweise durch Einbringen von Nukleinsäuren, die Ketolasen kodieren in die Ausgangsorganismus der Gattung Blakesleaa.

Dazu kann prinzipiell jedes Ketolase-Gen, also jede Nukleinsäuren die eine Ketolase codiert verwendet werden.

Alle in der Beschreibung erwähnten Nukleinsäuren können beispielsweise eine RNA-, DNA-oder cDNA-Sequenz sein.

Bei genomischen Ketolase-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall das der Wirtsorganismus der Gattung Blakesleaa nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Ketolase zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.

Beispiele für Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase und die entsprechenden Ketolasen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können sind beispielsweise Sequenzen aus : Haematoccus pluvialis, insbesondere aus Haematoccus pluvialis Flotow em. Wille (Accession NO : X86782 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 11, Protein SEQ ID NO : 12), Haematoccus pluvialis, NIES-144 (Accession NO : D45881 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 13, Protein SEQ ID NO : 14), Agrobacterium aurantiacum (Accession NO : D58420 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 15, Protein SEQ ID NO : 16), Alicaligenes spec. (Accession NO : D58422 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 17, Protein SEQ ID NO : 18),

Paracoccus marcusii (Accession NO : Y15112 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 19, Protein SEQ ID NO : 20), Synechocystis sp. Strain PC6803 (Accession NO : NP442491 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 21, Protein SEQ ID NO : 22), Bradyrhizobium sp. (Accession NO : AF218415 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 23, Protein SEQ ID NO : 24), Nostoc sp. Strain PCC7120 (Accession NO : AP003592, BAB74888 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 25, Protein SEQ ID NO : 26), Nostoc punctiforme ATTC 29133, Nukleinsäure : Acc.-No.

NZAABC01000195, Basenpaar 55,604 bis 55,392 (SEQ ID NO : 27) ; Protein : Acc.-No. ZP 00111258 (SEQ ID NO : 28) (als putatives Protein annotiert) oder Nostoc punctiforme ATTC 29133, Nukleinsäure : Acc.-No.

NZAABC01000196, Basenpaar 140,571 bis 139,810 (SEQ ID NO : 29), Protein : (SEQ ID NO : 30) (nicht annotiert).

Weitere natürliche Beispiele für Ketolasen und Ketolase-Gene, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit den vorstehend beschriebenen Sequenzen und insbesondere mit den Sequenzen SEQ ID NO : 12 und/oder 26 und/oder 30 leicht auffinden.

Weitere natürliche Beispiele für Ketolasen und Ketolase-Gene lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO : 12 und/oder 26 und/oder 30 aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

Die Hybridisierung kann unter moderaten (geringe Stringenz) oder vorzugsweise unter stringenten (hohe Stringenz) Bedingungen erfolgen.

Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., in : Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2.

Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9. 57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y.

(1989), 6.3. 1-6.3. 6 beschrieben.

Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit 0,2X SSC bei 50°C, bevorzugt bei 65°C) (20X SSC : 0,3 M Natriumcitrat, 3 M Natriumchlorid, pH 7.0).

Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von moderaten Bedingungen bei Raumtemperatur, 22°C, bis zu stringenten Bedingungen bei 65°C angehoben werden.

Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS

eingesetzt werden. In Gegenwart von 50 % Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt.

Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben : (1) Hybridiserungsbedingungen mit zum Beispiel (i) 4X SSC bei 65°C, oder (ii) 6X SSC bei 45°C, oder (iii) 6X SSC bei 68°C, 100 mg/ml denaturierter Fischsperma-DNA, oder (iv) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 mg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 68°C, oder (v) 6XSSC, 0,5 % SDS, 100 mg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50 % Formamid bei 42°C, oder (vi) 50 % Formamid, 4X SSC bei 42°C, oder (vii) 50 % (vol/vol) Formamid, 0,1 % Rinderserumalbumin, 0,1 % Ficoll, 0.1 % Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,5, 750 mM NaCI, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C, oder (viii) 2X oder 4X SSC bei 50°C (moderate Bedingungen), oder (ix) 30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (moderate Bedingungen).

(2) Waschschritte für jeweils 10 Minuten mit zum Beispiel (i) 0,015 M NaCI/0, 0015 M Natriumcitrat/0, 1 % SDS bei 50°C, oder (ii) 0,1X SSC bei 65°C, oder (iii) 0, 1X SSC, 0,5 % SDS bei 68°C, oder (iv) 0, 1X SSC, 0,5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C, oder (v) 0,2X SSC, 0,1 % SDS bei 42°C, oder (vi) 2X SSC bei 65°C (moderate Bedingungen).

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Organismen der Gattung Blakeslea bringt man Nukleinsäuren ein, die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO : 12 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 30 %, bevorzugter mindestens 40 %, bevorzugter mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 60 %, bevorzugter mindestens 70 %, bevorzugter mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, insbesondere 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf Aminosäureebene mit der Sequenz z SEQ ID NO : 12 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist.

Dabei kann es sich um eine natürliche Ketolase-Sequenz handeln, die wie vorstehend beschrieben durch Identitätsvergleich der Sequenzen aus anderen Organismen gefunden werden kann oder um eine künstliche Ketolase-Sequenz die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO : 12 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgewandelt wurde.

In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren bringt man Nukleinsäuren ein die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO : 26 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 30 %, bevorzugter mindestens 40 %, bevorzugter mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 60 %, bevorzugter mindestens 70 %, bevorzugter mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 % insbesondere 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO : 26 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist.

Dabei kann es sich um eine natürliche Ketolase-Sequenz handeln, die, wie vorstehend beschrieben, durch Identitätsvergleich der Sequenzen aus anderen Organismen gefunden werden kann oder um eine künstliche Ketolase-Sequenz die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO : 26 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgewandelt wurde.

In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren bringt man Nukleinsäuren ein die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO : 30 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 30 %, bevorzugter mindestens 40 %, bevorzugter mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 60 %, bevorzugter mindestens 70 %, bevorzugter mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, insbesondere 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO : 30 und die enzymatische Eigenschaft einer Ketolase aufweist.

Dabei kann es sich um eine natürliche Ketolase-Sequenz handeln, die, wie vorstehend beschrieben, durch Identitätsvergleich der Sequenzen aus anderen Organismen gefunden werden kann oder um eine künstliche Ketolase-Sequenz die ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO : 30 durch künstliche Variation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgewandelt wurde.

Unter dem Begriff"Substitution"ist in der Beschreibung der Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren durch eine oder mehrere Aminosäuren zu verstehen. Bevorzugt werden sog. konservative Austausche durchgeführt, bei denen die ersetzte Aminosäure eine ähnliche

Eigenschaft hat wie die ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise Austausch von Glu durch Asp, Gin durch Asn, Val durch Ile, Leu durch lie, Ser durch Thr.

Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine direkte Bindung.

Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini des Polypeptids und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen.

Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren in die Polypeptidkette, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Aminosäuren ersetzt wird.

Unter Identität zwischen zwei Proteinen wird die Identität der Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden, insbesondere die Identität die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene Software der Firma DNASTAR, inc. Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr ; 5 (2) : 151- 1) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird : Multiple alignment parameter : Gap penalty 10 Gap length penalty 10 Pairwise alignment parameter : K-tuple Gap penalty 3 Window 5 Diagonals saved 5 Unter einem Protein, das eine Identität von mindestens 20 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO : 12 oder 26 oder 30

aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 12 oder 26 oder 30, insbesondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 20 %, bevorzugt 80, %, 85%, besonders 90%, insbesondere 95% aufweist.

Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der Blakesleaaspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene von Organismen der Gattung Blakesleaa leicht ermitteln.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO : 11 in die Organismus der Gattung ein.

In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO : 25 in die Organismus der Gattung ein.

In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO : 29 in die Organismus der Gattung ein.

Alle vorstehend erwähnten Ketolase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die

chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2.

Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector umfasst daher in einer Ausführungsform der Erfindung bevorzugterweise eine Sequenz codierend für eine Ketolase, insbesondere der Ketolase Nostoc punctiforme aus mit der SEQ ID NO : 72.

Unter Hydroxylase-Aktivität die Enzymaktivität einer Hydroxylase verstanden.

Unter einer Hydroxylase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, am, gegebenenfalls substituierten, ß- lonon-Ring von Carotinoiden eine Hydroxy-Gruppe einzuführen.

Insbesondere wird unter einer Hydroxylase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Zeaxanthin oder Cantaxanthin in Astaxanthin umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter Hydroxyase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Hydroxylase umgesetzte Menge ß-Carotin oder Cantaxanthin bzw. gebildete Menge Zeaxanthin oder Astaxanthin verstanden.

Bei einer erhöhten Hydroxylase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Hydroxylase die umgesetzte Menge ß-Carotin oder Canthaxantin bzw. die gebildete Menge Zeaxanthin oder Astaxanthin erhöht.

Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der Hydroxylase-Aktivität des Wildtyp.

Die Bestimmung der Hydroxylase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Organismen und in Wildtyp-bzw. Referenz- Organismen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen : Die Aktivität der Hydroxylase wird nach Bouvier et al. (Biochim. Biophys.

Acta 1391 (1998), 320-328) in vitro bestimmt. Es wird zu einer bestimmten Menge an Organismenextrakt Ferredoxin, Ferredoxin-NADP Oxidoreductase, Katalase, NADPH sowie beta-Carotin mit Mono-und Digalaktosylglyzeriden zugegeben.

Besonders bevorzugt erfolgt die Bestimmung der Hydroxylase-Aktivität unter folgenden Bedingungen nach Bouvier, Keller, d'Harlingue und Camara (Xanthophyll biosynthesis : molecular and functional characterization of carotenoid hydroxylases from pepper fruits (Capsicum annuum L. ; Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328) : Der in-vitro Assay wird in einem Volumen von 0,250 ml Volumen durchgeführt. Der Ansatz enthält 50 mM Kaliumphosphat (pH 7,6), 0,025 mg Ferredoxin von Spinat, 0,5 Einheiten Ferredoxin-NADP+ Oxidoreduktase von Spinat, 0,25 mM NADPH, 0,010 mg beta-Carotin (in

0,1 mg Tween 80 emulgiert), 0,05 mM einer Mischung von Mono-und Digalaktosylglyzeriden (1 : 1), 1 Einheit Katalyse, 200 Mono-und Digalaktosylglyzeriden, (1 : 1), 0,2 mg Rinderserumalbumin und Organismenextrakt in unterschiedlichem Volumen. Die Reaktionsmischung wird 2 Stunden bei 30°C inkubiert. Die Reaktionsprodukte werden mit organischem Lösungsmittel wie THF, Aceton oder Chloroform/Methanol (2 : 1) \ extrahiert und mittels HPLC bestimmt.

Besonders bevorzugt erfolgt die Bestimmung der Hydroxylase-Aktivität unter folgenden Bedingungen nach Bouvier, d'Harlingue und Camara (Molecular Analysis of carotenoid cyclae inhibition ; Arch. Biochem.

Biophys. 346 (1) (1997) 53-64) : Der in-vitro Assay wird in einem Volumen von 250 pl Volumen durchgeführt. Der Ansatz enthält 50 mM Kaliumphosphat (pH 7,6), unterschiedliche Mengen an Organismenextrakt, 20 nM Lycopin, 250 pg an chromoplastidärem Stromaprotein aus Paprika, 0,2 mM NADP+, 0.2 mM NADPH und 1 mM ATP. NADP/NADPH und ATP werden in 10 mi Ethanol mit 1 mg Tween 80 unmittelbar vor der Zugabe zum Inkubationsmedium gelöst. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten bei 30°C wird die Reaktion durch Zugabe von Chloroform/Methanol (2 : 1) beendet. Die in Chloroform extrahierten Reaktionsprodukte werden mittels HPLC analysiert.

Ein alternativer Assay mit radioaktivem Substrat ist beschrieben in Fraser und Sandmann (Biochem. Biophys. Res. Comm. 185 (1) (1992) 9-15).

Die Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität kann durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Ausschalten von hemmenden Regulationsmechanismen auf Expressions-und Proteinebene oder durch

Erhöhung der Genexpression von Nukleinsäuren kodierend eine Hydroxylase gegenüber dem Wildtyp.

Die Erhöhung der Genexpression der Nukleinsäuren kodierend eine Hydroxylase gegenüber dem Wildtyp kann ebenfalls durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Induzierung des Hydroxylase-Gens durch Aktivatoren oder durch Einbringen von einer oder mehrerer Hydroxylase-Genkopien, also durch Einbringen mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase in denb Organismus der Gattung Blakesleaa.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend eine Hydroxylase in den Organismus der Gattung Blakesleaa.

Dazu kann prinzipiell jedes Hydroxylase-Gen, also jede Nukleinsäure, die eine Hydroxylase codiert, verwendet werden.

Bei genomischen Hydroxylase-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall, dass der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechende Hydroxylase zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.

Ein Beispiel für ein Hydroxylase-Gen ist eine Nukleinsäure, kodierend eine Hydroxylase aus Haematococcus pluvialis mit der Accession No.

AX038729 (WO 0061764 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 31, Protein : SEQ ID NO : 32), aus Erwinia uredovora 20D3 (ATCC 19321, Accession No. D90087 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 33, Protein : SEQ ID NO : 34) oder

Hydroxylase aus Thermus thermophilus (DE 102 34 126.5) kodiert durch die Sequenz mit der SEQ ID NO 76.

Weitere Hydroxylasen werden von den Nukleinsäuren mit den folgenden Accession Nummern kodiert jembjCAB55626. 1, CAA70427. 1, CAA70888.1, CAB55625.1, AF499108_1, AF315289_1, AF296158_1, AAC49443. 1, NP_194300. 1, NP_200070. 1, AAG10430. 1, CAC06712.1, AAM88619. 1, CAC95130.1, AAL80006. 1, AF162276_1, AA053295. 1, AAN85601. 1, CRTZERWHE, CRTZPANAN, BAB79605.1, CRTZALCSP, CRTZAGRAU, CAB56060.1, ZP00094836. 1, AAC44852. 1, BAC77670.1, NP_745389. 1, Nu-344225. 1, NP_849490. 1, ZP00087019. 1, NP_503072. 1, NP 852012. 1, NP_115929. 1, ZP00013255. 1 In den erfindungsgemäßen bevorzugten transgenen Organismen der Gattung Blakeslea liegt also in dieser bevorzugten Ausführungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein Hydroxylase-Gen vor.

In dieser bevorzugten Ausführungsform weist der genetisch veränderte Organismus beispielsweise mindestens eine exogene Nukleinsäure, kodierend eine Hydroxylase auf.

Bevorzugt verwendet man in vorstehend beschriebener bevorzugter Ausführungsform als Hydroxylase-Gene Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO : 32,34 oder kodiert durch die Sequenz mit der SEQ ID NO 76 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 80 %, am bevorzugtesten mindestens 90%, insbesondere 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf

Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO : 32,34 oder kodiert durch die Sequenz mit der SEQ ID NO 76 und die die enzymatische Eigenschaft einer Hydroxylase aufweisen.

Weitere Beispiele für Hydroxylasen und Hydroxylase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SEQ ID. NO : 31,33 oder 76 leicht auffinden.

Weitere Beispiele für Hydroxylasen und Hydroxylase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO : 31,33 oder 76 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, wie vorstehend beschrieben, durch Hybridisierungs-und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der Hydroxylase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Hydroxylase der Sequenz SEQ ID NO : 32,34 oder kodiert durch die Sequenz mit der SEQ 1D NO 76.

Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der Organismenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO : 31,33 oder 76 in den Organismus ein.

Alle vorstehend erwähnten Hydroxylase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector umfasst daher in weiteren Ausführungsformen der Erfindung bevorzugterweise eine Sequenz codierend für eine Hydroxiase, insbesondere eine Hydrolase aus Haematococcus pluvialis mit der SEQ ID NO : 70 oder eine Hydrolase aus Erwinia uredova mit der SEQ ID NO : 71. oder eine Hydroxylase aus Thermus thermophilus kodiert durch die Sequenz mit der SEQ ID NO 76.

Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector enthält vorzugsweise ferner die Expression regelnde und unterstützende Bereiche, insbesondere Promotoren und Terminatoren.

Der in der Transformation (i) eingesetzte Vector enthält vorzugsweise den gpd und/oder den ptef1 Promotor und/oder den trpC Terminator. Diese

haben sich zur Transformation der Blakeslea besonders bewährt. Auch der Einsatz von dem Fachmann geläufigen"inverted repeats" (IR, Römpp Lexikon der Biotechnologie 1992, Thieme Verlag Stuttgart, Seite 407 "Invers repetitive Sequenzen") zur Regelung der Expression bzw.

Transkription liegt im Rahmen der Erfindung.

Vorteilhafterweise weist der im Vector eingesetzte gpd Promotor die Sequenz SEQ ID NO : 1 auf. Vorteilhafterweise weist der im Vector eingesetzte trpC Terminator die Sequenz SEQ ID NO : 2 auf.

Vorteilhafterweise weist der im Vector eingesetzte ptef1 Promotor die Sequenz SEQ ID NO : 35 auf.

Insbesondere werden dabei der gpd Promotor und der trpC Terminator aus Aspergillus nidulans und der ptef1 Promotor aus Blakeslea trispora eingesetzt.

Insbesondere enthält der in der Transformation (i) eingesetzte Vector ein Resistenzgen. Bevorzugterweise handelt es sich um ein Hygromycin- Resistenzgen (hph), insbesondere das aus E. coli. Dieses Resistenzgen hat sich bei dem Nachweis der Transformation und Selektion der Zellen als besonders geeignet herausgestellt.

Als Promotor für hph wird also bevorzugt p-gpdA, der Promotor der Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase aus Aspergillus nidulans genutzt. Als Terminator für hph wird bevorzugt t-trpC, der Terminator des Gens trpC, codierend für Anthranilatsynthasekomponenten aus Aspergillus nidulans genutzt.

Als Vectoren haben sich Abkömmlinge des pBinAHyg Vectors als besonders geeignet herausgestellt. Der zur Transformation eingesetzte Vector umfasst also bevorzugterweise die SEQ ID NO : 3.

Hinzu kommen je nach gewünschtem Carotinoid oder dessen Vorstufe eine Sequenz codierend für eine Hydroxylase, Ketolase, Phytoendesaturase usw. wie diese zuvor beschrieben wurden. Die Vectoren umfassen also in einer Ausführugsform der Erfndung die Sequenz SEQ ID NO : 69 codierend für die Phytoendesaturase. Die Vectoren umfassen ferner in einer weiteren Ausführugsform der Erfndung die Sequenz SEQ ID NO : 72 codierend für eine Ketolase. Die Vectoren umfassen weiter in einer weiteren Ausführugsform der Erfndung die Sequenz SEQ ID NO : 70 oder 71 oder 76 codierend für eine Hydoxylase.

Entsprechende Kombinationen der zuvorgenannten Sequenzen liegen ebenso im Rahmen der Erfindung. So umfasst der Vector in einer Ausführungsform sowohl eine Sequenz SEQ ID NO : 72 codierend für eine Ketolase als auch die Sequenz SEQ ID NO : 70 oder 71 oder 76 codierend für eine Hydoxylase und ermöglicht so die Herstellung von Astaxanthin.

Insbesondere sind Vectoren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NO : 37 bis 51 und 62 im Rahmen der Erfindung einsetzbar.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind gentechnisch veränderte Organismen Blakeslea, insbesondere der Art Blakeslea trispora bzw. aus ihnen gebildetes Mycel erhältlich.

Die genetisch veränderten Organismen können zur Produktion von Carotinoiden, Xanthophyllen oder deren Vorstufen, insbesondere Phytoen, Bixion, Astaxanthin, Zeaxanthin und Canthaxanthin verwendet werden.

Auch können neue, im Wildtyp natürlicherweise nicht vorkommende Carotinoide durch Einbringung der entsprechenden genetischen Information von den gezielt genetisch veränderten Zellen bzw. dem durch sie gebildeten Mycel erzeugt und anschließend isoliert werden.

Bevorzugterweise ist die Gewinnung von Carotinoiden oder deren Vorstufen mit den gezielt genetisch veränderten Zellen bzw. das durch sie gebildete Mycel möglich.

Wird die gentechnische Veränderung nur in Zellen eines der vorkommenden Paarungstypen (bei Blakeslea trispora (+) oder (-)) durchgeführt, so wird zur Kultivierung der entsprechend andere, nicht veränderte Paarungstyp zugesetzt, da so eine gute Produktion der Carotinoide oder deren Vorstufen aufgrund der von dem zweiten, nicht veränderten Paarungstyp abgegebenen Substanzen (z. B. Trisporsäuren) zu erreichen ist. Vorteilhafterweise wird jedoch die gentechnische Veränderung in Zellen beider Paarungstypen vorgenommen und diese zusammen kultiviert. Hierdurch wird ein besonders gutes Wachstum und eine optimale Produktion der Carotinoiden oder deren Vorstufen erreicht.

Auch eine (künstliche) Zugabe der Trisporsäuren ist möglich und sinnvoll.

Trisporsäuren sind Sexualhormone in Mucorales Pilzen, wie Blakeslea, welche die Bildung von Zygophoren und die Produktion von ß-Carotin stimulieren (van den Ende 1968, J. Bacteriol. 96 : 1298-1303, Austin et al. 1969, Nature 223 : 1178-1179, Reschke Tetrahedron Lett. 29 : 3435- 3439, van den Ende 1970, J. Bacteriol. 101 : 423-428).

Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Beispielen näher ausgeführt.

Material und Methoden Molekulargenetische Arbeiten wurden, wenn nicht anders beschrieben, nach den Methoden in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999, John Wiley & Sons) durchgeführt.

Stämme und Wachstumsbedingungen

Die Blakeslea trispora Stämme ATCC 14271 (Paarungstyp (+)) und ATCC14272 (Paarungstyp (-)) wurden von der American Type Culture Collection erhalten. Die Anzucht von B. trispora erfolgte in MEP-Medium (Malzextrakt-Pepton-Medium) : 30 g/1 Malzextrakt (Difco), 3 g/1 Pepton (Soytone, Difco), 20 g/l Agar, Einstellung pH 5,5, ad 1000 ml mit H20 bei 28 °C.

Die Anzucht von Agrobacterium tumefaciens LBA4404 erfolgte nach Hoekema et al. (1983, Nature 303 : 179-180) bei 28 °C für 24 h in Agrobacterien-Minimal Medium (AMM) : 10 mM K2HP04, 10 mM KH2P04, 10 mM Glucose, MM-Salze (2,5 mM NaCl, 2 mM MgS04, 700 pM CaCl2, 9 pM FeSO4, 4 mM (NH4) 2S04).

Transformation von Agrobacterium tumefaciens Das Plasmid pBinAHyg wurde in den Agrobakterienstamm LBA 4404 (Hoekema et al., 1983, Nature 303 : 179-180) elektroporiert (Mozo and Hooykaas, 1991, Plant Mol. Biol. 16 : 917-918). Zur Selektion wurden bei der Agrobakterienanzucht folgende Antibiotika verwendet : Rifampicin 50 mg/l (Selektion auf das A. tumefaciens Chromosom), Streptomycin 30 mg/ ! (Selektion auf das Helferplasmid) und Kanamycin 100 mg/1 (Selektion auf den binären Vektor).

Transformation von Blakeslea trispora Zur Transformation wurden die Agrobakterien nach 24 h Anzucht in AMM auf eine OD600 von 0,15 in Induktionsmedium (IM : MM-Salze, 40 mM MES (pH 5,6), 5 mM Glucose, 2 mM Phosphat, 0,5% Glycerol, 200 uM Acetosyringone) verdünnt und erneut über Nacht in IM bis zu einer OD600 von ca. 0,6 angezogen.

Zur Co-Inkubation von Blakeslea ATCC 14271 bzw. ATCC14272 und Agrobacterium wurden 100 ut Agrobakteriensuspension mit 100 pl

Blakeslea Sporensuspension (107 Sporen/ml in 0,9% NaCl) gemischt und steril auf einer Nylon Membran (Hybond N, Amersham) auf IM-Agarose Platten (IM + 18 g/1 Agar) verteilt. Nach 3 Tagen Inkubation bei 26 °C wurde die Membran auf eine MEP-Agarplatte (30 g/1 Malzextrakt, 3 g/1 Pepton, pH 5,5, 18 g/1 Agar) überführt. Zur Selektion auf transformierte Blakesleazellen enthielt das Medium Hygromycin in einer Konzentration von 100 mg/ sowie zur Selektion gegen Agrobakterien 100 mg/l Cefotaxim. Die Inkubation erfolgte für ca. 7 Tage bei 26 °C. Anschließend erfolgte der Transfer von Mycel auf frische Selektionsplatten. Gebildete Sporen wurden mit 0,9% NaCl abgespült und auf CM17-1-Agar (3 g/1 Glucose, 200 mg/1 L-Asparagin, 50 mg/l MgSO4 x 7H2O, 150 mg/1 KH2P04, 25 pg/I ThiaminHCI, 100 mg/1 Yeast Extract, 100 mg/1 Na-desoxycholat, 100 mg/L Hygromycin, 100 mg/L Cefotaxim, pH 5,5, 18 g/1 Agar) ausplattiert. Zur Isolierung einzelner gentechnisch veränderter Sporen wurden die Sporen durch ein FACS Gerät der Fa. BectonDickson (Modell Vantage+Diva Option) einzeln auf Selektivmedium abgelegt.

Herstellung genetisch veränderter Blakeslea trispora durch Agrobacterium-vermittelte Transformation Herstellung des rekombinanten Plasmids pBinAHyg Aus dem Plasmid pANsCos1 (Fig. 1, Osiewacz, 1994, Curr. Genet. 26 : 87- 90, SEQ ID NO : 4) wurde die gpdA-hph-trpC-Kassette als Bglll/Hindlll Fragment isoliert und in das mit BamHI/Hindlil geöffnete binäre Plasmid pBin19 (Bevan, 1984, Nucleic Acids Res. 12 : 8711-8721) ligiert. Der so erhaltene Vektor wurde als pBinAHyg bezeichnet (Fig. 2, SEQ ID NO : 3) und enthielt das E. coli Hygromycin-Resistenzgen (hph) unter Kontrolle des gpd Promotors (SEQ ID NO : 1) und des trpC Terminators (SEQ ID NO : 2) aus Aspergillus nidulans sowie die entsprechenden Bordersequenzen, die für den DNA-Transfer von Agrobacterium notwendig sind. Die in den weiter unten beschriebenen

Ausführungsbeispielen genannten Vektoren sind Abkömmlinge von pBinAHyg.

Übertragung von pBinAHyg und Abkömmlingen von pBinAHyg in Agrobacterium tumefaciens Nachfolgend wird beispielhaft die Übertragung des Plasmids pBinAHyg in Agrobacterien beschrieben. Die Übertragung der Abkömmlinge erfolgte analog.

Das Plasmid pBinAHyg wurde in den Agrobakterienstamm LBA 4404 (Hoekema et al., 1983, Nature 303 : 179-180) elektroporiert (Mozo and Hooykaas, 1991, Plant Mol. Biol. 16 : 917-918). Zur Selektion wurden bei der Agrobakterienanzucht folgende Antibiotika verwendet : Rifampicin 50 mg/l (Selektion auf das A. tumefaciens Chromosom), Streptomycin 30 mg/1 (Selektion auf das Helferplasmid) und Kanamycin 100 mg/1 (Selektion auf den binären Vektor).

Übertragung von pBinAHyg und Abkömmlingen von pBinAHyg in Blakeslea trispora Zur Transformation wurden die Agrobakterien nach 24 h Anzucht in AMM auf eine OD660 von 0,15 in Induktionsmedium (IM : MM-Salze, 40 mM MES (pH 5,6), 5 mM Glucose, 2 mM Phosphat, 0,5% Glycerol, 200 uM Acetosyringone) verdünnt und erneut über Nacht in IM bis zu einer OD660 von ca. 0,6 angezogen.

Zur Co-Inkubation von Blakeslea trispora (B. t. ) und Agrobacterium tumefaciens (A. t. ) wurden 100 pl Agrobakteriensuspension mit 100 pl Blakeslea Sporensuspension (107 Sporen/ml in 0,9% NaCI) gemischt und steril auf einer Nylon Membran (Hybond N, Amersham) auf IM-Agarose Platten (IM + 18 g/1 Agar) verteilt. Nach 3 Tagen Inkubation bei 26 °C

wurde die Membran auf eine MEP-Agarplatte (30 g/1 Malzextrakt, 3 g/1 Pepton, pH 5,5, 18 g/1 Agar) überführt.

Zur Selektion auf transformierte Blakeslea-Zellen enthielt das Medium Hygromycin in einer Konzentration von 100 mg/l sowie zur Selektion gegen Agrobakterien 100 mg/ ! Cefotaxim. Die Inkubation erfolgte für ca. 7 Tage bei 26 °C. Anschließend erfolgte der Transfer von Mycel auf frische Selektionsplatten. Gebildete Sporen wurden mit 0,9% NaCl abgespült und auf CM17-1-Agar (3 g/l Glucose, 200 mg/ ! L-Asparagin, 50 mg/I MgS04 x 7H20,150 mg/l KH2PO4, 25 µg/l Thiamin-HCl, 100 mg/l Yeast Extract, 100 mg/l Na-desoxycholat, pH 5,5, 100 mg/l Cefotaxim, 100 mg/1 Hygromycin, 18 g/ ! Agar) ausplattiert. Die Übertragung von Sporen auf frische Selektionsplatten wurde dreimal wiederholt. Auf diese Weise wurde die Transformante Blakeslea trispora GVO 3005 isoliert. Alternativ erfolgte zur Selektion der GVO (gentechnisch veränderten Organismen) die Einzelablage der Sporen durch den BectonDickinson FacsVantage+Diva Option auf CM-17 Agar mit 100 mg/1 Cefotaxim, 100 mg/1 Hygromycin. In diesem Fall wurde nur dort Pilzmycel gebildet, wo die Sporen gentechnisch verändert waren.

Nachweis der genetischen Veränderung durch Übertragung von pBinAHyg und Abkömmlingen von pBinAHyg in Blakeslea trispora Nachfolgend wird beispielhaft der Nachweis der Übertragung für pBinAHyg in Blakeslea trispora beschrieben. Der Nachweis der Übertragung der Abkömmlinge erfolgte analog.

200 ml MEP-Medium (30 g/l Malzextrakt, 3 g/1 Pepton, pH 5,5) wurden mit 105 bis 107 Sporen der Transformante Blakeslea trispora GVO 3005 beimpft und 7 Tage bei 26 °C mit 200 Upm auf einem Rundschüttler inkubiert. Zum Nachweis der erfolgreichen Transformation wurde DNA aus dem Mycel isoliert (Peqlab Fungal. DNA Mini Kit) und in einer PCR

(Programm : 94 °C 1 min, dann 30 Zyklen mit 1 min. 94°C, 1 min. 58 °C, 1 min. 72 °C) eingesetzt.

Zum Nachweis des Hygromycinresistenzgens (hph) wurden die Primer hph-forward (5'-CGATGTAGGAGGGCGTGGATA, SEQ ID NO : 5) und hph-reverse (5'-GCTTCTGCGGGCGATTTGTGT, SEQ ID NO : 6) verwendet. Das erwartete Fragment von hph wies eine Länge von 800 bp auf.

Zur Amplifikation des Kanamycinresistenzgens nptill und damit als Kontrolle auf Agrobakterien wurden die Primer nptlll-forward (5'- TGAGAATATCACCGGAATTG, SEQ ID NO : 7) und nptlll-reverse (5'- AGCTCGACATACTGTTCTTCC, SEQ ID NO : 8) verwendet. Das erwartete Fragment von nptill wies eine Länge von 700 bp auf.

Zur Amplifikation eines Fragmentes des Glycerinaldehyd-3- phosphatdehydrogenasegens gpd1 und damit als Kontrolle auf Blakeslea trispora wurden die Primer MAT292 (5'- GTGAATGGAAATCCCATCGCTGTC, SEQ ID NO : 9) und MAT293 (5'- AGTGGGTACTCTAAAGGCCATACC, SEQ ID NO : 10) verwendet. Das erwartete Fragment von gpd1 wies eine Länge von 500 bp auf.

Das Ergebnis der PCR der Blakeslea trispora DNA ist in Fig. 3 anhand eines Standard-Gels gezeigt. Die Spuren des Gels wurden folgendermaßen belegt : 1) 100 bp Größenmarker (100 bp-1 kb) 2) B. t. GVO 3005 primer nptlll-for/nptlll-rev 3) B. t. GVO 3005 primer hph-for/hph-rev 4) B. t. GVO 3005 primer MAT292/MAT293 (gpd) 5) A. t. mit Plasmid pBinAHyg primer nptlll-for/nptlll-rev

6) A. t. mit Plasmid pBinAHyg primer hph-for/hph-rev 7) B. t. 14272 WT primer nptlll-for/nptlll-rev 8) B. t. 14272 WT primer hph-for/hph-rev 9) B. t. 14272 WT primer MAT292/MAT293 (gpd) In der DNA von Blakeslea trispora wurde das Hygromycinresistenzgens (hph) und als Positivkontrolle Glycerinaldehyd-3- phosphatdehydrogenasegen (gpd1) nachgewiesen. nptlll konnte demgegenüber nicht nachgewiesen werden.

Somit wurde die genetische Veränderung von Blakeslea trispora durch Agrobacterium-vermittelte Transformation nachgewiesen.

Isolierung homokaryotischer GVO von Blakeslea trispora : Durch erfolgreichen Transfer des Vectors pBinAHyg und Abkömmlingen von pBinAHyg in Blakeslea trispora entstehen genetisch veränderte Organismen (GVO) von Blakeslea trispora. Jedoch liegen in Blakeslea in allen Stadien des vegetativen und des sexuellen Zellzyklus mehrkernige Zellen vor. Daher erfolgt die Insertion der Fremd-DNA in der Regel nur in einem Kern. Ziel ist es, Stämme von Blakeslea zu erhalten, bei denen die Insertion der Fremd-DNA in allen Kernen vorliegt, d. h. Ziel ist ein homonukleates rekombinantes Pilzmycel.

1) Herstellung homonukleater rekombinanter Stämme durch FACS (fluorescence-activated cell sorting) Ein geringer Anteil der Sporen von Blakeslea trispora bzw. der gentechnisch veränderten Stämme von Blakeslea trispora ist von Natur aus einkernig. Zur Herstellung homonukleater rekombinanter Stämme, die Fremd-DNA von pBinAHyg oder pBinAHyg-Abkömmlingen enthielten, wurden die einkernigen Sporen durch FACS aussortiert und auf MEP (30 g/1 Malzextrakt, 3 g/l Pepton, pH 5,5, 18 g/l Agar) mit 100 mg/1 Cefotaxim

und 100 mg/1 Hygromycin plattiert. Die hier gebildten Mycelien waren homonukleat. Zur Sortierung mit FACS wurden die Sporen eines 3 Tage alten Ausstriches mit 10 ml Tris-HCI 50mMol + 0, 1% Span20 pro Agar- Platte abgeschwemmt. Die Sporenkonzentration betrug 0,5 bis 0,8 x 107 Sporen pro ml. Zu 9 mi Sporensuspension wurden 1ml DMSO und 10 pl Syto 11 (Farbstoff-Stammlösung in DMSO Molecular Probes Nr. S-7573) zugegeben. Danach wurde 2 h bei 30°C gefärbt. Selektion und Ablage erfolgten mittels eines Gerätes vom Typ FacsVantage+Diva Option Fa.

Becton Dickinson. Die Selektion erfolgte zuerst nach Größe, um einzelne Sporen von Aggregaten und Verunreinigungen zu trennen. Dann wurden diese Sporen nach ihrer Fluoreszenz (Anregung = 488nm ; Emission = 530 nm) sortiert abgelegt. Die linke Schulter der Gauß-Kurve der Fluoreszenzhäufigkeitsverteilung enthielt die einkernigen Sporen.

2) Herstellung homonukleater Stämme durch Kernreduktion und Selektion mit FACS Zur Reduzierung der Anzahl von Kernen pro Spore wurde vor der Selektion eine Behandlung von Sporensuspensionen mit MNNG (N- Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin) durchgeführt, und so durch chemische Mutagenese eine Kernreduktion erzielt.

Hierfür wurde zunächst eine Sporensuspension mit 1 x 107 Sporen/ml in Tris/HCI-Puffer, pH 7,0 hergestellt. Der Sporensuspension wurde MNNG in einer Endkonzentration von 100 pg/ml zugegeben. Die Zeit der Inkubation in MNNG wurde so gewählt, dass die Überlebensrate der Sporen ca. 5% betrug. Nach Inkubation mit MNNG wurden die Sporen dreimal mit 1g/l Span 20 in 50 mM Phosphatpuffer pH 7,0 gewaschen und nach der unter 1) beschriebenen Methode sortiert bzw. selektiert.

Alternativ konnten zur Reduktion der Kernzahl in den Sporen auch Röntgen-und UV-Strahlen eingesetzt werden, wie es von Cerdä-Olmedo und Patricia Reau in Mutation Res., 9 (1970), 369-384 beschrieben wurde.

3) Herstellung homonukleater Stämme durch Selektion auf rezessive Selektionsmarker Als rezessiver Selektionsmarker zur Selektion homonukleater Mycelien kommt beispielsweise der rezessive Selektionsmarker pyrG in Frage.

Wildtyp-Stämme von Blakeslea trispora sind pyrG+. Diese Stämme können nicht in Gegenwart des Pyrimidin-Analogs 5-Fluororotat (FOA) wachsen, weil sie FOA durch die Orotidin-5'-monophosphatdecarboxylase zu lethalen Metaboliten umsetzen. Gentechnisch veränderte Blakesleaa, die homonukleat pyrG-sind, fehlt die Enzymaktivität Orotidin-5'- monophosphatdecarboxylase. Folglich können diese pyrG--Stämme 5- Fluororotat nicht verwerten. Die Stämme wachsen daher in Gegenwart von FOA und Uracil. Im Fall der Kopplung der Mutation pyrG-und der Insertion von Fremd-DNA auf dem Kern einer einkernigen Spore, kann aus dieser Spore homonukleates rekombinantes Pilzmycel gebildet werden.

Zunächst wurde durch Insertion eines Fragmentes von pyrG (SEQ ID NO : 65) aus Blakeslea trispora in pBinAHyg das Plasmid pBinAHygBTpyrG- SCO (SEQ ID NO : 36, Fig. 4) erzeugt. Dieses Plasmid wurde in Blakelea trispora transformiert und führte dort durch homologe Rekombination zur Disruption von pyrG.

Homonukleate GVO von Blakeslea trispora mit dem Phänotyp pyrG- wurden folgendermaßen selektiert. Zur Agrobakterium-vermittelten Transformation von pBinAHygBTpyrG-SCO wurde wie oben beschrieben auf MEP (30 g/l Malzextrakt, 3 g/l Pepton, pH 5,5, 18 g/1 Agar) mit 100 mg/1 Cefotaxim und 100 mg/l Hygromycin plattiert. Die Sporen der

Transformanten wurden mit 10 ml Tris-HCI 50mM + 0,1% Span20 pro Agar-Platte abgeschwemmt. Die Sporenkonzentration betrug 0,5 bis 0,8 x 107 Sporen pro ml. Die Sporen wurden anschließend auf FOA-Medium mit 100 mg/1 Cefotaxim und 100 mg/ ! Hygromycin ausplattiert. FOA-Medium enthielt pro Liter 20 g Glucose, 1 g FOA, 50 mg Uracil, 200 ml Citrat-Puffer (0,5 M, pH 4,5) und 40 mi Spurensalzlösung nach Sutter, 1975, PNAS, 72 : 127). Homonukleate pyrG--Mutanten zeigten Wachstum auf dem Uracil-haltigen FOA-Medium ; aber kein Wachstum bei Plattierung auf FOA-Medium ohne Uracil. Auf die gleiche Weise wurden aus den im folgenden beschriebenen GVO von Blakeslea trispora zur Herstellung von Xanthophyllen homonukleate GVO hergestellt.

Alternativ ist es möglich die Sporen analog zur Vorschrift von Roncero et al. auf Medium mit 5-Carbon-5-deazariboflavin zu plattieren, das zusätzlich Hygromycin enthält (Roncero et al., 1984, Mutation Research, 125 : 195-204). Hierdurch werden homokaryonte Zellen des Genotyps hygR und dar selektiert. Nach diesem Prinzip werden homokaryonte Stämme von Blakeslea trispora mit dem Phänotyp hygR und dar erzeugt.

Ausführungsbeispiele zur Herstellung von gentechnisch veränderten Organismen von Blakeslea trispora für die Herstellung von Carotinoiden und Carotinoidvorstufen Die Erzeugung der im folgenden genannten Plasmide erfolgte durch die Methode"overlap-extension PCR"und durch anschließende Insertion der Amplifikationsprodukte in das Plasmid pBinAHyg. Die Methode"overlap- extension PCR"erfolgte wie in Innis et al. (Eds. ) PCR protocols : a guide to methods and applications, Academic Press, San Diego beschrieben. Die Transformation der pBinAHyg-Abkömmlinge und die Herstellung

homonukleater gentechnisch veränderter Stämme von Blakeslea trispora erfolgte wie oben beschrieben.

Gentechnisch veränderte Stämme von Blakeslea trispora zur Herstellung von Zeaxanthin Folgende Plasmide (Abkömmlinge von pBinAHyg) wurden zur gentechnischen Veränderung von Blakeslea trispora für die Herstellung von Zeaxanthin verwendet, codieren also u. a. Hydroxylasen (crtZ) : p-tefl-HPcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ (SEQ ID NO : 70) aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 (Accession No. AF162276) unter Kontrolle des ptef1 Promotors aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpTEF1-HPcrtZ, SEQ ID NO : 37, Fig. 5) ; p-carRA-HPcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 unter Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHyg- BTpcarRA-HPcrtZ, SEQ ID NO : 38, Fig. 6) p-carB-HPcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 unter Kontrolle des Promotors pcarB aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarB- HPcrtZ, SEQ ID NO : 39, Fig. 7) -p-carRA-HPcrtZ-TAG-3'carA-IR, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 unter Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora.

Stromabwärts des Gens der Hydroxylase ist eine Inverted-Repeat- Struktur lokalisiert, die aus dem 3'-Ende von carA und der stromabwärts von carA gelegenen Region stammt (IR, SEQ ID NO : 74, Inverted Repeat 1'ca. 350 bp von carA, dann ca. 200 bp, Loop' und anschließend ca. 350 bp, Inverted Repeat 2') (Seq. pBinAHyg- BTpcarRA-HPcrtZ-TAG-3'carA-IR, SEQ ID NO : 40, Fig. 8) ;

p-carRA-HPcrtZ-GCG-3'carA-IR, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 unter Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora. Das Gen der Hydroxylase ist mit einer Inverted-Repeat-Struktur fusioniert, die aus dem 3'-Ende von carA und der stromabwärts von carA gelegenen Region stammt (IR, SEQ ID NO : 74,, Inverted Repeat 1' ca. 350 bp von carA, dann ca. 200 bp, Loop'und anschließend ca.

350 bp, Inverted Repeat 2'). Das abgeleitete Fusionsprotein besteht folglich aus der Hydroxylase von Haematococcus pluvialis und dem Carboxyterminus von CarA aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHyg- BTpcarRA-HPcrtZ-GCG-3'carA-IR, SEQ ID NO : 41, Fig. 9) ; p-tef1-EUcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase EUcrtZ (SEQ ID NO : 71) aus Erwinia uredova 20D3 (Accession No. D90087) unter Kontrolle des ptef1 Promotors (Seq. pBinAHygBTpTEF1-EUcrtZ, SEQ ID NO : 42, Fig. 10) ; p-carRA-EUcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase EUcrtZ aus Erwinia uredova 20D3 unter Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarRA-EUcrtZ, SEQ ID NO : 43, Fig. 11) ; p-carB-EUcrtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase EUcrtZ aus Erwinia uredova 20D3 unter Kontrolle des Promotors pcarB aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarB-EUcrtZ, SEQ ID NO : 44, Fig. 12) ; p-gpdA-HPcrtZ-t-crtZ, enthaltend Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 unter Kontrolle des gpdA Promotors und des Terminators t-crtZ ; d. h. des stromabwärts von crtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 gelegenen Sequenzabschnitts (SEQ ID NO : 73) (Seq. pBinAHyg-gpdA-HPcrtZ- tcrtZ, SEQ ID NO : 45, Fig. 13).

p-gpdA-BTcarR-HPcrtZ-BTcarA, enthaltend Genfusion aus Genen der Lycopincyclase carR aus Blakeslea trispora, der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 und der Phytoensynthase carA aus Blakeslea trispora unter Kontrolle des gpdA Promotors aus Aspergillus nidulans (Seq. pBinAHyg- carR crtZ carA, SEQ ID NO : 46, Fig. 14) ; Herstellung gentechnisch veränderter Stämme von Blakeslea trispora zur Herstellung von Canthaxanthin Folgende Plasmide (Abkömmlinge von pBinAHyg) wurden zur gentechnischen Veränderung von Blakeslea trispora für die Herstellung von Canthaxanthin verwendet, codieren also u. a. Ketolasen (crtW) : -p-tef1-NPcrtW, enthaltend das Gen der Ketolase NPcrtW (SEQ ID NO : 72) aus Nostoc punctiforme PCC73102 (ORF148, Accesion No. NZAABC01000196) unter Kontrolle des ptef1 Promotors aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpTEF1-NpucrtW, SEQ ID NO : 47, Fig. 15) ; p-carRA-NPcrtW, enthaltend das Gen der Ketolase NPcrtW aus Nostoc punctiforme PCC73102 unter der Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarRA-NpucrtW, SEQ ID NO : 48, Fig. 16) ; p-carB-NPcrtW, enthaltend das Gen der Ketolase NPcrtW aus Nostoc punctiforme PCC73102 unter der Kontrolle des Promotors pcarB aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarB-NpucrtW, SEQ ID NO : 49, Fig. 17) ; Herstellung gentechnisch veränderter Stämme von Blakeslea trispora zur Herstellung von Astaxanthin Folgende Plasmide (Abkömmlinge von pBinAHyg) wurden zur gentechnischen Veränderung von Blakeslea trispora für die Herstellung

von Astaxanthin verwendet, codieren also u. a. für Hydroxylasen (crtZ) und Ketolasen (crtW) : -p-carRA-HPcrtZ-pcarRA-NPcrtW, enthaltend das Gen der Hydroxylase HPcrtZ aus Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144 und das Gen der Ketolase NPcrtW aus Nostoc punctiforme PCC73102 (ORF148, Accesion No. NZ_MBC01000196) beide jeweils unter Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarRA-HPcrtZ-BTpcarRA-NpucrtW, SEQ ID NO : 50, Fig. 18) ; -p-carRA-EUcrtZ-pcarRA-NPcrtW, enthaltend das Gen der Hydroxylase EUcrtZ aus Erwinia uredova20D3 (Accession No.

D90087) und das Gen der Ketolase NPcrtW aus Nostoc punctiforme PCC73102 beide jeweils unter Kontrolle des Promotors pcarRA aus Blakeslea trispora (Seq. pBinAHygBTpcarRA-EUcrtZ- BTpcarRA-NpucrtW, SEQ ID NO : 51, Fig. 19) ; Klonierung und Sequenzanalyse von Genen und Promotoren, die beispielhaft für die gentechnische Veränderung von Blakeslea trispora genutzt werden können.

Nachfolgend werden beispielhaft die Klonierung und Sequenzierung verschiedener Gene und Promotoren aus Blakeslea trispora beschrieben.

Klonierung und Sequenzanalyse ptef1 Die Klonierung von p-tef aus Blakeslea trispora erfolgte auf der Grundlage einer bereits in GenBank veröffentlichten Sequenz des Strukturgens für den Translations-Elongationsfaktor 1-a aus Blakeslea trispora (AF157235). Ausgehend von dem Sequenzeintrag AF157235 wurden Primer für die inverse PCR ausgewählt, um die stromaufwärts des Strukturgens gelegene Promotoregion zu amplifizieren und zu sequenzieren.

In der inversen nested PCR an 200 ng Xhol-gespaltener und zirkularisierter genomischer DNA von Blakeslea trispora ATCC14272 wurde ein 3000-bp-Fragment in folgendem Ansatz erhalten : Matrizen-DNA (1 pg genomische DNA von Blakeslea trispora ATCC 14272) Primer MAT344 5'-GGCGTACTTGAAGGAACCCTTACCG-3' (SEQ ID NO : 63) und MAT 345 5'-ATTGATGCTCCCGGTCACCGTGATT-3' (SEQ ID NO : 64) je 0, 25 uM, 100 uM dNTP, 10 pl Herculase-Polymerasepuffer 10x, 5 U Herculase (Zugabe bei 85 °C), H20 ad 100 ul. Das PCR-Profil war 95 °C, 10 min (1 Zyklus) ; 85 °C, 5 min (1 Zyklus) ; 60 °C, 30 s. 72 °C, 60 s, 95 °C, 30 s (30 Zyklen) ; 72 °C, 10 min (1 Zyklus). Der Sequenzabschnitt, der stromaufwärts des vermutlichen Startcodons des Gens tef1 innerhalb 3000-bp-Fragmentes liegt, wurde als Promotor ptef1 bezeichnet.

Klonierung Sequenzanalyse des Gens der HMG-CoA-Reduktase aus Blakeslea trispora Zunächst wurde mit dem Cosmidvektor pANsCos1 eine Genbank von Blakeslea trispora ATCC 14272, Mating Type (-) hergestellt. Der Vektor wurde durch Spaltung mit Xbal linearisiert und anschließend dephosphoryliert. Eine weitere Spaltung mit mit BamH1 schuf die Insertionsstelle, in welche die mit Sau3AI partiell gespaltene und dephosphorylierte genomische DNA von Blakeslea trispora ligiert wurde.

Die derart gebildeten Cosmide wurden anschließend in vitro verpackt und in Escherichia coli übertragen.

Auf der Grundlage der bekannten Sequenz eines Fragmentes des HMG- CoA-Reduktase codierenden Gens aus Blakeslea trispora (Eur. J.

Biochem 220,403-408 (1994)) wurde eine 315-bp-DNA-Sonde durch folgende PCR hergestellt. Reaktionsansatz : 1 pg genomische DNA von Blakeslea trispora ATCC 14272, Primer MAT314 5'- CCGATGGCGACGACGGAAGGTTGTT-3' [SEQ ID NO 79] und MAT315 5'-CATGTTCATGCCCATTGCATCACCT-3' [SEQ ID NO 80] je 0,25 pM, 100 uM dNTP, 10 ut Herculase-Polymerasepuffer 10x, 5 U Herculase

(Zugabe bei 85 °C), H20 ad 100 ul. Das PCR-Profil war 95 °C, 10 min (1 Zyklus) ; 85 °C, 5 min (1 Zyklus) ; 58 °C, 30 s. 72 °C, 30 s, 95 °C, 30 s (30 Zyklen) ; 72 °C, 10 min (1 Zyklus).

Mit dieser DNA-Sonde wurde die Cosmid-Genbank durchmustert. Es wurde ein Klon identifiziert, dessen Cosmid mit der DNA-Sonde hybridisierte. Die Insertion dieses Cosmids wurde sequenziert. Die DNA- Sequenz enthielt einen Abschnitt, der dem Gen einer HMG-CoA- Reduktase zugeordnet wurde [SEQ ID NO 75].

Klonierung und Sequenzanalyse carB (carB = Gen der Phytoendesaturase aus Blakeslea trispora) Aus dem Sequenzvergleich der Peptidsequenzen von Phytoendesaturasen und dem Vergleich der zugehörigen DNA- Sequenzen von Phycomyces blakesleeanus, Cercospora nicotianae, Phaffia rhodozyma und Neurospora crassa wurden die degenerierten Primer MAT182 5'-GCNGARGGNATHTGGTA-3' (SEQ ID 52) und MAT192 5'-TCNGCNAGRAADATRTTRTG-3 (SEQ ID 53) abgeleitet. Die PCR wurde in 100 pl Ansätzen durchgeführt. Diese enthielten 200 ng genomische DNA von Blakeslea trispora ATCC14272, 1 uM MAT182,1 pM MAT192,100 pM dNTP, 10 pl Pfu-Polymerasepuffer 10x, 2,5 U Pfu- Polymerase (Zugabe bei 85 °C), H20 ad 100 pl.

Das PCR-Profil war 95 °C, 10 min (1 Zyklus) ; 85 °C, 5 min (1 Zyklus) ; 40 °C, 30 s, 72 °C, 30 s, 95 °C, 30 s (35 Zyklen) ; 72 °C, 10 min (1 Zyklus).

Hiermit wurde ein 358-bp-Fragment erhalten, dessen abgeleitete Peptidsequenz Ähnlichkeit zu den Sequenzen der Phytoendesaturasen aufwies. Durch die Methode der inversen PCR (Innis et al. in PCR protocols : a guide to methods and applications. 1990. S. 219-227) wurden nach dem Prinzip des Chromosome-Walking die Genregionen

stromaufwärts und stromabwärts des 350-bp-Fragmentes folgendermaßen amplifiziert, kloniert und sequenziert : (i) ein 1,1-kbp-Fragment durch PCR mit den Primern MAT219 5'- AAGTGACACCGGTTACACGCTTGTCTT-3' (SEQ ID 54) und MAT 220 5'-GCTTATCACCATCTGTTACCTCCTTGC-3' (SEQ ID 55) erhalten aus 200 ng EcoRl-gespaltener und zirkularisierter genomischer DNA von Blakeslea trispora ATCC14272,0, 25 pM MAT219, 0, 25 pM MAT220, 100 uM dNTP, 10 pl Herculase- Polymerasepuffer 10x, 5 U Herculase (Zugabe bei 85 °C), H20 ad 100 pl. Das PCR-Profil war 95 °C, 10 min (1 Zyklus) ; 85 °C, 5 min (1 Zyklus) ; 60 °C, 30 s. 72 °C, 60 s, 95 °C, 30 s (30 Zyklen) ; 72 °C, 10 min (1 Zyklus), (ii) ein 2,9-kbp-Fragment durch PCR mit den Primern MAT219 und MAT220 erhalten aus 200 ng Xbal-gespaltener und zirkularisierter genomischer DNA von Blakeslea trispora ATCC14272,0, 25 pM MAT219,0, 25 uM MAT220, 100 uM dNTP, 10 pI Herculase- Polymerasepuffer 10x, 5 U Herculase (Zugabe bei 85 °C), H20 ad 100 ul. Das PCR-Profil war 95 °C, 10 min (1 Zyklus) ; 85 °C, 5 min (1 Zyklus) ; 60 °C, 30 s, 72 °C, 3 min, 95 °C, 30 s (30 Zyklen) ; 72 °C, 10 min (1 Zyklus) ; Der klonierte Sequenzabschnitt ist schematisch in Fig. 20 [SEQ ID NO 77] dargestellt. Die Sequenzierung erfolgte in Strang-und Gegenstrangrichtung mit den klonierten Fragmenten sowie mit den PCR- Produkten. Die Sequenz des klonierten Sequenzabschnitts ist in Fig. 21 [SEQ ID NO 78] gezeigt.

Sequenzvergleiche Die Nukleotidsequenz von carB und die Peptidsequenz des abgeleiteten Proteins CarB wurden mit den bekannten Sequenzen verwandter Proteine verglichen. Zum Sequenzvergleich wurden die Programme GAP und BESTFIT eingesetzt.

CarB-Identische Aminoacylreste nach GAP Programmeinstellungen : Gap Weight : 8 Length Weight : 2 Average Match : 2.912 Average Mismatch : -2. 003 Dabei wurde folgende Werte für die Übereinstimmung der Aminosäuren zu CarB aus Blakeslea trispora ATCC14272 in % gefunden : Phycomyces blakesleeanus : 72,491 Phaffia rhodozyma : 50,460 Neurospora crassa : 47,943 Cercospora nicotianae : 47,740 CarB-Identische Aminoacylreste nach BESTFIT Programmeinstellungen : Gap Weight : 8 Length Weight : 2 Average Match : 2.912 Average Mismatch : -2. 003 Dabei wurde folgende Werte für die Übereinstimmung der Aminosäuren zu CarB aus Blakeslea trispora ATCC14272 in % gefunden : Phycomyces blakesleeanus : 73,380 Phaffia rhodozyma : 53,175 Neurospora crassa : 51,896 Cercospora nicotianae : 50,791 carB-Identische Basen nach GAP Programmeinstellungen : Gap Weight : 50

Length Weight : 3 Average Match : 10.000 Average Mismatch : 0.000 Dabei wurde folgende Werte für die Übereinstimmung der Basen zu CarB aus Blakeslea trispora ATCC14272 in % gefunden : Phycomyces blakesleeanus : 64,853 Cercospora nicotianae : 50,143 Phaffia rhodozyma : 43,179 Neurospora crassa : 42,130 carB-Identische Basen nach BESTFIT Programmeinstellungen : Gap Weight : 50 Length Weight : 3 Average Match : 10.000 Average Mismatch : -9. 000 Dabei wurde folgende Werte für die Übereinstimmung der Basen zu CarB aus Blakeslea trispora ATCC14272 in % gefunden : Phycomyces blakesleeanus : 68,926 Phaffia rhodozyma : 62,403 Neurospora crassa : 60,230 Cercospora nicotianae : 56,884 Klonierung zur Expression von carB Zur Klonierung und Expression von carB aus Blakeslea trispora wurden von dem oben beschriebenen klonierten Sequenzabschnitt aus Blakeslea trispora in sechs Leserastern die möglichen Proteinsequenzen abgeleitet.

Diese Proteinsequenzen wurden mit den Sequenzen der Phytoendesaturasen aus Phycomyces blakesleeanus, Phaffia rhodozyma, Neurospora crassa, Cercospora nicotianae verglichen. Auf der Grundlage des Sequenzvergleiches wurden im klonierten Sequenzabschnitt der

genomischen DNA von Blakeslea trispora drei Exons identifiziert, die zusammengefügt eine codierende Region ergeben, deren abgeleitetes Genprodukt über die gesamte Länge 72, 7% identische Aminoacylreste mit der Phytoendesaturase CarB aus Phycomyces blakesieeanus aufweist.

Dieser Sequenzabschnitt aus drei möglichen Exons und zwei möglichen Introns wurde daher als Gen carB bezeichnet. Zur Überprüfung der vorhergesagten Genstruktur wurde die codierende Sequenz von carB aus Blakeslea trispora durch PCR mit cDNA von Blakeslea trispora als Matrize und mit den Primern Bol1425 5'- AGAGAGGGATCCTTAAATGCGAATATCGTTGC-3' (SEQ ID 56) und Bol1426 5'-AGAGAGGGATCCATGTCTGATCAAAAGAAGCA-3' (SEQ ID 57) erzeugt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde sequenziert. Die Lokalisation von Exons und entrons wurde durch Vergleich der cDNA mit der genomischen DNA von carB bestätigt. In Fig. 21 ist die codierende Sequenz von carB schematisch dargestellt. Zur Expression von carB in Escherichia coli wurde zunächst die Ndel-Schnittstelle in carB durch die Methode overlap extension PCR entfernt sowie am 5'-Ende des Gens eine Ndel-Schnittstelle und am 3'-Ende eine BamHI-Schnittstelle eingefügt.

Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit dem Vektor pJOE2702 ligiert.

Das erhaltene Plasmid wurde als pBT4 bezeichnet und zusammen mit pCAR-AE in Escherichia coli XL1-Blue kloniert. Die Expression erfolgte durch Induktion mit Rhamnose. Der Nachweis der Enzymaktivität erfolgte durch Nachweis der Lycopinsynthese via HPLC. Die Klonierungsschritte sind im folgenden beschrieben : PCR 1.1 : Ca. 0,5 pg cDNA von Blakeslea trispora, 0,25 pM MAT350 5'- ACTTTATTGGATCCTTAAATGCGAATATCGTTGCTGC-3' (SEQ ID 58), 0,25 uM MAT244 5'- GTTCCAATTGGCCACATGAAGAGTAAGACAGGAAACAG-3' (SEQ ID 59), 100 uM dNTP, 10 pl Pfu-Polymerase-Puffer (10x), 2,5 U Pfu- Polymerase (Zugabe bei 85 °C,"hot start") und H20 ad 100pL.

Temperaturprofil : 1. 95 °C 10 min, 2. 85 °C 5 min, 3. 40 °C 30s, 4. 72 °C 1 min 30 s, 5.95 °C 30 s, 6. 50 °C 30 s, 7. 72 °C 1 min 30 s, 8. 95 °C 30 s, 9. 72 °C 10min Zyklen : (1-2.) 1x, (3-5. ) 5x, (6-8. ) 25x, (9.) 1x PCR1. 2 : Ca. 0,5 lig cDNA von Blakeslea trispora, 0, 25 pM MAT243 5'- CCTGTCTTACTCTTCATGTGGCCAATTGGAACCAACAC-3' (SEQ ID 60), 0, 25 uM MAT353 5'- CTATTTTAATCATATGTCTGATCAAAAGAAGCATATTG-3' (SEQ ID 61), 100 pM dNTP, 10 pl Pfu-Polymerase-Puffer (1Ox), 2,5 U Pfu-Polymerase (Zugabe bei 85 °C,"hot start") und H20 ad 100 pL.

Temperaturprofil : 1. 95 °C 10 min, 2. 85 °C 5 min, 3. 40 °C 30s, 4.72 °C 1 min 30 s, 5.95 °C 30 s, 6. 50 °C 30 s, 7. 72 °C 1 min 30 s, 8. 95 °C 30s, 9. 72 °C 10min Zyklen : (1-2.) 1x, (3-5. ) 5x, (6-8. ) 25x, (9.) 1x Reinigung der PCR-Fragmente aus PCR 1.1, 1.2 Dazu wurde PCR 2 zur Herstellung der codierenden Sequenz von carB aus Blakeslea trispora für die Kionierung in pJOE2702 durchgeführt : Ca. 50 ng Produkt aus PCR 1.1 und ca. 50 ng Produkt aus PCR1.2 mit 0,25 µM MAT350 (5'- ACTTTATTGGATCCTTAAATGCGAATATCGTTGCTGC-3'SEQ ID NO 58), 0, 25 uM MAT353 (5'- CTATTTTAATCATATGTCTGATCAAAAGAAGCATATTG-3'SEQ ID NO 61), 100 uM dNTP, 10 pL Pfu-Polymerase-Puffer (10x), 2,5 U Pfu- Polymerase (Zugabe bei 85 °C,"hot start") und H20 ad 100 pL.

Temperaturprofil : 1. 95°C 10 min, 2. 85°C5min, 3. 59°C30s, 4. 72 °C 2 min, 5. 95 °C 30 s, 6. 72°C 10 min Zyklen : (1-2.) 1x, (3-5. ) 22x, (6.) 1x

Anschließend erfolgte eine Reinigung des erhaltenen Fragmentes (-1, 7 kbp), eine Ligation in Vektor pPCR-Script-Amp, eine Klonierung in Escherichia coli XL1-Blue, Sequenzierung der Insertion, Spaltung mit Ndel und BamH1 sowie eine Ligation in pJOE2702. Das erhaltene Plasmid wurde als pBT4 bezeichnet.

Charakterisierung und Nachweis der Enzymaktivität von CarB (Phytoendesaturase) Das von carB abgeleitete Genprodukt wurde als CarB bezeichnet. CarB weist auf Grundlage der Peptidsequenzanalyse folgende Eigenschaften auf : Länge : 582 Aminoacylreste Molekulare Masse : 66470 Isoelektrische Punkt : 6,7 Katalytische Aktivität : Phytoendesaturase Edukt : Phytoen Produkt : Lycopin EC-Nummer : EC 1.14. 99- Der Nachweis der Enzymaktivität erfolgte in vivo. Wenn das Plasmid (pCAR-AE) in Escherichia coli XL1-Blue übertragen wird, entsteht der Stamm Escherichia coli XL1-Blue (pCAR-AE). Dieser Stamm synthetisiert Phytoen. Wenn zusätzlich das Plasmid pBT4 in Escherichia coli XL1-Blue übertragen wird, entsteht der Stamm Escherichia coli XL1-Blue (pCAR- AE) (pBT4). Da ausgehend von carB eine enzymatisch aktive Phytoendesaturase gebildet wird, produziert dieser Stamm Lycopin.

Die Plasmide pCAR-AE und pBT4 wurden daher in Escherichia coli übertragen. Nach Wachstum in Flüssigkultur wurden die Carotinoide aus den Zellen extrahiert und charakterisiert (vgl. oben).

Durch HPLC Analyse wurde nachgewiesen, daß der Stamm Escherichia coli XL1-Blue (pCAR-AE) Phytoen und der Stamm Escherichia coli XL1- Blue (pCAR-AE) (pBT4) Lycopin produziert. CarB weist folglich die Enzymaktivität einer Phytoendesaturase auf.

Herstellung gentechnisch veränderter Stämme von Blakeslea trispora zur Herstellung von Phytoen Nachfolgend werden beispielhaft die Herstellung von gentechnisch veränderten Organismen zur Herstellung von Phytoen beschrieben.

Vector pBinAHygAcarB zur Erzeugung von carB--Mutanten von Blakeslea trispora Für die Deletion von carB in Blakeslea trispora wurde der Vektor pBinAHygAcarB (SEQ. ID. NO : 62, Fig. 22) konstruiert. Der Vorläufer von pBinAHygAcarB ist pBinAHyg (SEQ. ID. NO : 3, Fig. 2). pBinAHyg wurde folgendermaßen konstruiert : Aus dem Plasmid pANsCos1 (SEQ. ID. NO : 4, Fig. 1, Osiewacz, 1994, Curr. Genet. 26 : 87-90) wurde die gpdA-hph Kassette als Bgill/Hindlil Fragment isoliert und in das BamHI/Hindlll geöffnete binäre Plasmid pBin19 (Bevan, 1984, Nucleic Acids Res. 12 : 8711-8721) ligiert. Der so erhaltene Vektor wurde als pBinAHyg bezeichnet und enthält das E. coli Hygromycin-Resistenzgen (hph) unter Kontrolle des gpd Promotors und des trpC Terrminators aus Aspergillus nidulans sowie die entsprechenden Bordersequenzen, die für den DNA-Transfer von Agrobacterium notwendig sind.

Die Amplifikation der codierenden Sequenz von carB mit den Primern MAT350 und MAT353 mittels PCR wurde mit den folgenden Parametern durchgeführt : 50 ng pBT4 mit 0, 25 uM MAT350 (5'-ACTTTATTGGATCCTTAAAT- GCGAATATCGTTGCTGC-3' ; SEQ ID NO 58), 0, 25 uM MAT353 (5'-

CTATTTTAATCATATGTCTGATCAAAAGAAGCATATTG-3' ; SEQ ID NO 61), 100 uM dNTP, 10 pL Pfu-Polymerase-Puffer, 2,5 U Pfu-Polymerase (Zugabe bei 85 °C,"hot start") und ad 100 uL H20 Temperaturprofil : 1. 95 °C 10 min, 2. 85 °C 5 min, 3.58 °C 30s, 4. 72°C 2 min, 5. 95 °C 30s, 6. 72 °C 10 min.

Zyklen : (1.-2.) 1x, (3-5. ) 30x, (6.) 1x Anschließend erfolgte eine Reinigung des erhaltenen Fragmentes (-1, 7 kbp), eine Spaltung mit Hindlll, eine weitere Reinigung des 364-bp-Hindlll- Fragments-carB, gefolgt von einer Spaltung von pBinAHyg mit Hindlll, eine Ligation von 364-bp-Hindlil-Fragments-carB in pBinAHyg, eine Transformation des Vektors in Escherichia coli und eine Isolierung des Konstruktes und Bezeichnung als pBinAHygAcarB wie oben beschrieben.

Alternativ erfolgte eine partielle Spaltung mit Hindill und die Klonierung eines größeren Hindill-Fragmentes aus carB in pBinAHyg zur Herstellung von pBinAHygAcarB.

Erzeugung von carB--Mutanten von Blakeslea trispora Zunächst wurde das Plasmid pBinAHygAcarB in den Agrobakterienstamm LBA 4404 übertragen, z. B. durch Elektroporation (vgl. oben). Anschließend wurde das Plasmid von Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 in Blakeslea trispora ATCC 14272 und in Blakeslea trispora ATCC 14271 übertragen (vgl. oben). Der erfolgreiche Nachweis des Gentransfers in Blakesleslea trispora erfolgte über Polymerase- Kettenreaktion nach folgendem Protokoll : Ca. 0,5 ug DNA aus Blakeslea trispora ATCC 14272 carB-bzw. ATCC 14271 carB-wurden mit 0, 25 uM Primer hph forward (5'- CGATGTAGGAGGGCGTGGATA-3' ; SEQ ID NO 5), 0, 25 uM Primer hph reverse (5'-GCTTCTGCGGGCGATTTGTGT-3'; SEQ ID NO 6), 100 uM

dNTP, 10 pL Herculase-Polymerase-Puffer, 2,5 U Herculase-DNA- Polymerase (Zugabe bei 85 °C,"hot start") und ad 100 ul H20 umgesetzt.

Temperaturprofil : 1. 95°C 10 min, 2. 85 °C 5 min, 3. 58 °C 1 min, 4.72 °C 1 min, 5.94 °C 1 min, 6. 72°C 10 min.

Zyklen : (1.-2.) 1x, (3-5. ) 30x, (6.) 1x Als Negativkontrolle wurde eine Amplifikation des Kanamycinresistenzgens aus Agrobacterium versucht. Dazu wurden folgende PCR-Bedingungen verwendet : Ca. 0, 5 pg DNA aus Blakesiea trispora ATCC 14272 carB-bzw. ATCC 14271 carB-wurden mit 0, 25 uM Primer nptlll forward (5'- TGAGAATATCACCGGAATTG-3' ; SEQ ID NO 7), 0,25 uM Primer nptlll reverse (AGCTCGACATACTGTTCTTCC-3' ; SEQ ID NO 8), 100 pM dNTP, 10 pL Herculase-Polymerase-Puffer, 2,5 U Herculase-DNA- Polymerase (Zugabe bei 85 °C,"hot start") und ad 100 uL H20 umgesetzt.

Temperaturprofil : 1. 95 °C 10 min, 2. 85 °C 5 min, 3. 58 °C 1 min, 4.72 °C 1 min, 5.94 °C 1 min, 6.72 °C 10 min- Zyklen : (1-2.) 1x, (3-5. ) 30x, (6.) 1x Produktion von Carotinoiden und Carotinoidvorstufen mit Blakeslea trispora Zur Produktion der Carotinoide Zeaxanthin, Canthaxanthin, Astaxanthin und Phytoen wurden die entsprechenden gentechnisch veränderten Blakeslea trispora (+) und (-) Stämme fermentiert, das produzierte Carotinoid mittels HPLC Analyse nachgewiesen und isoliert.

Das Flüssigmedium zur Produktion von Carotinoiden enthielt pro Liter : 19 g Maismehl, 44 g Sojamehl, 0,55 g KH2P04, 0,002 g Thiaminhydochlorid, 10 % Sonnenblumenöl. Der pH wurde mit KOH auf 7,5 eingestellt.

Zur Herstellung der Carotinoiden wurden Schüttelkolben mit Sporensuspensionen von (+) und (-) Stämmen der GVO von Blakeslea trispora beimpft. Die Schüttelkolben wurden bei 26 °C mit 250 rpm für 7 Tage inkubiert. Alternativ wurde zu Mischungen der Stämme nach 4 Tagen Trisporsäuren zugegeben und weitere 3 Tage inkubiert. Die Endkonzentration der Trisporsäuren betrug 300-400 ug/ml.

Extraktion und Analytik Extraktion : 1. Entnahme von 10 mi Kultursuspension 2. Zentrifugation, 10 min, 5.000 x g 3. Verwerfen des Überstandes 4. Resuspendierung des Pellets in 1 ml Tetrahydrofuran (THF) durch Vortexen 5. Zentrifugation, 5 min, 5.000 x g 6. Abnahme der THF-Phase 7. Wiederholung der Schritte 4. -6. (2 x) 8. Vereinigung der THF-Phasen 9. Zentrifugation der vereinigten THF-Phasen 5 min bei 20.000 x g, um Reste der wäßrigen Phase abzutrennen Analytik Messung von Phytoen mittels HPLC Säule : ZORBAX Eclipse XDB-C8,5 um, 150*4,6 mm Temperatur : 40 °C Flußrate : 0,5 ml/min Injektionsvolumen : 10 pl

Detektion : UV 220 nm Stoppzeit : 12 min Nachlaufzeit : 0 min Maximaldruck : 350 bar Eluent A : 50 mM NaH2P04, pH 2,5 mit Perchlorsäure Eluent B : Acetonitril Gradient : Zeit [min] A [%] B [%] Fluß [ml/min] 0 50 50 0,5 12 50 50 0,5 Als Matrix wurden Extrakte der Fermentationsbrühen verwendet. Vor der HPLC wurde jede Probe wird durch ein 0, 22 Bum Filter filtriert. Die Proben wurden kühl gehalten und vor Licht geschützt. Zur Kalibrierung wurden jeweils 50-1000 mg/l eingewogen und in THF gelöst. Als Standard wurde Phytoen verwendet, welches unter den gegebenen Bedingungen eine Retentionszeit von 7,7 min. aufweist.

Messung von Lycopin, ß-Carotin, Echinenon, Canthaxanthin, Cryptoxanthin, Zeaxanthin und Astaxanthin mittels HPLC Säule : Nucleosil 100-7 C18,250*4, 0 mm (Macherey & Nagel) Temperatur : 25 OC Flußrate : 1, 3 ml/min Injektionsvolumen : 10 pl Detektion : 450 nm Stoppzeit : 15min Nachlaufzeit : 2 min Maximaldruck : 250 bar Eluent A : 10% Aceton, 90% H20 Eluent B : Aceton Gradient :

Zeit [min] A [%] B [%] Fluß [ml/min] 0 30 70 1,3 10 5 95 1,3 12 5 95 1,3 13 30 70 1,3 Als Matrix wurden Extrakte der Fermentationsbrühen verwendet. Vor der HPLC wurde jede Probe wird durch ein 0,22 pm Filter filtriert. Die Proben wurden kühl gehalten und vor Licht geschützt. Zur Kalibrierung wurden jeweils 10 mg eingewogen und in 100 ml THF gelöst. Als Standard wurden folgende Carotinoide mit folgenden Retentionszeiten eingesetzt-Carotin (12,5 min), Lycopin (11,7 min), Echinenon (10,9 min), Cryptoxanthin (10,5 min), Canthaxanthin (8,7 min), Zeaxanthin (7,6 min) und Astaxanthin (6,4 min) [s. Fig 23].

Produktion von Zeaxanthin mit gentechnisch veränderten Stämmen von Blakeslea trispora Nachfolgend wird beispielhaft die Herstellung von Zeaxanthin mit gentechnisch veränderten Organismen (GVO) von Blakeslea trispora beschrieben.

Durch Agrobakterium-vermittelte Transformation wurde der Vektor pBinAHygBTpTEFI-HPcrtZ in Blakeslea trispora übertragen (s. o. ). Ein Hygromycin-resistenter Klon wurde isoliert und auf eine Kartoffel-Glucose- Agarplatte (Merck KGaA, Darmstadt) übertragen.

Nach drei Tagen Inkubation bei 26°C wurde ausgehend von dieser Platte ein Sporensuspension hergestellt. Ein 250-mi-Erlenmeyerkolben ohne Schikanen mit 50 mi Growth-Medium (Maismehl 47 g/l, Sojamehl 23 g/l, KH2P04 0, 5 g/l, Thiamin-HCI 2.0 mg/l, pH mit NaOH vor der Sterilisation auf 6,2-6, 7 eingestellt) wurde mit 1x105 Sporen beimpft.

Diese Vorkultur inkubierte 48 Stunden bei 26 °C und 250 upm. Für die Hauptkultur wurde ein 250-ml-Erlenmeyerkolben ohne Schikane

enthaltend 40 mi Produktionsmedium mit 4 ml der Vorkultur beimpft und 8 Tage bei 26 °C und 150 upm inkubiert. Das Produktionsmedium enthielt Glucose 50 g/l, Casein Acid Hydrolisate 2 g/l, Hefeextrakt 1 g/I, L- Asparagin 2 g/l, KH2P04 1,5 g/I, MgS04 x 7 H20 0,5 g/l, Thiamin-HCI 5 mg/l, Span20 10 g/l, Tween 80 1 g/l, Linolsäure 20 g/l, Maisquellwasser 80 g/l. Nach 72 Stunden erfolgte die Zugabe von Kerosin in einer Endkonzentration von 40 g/1 Kerosin.

Nach der Ernte der Kulturen werden die verbliebenen ungefähr 35 ml Kultur mit Wasser auf 40 ml aufgefüllt. Anschließend werden die Zellen im Hochdruckhomogenisator, Typ Micron Lab 40, Fa. APV Gaulin, 3 x bei 1500 bar aufgeschlossen.

Die Suspension mit den aufgeschlossenen Zellen wurde mit 35 ml THF versetzt und 60 min bei RT im Dunkeln bei 250 upm geschüttelt. Danach wurden 2 g NaCI zugegeben und das Gemisch nochmals geschüttelt. Der Extraktionsansatz wurde dann 10 min bei 5000 x g zentrifugiert. Die gefärbte THF-Phase wurde abgenommen, die Zellmasse war vollständig entfärbt.

Die THF-Phase wurde am Rotationsverdampfer bei 30 mbar und 30 °C auf 1 ml eingeengt und danach nochmals in 1 ml THF aufgenommen.

Nach Zentrifugation 5 min bei 20 000 x g wurde ein Aliquot der oberen Phase entnommen und durch HPLC analysiert (Fig. 24, Fig. 23).