【발명의 명칭】

시토신 디아미나제에 의한 DNA에서의 염기 교정 확인 방법

【기술분야】

(1) 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제

(2) 가이드 RNA, 및 (3) 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent； USER)을 포함하는， DNA 이중 가닥 절단 (double strand breaks; DSBs)용 조성물， 이를 이용한 시토신 디아미나제에 의한 DNA 이중 가닥 절단 (double strand break) 생성 방법， 시토신 디아미나제에 의하여 염기 교정 (base editing)이 도입된 DNA의 핵산 서열 분석 방법， 및 시토신 디아미나제의 염기 교정 위치， onᅳ target 부위에서의 염기 교정 효율， 비표적 위치 (off-target site), 및 /또는 표적 특이성을 확인 (또는 측정 또는 검출)하는 방법과 관련된 것이다.

【배경기술】

Cas9-연결된 디아미나제 (Cas9-1 inked deaminase)는 유전적 장애를 유발하는 점 돌연변이를 교정하거나 인간 및 다른 진핵 세포에 목적하는 단일 뉴클레오타이드 변이를 도입하도록 표적화된 방식 (targeted manner)으로 단일 뉴클레오타이드 전환을 가능하게 한다. 그러나， 이러한 RNA-programmable 디아미나제의 유전체 전반 (genome-wide)에 걸친 표적 특이성은 아직 많이 알려져 있지 않다.

Programmable 디아미나제는 다음의 4 종류가 보고되어 있다:

1) S. j graes에서 유래하는 촉매적으로 결핍된 Cas9 (catalytically-deficient Cas9; dCas9) 또는 D10A Cas9 니케이즈 (nCas9)와, 래트의 시티딘 디아미나아제인 rAPOBECl를 포함하는 베이스 에디터 (Base Editors; BEs); 2) dCas9 또는 nCas9와， 바다칠성장어 (sea lamprey)의 act i vat ion- induced cyt idine deaminase (AID) ortholog인 PmCDAl 또는 인간 AID를 포함하는 Target-AID; 3) MS2-결합 단백질에 융합된 과활성화된 AID 변이체를 모집하기 위해 MS2 RNA 헤어핀에 연결된 sgRNAs와 dCas9를 포함하는 CRISPRᅳ X； 및 4) 징크 -핑거 단 _, 백질 또는 transcription activator-like effectors (TALEs)가 시티딘 디아미나제에 융합 된 것.

DNA 결합 모들과 시티딘 디아미나제 (cyt idine deaminase)로 구성된 progra誦 able 디아미나제는 DNA 이중 가닥 절단 (DSBs)을 생성하지 않고 유전체에서 표적화된 뉴클레오타이드 치환 또는 염기 교정 (base edi t ing)을 가능하게 한다. 표적 부위에 작은 삽입 또는 결실 ( indel s)을 유도하는 CRISPR-Cas9 및 ZFNs와 같은 programmable 뉴클레아제와 달리， programmable 디아미나제는， 표적 부위에서의 수 개의 뉴클레오타이드 (window of several nucleot ides) 내에서, C를 T(U)로 (또는 보다 낮은 빈도로， C를 G 또는 A로 변환) 변환시킨다. programmable 디아미나제는 인간의 세포， 동물 및 식물에서 유전 질환을 유발하는 점 돌연변이를 교정하거나 단일 염기 다형성 (SNP)을 생성할 수 있다.

progra隱 able 디아미나제에 의한 염기 교정 (base edi t ing)에 대한 광범위한 관심에도 불구하고， progra隱 able 디아미나제의 유전체 전체에 대한 표적 특이성을 분석할 수 있는 수단이 개발된 바가 없다. 따라서， programmable 디아미나제의 유전체 전체에 대한 표적 특이성을 분석하여， programmable 디아미나제의 염기 교정 효율， 비표적 사이트 (of f—target s i te) , 비표적 효과 (of f-target ef fect ) 등을 분석할 수 있는 수단의 개발이 필요하다.

[발명의 상세한 설명]

【기술적 과제】

본 명세서에서는 programmable 디아미나제의 유전체 전체에 대한 표적 특이성을 분석할 수 있는 수단, 및 이를 통하여 programmable 디아미나제의 염기 교정 효율， 비표적 사이트， 비표적 효과 등을 분석할 수 있는 수단이 제공된다.

일 예는 ( 1) 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제， 또는 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자， 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 포함하는 플라스미드， (2) 가이드 RNA , 및 (3) 우라실-특이적 제거 시약 (Uraci l -Speci f i c Exci sion Reagent； USER)을 포함하는， DNA 이중 가닥 _ᅵ 절단 (double strand breaks ; DSBs)용 조성물을 제공한다.

다른 예는，

( i ) (a) 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제， 또는 (b) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자， 또는 (C) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 포함하는 플라스미드를 가이드 RNA 와 함께 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시키는 단계 ; 및

(ii) 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent;

USER)을 처리하는 단계

를 포함하는， DNA 이중 가닥 절단 (double strand break) 생성 방법을 제공한다.

다른 예는，

(i) (a) 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제， 또는 (b) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자， 또는 (c) 시토신 디아미나제 암호화. 유전자 ^■ 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 포함하는 플라스미드를 가이드 RNA 와 함께 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시키는 단계 ;

(ii) 우라실—특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)을 처리하여 DNA에 이중 가닥 절단을 생성하는 단계 ; 및

(iii) 상기 절단된 DNA 절편의 핵산 서열을 분석하는 단계

를 포함하는， 상기 시토신 디아미나제에 의하여 염기 교정 (base editing)이 도입된 DNA의 핵산 서열 분석 방법을 제공한다.

다른 예는，

(i) (a) 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제， 또는 (b) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자， 또는 (c) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 포함하는 플라스미드를 가이드 RNA 와 함께 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시키는 단계 ;

(ii) 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent； USER)을 처리하여 DNA에 이중 가닥 절단을 생성하는 단계 ;

(iii) 상기 절단된 DNA 절편의 핵산 서열을 분석하는 단계; 및

(iv) 상기 분석에 의여 수득된 핵산 서열 데이터 (sequence read)에서 상기 이중 가닥 절단 위치를 확인하는 단계 를 포함하는， 시토신 디아미나제의 염기 교정 위치， on-target 부위에서의 염기 교정 효율， 비표적 위치 ( ₀ f f-target s i te) , 및 /또는 표적 특이성을 확인 ^' (또는 측정 또는 검출)하는 방법을 제공한다.

【과제의 해결 수단】

본 명세서에서는 Digenome-seq를 수정하여 인간 유전체에서 Cas9 니케이즈 (ni ckase)와 디아미나제 (deaminase)로 구성된 베이스 에디터 (예컨대， Base Edi tor 3； BE3)의 특이성을 평가하였다. 유전체 DNA를 DNA 변형 효소 (DNA-modi fying enzymes)의 흔합물 및 BE3으로 시험관내에서 처리하여 우라실 함유 부위에서 DNA 이중 가닥 절단 (DNA double-strand breaks； DSBs)를 생성하는 것을 확인하였다. 본 명세서에서 제공되는 디아미나제를 이용한 DNA 이중 가닥 절단 방법 및 이를 이용한 핵산 서열 분석 방법에 의하여， BE3 비표적 사이트를 전체 유전체 시뭔싱 데이터를 사용하여 계산적으로 확인할 수 있다. 또한， 상기 방법에 의하여， BE3는 고도로 특이적이며, 인간 유전체에서 단지 18 ± 9 위치에서만 시토신- 우라실 전환을 유도함을 확인할 수 있다. 한편， 본 명세서에서 제공되는 D i genome-s eq ( d i ge s t ed-genome sequencing) 방법에 의한 디아미나제를 이용한 DNA 이중 가닥 절단 방법 및 이를 이용한 핵산 서열 분석 방법은 0. 1%의 치환 빈도로 BE3 비표적 사이트를 포착하기에 층분히 민감하다. 그 결과, BE3 및 Cas9의 비표적 부위는 많은 경우에 상이하여， 유전체 전반적인 특이성에 대한 독립적인 평가가 필요함을 알 수 있다.

우선， DNA에 이중 가닥 절단을 유발하지 않는 시토신 디아미나제를 이용하여 DNA에 이중 가닥 절단을 생성하는 기술이 제공된다.

일 예는 ( 1) 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제， 또는 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자， 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 포함하는 플라스미드， (2) 가이드 RNA, 및 (3) 우라실-특이적 제거 시약 (Uraci l-Speci f i c Exci sion Reagent； USER)을 포함하는， DNA 이중 가닥 절단 (double strand breaks ; DSBs)용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 시토신 디아미나제를 사용하여 DNA 이중 가닥 절단을 유도하는데 사용될 수 있다.

상기 시토신 디아미나제는 뉴클레오타이드에 존재하는 염기인 시토신 (예컨대， 2중 가닥 DNA 또는 RNA에 존재하는 시토신)을 우라실로 변환 (C-to-U conversion or Oto-U editing)시키는 활성을 갖는 모든 효소를 의미하는 것으로， 표적 부위의 서열 (표적 서열)의 PAM 서열이 존재하는 가닥에 위치하는 시토신을 우라실로 변환시킨다. 일 예에서， 상기 시토신 디아미나제는 인간， 원숭이 등의 영장류, 래트， 마우스 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래된 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대， 상기 시토신 디아미나제는

APOBEC ("apolipoprotein B mRNA editing enzyme , catalytic polypeptideᅳ like") 패밀리에 속하는 효소들 중에서 1종 이상 선택될 수 있으며， 예컨대， 다음으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:

APOBECl： 인간 [Homo sapiens) APOBECl (단백질: GenBank Accession Nos. NP_001291495.1, NP_001635.2, NP_005880.2 등; 유전자 (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): GenBank Accession Nos. NM_001304566.1, 醒 _001644.4， 匪 _005889.3 등)， 마우스 Mus musculus) APOBECl (단백질: GenBank Accession Nos. NP_001127863.1, NP_112436.1 등; 유전자 (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): GenBank Accession Nos. 匪 _001134391.1， NM_031159.3 등);

AP0BEC2: 인간 AP0BEC2 (단백질: GenBank Accession No.

NP_006780.1 등; 유전자: GenBank Accession No. 匪 _006789.3 등)， 마우스 AP0BEC2 (단백질: GenBank Accession No. NP_033824.1 등; 유전자: GenBank Accession No. 丽_009694.3 등);

AP0BEC3B: 인간 AP0BEC3B (단백질: GenBank Accession Nos. NP_001257340.1, NP_004891.4 등; 유전자 (mRNA or cDNA, 이하 동일) (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): GenBank Accession Nos. 匪 _001270411.1， NM_004900.4 등)， 마우스 ( Ius musculus) AP0BEC3B (단백질: GenBank Accession Nos. NP_001153887.1， NP_001333970.1, NP_084531.1 등; 유전자 (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): GenBank Accession Nos. NM_001160415.1, 匪ᅳ 001347041.1， 匪 _030255.3 등);

AP0BEC3C: 인간 AP0BEC3C (단백질: GenBank Accession No. NP_055323.2등; 유전자: GenBank Accession No. 匪 _014508.2등);

AP0BEC3D (including AP0BEC3E)： 인간 AP0BEC3D (단백질: GenBank Accession No. NP_689639.2 등; 유전자: GenBank Accession No. 匪_152426.3등);

AP0BEC3F: 인간 AP0BEC3F (단백질: GenBank Accession Nos.

NP_660341.2, NP_001006667.1 등; 유전자 (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): 匪_145298.5， 丽_001006666.1등);

AP0BEC3G: 인간 AP0BEC3G (단백질: GenBank Accession Nos. NP_068594.1, NP_001336365.1, NP_001336366.1, NP_001336367.1 등; 유전자 (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): 丽 _021822.3， 丽 _001349436.1， 丽 _001349437.1， NM_001349438.1 등 );

AP0BEC3H: 인간 AP0BEC3H (단백질: GenBank Accession Nos. NP_001159474.2, NP_001159475.2, NP_001159476.2, NP_861438.3 등; 유전자 (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): 匪 _001166002.2， 丽_001166003.2, NM_001166004.2, NM_181773.4 등);

AP0BEC4 (including AP0BEC3E)： 인간 AP0BEC4 (단백질: GenBank Accession No. NP_982279.1 등; 유전자: GenBank Accession No. NM_203454.2 등); 마우스 AP0BEC4 (단백질: GenBank Accession No. NP_001074666.1 등; 유전자: GenBank Accession No. 匪 _001081197.1 등);

Act i vat ion- induced cyt idine deaminase (AICDA 또는 AID)： 인간

AID (단백질: GenBank Accession Nos. NP_001317272.1, NP_065712.1 등; 유전자 (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): GenBank Accession Nos. NM_001330343.1, 匪ᅳ 020661.3 등); 마우스 AID (단백질: GenBank Accession No. NP_033775.1 등; 유전자:

GenBank Accession No. NM_009645.2 등) 등.

본 명세서에 사용된 바로서， 표적 특이적 뉴클레아제는， 유전자 가위 (progra誦 able nuclease)라고도 블리며, 목적하는 유전체 DNA 상의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 모든 형태의 엔도뉴클레아제를 통칭한다. 예컨대， 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 표적 유전자의 특정 서열을 인식하고 뉴클레오티드 절단 활성을 가져 표적 유전자에서 인델

(insertion and/or deletion, Indel)을 야기할 수 있는 모든 뉴클레아제에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

예컨대， 상기 표적 특이적 뉴클레아제는

유전체 상의 특정 표적 서열을 인식하는 도메인인 식물 병원성 유전자에서 유래한 TAL 작동자 (transcription activator-like effector) 도메인과 절단 도메인이 융합된 TALEN (transcription activator-like effector nuclease)；

징크 -핑거 뉴클레아제 (zinc-finger nuclease);

메가뉴클러 15]·제 (meganuc lease)；

미생물 면역체계인 CRISPR에서 유래한 RGEN (RNA-guided engineered nuclease; 예컨대， Cas9, Cpfl, 등);

아고 호몰로그 (Ago homo log, DNA-guided endonuc lease)

등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에서， 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 Cas 단백질 (예컨대， Cas9 단백질 (CRISPR (Clustered regularly interspaced short pal indromic repeats) associated protein 9))， Cpfl 단백질 (CRISPR from Prevotel la and Franci sella 1) 등과 같은 타입 Π 및 /또는 타입 V의 CRISPR 시스템에 수반되는 엔도뉴클레아제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이 경우， 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 유전체 DNA의 표적 부위로 안내하기 위한 표적 DNA 특이적 가이드 RNA를 추가로 포함할 수 있다. 상기 가이드 RNA는 생체 외 (in vitro)에서 전사된 (transcribed) 것일 수 있고， 예컨대 올리고뉴클레오티드 이중가닥 또는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것일 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 가이드 RNA에 결합된 리보핵산-단백질 복합체를 형성 (RNA- Guided Engineered Nuclease)하여 리보핵산 단백질 (RNP) 형태로 작용할 수 있다.

Cas9 단백질은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로， 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 nickase를 형성할 수 있는 단백질이다.

Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Informat ion)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다. 예컨대， 상기 Cas9 단백질은

스트랩토코커스 sp. {Streptococcus sp.), 예컨대， 스트렙토코커스 피요젠스 Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질 (예컨대， SwissProt Accession number Q99ZW2(NP_269215.1) (암호화 유전자: 서열번호 229)；

캄필로박터 속, 예컨대， 캄필로박터 제주니 {Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질;

스트렙토코커스 속， 예컨대， 스트렙토코커스 써모필러스 {Streptococcus thermophi les) 또는 스트랩토코커스 아우레우스 {Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질;

네이세리아 메닝기디티스 Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질;

파스테우렐라 Pasteurella) 속, 예컨대， 파스테우텔라 물토시다 (Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질;

프란시셀라 iFrancisella) 속， 예컨대， 프란시셀라 노비시다 {Francisella novicida) 유래의 예컨대 Cas9 단백질

등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

Cpfl 단백질은 상기 CRISPR/Cas 시스템과는 구별되는 새로운 CRISPR 시스템의 엔도뉴클레아제로서, Cas9에 비해 상대적으로 크기가 작고 tracrRNA가 필요 없으며， 단일 가이드 RNA에 의해 작용할 수 있다. 또한, 티민 (thymine)이 풍부한 PAM (protospacer-adj acent motif) 서열을 인식하고 DNA의 이중 사슬을 잘라 점착종단 (cohesive end; cohesive double-strand break)을 생성한다.

예컨대， 상기 Cpfl 단백질은 캔디다투스 Candidatus) 속, 라치노스피라 {Lachnospira) 속， 뷰티리비브리오 Butyri vibrio) 속， 페레그리니박테리아 {Peregrini bacteria) , 액시도미노코쿠스

{Acidominococcus) 속， 포르파이로모나스 Porphyr圆 nas) 속， 프레보텔라 (Prevotella) 속， 프란시셀라 Francisel la) 속, 캔디다투스 메타노플라스마 (ᅳ Candidatus Methanoplasma) , 또는 유박테리움 {Eubacteriu ) 속 유래의 것일 수 있고， 예컨대， Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17) , Lachnospiraceae bacterium (MC2017) , Butyrivibrio proteoclasi icus, Peregr ini bacter i a bacterium (GW2011_GWA_33_10) , Acidaminococcus sp . (BV3L6) , Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006) , Porphyromonas crevioricanis, Prevotel la disiens, Mo r axel la bovoculi (237) , Smiihella sp . (SC_K08D17) , Leptospira inadai , Lachnospiraceae bacterium (MA2020) , Franci sella novicida (U112) , Candidatus Methanoplasma ter itum, Candidatus Paceibacter , Eubacterium eligens 등의 미생물 유래의 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다 .

상기 표적 특이적 엔도뉴클레아제는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법 등과 같이 인위적 또는 비자연적 생산된 것 (non-natural ly occurr ing)일 수 있다. 일 예에서， 상기 표적 특이적 엔도뉴클레아제 (예컨대， Cas9 , Cpf l , 등)은 재조합 DNA에 의하여 만들어진 재조합 단백질일 수 있다. 재조합 DAN(Recombinant DNA ; rDNA)는 다양한 유기체로부터 얻어진 이종 또는 동종 유전 물질을 포함하기 위하여 분자 클로닝과 같은 유전자 재조합 방법에 의하여 인공적으로 만들어진 DNA 분자를 의미한다. 예컨대， 재조합 DNA를 적절한 유기체에서 발현시켜 표적 특이적 엔도뉴클레아제를 생산 Un vivo 또는 in /iro)하는 경우， 재조합 DNA는 제조하고자 하는 단백질을 암호화 하는 코돈들 중에서 상기 유기체에 발현하기에 최적화된 코돈을 선택하여 재구성된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실한 표적특이적 엔도뉴클레아제을 의미하는 것으로， 예컨대， 엔도뉴클레아제 활성을 상실하고 니케이즈 활성을 갖는 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 활성과 니케이즈 활성을 모두 상실한 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 블활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제가 니케이즈 활성을 갖는 것인 경우， 상기 시토신이 우라실로 변환되는 것과 동시 또는 순서와 무관하게 순차적으로， 시토신이 우라실로 변환된 가닥 또는 그 반대 가닥 (예컨대 반대 가닥)에서 ni ck이 도입된다 (예컨대， PAM 서열의 5 ' 말단 방향으로 3번째 뉴클레오타이드와 4번째 뉴클레오타이드 사이에 ni ck이 도입됨) . 이와 같은 표저특이적 엔도뉴클레아제의 변형 (돌연변이)는 적어도 촉매 활성을 갖는 아스파르트산 잔기 (catalyt i c aspartate res i due ; 예컨대， 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 경우 10번째 위치의 아스파르트산 (D10) 잔기 등)가 임의의 다른 아미노산으로 치환된 Cas9의 돌연변이를 포함하는 것일 수 있으며， 상기 다른 아미노산은 알라닌 (al anine)일 수 있지만， 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용된 바로서, 상기 '다른 아미노산'은， 알라닌， 이소류신， 류신, 메티오닌， 페닐알라닌， 프를린， 트립토판, 발린， 아스파라긴산， 시스테인， 글루타민， 글리신， 세린， 트레오닌， 티로신， 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌， 히스티딘， 라이신， 상기 아미노산들의 공지된 모든 변형체 중에서， 야생형 단백질이 원래 변이 위치에 갖는 아미노산을 제외한 아미노산들 중에서 선택된 아미노산을 의미한다.

일 예에서， 상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제가 변형 Cas9 단백질인 경우， 변형 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요젠스 { Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질 (예컨대， Swi ssProt Access i on number Q99ZW2(NP_269215. 1 ) )에 D10 위치에서의 돌연변이 (예컨대， 다른.아미노산으로의 치환) 가 도입되어 엔도뉴클레아제 활성이 상실되고 니케이즈 활성을 갖는 변형 Cas9 , 스트렙토코커스 피요젠스 { Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질에 D10 위치에서의 돌연변이 (예컨대， 다른 아미노산으로의 치환)와 H840 위치에 돌연변이 (예컨대， 다른 아미노산으로의 치환)가 모두 도입되어 엔도뉴클레아제 활성 및 니케이즈 활성을 모두 상실한 변형 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대， 상기 CAs9 단백질의 D10 위치에서의 돌연변이는 D10A 돌연변이 (Cas9 단백질의 아미노산 중 10번째 아미노산인 D가 A로 치환된 돌연변이를 의미함; 이하， Cas9에 도입된 돌연변이는 동일한 방법으로 표기됨)일 수 있고, 상기 H840 위치에서의 돌연변이는 H840A 돌연변이일 수 있다.

상기 시토신 디아미나제와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 직접 또는 펩타이드 링커를 통하여 서로 융합된 융합 단백질 (예컨대， N- 말단에서 C-말단 방향으로 시토신 디아미나제 -불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 순서로 위치하거나 (즉, 시토신 디아미나제의 C-말단에 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제가 융합됨)， 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제-시토신 디아미나제 순서로 위치가 위치 (즉， 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제의 c-말단에 시토신 디아미나제가 융합됨)할 수 있음) 형태로 사용 (또는 상기 조성물에 포함)되거나 되거나， 정제된 시토신 디아미나제와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제의 흔합물 형태로 사용 (또는 상기 조성물에 포함)되거나， 시토신 디아미나제 암호화 유전자와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자가 모두 포함 (예컨대， 상기 두 유전자는 앞서 설명한 융합 단백질을 암호화하도록 포함됨)된 하나의 플라스미드 형태로 사용 (또는 상기 조성물에 포함)되거나， 시토신 디아미나제 암호화 유전자와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 가 각각 별개의 플라스미드에 포함된 시토신 디아미나제 발현 플라스미드와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 발현 플라스미드의 흔합물 형태로 사용 (또는 상기 조성물에 포함)될 수 있다. 일 구체예에서는 N-말단에서 Cᅳ말단 방향으로 시토신 디아미나제 -블활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 순서로 위치하는 융합 단백질， 또는 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제- 시토신 디아미나제 순서로 위치하는 융합 단백질， 또는 상기 융합 단백질을 암호화하도록 시토신 디아마나제 암호화 유전자와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자가 하나의 플라스미드에 포함된 형태로 사용될 수 있다.

상기 플라스미드는 상기 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 /또는 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 삽입하고 이를 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있는 발현 시스템을 포함하는 모든 플라스미드일 수 있다. 상기 플라스미드는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (repl icat ion or igin) , 프로모터， 작동 유전자 (operator) , 전사 종결 서열 (terminator ) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대， 제한 효소 부위) 및 /또는 임의로 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및 /또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site ; RBS) 및 /또는 전자 조절 인자 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 플라스미드는 당업계에서 사용되는 플라스미드， 예컨대， pcDNA 시리즈， pSClOl , _P GV1106, pACYC177, ColEl , pKT230, pME290, pBR322 , _P UC8/9 , pUC6 , pBD9, pHC79 , _P IJ61 , pLAFRl , _P HV14, pGEX 시리즈， pET 시리즈， pUC19 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 숙주세포는 상기 시토신 디아미나제에 의하여 염기 교정 또는 이중 가닥 절단을 도입하고자 하는 세포 (예컨대， 인간 세포 등과 같은 포유류 세포를 포함하는 진핵 세포) 또는 상기 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 /또는 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 발현하여 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제를 발현할 수 있는 모든 세포 (예컨대， E. coli 등) 들 중에서 선택될 수 있다.

상기 가이드 RNA 는 상기 시토신 디아미나제와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제의 흔합물 또는 융합 단백질을 표적 부위로 안내하는 역할을 하는 것으로, CRISPR RNA (crRNA), irayjs-activating crRNA (tracrRNA), 및 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있으며， 구체적으로 crRNA 와 tracrRNA 가 서로 결합된 이중 가닥 crRNA: tracrRNA 복합체， 또는 crRNA 또는 그 일부와 tracrRNA 또는 그 일부가 올리고뉴클레오타이드 링커로 연결된 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다.

상기 가이드 RNA 의 구체적 서열은 사용된 표적특이적 엔도뉴클레아제 의 종류 또는 그 유래 미생물 등에 따라서 적절히 선택할 수 있으며， 이는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 알 수 있는 사항이다.

표적특이적 엔도뉴클레아제로서 Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 사용하는 경우， crRNA 는 다음의 일반식 1 로 표현될 수 있다:

5'_(N _cas9 )厂 (GUUUUAGAGCUA)-(X _cas9 ) _m — 3' (일반식 1)

상기 일반식 1에서，

N _cas9 는 표적화 서열， 즉 표적 유전자 (target gene)의 표적 부위 (target site)의 서열에 따라서 결정되는 부위 (즉, 표적 부위의 서열과 흔성화 가능한 서열임)이며， 1 은 상기 표적화 서열에 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로 17 내지 23 또는 18 내지 22의 정수， 예컨대 20일 수 있고; 상기 표적 서열의 3 ' 방향으로 인접하여 위치하는 연속하는 12 개의 뉴클레오타이드 (GUUUUAGAGCUA ; 서열번호 230)를 포함하는 부위는 crRNA 의 필수적 부분이고，

X _cas9 는 crRNA 의 3 ' 말단쪽에 위치하는 (즉， 상기 crRNA 의 필수적 부분의 3 ' 방향으로 인접하여 위치하는) m개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로， m 은 8 내지 12 의 정수， 예컨대 11 일 수 있으며， 상기 m 개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있으며， 각각 독립적으로 A , U , C 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

일 예에서， 상기 X _cas9 는 UGCUGUUUUG (서열번호 231)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한， 상기 tracrRNA는 다음의 일반식 2로 표현될 수 있다:

⁵ 一 (Ycas9 )p—

(UAGC GTOAAMU OiCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC)-3 ' (일반식 2)

상기 일반식 2에서，

60 개의 뉴클레오타이드

(UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCG GUGC ;

서열번호 232)로 표시된 부위는 tracrRNA의 필수적 부분이고，

Y _cas9 는 상기 tracrRNA 의 필수적 부분의 5 ' 말단에 인접하여 위치하는 p 개의 뉴클레오타이드를 i함하는 부위로， p 는 6 내지 20 의 정수， 예컨대 8 내지 19 의 정수일 수 있으며， 상기 p 개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고， A , U, C 및 G 로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.

또한， sgRNA 는 상기 crRNA 의 표적화 서열과 필수적 부위를 포함하는 crRNA 부분과 상기 t racrRNA 의 필수적 부분 (60 개 뉴클레오타이드)를 포함하는 tracrRNA 부분이 올리고뉴클레오타이드 링커를 통하여 헤어핀 구조 ( stem- loop 구조)를 형성하는 것일 수 있다 (이 때， 을리고뉴클레오타이드 링커가 루프 구조에 해당함) . 보다 구체적으로， 상기 sgRNA 는 crRNA 의 표적화 서열과 필수적 부분을 포함하는 crRNA 부분과 tracrRNA 의 필수적 부분을 포함하는 tracrRNA 부분이 서로 결합된 이중 가닥 RNA 분자에서， crRNA 부위의 3 ' 말단과 tracrRNA 부위의 5' 말단이 올리고뉴클레오타이드 링커를 통하여 연결된 헤어핀 구조를 갖는 것일 수 있다.

일 예에서， sgRNA는 다음의 일반식 3으로 표현될 수 있다:

5 ' - (N _cas9 )厂 (GUUUUAGAGCUA) - (올리고뉴클레오타이드 링커)― (UAGC GUUAA U GGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC)-3 '

(일반식 3)

상기 일반식 3에서， ( ^ 는 표적화 서열로서 앞서 일반식 1에서 설명한 바와 같다.

상기 sgRNA 에 포함되는 올리고뉴클레오타이드 링커는 3 내지 5 개， 예컨대 4 개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고， A, ,U, C 및 G 로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.

상기 crRNA 또는 sgRNA 는 5' 말단 (즉， crRNA 의 타겟팅 서열 부위의 5' 말단)에 1 내지 3개의 구아닌 (G)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 tracrRNA 또는 sgRNA 는 tracrRNA 의 필수적 부분 (60nt)의 3' 말단에 5 개 내지 7개의 우라실 (U)을 포함하는 종결부위를 추가로 포함할 수 있다.

상기 가이드 RNA 의 표적 서열은 표적 DNA 상의 PAM (Protospacer Adjacent Motif 서열 (5. pyogenes Cas9 의 경우， 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C 임))의 5'에 인접하여 위치하는 약 17 개 내지 약 23 개 또는 약 18개 내지 약 22개， 예컨대 20개의 연속하는 핵산 서열일 수 있다.

상기 가이드 RNA 의 표적 서열과 흔성화 가능한 가이드 RNA 의 표적화 서열은 상기 표적 서열이 위치하는 DNA 가닥 (즉， PAM 서열 (5'- NGG-3 ¹ (N 은 A, T, G, 또는 C 임)이 위치하는 DNA 가닥)의 상보적인 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 50% 이상， 60% 이상， 70% 이상， 80% 이상， 90% 이상， 95% 이상， 99% 이상， 또는 10OT의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로， 상기 상보적 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 상보적 결합이 가능하다.

본 명세서에서， 표적 부위의 핵산 서열은 표적 유전자의 해당 유전자 부위의 두 개의 DNA 가닥 중 PAM 서열이 위치하는 가닥의 핵산 서열로 표시된다. 이 때， 실제로 가이드 RNA 가 결합하는 DNA 가닥은 PAM 서열이 위치하는 가닥의 상보적 가닥이므로， 상기 가이드 RNA 에 포함된 표적화 서열은， RNA 특성상 T 를 U 로 변경하는 것을 제외하고， 표적 부위의 서열과 동일한 핵산 서열을 갖게 된다. 따라서， 본 명세서에서， 가이드 RNA의 표적화 서열과 표적 부위의 서열 (또는 절단 부위의 서열)은 T와 U가 상호 변경되는 것을 제외하고 동일한 핵산 서열로 표시된다.

상기 가이드 RNA는 RNA 형태로 사용 (또는 상기 조성물에 포함)되거나， 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드 형태로 사용 (또는 상기 조성물에 포함)될 수 있다.

상기 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)은 상기 시토신 디아미나제에 의하여 시토신로부터 변환된 우라실을 제거하고， 및 /또는 상기 우라실이 제거된 위치에 DNA 절단을 도입하는 역할을 하는 모든 물질을 포함할 수 있다.

일 예에서， 상기 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent； USER)은 우라실 DNA 글라이코실라제 (Uracil DNA glycosylase; UDG), 엔도뉴클레아제 VIII, 및 이들의 조합을 포함한다. 일 예에서， 상기 우라실-특이적 제거 시약은 엔도뉴클레아제 VIII 또는 우라실 DNA 글라이코실라제와 엔도뉴클레아제 VI II의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

우라실 DNA 글라이코실라제 (Uracil DNA glycosylase; UDG)는 DNA에 존재하는 우라실 (U)을 제거하여 DNA의 mutagenesis를 방지하는 작용을 하는 효소로서， 우라실의 N-glycosylic bond을 절단함으로써 base- excision repair (BER) pathway를 개시하도록 하는 역할을 하는 모든 효소들 중에서 1종 이상 선택될 수 있다. 예컨대， 상기 우라실 DNA 글라이코실라제는 Escherichia coli 우라실 DNA 글라이코실라제 (예컨대， GenBank Accession Nos. ADX49788.1, ACT28166.1, EFN36865.1, BAA10923.1, ACA76764.1, ACX38762.1, EFU59768.1, EFU53885.1, EFJ57281.1, EFU47398.1, EFK71412.1, EFJ92376.1, EFJ79936.1, EF059084.1, EFK47562.1, KXH01728.1, ESE25979.1, ESD99489.1, ESD73882.1, ESD69341.1 등)， 인간 우라실 DNA 글라이코실라제 (예컨대， GenBank Accession Nos. NP_003353.1, NP_550433.1 등)， 마우스 우라실 DNA 글라이코실라제 (예컨대， GenBank Accession Nos. NP_001035781.1, NP_035807.2 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 엔도뉴클레아제 VI II는 상기 우라실이 제거된 뉴클레오타이드를 제거하는 역할을 하는 것으로， 상기 우라실 DNA 글라이코실라제에 의하여 손상된 우라실을 이중 가닥 DNA로부터 제거하는 N-glycosylase 활성과 상기 손상된 우라실 제거로부터 발생한 apurinic site (AP site)의 3' 및 5 ¹ 말단을 절단하는 AP-lyase 활성을 모두 갖는 모든 효소들 중에서 1종 이상 선택될 수 있다. 예컨대， 상기 엔도뉴클레아제 VIII는 인간 엔도뉴클레아제 VIII (예컨대， GenBank Accession Nos. BAC06476.1, NP_001339449.1, NP_001243481.1, NP_078884.2 NP_001339448.1 등)， 마우스 엔도뉴클레아제 VIII (예컨대， GenBank Accession Nos. BAC06477.1 , ΝΡ— 082623.1 등)， Escherichia coli 엔도뉴클레아제 VIII (예컨대, GenBank Accession Nos. 0BZ49008.1, 0BZ43214.1, 0BZ42025.1, ANJ41661.1, KYL40995.1, KMV55034.1, KMV53379.1, KMV50038.1, KMV40847.1, AQW72152.1 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예에서， 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제로서 스트렙토코커스 피요젠스 ᅳ Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질에 D10A 돌연변이와 H840A 돌연변이가 모두 도입된 변형 Cas9 단백질과 같이 엔도뉴클레아제 활성뿐 아니라 니케이즈 활성도 상실된 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제를 사용하는 경우, 이중 가닥 절단을 위하여， 한쪽 가닥의 우라실이 제거되어 단일 가닥으로 존재하는 DNA 의 단일 가닥 부위를 특이적으로 분해 (단일 가닥 부위의 양 말단의 포스포다이에스테르 결합을 절단)하는 엔도뉴클레아제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 DNA 의 단일 가닥 부위를 특이적으로 분해하는 엔도뉴클레아제는 S1 뉴클레아제 {Aspergi 1 lus oryzae유래; 여】컨대, Catalog number M5791 (Promega) 등)， 녹두 뉴클레아제 (Mung bean nuclease) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

이와 같은 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 및 우라실-특이적 제거 시약의 처리에 의하여 시토신 디아미나제에 의하여 시토신에서 우라실로 염기 변환 (염기 교정)이 일어난 부위에 이중 가닥 절단이 생성된다 (도 4a 참조). 이와 같이 생성된 DNA 절단 단편은 서로 연장된 말단 (staggered end)를 갖는다. 그 후， 임의로 end repair 과정이 일어날 수 있으며， 이에 의하여 blunted ended DNA 단편 (이중 가닥)이 생성될 수 있다 (도 4a 참조). 다른 예는，

(i) (a) 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제， 또는 (b) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자， 또는 (c) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 포함하는 플라스미드를 가이드 RNA 와 함께 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시키는 단계 ; 및

(ii) 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent； USER)을 처리하는 단계

를 포함하는， 시토신 디아미나제를 사용하여 DNA 에 이중 가닥 절단

(double strand break)를 생성하는 방법을 제공한다.

이와 같이 시토신 디아미나제를 사용하여 DNA 에 이중 가닥 절단을 생성 (또는 도입)함으로써， 유전체 DNA 또는 DNA 의 표적 부위에서 시토신 디아미나제에 의하여 염기 교정 (base editing, 즉 C 에서 U 로의 변환)이 일어난 위치, 시토신 디아미나제의 염기 교정 효율 등을 분석할 수 있으며， 이를 통하여， 시토신 디아미나제의 on-target 부위에서의 염기 교정 효율， on-target 서열에 대한 특이성， off— target 서열 등을 확인 (또는 측정)할 수 있다.

다른 예는，

(i) (a) 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제， 또는 (b) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자， 또는 (c) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 포함하는 플라스미드를 가이드 RNA 와 함께 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시키는 단계 ;

(ii) 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent； USER)을 처리하여 DNA에 이중 가닥 절단을 생성하는 단계 ; 및

(iii) 상기 절단된 DNA 절편의 핵산 서열을 분석하는 단계

를 포함하는， 시토신 디아미나제에 의하여 염기 교정 (base editing)이 도입된 DNA의 핵산 서열 분석 방법을 제공한다.

다른 예는， (i) (a) 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레.아제， 또는 (b) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자, 또는 (c) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 포함하는 플라스미드를 가이드 RNA 와 함께 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시키는 단계 ;

(ii) 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent； USER)을 처리하여 DNA에 이중 가닥 절단을 생성하는 단계 ;

(iii) 상기 절단된 DNA 절편의 핵산 서열을 분석하는 단계; 및

(iv) 상기 분석에 의여 수득된 핵산 서열 데이터에서 상기 이증 가닥 절단 위치를 확인하는 단계

를 포함하는， 시토신 디아미나제의 염기 교정 위치， on-target 부위에서의 염기 교정 효율， 비표적 위치 ( ₀ ff-target site), 및 /또는 표적 특이성을 확인 (또는 측정 또는 검출)하는 방법을 제공한다.

상기 시토신 디아미나제， 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제， 플라스미드， 가이드 RNA 및 우라실-특이적 제거 시약은 앞서 설명한 바와 같다.

상기 방법은 세포 내 또는 시험관 내 (in vitro)에서 수행되는 것일 수 있으며, 예컨대 시험관 내에서 수행되는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 방법의 모든 단계가 시험관 내 (in vitro)에서 수행되거나， 상기 단계 (i)은 세포 내에서 수행되고， 상기 단계 (ii) 이후 단계는 상기 단계 (0이 수행된 세포에서 추출된 DNA (예컨대， 유전체 DNA)를 사용하여 시험관 내 (in vitro)에서 수행되는 것일 수 있다.

상기 단계 (i)은 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 (또는 이들의 암호화 유전자)와 가이드 RNA 를 세포에 형질감염시키거나, 또는 상기 세포로부터 추출된 DNA 에 접촉 (예컨대， 함께 배양)시켜, 가이드 RNA 에 의하여 표적화되는 표적 부위 내에서 시토신에서 우라실로의 변환 및 DNA nick 발생을 유도하는 단계이다. 상기 세포는 시토신 디아미나제에 의한 염기 교정을 도입하고자 하는 모든 진핵 세포들 중에서 선택된 것일 수 있으며， 예컨대， 인간 세포를 포함하는 포유 동물 세포들 중에서 선택될 수 있다. 상기 형질감염은 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라시미드를 통상적인 모든 수단에 의하여 세포에 도입시킴으로써 수행될 수 있으며， 예컨대， 상기 플라스미드의 세포로의 도입은 전기천공 (electroporation), 리포펙션 등에 의하여 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에서， 상기 단계 (i)은 상기 세포 (시토신 디아미나제에 의한 염기 교정 (염기 교정 위치， 염기 교정 효율 등)을 확인하고자 하는 세포)로부터 추출된 DNA 를 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 (예컨대， 시토신 디아미나제 및 블활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질) 및 가이드 RNA 와 함께 배양함으로써 수행될 수 있다 Un vitro). 상기 세포로부터 추출된 DNA는 유전체 DNA (genome DNA) 또는 표적 유전자 또는 표적 부위를 포함하는 PC (polymerase chain reaction) 증폭 산물일 수 있다.

상기 단계 (ii)는 상기 단계 (i)에서 우라실로 변형된 염기를 제거하여 DNA 이중 가닥 절단을 생성하는 단계이다. 보다 구체적으로， 상기 단계 (ii)는 상기 단계 (i)에서 얻어진 반웅물에 우라실 DNA 글라이코실라제 (Uracil DNA glycosylase; UDG), 엔도뉴클레아제 VIII， 및 이들의 조합을 처리 (접촉)하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 우라실 DNA 글라이코실라제와 엔도뉴클레아제 VIII를 모두 처리 (접촉)하는 경우， 동시에 처리하거나 순서에 무관하게 순차적으로 처리할 수 있다. 상기 처리 (접촉)하는 단계는 상기 단계 (i)에서 얻어진 반웅물을 우라실 DNA 글라이코실라제 및 /또는 엔도뉴클레아제 VIII 와 함께 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다.

상기 단계 (ii)의 반응물은， 상기 단계 (i)이 세포 내에서 수행된 경우 (즉 세포를 형질감염시켜 수행된 경우)， 상기 형질감염된 세포로부터 분리된 DNA 를 포함하는 것일 수 있고， 상기 단계 (i)이 세포로부터 추출 (분리)된 DNA 에 대하여 시험관 내 (in vitro) 수행된 것인 경우， 상기 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA 처리된 분리된 DNA를 포함하는 것일 수 있다.

다른 예에서， 상기 단계 (i)에서 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제로서 스트렙토코커스 피요젠스 {Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질에 D10A 돌연변이와 H840A 돌연변이가 모두 도입된 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제를 사용하는 경우， 상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 활성뿐 아니라 니케이즈 활성도 상실하였으므로， 이중 가닥 절단을 위하여， 상기 단계 (ii) 이후 및 단계 (Hi) 이전에， 한쪽 가닥의 우라실이 제거되어 단일 가닥으로 존재하는 DNA 의 단일 가닥 부위를 특이적으로 분해 (단일 가닥 부위의 양 말단을 절단)하는 엔도뉴클레아제를 처리하는 단계 (단계 (ii-1))를 추가로 포함할 수 있다 (도 22의 a 참조). 상기 DNA의 단일 가닥 부위를 특이적으로 분해하는 엔도뉴클레아제는 S1 뉴클레아제일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

임의로， 상기 단계 (i) 수행 (또는 완료) 후 단계 (ii) 수행 전에， 단계 (i)에서 사용된 시토신 디아미나제， 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 , 및 /또는 가이드 RNA를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 가이드 RNA 와 함께 사용되어 서열 특이성 (specificity)을 가지므로 대부분 표적 위치 (on-target)에 작용하지만， 표적 서열 이외의 부위에 표적 서열과 유사한 서열이. 어느 정도 존재하는지에 따라 비표적 위치 (off-target site)에 작용하는 부작용이 발생할 수도 있다. 본 명세서에서， 비표적 위치 (off-target site)라 함은 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제의 표적 부위는 아니지만 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제가 활성을 가지는 위치를 말한다. 즉， 표적 위치 이외의, 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제에 의해 염기 교정 및 /또는 ^' 절단되는 위치를 말한다. 일 예에서， 상기 비표적 위치는 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제에 대한 실제 비표적 위치뿐만 아니라 비표적 위치가 될 가능성이 있는 위치까지 포함하는 개념으로 사용될 수 있다. 상기 비표적 위치는 이에 제한되는 것은 아니나， 시험관 내 Un r/ ro)에서 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제에 의해 절단되는 표적 위치 이외의 모든 위치를 의미할 수 있다.

시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제가 표적 위치 이외의 위치에서도 활성을 가지는 것은 다양한 원인에 의해 야기될 수 있다. 예컨대， 표적 부위에 대하여 설계된 표적 서열과 뉴클레오타이드 불일치 (mi smatch) 수준이 낮아서， 표적 서열과 서열 상동성이 높은 표적 서열 이외의 서열 (비표적 서열)의 경우 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제가 작동할 가능성이 있다. 상기 비표적 서열은 이에 제한되는 것은 아니나， 표적 서열과 1 개 내지 6개， 1개 내지 5개, 1개 내지 4개， 1개 내지 3개， 1개 내지 2개， 또는 1 개의 뉴클레오타이드 불일치 (mi smatch)를 가지는 서열 (유전자 부위)일 수 있다.

불일치 서열에서 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제가 작동하는 경우 유전체 내에서 원치 않는 유전자의 돌연변이를 야기할 수 있어 심각한 문제가 야기될 수 있다. 이에， 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제의 표적 위치에서의 활성 못지 않게 비표적 서열을 정확히 검출하여 분석하는 과정 또한 매우 중요할 수 있으며， 이는 비표적 효과 없이 표적 위치에만 특이적으로 작동하는 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

본 발명의 목적상 상기 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 생체 내 in vivo) 및 시험관 내 { in 에서 활성을 가질 수 있으므로， 시험관 내에서 DNA (예컨대， 유전체 DNA)의 비표적 위치를 검출하는데 사용될 수 있으며， 이를 생체 내에서 적용하였을 때 상기 검출된 비표적 위치 (비표적 서열을 포함하는 유전자상 위치 (부위) )와 동일한 위치에도 활성을 가질 것을 예상할 수 있다.

상기 단계 ( i i i )는 상기 단계 ( Π )에서 절단된 DNA 절편의 핵산 서열을 분석하는 단계로서， 통상적인 모든 핵산 서열 분석 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예컨대， 상기 단계 ( i )에서 사용된 분리된 DNA가 유전체 DNA 인 경우， 상기 핵산 서열 분석은 전체 유전체 시퀀싱 (whole genome sequencing)에 의하여 수행될 수 있다. 전체 유전체 시뭔싱을 수행하는 경우， 표적 부위의 서열과 상동성을 가지는 서열을 찾아 비표적 위치일 것으로 예측하는 간접적인 방법과 달리 전체 유전체 수준에서 실질적으로 표적 특이적 뉴클레아제에 의해 절단되는 비표적 위치를 검출할 수 있으므로， 보다 정확하게 비표적 위치를 검출할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바로서, "전체 유전체 시퀀싱 (whole genome sequencing; WGS)"은 ^' 차세대 시¾싱 (next generation sequencing)에 의한 전장 유전체 시뭔싱을 10 X， 20 X， 40 X 형식으로 여러 배수로 유전체를 읽는 방법을 의미한다. "차세대 시뭔싱' '은 칩 (Chip) 기반 및 PCR 기반 페어드엔드 (paired end) 형식으로 전장 유전체를 조각내고， 상기 조각을 화학적인 반웅 (hybridization)에 기초하여 초고속으로 시뭔싱을 수행하는 기술을 의미한다.

상기 단계 (iv)는 상기 단계 (iii)에서 수득한 염기서열 데이터 (sequence read)에서 DNA가 절단된 위치를 확인 (또는 결정)하는 단계로서 시뭔싱 데이터를 분석하여 표적 위치 (on-target site)와 비표적 위치 (off— target site)를 간편하게 검출할 수 있다. 상기 염기서열 데이터로부터 DNA 가 절단된 특정 위치를 결정하는 것은 다양한 접근 방법으로 수행될 수 있으며， 본 명세서에서는 상기 위치를 결정하기 위한 여러 가지의 합리적인 방법들을 제공한다. 그러나 이는 본 발명의 기술적 사상에 포함되는 예시에 불과하며， 본 발명의 범위가 이들 방법에 의해 제한되는 것은 아니다.

예컨대， 상기 절단된 위치를 결정하기 위한 일례로서， 전체 유전체 시뭔싱을 통해 수득한 염기서열 데이터를 유전체 상의 위치에 따라 정렬하였을 경우, 5' 말단이 수직 정렬된 위치가 DNA 가 절단된 위치를 의미할 수 있다. 상기 염기서열 데이터를 유전체 상의 위치에 따라 정렬하는 단계는 분석 프로그램 (예를 들어， BWA/GATK 또는 ISAAC 등)을 이용하여 수행할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바로서， 상기 용어 "수직 정렬"이란， BWA/GATK 또는 ISAAC 등의 프로그램으로 전체 유전체 시뭔싱 결과를 분석할 때， 인접한 왓슨 가닥 (Watson strand)과 크릭 가닥 (Crick strand) 각각에 대해, 2 개 이상의 염기서열 데이터의 5' 말단이 유전체 상의 동일한 위치 (nucleotide position)에서 시작되는 배열을 말한다. 이로 인하여， 상기 단계 (ii)에서 절단되어 동일한 5' 말단을 갖게 되는 DNA 단편들이 각각 시퀀싱되어 나타나게 된다.

즉， 상기 단계 (ii)에서의 절단이 표적 위치 및 비표적 위치에서 일어나는. 경우， 염기서열 데이터를 정렬하게 되면 공통적으로 절단된 부위는 각각 그 위치가 5' 말단으로 시작되므로 수직 정렬되나， 절단되지 않은 부위에는 5' 말단이 존재하지 않으므로 정렬 시 스태거드 (staggered) 방식으로 배열될 수 있다. 따라서， 수직 정렬된 위치를 상기 단계 ( i i )에서 절단된 부위로 볼 수 있으며， 이는 곧 시티딘 디아미나제 및 블활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제의 표적 위치 또는 비표적 위치를 의미하는 것일 수 있다.

상기 "정렬' '은 표준 염기서열 (reference genome)로 염기서열 데이터를 맵핑한 뒤， 유전체에서 동일 위치를 가지는 염기들을 각 위치에 맞게 배열하는 것을 의미한다. 따라서， 염기서열 데이터를 상기와 같은 방식으로 정렬할 수 있다면 어떠한 컴퓨터 프로그램도 이용될 수 있으며, 이는 당업계에 이미 알려진 공지의 프로그램이거나 또는 목적에 맞게 제작된 프로그램들 중에서 선택될 수 있다. 일 실시예에서는 ISAAC를 이용하여 정렬을 수행하였으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

정렬 결과， 상기 설명한 바와 같은 5 ' 말단이 수직 정렬된 위치를 찾는 등의 방법을 통해 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제에 의해 DNA가 절단된 위치를 결정할 수 있고， 상기 절단된 위치가 표적 위치 (on-target si te)가 아니라면， 비표적 위치 (of f-target s i te)로 판단할 수 있다. 다시 말해， 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제의 표적 위치로 설계한 염기 서열과 동일한 서열은 표적 위치이고, 상기 염기 서열과 동일하지 않은 서열은 비표적 위치로 볼 수 있다. 이는 상기 기술한 비표적 위치의 정의상 자명한 것이다. 상기 비표적 위치는 특히， 표적 위치의 서열과 상동성을 가지는 서열로 구성된 것일 수 있고， 구체적으로 표적 위치와 1 개 이상의 뉴클레오타이드 불일치 (mi smatch)를 가지는 서열， 더욱 구체적으로 표적 위치 (표적 서열)와 1 개 내지 6 개， 1 개 내지 5 개, 1 개 내지 4 개， 1 개 내지 3 개， 1 개 내지 2 개， 또는 1 개 1 내지 6 개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지는 것일 수 있으나， 이에 특별히 제한되는 것은 아니고 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제가 절단할 수 있는 위치라면 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.

다른 예에서， 5 ' 말단이 수직 정렬된 위치를 찾는 방법 이외에도， 5 ' 말단 플롯에서 이중 피크 패턴을 보이는 경우 그 위치가 표적 위치가 아니라면 비표적 위치로 판단할 수 있다. 유전체 DNA 내의 각 위치에 대하여 동일한 염기의 5 ' 말단을 구성하고 있는 뉴클레오타이드 수를 세어 그래프를 그릴 경우, 특정 위치에서 이중 피크 패턴이 나타나게 되는데, 상기 이중 피크는 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제에 의해 절단된 이중 가닥의 각각의 가닥에 의해 나타나는 것이기 때문이다.

따라서, 상기 비표적 위치 확인 방법은， 상기 단계 (iv) 이후에, 상기 절단된 위치가 표적 위치 (on-target site)가 아닌 경우， 비표적 위치 (off-target site)로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 실시예에서， 유전체 DNA 에 대하여 상기 단계 (i) 및 (ii)를 수행하여 이중 가닥 절단한 뒤， 전체 유전체 분석 (단계 (iii)) 수행 후， 이를 ISAAC 로 정렬하여 절단된 위치에서는 수직 정렬， 절단되지 않은 위치에서는 스태거드 방식으로 정렬되는 패턴을 확인하여， 이를 5' 말단 플롯으로 나타내었을 때 절단 부위에서 이중 피크의 독특한 패턴이 나타날 수 있다.

나아가 이에 제한되는 것은 아니나， 구체적인 일례로 왓슨 가닥 (Watson strand)과 크릭 가닥 (Crick strand)에 해당하는 염기서열 데이터 (sequence read)가 각각 두 개 이상씩 수직으로 정렬되는 위치를 비표적 위치인 것으로 판단할 수 있고, 또한 20 % 이상의 염기서열 데이터가 수직으로 정렬되고， 각각의 왓슨 가닥 및 크릭 가닥에서 동일한 5' 말단을 가진 염기서열 데이터의 수가 10 이상인 위치가 비표적 위치, 즉 절단되는 위치인 것으로 판단할 수 있다.

상기한 방법은 단계 (iii) 및 (iv)의 과정은 Digenome-seq

(digested-genome sequencing 일 수 있으며, 보다 구체적인 내용은 한국 특허공개 제 10-2016-0058703 호에 기재되어 있다 (상기 문헌은 본 발명에 참조로서 포함된다).

앞서 설명한 방법에 의하여， 시토신 디아미나제의 염기 교정 위치 (즉, 이중 가닥 절단 위치)， on— target 부위에서의 염기 교정 효율 또는 표적 특이성 (즉， on-target 부위에서의 염기 교정 빈도 /전체 염기 교정 빈도)， 및 /또는 비표적 위치 (off-target site; 시토신 디아미나제의 염기 교정 위치로 확인된 위치 중 on-target 위치가 아닌 위치)를 확인 (또는 측정 또는 검출)할 수 있다.

상기 비표적 위치 확인 (검출)은 시험관 내 Un 에서 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제를 유전체 DNA 에 처리하여 수행될 수 있다. 이에 상기 방법을 통해 확인 (검출)된 비표적 위치에 대하여 실질적으로 생체 내 in wVo)에서도 비표적 효과가 나타나는지 확인해볼 수 있다. 다만 이는 추가적인 검증 과정에 불과하므로 본 발명의 범위에 필수적으로 수반되는 단계는 아니며, 필요에 따라 추가적으로 수행될 수 있는 단계에 불과하다.

본 명세서에 사용된 바로서， 용어 "비표적 효과 (off-target effect)"는 비표적 위치 (off-target site)에서 염기 교정 및 /또는 이중 가닥 절단이 일어나는 수준을 의미하기 위한 것일 수 있다. 용어 "인델 (Insertion and/or deletion; Indel)' '은 DNA 의 염기 배열에서 일부 염기가 중간에 삽입되거나 (insertion) 및 /또는 결실된 (deletion) 변이를 총칭한다.

다른 예에서, 시토신 디아미나제의 염기 교정 위치， on-target 부위에서의 염기 교정 효율， 비표적 위치 ( ₀ ff-target site), 및 /또는 표적 특이성을 확인 (또는 측정 또는 검출)하는 방법은 상기 설명한 Digenome-seq 방법 이외의 방법으로 수행할 수 있다.

예컨대， 시토신 디아미나제의 염기 교정 위치, on-target 부위에서의 염기 교정 효율， 비표적 위치 ( ₀ ff-target site), 및 /또는 표적 특이성을 확인 (또는 측정 또는 검출)하는 방법욘 circle-seq 방법에 의할 수 있으며， 구체적으로， 다음의 단계를 포함할 수 있다 (도 20a 참조):

(i) 세포로부터 추출된 유전체 DNA를 단편화 및 원형화시키는 단계

(ii) 상기 원형화된 DNA 절편에 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제를 처리한 후， 우라실-특이적 제거 시약

(Uracil-Specific Excision Reagent； USER)을 처리하여 원형화된 DNA 절편에 이중 가닥 절단을 생성하는 단계; 및

(iii) 상기 이중 가닥 절단이 생성된 DNA 절편을 이용하여 라이브러리를 구축하고， 차세대 유전체 시퀀싱 (NGS)을 수행하는 단계

를 포함할 수 있다. 상기 단계 (ii)의 시토신 디아미나제 및 불활상화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 가이드 RNA 와 함께 사용될 수 있다.

다른 예에서, 시토신 디아미나제의 염기 교정 위치， on-target 부위에서의 염기 교정 효율， 비표적 위치 ( ₀ ff-target site), 및 /또는 표적 특이성을 확인 (또는 측정 또는 검출)하는 방법은 Bless 방법에 의할 수 있으며， 구체적으로， 다음의 단계를 포함할 수 있다 (도 20b 참조):

(i) (a) 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제， 또는 (b) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자， 또는 (C) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포 또는 세포로부터 분리된 유전체 DNA에 접촉시키는 단계 ;

(ii) 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)을 처리하여 DNA에 이중 가닥 절단을 생성하는 단계;

(iii) 상기 절단된 DNA 절편 말단에 표지한 후， 이를 포획하는 단계；

(iv) 상기 포획된 DNA 절편을 증폭하고, 차세대 유전체 시퀀싱 (NGS)을 수행하는 단계

를 포함할 수 있다. 상기 단계 (i)의 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제， 또는 이를 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 플라스미드는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 를 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드와 함께 사용될 수 있다.

다른 예에서， 시토신 디아미나제의 염기 교정 위치， on-target 부위에서의 염기 교정 효율， 비표적 위치 (off-target site), 및 /또는 표적 특이성을 확인 (또는 측정 또는 검출)하는 방법은 DSBCapture 방법에 의할 수 있으며， 구체적으로， 다음의 단계를 포함할 수 있다 (도 20c 참조):

(i) (a) 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제， 또는 (b) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자， 또는 (c) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포 또는 세포로부터 분리된 유전체 DNA에 접촉시키는 단계 ;

(ii) 우라실ᅳ특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent；

USER)을 처리하여 DNA에 이중 가닥 절단을 생성하는 단계 ;

(iii) 상기 절단된 DNA 절편에 대하여 end repair 및 adaptor ligation을 수행하는 단계;

(iv) 상기 (iii)에서 얻어진 DNA 절편을 증폭하고， 차세대 유전체 시퀀싱 (NGS)을 수행하는 단계

를 포함할 수 있다. 상기 단계 (i)의 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제， 또는 이를 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 플라스미드는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 를 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드와 함께 사용될 수 있다.

【발명의 효과】

본 명세서에서 제공되는 시티딘 디아미나제를 이용한 DNA 이중 가닥 절단 방법 및 이를 이용한 핵산 서열 분석 기술에 의하여, 시티딘 디아미나제의 염기 교정 위치， on-target 부위에서의 염기 교정 효율 또는 표적 특이성， 및 /또는 비표적 위치를 보다 정확하고 효율적으로 확인할 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 la는 HEK293T 세포의 7 가지 내재적 표적 부위 (EMXl, FANCF,

HEK2, RNF2, HEK3, HEK4, HBB) 에서 BEl (AP0BECl-dCas9) , BE2 (AP0BEC1- dCas9-UGI ) 및 BE3 (AP0BECl-nCas9-UGI) (참고예 1 참조)으로 얻은 염기 교정 효율을 나타낸다.

도 lb는 HEK293T 세포 내 7 개의 내재적 표적 부위에서 표적 심층 시뭔싱에 의해 측정된 Cas9 뉴클레아제 -유도 돌연변이 빈도를 보여준다. 도 lc는 7 개의 내재적 표적 지점에서 indel 빈도 또는 염기 교정 효율의 순위를 대표적으로 보여주는 그래프이다.

도 2a은 표적 부위 및 이와 1 내지 4개의 미스매치를 갖는 sgRNA 및， BE3 또는 Cas9를 암호화하는 플라스미드를 HEK293T 세포에 공동 형질감염시키고, 3개의 내재적 부위 (endogenous sites; EMXl)에서의 돌연변이 빈도를 측정한 결과이다 (기재된 핵산 서열은 그래프 위에서 아래 방향으로 서열번호 1부터 서열번호 31까지 순차적으로 번호 매겨짐). 도 2b는 표적 부위 및 이와 1 내지 4개의 미스매치를 갖는 sgRNA 및， BE3 또는 Cas9를 암호화하는 플라스미드를 HEK293T 세포에 공동 형질감염시키고， 3개의 내재적 부위 (endogenous sites; HBB)에서의 돌연변이 빈도를 측정한 결과이다 (기재된 핵산 서열은 그래프 위에서 아래 방향으로 서열번호 32부터 서열번호 62까지 순차적으로 번호 매겨짐). 도 2c는 표적 부위 및 이와 1 내지 4개의 미스매치를 갖는 sgRNA 및， BE3 또는 Cas9를 암호화하는 플라스미드를 HEK293T 세포에 공동 형질감염시키고， 3개의 내재적 부위 (endogenous s i tes ; RNF2)에서의 돌연변이 빈도를 측정한 결과이다 (기재된 핵산 서열은 그래프 위에서 아래 방향으로 서열번호 63부터 서열번호 93까지 순차적으로 번호 매겨짐) . 도 3a는 EMX1 부위에서의 Cas9 뉴클레아제와 관련된 indel 빈도와 BE3와 관련된 염기 교정 빈도를 보여주는 그래프이다.

도 3b는 HBB 부위에서의 Cas9 뉴클레아제와 관련된 indel 빈도와 BE3와 관련된 염기 교정 빈도를 보여주는 그래프이다.

도 3c는 RNF2 부위에서의 Cas9 뉴클레아제와 관련된 indel 빈도와

BE3와 관련된 염기 교정 빈도를 보여주는 그래프이다.

도 4a는 BE3 Digenome-seq의 개요를 모식적으로 보여준다.

도 4b는 BE3 및 /또는 USER를 처리한 경우， 절단된 PCR 산물을 보여주는 전기영동 사진이다.

도 4c는 B3에 의한 C 대 U 전환 및 USER에 의한 DNA 절단 결과를 보여주는 Sanger 시퀀싱 결과이다.

도 4d는 EMX1의 표적 사이트에서의 sequence read의 직선 정렬을 나타내는 IGV 이미지이다.

도 5는 6개의 다른 표적 s i tes에서의 sequence read의 직선 정렬을 나타내는 IGV 이미지이다.

도 6a (EMX1) 및 6b (HBB)는 손상되지 않은 유전체 DNA (회색; 중앙부로부터 첫 번째 layer )와 BE3 및 USER (파란색; 중앙부로부터 2 번째 layer ) 또는 Cas9 (빨간색; 중앙부로부터 3 번째 l ayer ; 도 6b에만 있음)로 분해된 유전체 DNA로 얻은 DNA 절단 점수를 나타내는 Genome-wide ci rcus plot로서， 화살표는 타겟 사이트를 나타낸다.

도 6c (EMX1) 및 6d (HBB)는 Di genome-capture si tes (표 2-8)에서 DNA 서열을 사용하여 WebLogo를 통해 얻은 서열 로고 (DNA 분해 점수 > 2.5)를 나타낸다.

도 6e (EMX1) 및 6f (HBB)는 표적 심부 시뭔싱을 이용하여 결정된 Cas9 매개 indel 빈도와 BE3 매개 치환 빈도의 Scatterplot를 나타내는 것으로, 원으로 표시된 점들은 BE3에 의해 확인되었지만 Cas9에 의해 유효한 효과가 없는 비표적 사이트를 나타낸다. 도 6g (EMX1) 및 6h (HBB)는 표적 심부 시퀀성에 의해 HEK293T 세포에서 확인 된 BE3 비표적 사이트를 보여주는 것으로， PAM 서열은 3 ' 말단의 마지막 3개 뉴클레오타이드이고， mi smatched base는 소문자로 표시하였으며， 대시 (-)는 RNA bulges를 나타낸다 (Error bars indi cate s . e .m . (n = 3) ) .

도 7은 Cas9 뉴클레아제- 및 base edi tor-처리 유전체 DNA의 Digenome-seq에 의해 확인된 DNA 절단 점수가 2.5 이상인 부위의 수를 보여주는 벤 다이어그램이다.

도 8은 DNA 절단 점수의 범위에 대한 총 사이트 수 (國)와 10 개 이하의 mi smatches (ᄆ)가 있는 PAM 함유 사이트 수를 보여주는 그래프이다.

도 9는 Cas9 nucl ease- 및 Base edi tor- 처리 유전체 DNA의 Digenome-seq에 의해 확인 된 0. 1 이상의 DNA 절단 점수를 갖는 PAM-포함 상동성 부위의 수를 보여주는 벤다이어그램이다.

도 10은 Digenome-seq에 의해 포획된 상동성 부위의 비율을 보여주는 것으로， 막대는 표적 (표적 ) 부위와 6 nt까지 다른 상동성 부위의 수를 나타내고， 사각형 (BE3)과 삼각형 (Cas9)은 미스매치 숫자의 범위에 대해 Digenome-seq 포획 사이트의 비율을 나타낸다.

도 11a 및 lib는 Digenome 1.0 ( 11a) 및 Digenome 2.0 ( lib)에 의해 확인 된 BE3-와 Cas9-관련 사이트의 수 사이의 상관관계를 보여주는 그래프이다.

도 12a 및 12b는 Digenome 1.0 (a) 또는 Digenome 2.0 (b)에 의해 확인 된 BE3 관련 사이트의 수와 6 개 이하의 미스매치가있는 사이트의 수 사이의 상관 관계를 보여주는 그래프이다.

도 13은 posi t ions 4-9에 시토신이 없는 Cas9에만 관련된 Digenome- 포획된 비표적 사이트를 예시적으로 보여준다.

도 14a 내지 14c는 3 개의 다른 Cas9 뉴클레아제와 관련된 Digenome-captured사이트의 염기 교정 효율을 보여준다.

도 15a 내지 15c는 Digenome-음성 사이트에서 3 가지 서로 다른 BE3 디아미나제의 염기 교정 효율을 보여준다.

도 16a는 기존 sgRNA (gX19 sgRNA) , 절단된 (truncated) sgRNA (gX18 또는 gX17 sgRNA) 및 연장 (extended) sgRNA (gX20 또는 ggX20 sgRNA)를 도식적으로 보여준다.

도 16b는 HEK293T세포의 표적 사이트 및 비표적 사이트의 염기 교정 빈도를 표적 심독 시뭔싱으로 측정한 결과를 보여준다.

도 17은 변형된 sgRNA를 사용하여 BE3 비표적 효과를 감소시킬 수 있음을 보여주는 것으로， 17a는 기존의 sgRNA (GX19 sgRNA)와 변형된 sgRNA (GX17 sgRNA, gX18 sgRNA, gX20 sgRNA 및 ggX20 sgRNA)의 개략적으로 보여주고， 도 17b는 HEK293T 세포에서 표적 심층 시뭔싱에 의해 EMX1 표적 사이트 및 비표적 사이트에서 측정된 염기 교정 효율 (빈도)를 보여준다.

도 18a는 플라스미드 rAP0BECl-XTEN-dCas9-NLS의 개열지도이다. 도 18b는 플라스미드 rAPOBECl-XTEN— dCas9-UGI-NLS의 개열지도이다. 도 18c는 플라스미드 rAP0BECl-XTEN-Cas9n— UGI-NLS의 개열지도이다. 도 19는 Cas9 expression plasmid의 개열지도이다.

도 20은 His6-rAP0BECl-XTEN-dCas9을 코딩하는 플라스미드 pET28b- BE1의 개열지도이다.

도 21a 내지 21c는 Digenome-seq 이외의 방법으로 전체 유전체에서의 베이스 에디터의 비표적 사이트를 프로파일링하는 방법을 모식적으로 보여주는 것으로， 21a는 circle-seq, 21b는 Bless , 21c는 DSBCapture를 이용한 방법을 각각 보여준다.

도 22는 BEl(rAP0BECl-dCas9)-매개 이중 가닥 절단 (double strand breaks； DSBs) 과정 및 결과를 보여주는 것으로, (a)는 BE1 (rAPOBECl- dCas9) , USER 효소， 및 SI 뉴클레아제를 이용하여 DSB를 도입하는 과정을 모식적으로 보여주며， (b)는 BEl/sgRNA, USER 효소， 및 S1 뉴클레아제 처리 후의 PCR 증폭 산물에서의 BE1-매개 DSB 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.

【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며， 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

[참고예]

1. 세포 배양 및 형질감염 HEK293T 세포 (ATCC CRL-11268)를 10 >(w/v) FBS 및 (w/v) 페니실린 /스트랩토 마이신 (Welgene)으로 보층된 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) 배지에서 유지시켰다. HEK293T 세포 (1.5xl0 ⁵ )를 24- 웰 플레이트에 접종하고， Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 sgRNA plasmid (500 ng)와, Base Editor plasmid (Addgene plasmid #73019 (Expresses BEl with Cᅳ terminal NLS in mammal i an cells; rAPOBECl-XTEN- dCas9-NLS; 도 18a), #73020 (Expresses BE2 in ma瞧 alian cells; rAP0BECl-XTEN-dCas9-UGI-NLS； 도 18b), #73021 (Expresses BE3 in mammalian cells; rAP0BECl-XTEN-Cas9n— UGI—NLS; 도 18c)) (1.5/g) 또는 Cas9 expression plasmid (Addgene plasmid #43945; 도 19)를 형질감염시켰다 (at ~80% confluency). 형질감염 후 72 시간 후에 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)을 사용하여 유전체 DNA를 분리하였다. 상기 세포에 대하여 마이코플라스마 오염 여부를 테스트하지 않았다.

하기하는 실시예에 사용된 sgRNA 는 표적 부위 서열 (표적 서열; on-target 서열; 표 1-8 참조) 중 5' 말단의 PAM서열 (5'-NGG— 3' (N은 A, T, G, 또는 C임))을 제외한 서열에서 T를 U로 바꾼 서열을 아래의 일반식 3의 표적화 서열 '로 하여 제작된 것을 사용하였다:

5 ' -(N _cas9 )厂 (GUUUUAGAGCUA)-(GMA)- ( UAGC GUUAAMUAAGGCUAGUCCGUUAUCMCUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC )-3' (일반식 3; 올리고뉴클레오타이드 링커: GAAA).

2. 단백질 정제

Hi _S 6-rAP0BECl-XTEN-dCas9 단백질을 코딩하는 플라스미드 (pET28b- BEl; Expresses BEl with N-terminal His6 tag in E. Coli； 도 20)는 David Liu (Addgene plasmid #73018)로부터 제공받았다. 또한， 상기 His6- rAP0BECl-XTEN-dCas9 단백질을 코딩하는 플라스미드 pET28b— BE1에서 site directed mutagenesis를 이용하여 dCas9의 A840을 H840로 치환하여， His6- rAP0BECl-nCas9 단백질 (BE3 delta UGI; UGI 도메인을 결여한 BE3 변이형)을 코딩하는 플라스미드 (pET28b-BE3 delta UGI)를 제작하였다.

Rosetta 발현 세포 (Novagen, catalog number： 70954-3CN)를 상기 준비된 pET28b— BE1 또는 pET28b_BE3 delta UGI 로 형질 전환시키고， 100 μg/ \ kanamycin 과 50 mg/ml carbenici 1 in 을 포함하는 Lur ia-Bertani (LB) brot에서 37 ^° C 조건으로 밤새 배양하였다. pET28b-BEl 또는 pET28b- BE3 delta UGI 을 함유하는 Rosetta 세포를 밤새 배양한 배양물 10ml 를 100 g/ml kanamycin 및 50mg/ml carbenicilin 을 함유하는 400ml LB broth 에 접종하고 OD600이 0.5-0.6에 도달 할 때까지 30 ^° C 조건에서 배양하였다. 상기 배양된 세포를 1 시간 동안 16 ^° C로 넁각시키고， 0.5 mM IPTG(Isopropyl β -D-l—thiogalactopyranoside)를 보충하여， 14-18 시간 동안 배양하였다.

단백질 정제를 위해， 세포를 4 ^° C에서 10 분 동안 5000xg 에서 원심 분리하여 수확하고， 리소자임 (Sigma) 및 프로테아제 억제제 (Roche complete, EDTA-f ree)보층된 용해 완층액 (50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl , 1 mM DTT 및 10 mM imidazole, pH 8.0) 5 ml 에서 초음파 처리하여 용해시켰다. 상기 얻어진 세포 반웅물을 4 ^° C에서 13,000 rpm로 30분 동안 원심분리하여 얻어진 용해성 세포 용해물을 Ni-NTA 아가로즈 레진 (Qiagen)과 함께 4 ^° C에서 1 시간 동안 배양하였다. 세포 용해물 /Ni- NTA 흔합물을 컬럼에 적용하고 완층액 (50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl 및 20 mM 이미다졸， pH 8.0)으로 세척하였다. BE3 단백질을 용출 완층액 (50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl 및 250 mM 이미다졸， pH 8.0)으로 용출시켰다. 용출된 단백질을 저장 완층액 (20 mM HEPES-KOH (pH 7.5)， 150 mM KC1 , 1 mM DTT 및 20% 글리세를)으로 버퍼 교체하여 저장하고 원심 분리 필터 유닛 (Millipore)을 사용하여 농축시켜， rAP0BECl-XTEN_dCas9 단백질과 rAP0BECl-nCas9을 정제하였다.

3. PCR증폭산물의 탈아민화 및 USER처리

우선, EMX1 사이트를 포함하는 PCR 증폭 산물 (10 /g)을 37 ^° C에서 1 시간 동안 100 ^의 반웅 부피에서 정제된 rAP0BECl-nCas9 단백질 (4 과 EMX1 특이성 sgRNA (3 g)와 함께 배양하였다. 그 후， 상기 배양물을 37 ^° C에서 30 분 동안 USER (Uraci 1-Speci f ic Excision Reagent) (6 units) (New England Bio labs; ht tps： // www . neb . com/ product s/m5505- user-enzyme; Uracil DNA glycosylase (UDG) 및 DNA glycosylase- lyase Endonuc lease VIII 흔합물과 50 mM KC1， 5 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)， 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 175 mg/ml BSA 및 50¾)(w/v) glycerol 포함)와 함께 배양한 다음， 아가로즈 젤 전기 영동을 수행하였다.

4. 유전체 DNA의 탈아민화및 USER처리 유전체 DNA 는 제조자의 지시에 따라 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)을 사용하여 HEK293T 세포로부터 정제 (추출)하였다. 유전체 DNA (10 //g)를 상기 참고예 2에서 정제된 rAP0BECl_nCas9 단백질 (300 nM)과 sgRNA (900 nM)와 함께 500 ^의 반응 용량으로 37 ^° C에서 8 시간 동안 완충액 (100 mM NaCl, 40 mM) Hris-HCl, 10 mM MgC12, 및 100 /g/ml BSA, pH 7.9)에서 배양하였다. RNase A (50 /g/mL)를 사용하여 sgRNA 를 제거한 후， 우라실 함유 유전체 DNA 를 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)로 정제하였다. 정제된 genomic DNA (2 /zg)를 USER (6 Unit)와 함께 37 ^° C에서 100 의 반응 용량으로 3 시간 동안 배양한 다음, DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)로 다시 정제하였다. 표적 부위를 SUN-PCR 블렌드를 사용하여 PCR 증폭시키고 생거 (Sanger) 서열 분석을 수행하여 BE3-매개 시토신 탈아민화 및 USER-매개 DNA 절단을 확인하였다.

5. 전체 유전체 및 digenome의 시퀀성

Covaris 시스템 (Life Technologies)을 사용하여 400—500 bp 범위로 유전체 DNA (1 /g)를 단편화하고 End Repair Mix (Thermo Fischer)를 사용하여 blunt-ended 시켰다. 단편화된 DNA 를 어댑터로 연결하여 라이브러리를 생성 한 다음， Macrogen 에서 HiSeq X Ten Sequencer (Illumina)¾-사용하여 WGS(whole genome sequencing)를 수행하였다.

6. 표적 심층 시퀀싱 (Targeted deep sequencing)

deep sequencing 라이브러리 생성을 위해， 표적과 잠재적인 비표적 부위를 KAPA HiFi HotStart PCR 키트 (KAPA Biosystems # KK2501)로 증폭시켰다. 풀링된 PCR 증폭물을 TruSeq HT Dual Index 시스템 (Illumina)이 장착된 MiniSeq (Illumina) 또는 Illumina Miseq(LAS Inc. 한국)을 사용하여 시뭔싱하였다. 실시예 1. 인간 세포에서 BE3-관련 염기 교정 효율과 Cas9-관련 indel 빈도의 비교

HEK293T 세포의 7 개의 유전체 유전자좌 (EMXl, FANCF, HEK2, RNF2, HEK3, HEK4, HBB)에서， 세 가지 다른 형태의 BE의 단일 염기 치환 빈도에 의해 정의된 염기 교정 (base editing) 효율을 구하여， Cas9 뉴클레아제의 표적 부위에서의 i _nde i 빈도에 의해 정의된 유전체 교정 효율과 비교하였다 (도 la, b). 도 la는 HEK293T 세포의 7 가지 내재적 표적 부위 (EMX1 , FANCF, HEK2, RNF2 , HEK3 , HEK4, HBB)에서 BE1 (AP0BEC1- dCas9) , BE2 (AP0BEC-dCas9-UGI ) 및 BE3 (AP0BEC-nCas9-UGI ) (참고예 1 참조)으로 얻은 염기 교정 효율을 나타낸다. 염기 교정 효율은 표적 심층 시뭔싱 (targeted deep sequencing)으로 측정하였다 (참고예 6 참조) . BE3 [AP0BEC-nCas9-UGI (uraci l DNA glycosylase inhibi tor) , 29±6 )]이 BE1 (AP0BECl-dCas9 , 5± 1%)와 BE2 (AP0BEC-dCas9-UGI , 8± 2%)보다 우수한 효율을 나타내었다. 도 lb는 HEK293T 세포 내 7 개의 내재적 표적 부위에서 표적 심층 시뭔싱에 의해 측정된 Cas9 뉴클레아제 -유도 돌연변이 빈도를 보여준다 (참고예 1의 Cas9 expression plasmid (Addgene plasmid #43945 ; 도 19)를 사용하여 얻어진 결과임) . 이러한 결과는 BE3 활성이 Cas9 뉴클레아제 활성과 독립적임을 확인시켜 주는 것이다.

도 lc는 7 개의 내재적 표적 지점 (on target si te ; 표 2-8 참조)에서 indel 빈도 또는 염기 교정 효율의 순위를 대표적으로 보여주는 그래프이다. 도 lc에서 보여지는 바와 같이， 활성 순위 분석 결과， 특정 sgRNA는 Cas9과 함께 작용할 때는 활성이 낮지만 BE3와 함께 작용할때는 높은 활성을 나타내는 한편， 그 반대의 상관성을 나타내는 sgRNA도 존재하였다.

실시예 2· mismatched sgRNAs에 대한 BE3와 Cas9의 관용 (tolerance)

BE3 디아미나제의 특이성을 평가하기 위하여， BE3가 smal l guide

RNA (sgRNAs)에서의 미스매치 (mi smatch)를 관용할 수 있는지 여부를 세포 내에서 조사하였다. 이를 위해, 1 내지 4개의 미스매치를 갖는 sgRNA 및， BE3 또는 Cas9를 암호화하는 플라스미드 (참고예 1 참조)를 HEK293T 세포에 공동 형질감염시키고， 3개의 내재적 부위 (endogenous si tes ; EMX1 , HBB, RNF2)에서의 돌연변이 빈도를 측정하였다.

사용된 1 내지 4개의 미스매치를 갖는 sgRNA의 표적 부위 (PAM서열 (굵은 글씨) 포함)를 아래의 표 1에 정리하였다:

[표 1]

GAGTCCGAatgaAAGA GTTGCCCCgtgaGGCAG GTCATCTTgactATTA

34 65

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCGAGCAGggag GTTGCCCCACAGaatgG GTCATCTTAGTCgccg

35 66

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCGAGCAGAAGA GTTGCCCCACAGGGCAa GTCATCTTAGTCATTA

36 67

gaggGGG cggCGG ttcaAGG

GAactCGAGCAGAAGA GTcatCCCACAGGGCAG GTtgcCTTAGTCATTA

37 68

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCtagGCAGAAGA GTTGCtttACAGGGCAG GTCATtccAGTCATTA

38 69

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCGAatgGAAGA GTTGCCCCgtgGGGCAG GTCATCTTgacCATTA

39 70

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCGAGCAaggGA GTTGCCCCACAaaaCAG GTCATCTTAGTtgcTA

40 71

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCGAGCAGAAag GTTGCCCCACAGGGtga GTCATCTTAGTCATcg

41 72

gGAAGGG TAACGG tCTGAGG

GAGTCCGAGCAGAAGA GTTGCCCCACAGGGCAG GTCATCTTAGTCATTA

42 73

AaggGGG cggCGG CtcaAGG

GAacCCGAGCAGAAGA GTcaCCCCACAGGGCAG GTtgTCTTAGTCATTA

43 74

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTttGAGCAGAAGA GTTGttCCACAGGGCAG GTCActTTAGTCATTA

44 75

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCagGCAGAAGA GTTGCCttACAGGGCAG GTCATCccAGTCATTA

45 76

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCGAatAGAAGA GTTGCCCCgtAGGGCAG GTCATCTTgaTCATTA

46 77

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCGAGCgaAAGA GTTGCCCCACgaGGCAG GTCATCTTAGctATTA

47 78

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCGAGCAGggGA GTTGCCCCACAGaaCAG GTCATCTTAGTCgcTA

48 79

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCGAGCAGAAag GTTGCCCCACAGGGtgG GTCATCTTAGTCATcg

49 80

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCGAGCAGAAGA GTTGCCCCACAGGGCAa GTCATCTTAGTCATTA

50 81

gaAAGGG cAACGG ttTGAGG

GAGTCCGAGCAGAAGA GTTGCCCCACAGGGCAG GTCATCTTAGTCATTA

51 82

AGggGGG TggCGG CCcaAGG

GgGTCCGAGCAGAAGA GcTGCCCCACAGGGCAG GcCATCTTAGTCATTA

52 83

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGcCCGAGCAGAAGA GTTaCCCCACAGGGCAG GTCgTCTTAGTCATTA

53 84

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCtGAGCAGAAGA GTTGCtCCACAGGGCAG GTCATtTTAGTCATTA

54 85

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCGgGCAGAAGA GTTGCCCtACAGGGCAG GTCATCTcAGTCATTA

55 86

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCGAGtAGAAGA GTTGCCCCAtAGGGCAG GTCATCTTAaTCATTA

56 87

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCGAGCAaAAGA GTTGCCCCACAaGGCAG GTCATCTTAGTtATTA

57 88

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG GAGTCCGAGCAGAgGA GTTGCCCCACAGGaCAG GTCATCTTAGTCAcTA

27 58 89

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCGAGCAGAAGg GTTGCCCCACAGGGCgG GTCATCTTAGTCATTg

28 59 90

AGAAGGG TAACGG CCTGAGG

GAGTCCGAGCAGAAGA GTTGCCCCACAGGGCAG GTCATCTTAGTCATTA

29 60 91

AaAAGGG cAACGG CtTGAGG

GAGTCCGAGCAGAAGA GTTGCCCCACAGGGCAG GTCATCTTAGTCATTA

30 61 92

AGAgGGG TAgCGG CCTaAGG

GAGTCCGAGCAGAAGA GTTGCCCCACAGGGCAG GTCATCTTAGTCATTA

31 AGAAGGG (on 62 TAACGG (on target 93 CCTGAGG (on

target sequence) sequence) target sequence)

(표 1에서， 소문자로 표시된 염기 우치는 mismatched 사 ⁰ 의미함)

상기 표 1의 미스매치 서열 및 표적 서열에서 얻어진 결과 (Indel 빈도와 시토신 전환 빈도)를 도 2a 내지 2c에 나타내었다 (2a: EMXl, 2b: HBB 및 2c: RNF2; Error bars indicate s.e.m. (n = 3)). 도 2a 내지 2c에서 'Cn'으로 표시된 것은 미스매치 서열 또는 표적 서열에서 5' 발단부터 n번째에 위치하는 시토신 (C)의 변이 (다른 염기로 치환 또는 결실) 비율을 나타낸다. Indel 빈도와 시토신 전환 빈도 (base editing frequency)는 표적 심층 시뭔싱 (참고예 6)을 사용하여 측정하였다. 상기 표적 심층 시뭔싱에 사용된 프라이머는 다음과 같다:

EMX1

1st PCR

Forward(5 '→3 ' )：

AGTGTTGAGGCCCCAGTG (서열번호 94);

Reverse(5'→3' )：

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGCAGCAAGCAGCACTCT (서열번호

95)；

2nd PCR

Forward(5'→3' )：

ACACTCmCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGCCTCCTGAGTTTCTCAT (서열번호

96)；

Reverse(5'→3' )

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGCAGCAAGCAGCACTCT (서열번호

^' 97)； HBB

1st PCR

Forward(5'→3' )：

GGCAGAGAGAGTCAGTGCCTA (서열번호 98);

Reverse(5'→3' )：

GTGACT(^AGTOAGACGTGT( TCTTCCGATCTCAGGGCTGGGCATAAAAGT (서열번호

99)；

2nd PCR

Forward(5'→3' )：

ACACTCmCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTCTCCACATGCCCAGTTTC

(서열번호 100);

Reverse(5'→3' )

GTGACTGGAGTOAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGGGCTGGGCATAAAAGT

(서열번호 101)；

RNF2

1st PCR

Forward(5'→3' )：

CCATAGCACTTCCCTTCCAA (서열번호 102);

Reverse(5'→3' )：

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCAACATACAGAAGTCAGGAA

(서열번호 103)；

2nd PCR

Forward(5'→3' )：

ACACTCmCCCTACACGACi TCTTCCGATCTATTTCCAGCAATGTCTCAGG

(서열번호 104);

Reverse(5'→3' )

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCAACATACAGAAGTCAGGAA

(서열번호 105).

또한， EMX1 (도 3a) 부위， HBB 부위 (도 3b)， 및 RNF2 부위 (도 3c)에서의 Cas9 뉴클레아제와 관련된 indel 빈도와 BE3와 관련된 염기 교정 빈도를 mismatched sgRNAs (표 1 참조)를 사용하여 측정하여， 그 결과를 도 3a 내지 3c에 나타내었다. 도 3a 내지 3c에서 보여지는 바와 같이, 전반적으로， Cas9 유도 indel 빈도와 BE3 유도 치환 빈도 간 통계적으로 유의미한 상관관계 (3개의 부위에서 각각 = 0.70， 0.83 , 및 0.72)가 있다.

BE3 디아미나제와 Cas9 뉴클레아제는 거의 모든 위치에서의 1개 뉴클레오타이드 ( 1-nt )의 미스매치 및 PAM-원위 영역 (protospacer- ad j acent mot i f (PAM)-di stal region)에서의 2개 뉴클레오타이드 (2-nt ) 미스매치에 대해서는 관용을 보였으나， PAM-근위 영역 또는 PAM-원위 영역에서의 3-nt 또는 4-nt 미스매치에 대해서는 관용을 나타내지 못한다. 그러나， 2 개 또는 3 개의 미스매치를 갖는 일부 sgRNA (도 2a— 2c에서 별표로 표시)는 BE3와 함께 사용하는 경우 높은 활성을 나타내는 반면， Cas9와 함께 사용하는 경우에는 활성이 우수하지 않았으며, 그 반대도 마찬가지였다. 예를 들어， EMX1 부위에서， 완전히 일치하는 sgRNA 또는 3-nt 미스매치 sgRNA를 BE3와 함께 사용하는 경우 비교 가능한 정도의 빈도 차이 (33% vs . 14%)로 치환을 유도하는 반면， 동일한 완전 일치 또는 3-nt 미스매치 sgRNA를 Cas9와 함께 사용하는 경우에는 광범위하게 다른 indel 빈도를 나타내었다 (50% vs . 2%) (도 2a) . 반대로， 2 개의 2-nt 미스매치를 갖는 sgRNA를 BE3와 함께 사용하는 경우에 활성이 낮은 반면 (치환 빈도 <1%)， 동일한 미스매치를 갖는 sgRNA를 Cas9와 함께 사용하는 경우에는 활성이 높았다 ( indel 빈도 > 10%) (도 2a) . 이러한 결과는 미스매치를 갖는 sgRNA에 대한 Cas9 뉴클레아제와 BE3 디아미나제의 내성이 다를 수 있으며， BE3와 Cas9가 유전체 내에서 분리된 세트의 비표적 부위를 가질 수 있음을 암시한다. 따라서， RNA-progra匪 able 디아미나제의 유전체 -전체 특이성을 프로파일링하는 방법이 필요하다.

실시예 3. 인간 유전체에서 BE3 비표적 sites를 확인하기 위한 Digenome-seq

유전체 전체에 걸쳐 Cas9 뉴클레아제가 DSB를 유도하는 비표적 위치를 확인하기 위한 방법으로， GUIDE-seq (Tsai , S.Q . et al . GUIDE-seq enables genome-wi de prof i l ing of 비표적 cleavage by CRISPR-Cas nucleases . Nature biotechnology 33， 187-197 (2015) ) , HTGTS (Frock, R .L . et al . Genome-wide detect ion of DNA double-stranded breaks induced by engineered nucleases . Nature biotechnology (2014) ) , BLESS (Ran, F .A. et al . In vivo genome edi t ing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 520, 186-191 (2015)), 및 IDLV capture (Wang, X. et al . Unbiased detection of 비표적 cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-def ect i ve lent iviral vectors . Nature biotechnology 33， 175ᅳ 178 (2015)) 등과 같은 몇 가지 상이한 세포 기반 방법들이 개발되었다. deaminases가 DSB를 생성하지 않기 때문에， 적어도 현재의 형태로는， 상기 방법들 중 어느 것도 programmable deaminases의 유전체 전체 특이성 (genome-wide sped f icit ies)을 평가하는 데에 적합하지 않다. 적절한 효소를 사용하여 시험관내 (/i / ro)에서 탈아민화된， 우라실 함유 위치 (deaminated, uraci 1-containing sites)에서 DSB를 생성할 수 있으며， 이때 발생한 DNA 절단 위치는 Cas9와 Cpfl 뉴클레아제의 유전체 전체 특이성을 평가하는데 사용되는 시험관내 방법인 Digenome-seq (digested- genome sequencing; 참조문헌: Kim, D. , Kim, S. , Kim, S. , Park, J. & Kim, J.S. Genome-wide t rget specificities of CRISPRᅳ Cas9 nucleases revealed by multiplex Digenome-seq. Genome research 26, 406-415 (2016); Kim, D. et al . Genome-wide analysis reveals specificities of Cpfl endonuc leases in human eel Is . Nature biotechnology 34， 863-868 (2016)； Kim, D. et al . Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPRᅳ Cas9 비표적 effects in human cells. Nature methods 12， 237-243, 231 p following 243 (2015))을 통해 확인할 수 있을 것으로 예측된다.

이러한 예측을 확인하기 위하여， 표적 서열을 포함하는 PCR 증폭산물 (amp Π con)을， 시험관내에서， (1) UGI 도메인이 없는 BE3의 유도체인 재조합 rAP0BECl-nCas9 단백질 (참고예 2)과 이의 sgRNA와 함께 배양하여， C로부터 U로의 전환 (C-to-U conversions) 및 Watson and Crick strands에서의 절단 (nick)을 각각 유도한 후， (2) E. coli Uracil DNA glycosylase (UDG)와 DNA glycosylaseᅳ lyase Endonuc lease VI 11의 흔합물인 USER (Uraci 1-Specific Excision Reagent)와 함께 배양하여 우라실 위치에서의 틈새 (gap)를 생성하여 composite DSB를 발생시켰다 (도 4a 참조). 다음으로， Digenome-seq를 사용하여 BE3 디아미나제의 유전체 전체 표적 특이성을 평가할 수 있는지 여부를 조사하였다. HEK293T 세포로부터 정제된 인간 유전체 DNA를 7 시간 동안 각각 3 회의 BE3 리보뉴클레오타이드 (RNP) (300 nM rAP0BECl-nCas9 단백질 (참고예 2) 및 900 nM sgRNA)와 함께 배양 한 다음， 3 시간 동안 사용자와 함께 배양 하였다 (도 4a 참조).

도 4a는 이와 같은 BE3 Digenome-seq의 개요를 보여준다. E. coli Uracil DNA glycosylase (UDG)와 DNA glycosylase- lyase Endonuc lease VI 11의 흔합물인 USER에 의해 BE3-매개 우라실 함유 부위가 절단되는 것을 확인할 수 있다. 도 4b는 BE3 및 /또는 USER를 처리한 경우， 절단된 PCR 산물을 보여주는 전기영동 사진이다. 도 4b에 나타난 바와 같이， PCR 증폭산물은 BE3과 USER와 함께 배양할 때 절단됨을 확인할 수 있다.

BE3에 의해 유도 된 C 대 U 전환 및 USER에 의한 우라실 제거는 Sanger 시뭔싱에 의해 확인하였다 (도 4c 참조). 도 4c는 B3에 의한 C 대 U 전환 및 USER에 의한 DNA 절단 결과를 보여주는 Sanger 시뭔싱 결과이다. 각 유전체 DNA 샘플을 end repair 및 adaptor ligation한 후， 전체 유전체 시퀀싱 (WGS)을 수행하였다 (도 4a 참조).

인간 참조 유전체 (human reference genome； hgl9)에 대한 서열 정렬 (sequence alignment) 푸， 통합 유전체 뷰어 (Integrative Genomics Viewer; IGV)를 사용하여 표적 위치에서의 정렬 패턴을 모니터링하여 그 결과를 도 4d 및 도 5에 나타니었다. 도 4d는 EMX1의 표적 사이트에서의 sequence read의 직선 정렬을 나타내는 IGV 이미지이고， 도 5는 6개의 다른 표적 sites에서의 sequence read의 직선 정렬을 나타내는 IGV 이미지이다. 도 4d 및 도 5에 나타난 바와 같이， 시험관내에서 생성된 DSB와 관련된 시그니처 패턴이 7 개의 표적 위치 모두에서 관찰되었다.

실시예 4. Digenome-seq에 의하여 밝혀진 유전체 전체의 BE3비표적 사이트

인간 유전체에서 BE3 비표적 위치를 확인하기 위하여， 5' 말단이 정해진 위치에 정렬된 서열 리드의 개수 (number of sequence reads)를 기반으로 DNA 절단 점수를 유전체의 각 nt 위치에 할당하고， 발명자들의 이전 연구 (Kim, D. , Kim, S. , Kim, S. , Park, J. & Kim, J.S. Genome-wide target specificities of CRISPRᅳ Cas9 nucleases revealed by multiplex Digenome-seq. Genome research 26， 406-415 (2016))에서 동일한 7 sgRNA 세트와 함께 사용되는 Cas9 뉴클레아제의 비표적 위치를 확인하기 위하여 사용된 컷오프 값인 2.5 이상의 점수를 갖는 위치를 모두 나열하였다 (도 6a-d 및 표 2-8).

각 뉴클레오티드의 위치 i (즉 유전체 DNA 상의 뉴클레오타이드 위치)에 DNA 절단 점수를 다음의 수식으로 산출하였다: ΐ위치에서의점수 -

i위치에서 시작하는 ¾방향염기서 ¾데이터의 수

i위치에서 사작하는역방향염기서열데이터의수

위치에서의시원상 ¾이

임의의상수

상기 수식에서 염기서열 데이터의 수는 뉴클레오타이드 리드 수를 의미하고, 시퀀싱 깊이는 특정 위치에서의 시뭔싱 리드수를 의미하며， C 값은 1로 하였다.

Digenome一 captured si tes (cleavage si te + PAM) 및 DNA 절단 스코어 (DNA cleavage score)를 아래의 표 2 내지 8에 나타내었다:

[표 2] (On target : EMX1_4)

EMX1_14 chi-9 111348573 1.56 GAGTCC t. tG-AGAAGAAGgAAGG 118 RNA bulge

EMX1_15 chr3 5031614 1.50 GAaTCCaAGCAGgAGAAGAAGGA 119 X

EMX1_16 chrl4 31216733 1.34 G t cCaGAG-AGAAGAAGAgAGG 120 RNA bulge

EMX1_17 chr l4 48932119 1. 16 GAGTCCcAGCAaAAGAAGAAAAG 121 X

EMX1— 18 chr ll 107812992 1.04 aAGTCCaAG t -GAAGAAGAAAGG 122 RNA- bul ge

EMX1_19 chr l2 106646090 1.03 aAGTCC t GCAGAAGAgGAAGGG 123 X

EMX1_20 chr2 71969823 0.80 GAGTCC t AG-AGAAGAAaAAGGG 124 RNA bulge

EMX1_21 chr3 145057362 0.48 GAGTCCc r -CAGgAGAAGAAAGG 125 RNA bulge

EMX1_22 chr6 9118799 0.45 a cGTC t GAGCAGAAGAAGAATGG 126 X

EMX1_23 chr l 59750259 0.27 GAGTt CcAGaAGAAGAAGAAGAG 127 X

EMX1_24 chrll 79484079 0.22 GAGTCC t Aa-AGMGAAGcAGGG 128 RNA bulge

EMX1_25 chr9 135663403 0.21 129 X

[표 3] (On target sequence： FANCF_2)

[표 4] (On target sequence : RNF2_1 )

[표 5] (On target sequence - ^' HBB_1 ) 聽― 1 chr ll 5248214 17.68 CTTGCCCCACAGGGCAGTAACGG 145 X

HBB_2 chr l7 8370252 13.64 tTgctCCCACAGGGCAGTAAACG 146 . X

HBB_3 chr l2 124803834 10.88 gcTGCCCCACAGGGCAGcAAAGG 147 X

HBB_4 chrX 75006256 2.34 gTgGCCCCACAGGGCAGgAATGG 148 X 醒_5 chrl2 93549201 0.55 aTTGCCCCACgGGGCAGTgACGG 149 X 匪— 6 chr lO 95791920 0.27 acTc t CCCACAaGGCAGTAAGGG 150 X

HBB_7 chr9 104595883 0. 18 t c aGCCCCACAGGGCAGTAAGGG 151 X

[표 6] (On target sequence : HEK2_2)

[표 7] (On target sequence： HEK3_2)

표 8] (On target sequence： HEK4_1) 腿4_9 chr20 1151854 8.41 GGCACTGtGGCTGcAGGTGGAGG 170 X

HEK4_10 chr l5 71686928 7.70 tGCtCTGCGGCaGGAGGaGGAGG 171 X

HEK4_11 chr7 1397398 6.71 aGCACTGCaGCTGGgaGTGGAGG 172 X

HE 4_12 chr20 45343010 6. 57 GGCACTGaGGgTGGAGGTGGGGG 173 X

HE 4_13 chr8 20854500 5. 57 GGCACTGgGGCTGGAGacGGGGG 174 X

HEK4—14 chr7 54561437 5.40 aGgACTGCGGCTGGgGGTGGTGG 175 X

HE 4_15 chr 15 60790561 5. 29 GGCACTGCaaCTGGAaGTGaTGG 176 X

HE 4_16 chr l3 27629410 4.40 GGCACTGgGGt TGGAGGTGGGGG 177 X

HE 4_17 chr 7 110143150 3. 69 GcCACTGCaGCTaGAGGTGGAGG 178 X

HE 4_18 chr 7 139244406 3. 59 GcCACTGCGaCTGGAGGaGGGGG 179 X

HEK4_19 chr 19 2474643 3.56 GGCACTG-GGCTGGAGGcGGGGG 180 RNA bulge

HEK4_20 chr 2 6961255 3. 17 aGCtCTGCGGCaGGAGtTGGAGG 181 X

HE 4_21 chr 17 75429280 2.90 GaCACcaCGGCTGGAGaTGGTGG 182 X

HEK4_22 chr 7 17979717 2.66 Gcact gGCaGCcGGAGGTGGTGG 183 DNA bulge

HE 4_23 chr 9 5020590 2. 64 t GCACTGCaGCTGcAGGTGGAGG 184 X

HE 4_24 chrX 122479548 2. 52 GGCACTG-GGCTGGAGaTGGAGG 185 RNA bulge

HEK4_25 chr 12 104739608 2. 48 cc t tCTGCGGCTGGAaGTGGTGG 186 X

HE 4_26 chr 17 40693638 2.38 Gc ac t gc aGGCaGGAGGTGaGTG 187 DNA bulge

HEK4_27 chr 8 144781301 2.38 GaCACTGCaGCTGGAGGTGGGGT 188 X

HEK4— 28 chr 9 74103955 2.36 GGCACTGCaGCaGGgGaTGGGGG 189 X

HEK4_29 chr 18 37194558 2.31 GGCACTGCGGgTGGAGGcGGGGG 190 X

HEK4_30 chr 20 60895671 2. 12 GGCACaGCaGCTGGAGGTGcTGG 191 X

HEK4_31 chr 12 113935460 1.63 GGCcCTGCGGCTGGAGaT t GGG 192 X

HE 4_32 chrX 70597642 1. 57 GaCACTGC- t CTGGAGGTGGTGG 193 RNA bul ge

HE 4_33 chr 15 41044242 1.31 GGCgCTGCGGCgGGAGGTGGAGG 194 X

HEK4_34 chr 17 176302 1. 18 tGCACTGt GGCTGGAGaTGGGGG 195 X

HEK4— 35 chr 10 77103119 1. 15 GGCAt caCGGCTGGAGGTGGAGG 196 X

HE 4_36 chr 7 134872032 0.93 aGCACTGt GGCTGGgGGaGGCGG 197 X

HEK4_37 chr 9 133039175 0.86 Gt CACTGCaGCTGGAGGaGGGGG 198 X

HE 4_38 chr 10 73435248 0.79 Gt aACTGCGGCTGGcGGTGGTGG 199 X

HE 4_39 chr 14 21993455 0. 78 GGt ACaGCGGCTGGgGGaGGCGG 200 X

HE 4_40 chr 17 29815563 0.59 GGCgCTGCGGCcGGAGGTGGGGC 201 X

HEK4_41 chr 16 50300346 0. 56 aGCACTGt GGCTGGgGGaGGGGG 202 X

HEK4_42 chr 11 78127584 0. 53 tGCACTGCaGCTGGAGGcaaCGG 203 X

HE 4_43 chr 19 . 1295086 0. 52 GaCACTGaGGCaGGAGGTGGGGG 204 X

HEK4— 44 chr 2 162283033 0. 51 GGCAt c t gGGCTGGgGGTaGGGG 205 X

HEK4_45 chr 20 24376056 0.47 GGCACTGaGaCc aGAGGTGGTGG 206 X

HEK4_46 chr 16 1029977 0.42 GGCACTGCaGacGGAGGTGtGGG 207 X

HE 4_47 chr 19 47503406 0.39 GGCACTG-GGCTGGAGGgGaGAG 208 RNA bulge

HEK4_48 chr 2 231467380 0.39 GGCACTGCaGCTGGgGGTt GGTG 209 X

HEK4— 49 chr 10 13692636 0.38 GGCACTGgGGCTGGgGGaGGGGG 210 X 飄4_50 chrl 32471659 0.34 GGCACTt CaGCTGGAGGcaGAGG 211 X

HE 4_51 chrl7 8634933 0.33 GGCACat -GGaTGGAGGTGGAGG 212 RNA bulge

HE 4_52 chr6 83388605 0.30 aGCACTGt GG-TGGAGGTGGAGG 213 RNA bulge

HEK4_53 chrlO 27700491 0.29 GGCACTG-GGt TGGgGGTGGTGG 214 RNA bul e

HE 4_54 chrl 143662284 0.27 GGCACa t -GGCTGGgGGTGGTGG 215 RNA bulge

HE 4_55 chr 16 49777696 0.22 t GCACTGCGaCTGGAGGgaGAGG 216 X

HEK4— 56 chrl9 38616186 0.19 GGCACTGaGaCTGGgGGTGGGGG 217 X

HEK4— 57 chr 10 126752487 0.18 GGCACTGCaGCctGgGGgtGGGG 218 X

HEK4_58 chr 16 28266968 0.17 GGC t CT t CGGCTGGAGGTaGCGG 219 X

HEK4_59 chr 2 149886210 0.15 GaCACTG-GGCTGGAGGTtGCGG 220 RNA bulge

HEK4_60 chr 20 37471343 0.15 aGCACTGt. GcCTGGgGGTGGGGG 221 X

HE 4_61 chr 12 53453556 0.13 t GgACTGCGGCTGGAGagGGAGG 222 X

HEK4_62 chr 15 30501337 0.13 GGCACTG-GGCTGGAtGTGGTGG 223 RNA bul e

HEK4_63 chr 5 139284047 0.12 GGCACTGaGGCTGcAGGcGGCGG 224 X

HEK4_64 chr 8 119227145 0.12 GGCACaatGGCTGGAGGTGaAGG 225 X

HEK4— 65 chr 14 95761249 0.11 GGCACTc t GGCTGGAGcTGGGGG 226 X

HEK4_66 chr 3 23651529 0.11 GGCACaGCaGgTGGAGGTGGAGG 227 X

HEK4_67 chr 12 9287415 0.10 GGC t CTGCaGCc aGgGGTGGAGG 228 X

(표 2 내지 표 8에서 소문자로 표시된 염기는 mismatched base를 나타낸다)

도 6a 및 6b는 손상되지 않은 유전체 DNA (회색; 중앙부로부터 첫 번째 layer)와 BE3 및 USER (파란색; 중앙부로부터 2 번째 layer) 또는 Cas9 (빨간색; 중앙부로부터 3 번째 layer; 도 6b에만 있음)로 분해된 유전체 DNA로 얻은 DNA 절단 점수를 나타내는 Genome-wide circus plot로서， 화살표는 타켓 사이트를 나타낸다. 도 6c 및 6d는 Digenome- capture sites (표 2-8)에서 DNA 서열을 사용하여 WebLogo를 통해 얻은 서열 로고 (DNA 분해 점수 > 2.5)를 나타내고， 도 6e 및 6f는 표적 심부 시뭔싱을 이용하여 결정된 Cas9 매개 indel 빈도와 BE3 매개 치환 빈도의 Scatterplot를 나타내는 것으로, 원으로 표시된 점들은 BE3에 의해 확인되었지만 Cas9에 의해 유효한 효과가 없는 비표적 사이트를 나타낸다. 도 6g 및 ^' 6h는 표적 심부 시퀀싱에 의해 HEK293T 세포에서 확인 된 BE3 비표적 사이트를 보여주는 것으로， PAM 서열은 3' 말단의 마지막 3개 뉴클레오타이드이고， mismatched base는 소문자로 표시하였으며， 대시 (- )는 RNA bulges를 나타낸다 (Error bars indicate s.e.m. (n = 3)) .

상기 심부 시퀀싱에 사용된 프라이머를 아래의 표 9 내지 표 15에 정리하였다: GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

CCCTTTCTTAATAAAT CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

EMX1_12

TACCCAGTTTC CTAAAAAGATAGGCAA TTGGACTAAAACACTG CTAAAAAGATAGGCAA ACATAGGAAAA CCCAAG ACATAGGAAAA

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

GCTTTTCTGGGGACAT CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

EMX1_13

AGCA CTAAGAATTCCAGGCA TACTTCCCTTGTCATC CTAAGAATTCCAGGCA GTTAACCA CCACA GTTAACCA

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

CACAGGAATGTCTTGG CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

EMX1_14

GTCA CTCTCTTCAATCCATC TCTTAGCCTGGGTCAT CTCTCTTCAATCCATC GCCAGT GCACT GCCAGT

ACACTCTTTCCCTACA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA CGACGCTCTTCCGATC GCACTTGTTGGCCATT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

EMX1_15

TTGAGGAGGCAAAAGG TGTA TTGAGGAGGCAAAAGG CTTTTTGAATATGTTT GAATA GAATA TAAATTCTCCACA

ACACTCTTTCCCTACA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA CGACGCTCTTCCGATC GCACAGAGGGTTGTTT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

EMX1_16

TAAGGCTAGCCCAGAG GCTT TAAGGCTAGCCCAGAG CTTTCATCCTTTTGTG TCTCC TCTCC GGGTTC

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

GGAATCAATCAATGAA CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

EMX1_17

GTTGAAGA CTTTTGCAATTTGCTT TGCAATCTGAAGAACA CTTTTGCAATTTGCTT AGTTATTGAA AAGAGCA AGTTATTGAA

ACACTCTTTCCCTACA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAG TCAGA CGACGCTCTTCCGATC TCAAGAGACTGTTGTT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

EMX1_18

TTGACATTTGATAGAA TTAGATTGTC TTGACATTTGATAGAA CTCCCAGTCCAATGGC CAGATGGGTA CAGATGGGTA TGTAGT

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

CCCTGCAAATTGAGTA CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

EMX1_19

CGTG CTGTCCCGAAGTGCTG TTGGGGGCCATTCTTT CTGTCCCGAAGTGCTG GAATTA ATAGTT GAATTA

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

GACAGTCCTGGGCTAG CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

EMX1_20

GTGA CTCTCTGGACTCAGCT TGAGAGTCAGGAGTGC CTCTCTGGACTCAGCT CCCATC CCAGT CCCATC

ACACTCTTTCCCTACA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA CGACGCTCTTCCGATC AGATGAATGCAGGGAG CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

EMX1_21

TCCTCTCATTTCTACC CTGT TCCTCTCATTTCTACC CTTTCTGAATTAAAAA ACCATTG ACCATTG TGGAAAGAACTG

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

ACAATTTCAGTAGTAG CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

EMX1_22

CATTAAGGAAT CTTTGTGACAAACTGC TGAATGCCAGTTCTGG CTTTGTGACAAACTGC CCTCTG GTTGT CCTCTG

ACACTCTTTCCCTACA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA CGACGCTCTTCCGATC CAAAAATCAACTCAAG CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

EMX1_23

TAATTTCTGAACCCAA ATGGATTAAA TAATTTCTGAACCCAA CTGAGAACCTAGGGAA AGACAGG AGACAGG AACTCTTCTG

EMX1_24 ACACTCTTTCCCTACA CTTGTGGATCATGGGT ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA CGACGCTCTTCCGATC ACTGAG CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT TCCAAGCTATTTAACT TCCAAGCTATTTAACT CTTGGGCCTTGGTATT GGTATGCAC GGTATGCAC AGAGCA

ACACTCTTTCCCTACA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA CGACGCTCTTCCGATC TGCTTTTTCACTTGTC CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

EMX1_25

TTCAAGGGGGTATATA TAGTTTTCTT TTCAAGGGGGTATATA CTAACAATTTCCCACA AAAGGAAGA AAAGGAAGA AAGTCCA

[표 10] ,

Ifcl rtf 舊霸 ¾ί^^ /- ^' ί \Π' ^'

1st PCR 2nd PCR

ID

Forward (5 ' to3 ' ) Reverse (5 ' to3 ' ) Forward (5 ' to3 ' ) Reverse (5 ' to3 ' )

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

CTGAAGGTGCTGGTTT CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

FANCF.l

AGGG CTTGTCTGATTGAGTC TTGACATCCAGGGTTT CTTGTCTGATTGAGTC

' CCCACA CAAGTC CCCACA

ACACTCTTTCCCTACA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

FANCF_2

CGACGCTCTTCCGATC TGACATGCATTTCGAC CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

(on

TATGGATGTGGCGCAG CAAT TATGGATGTGGCGCAG CTAGCATTGCAGAGAG

target )

GTAG GTAG GCGTAT

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

CCTCAGGGATGGATGA CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

FANCF_3

AGTG CTTCCCAGTGAGACCA TCCCTTACCAGATGGA CTTCCCAGTGAGACCA GTTTGA GGACA GTTTGA

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

CCCTTACCAGATGGAG CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

FANCF— 4

GACA CTACCTTGAGTTTTGC TGTGACCCAGGTCCAG CTACCTTGAGTTTTGC CCAGTG TGTTT CCAGTG

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

AGCTTTAAAATGGGGA CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

FANCF— 5

ATCCA CTTTCCCAGCACTGTT TCTCCAGTACAGGGGC CTTTCCCAGCACTGTT CTGTTG TTTTG CTCTTG

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

ACACAGGGTGCAGTGG CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

FANCF_6

TACA CTTGGGGAGTATCCTT TAGGTGCTTCTGCAGG CTTGGGGAGTATCCTT GCAATC TCATC GCAATC

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

ACGCCAGCACTTTCTA CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

FANCF_7

AGGA CTCACAGATTGATGCC TGCCTGCTGCACTCTC CTCACAGATTGATGCC ACTGGA TGAGTA ACTGGA

ACACTCTTTCCCTACA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA CGACGCTCTTCCGATC ACACCTCCGAGGCCTT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

FANCF— 8

TTTTCCTCAACCTTTT CT TTTTCCTCAACCTnT CTCAGGTCCTCCTCTC CTGCTG CTGCTG - CCAGTT

ACACTCTTTCCCTACA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA CGACGCTCTTCCGATC GCCAGGATTTCCTCAA CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

FANCF_9

TCCTGAATAACTAAAT ACM TCCTGAATAACTAAAT CTGCCMGTTCCCATA GACAACATGG GACAACATGG AGCAAA

FANCF_10 GCTCTCAAATGGCTCC GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA MAC CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

CTCAGAGTGGCCTGCT TTCCTCCATCTCATTC CTCAGAGTGGCCTGCT TACAATC CCATC TACAATC

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

GCCGAGMTTACCACG CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

FANCF_11

ACAT CTGGCACACAGCTGTA TTCACAGCGAGGAAGG CTGGCACACAGCTGTA CGTAGG ACAAT CGTAGG

ACACTCTTTCCCTACA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA CGACGCTCTTCCGATC CTCCTCAGTGGGTGAA CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

FANCF_12

TGGAGCTCTCAGTTGG GTCC TGGAGCTCTCAGTTGG CTACGGAGAGGTCACA ACTGG ACTGG TGAAGG

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

TGAAAAGCAGTCTAGG CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

FANCF_13

ACACAAA CTCAACTCTGCCATGT TTGGCAGGCTAGGTTT CTCAACTCTGCCATGT GCCTTA AGAGC GCCTTA

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

CACATATGAAATATTA CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

FANCF_14

AATTTGAACCA CTGGGAATATAGAAAA TTGAACCATGTTACCT CTGGGAATATAGAAAA ATCAAGAGATGG TTTGACC ATCAAGAGATGG

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

CGTCTTCGCTCTTTGG CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT

FANCF_15

TTTT CTCACCCTGTAGATCT TTGTGGCACATAGTCG CTCACCCTGTAGATCT CTCTCACG TAACCTC CTCTCACG

[표 11]

[표 12]

ACACTCTTTCCCTACAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC GACGCTCTTCCGATCTT CAGAAAATAAAGCAGCT GACGCTCTTCCGATCTT GTGTGCTCTTCCGATCT

腿― 4

TGTGTAACAGCCACTCA GACTCAC TGTGTAACAGCCACTCA CCTGGCAAAAGTGTTTG CCA CCA GAT

GTGACTGGAGTTCAGAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

TTTGCATTCCTTTTAGC GTGTGCTCTTCCGATCT GACGCTCTTCCGATCTA GTGTGCTCTTCCGATCT

HBB_5

TTCTTTT AGCTACCACGGTGACAG TGGCTGTTATTCAGGGA AGCTACCACGGTGACAG TAACA AA TAACA

ACACTCTTTCCCTACAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC GACGCTCTTCCGATCTT AAATGGTAAAAAGAAAC GACGCTCTTCCGATCTT GTGTGCTCTTCCGATCT

HBB_6

CCACTTTGTTAGTCAGG TCAAATGC CCACTTTGTTAGTCAGG GGATACCACTGGGCTTC AGATTC AGATTC TGA

GTGACTGGAGTTCAGAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

TTCAAATCTGGAAAATA GTGTGCTCTTCCGATCT GACGCTCTTCCGATCTT GTGTGCTCTTCCGATCT

醒― 7

ATCTATCACC ATTTCCAGGCTATGCTT TTCATACCCTTTCCCGT ATTTCCAGGCTATGCTT CCA TC CCA

[표 13]

HEK2 ¾ I¾ I層爾

1s t PCR 2nd PCR

ID

Forward (5 ' to3 ' ) Rever se (5 ' to3 ' ) Forward (5 ' to3 ' ) Reverse ( 5 ' to3 ' )

ACACTCTTTCCCTACAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC GACGCTCTTCCGATCTC TTTTCTTGTGAAACAGA GACGCTCTTCCGATCTC GTGTGCTCTTCCGATCT

HE 2_1

GTACTATGCAAGCCACA AATGTCA GTACTATGCAAGCCACA AATGCTCCCACACCATT TTG TTG TTT

ACACTCTTTCCCTACAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

HEK2—2

GACGCTCTTCCGATCTA TTCCCAAGTGAGAAGCC GACGCTCTTCCGATCTA GTGTGCTCTTCCGATCT

(on

GGACGTCTGCCCAATAT AGT GGACGTCTGCCCAATAT AAAATTGTCCAGCCCCA

t arget )

GT GT TCT

GTGACTGGAGTTCAGAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

ATTTACAAAACTTAGGA GTGTGCTCTTCCGATCT GACGCTCTTCCGATCTT GTGTGCTCTTCCGATCT

HEK2_3

GAATCAAAGG CAGCTGCTGTTATCCTT CAAAGGAAAAGCAACGT CAGCTGCTGTTATCCTT CCTC GA CCTC

[표 14]

AGCAG CAGTG AGCAG

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

TTATGCGGCAAAACAA CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT AATG CTTCGTCGCTGACAAT TGATCTCATCCCCTGT CTTCGTCGCTGACAAT

HEK3_4 TTCTGA TGACC TTCTGA

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

TGTTATCAACTGGGGG CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT TTGC CTTCCTTCATGGACTG TAGAGGGGCATCTCGT CTTCCTTCATGGACTG

HEK3_5 GTAGGC GTAGA GTAGGC

ACAGTCTTTCCCTACA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA CGACGCTCTTCCGATC AAGCTATGATGTGATG CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT TTGTGTGCATGGTTCA TGACTGG TTGTGTGCATGGTTCA CTCATGGTGTCTCACC

HE 3_6 TCTCC TCTCC CCTGTA

GTGACTGGAGTTCAGA ACACTCTTTCCCTACA GTGACTGGAGTTCAGA

GCCATGATCCTCGTGA CGTGTGCTCTTCCGAT CGACGCTCTTCCGATC CGTGTGCTCTTCCGAT TTTT CTACTTACCGAAGGCA TTCTCATGCTGTCTTG CTACTTACCGAAGGCA

HEK3_7 GGGACT GATAAACA GGGACT

[표 15]

« 、 ÷. ¾ , HEK4 ■麵墨 曙

1st PCR 2nd PCR

ID

Forward (5 ' to3 ' ) Reverse (5 ' to3 ' ) Forward (5 ' to3 ' ) Reverse (5 ' to3 ' )

ACACTCTTTCCCTACAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

HEK4_1

GACGCTCTTCCGATCTC GACGTCCAAAACCAGAC GACGCTCTTCCGATCTC GTGTGCTCTTCCGATCT

(on

TCCCTTCAAGATGGCTG TCC TCCCTTCAAGATGGCTG ACTCCTTCTGGGGCCTT

target )

AC AC TT .

GTGACTGGAGTTCAGAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

TCCCCAATGTTTTCTTG GTGTGCTCTTCCGATCT GACGCTCTTCCGATCTT GTGTGCTCTTCCGATCT

HE 4_2

TGA GATTACACAGAGGAGGC AGAAGCGGACCCCACAT GATTACACAGAGGAGGC ACCA AG ACCA

GTGACTGGAGTTCAGAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

TGAGAGAACATGGTGCT GTGTGCTCTTCCGATCT GACGCTCTTCCGATCTG GTGTGCTCTTCCGATCT

HE 4_3

TTG AGGCTGTGGTAGGGACT AATGTGGACAGCATTGC AGGCTGTGGTAGGGACT CAC AT CAC

ACACTCTTTCCCTACAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC GACGCTCTTCCGATCTC AACCAACATGGTGGGAC GACGCTCTTCCGATCTC GTGTGCTCTTCCGATCT

HEK4_4

CAGMGAGTGTGGTGCA ACT CAGMGAGTGTGGTGCA AGGCTGTGGTGAAGAGG GT GT ATG

GTGACTGGAGTTCAGAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

GGAGTTAGGCGTAGCTT GTGTGCTCTTCCGATCT GACGCTCTTCCGATCTA GTGTGCTCTTCCGATCT

HEK4_5

CAGG CCTGGCACAGACCTTCC ATCCAATCAATGGGAGC CCTGGCACAGACCTTCC TAA AT TAA

ACACTCTTTCCCTACAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC GACGCTCTTCCGATCTA GCTGGTCATGCAGTGTC GACGCTCTTCCGATCTA GTGTGCTCTTCCGATCT

HE 4_6

AAGCCCAGCTCTGCTGA TGT AAGCCCAGCTCTGCTGA CCCCATTTCTGCCTGAT TA TA TT

ACACTCTTTCCCTACAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

TGGGCTCAACCCAGGTG

HEK4_7 GACGCTCTTCCGATCTG GACGCTCTTCCGATCTG GTGTGCTCTTCCGATCT

T GGCATGGCTTCTGAGAC GGCATGGCTTCTGAGAC CCGGATGATTCTCCTAC T T TTCC

ACACTCTTTCCCTACAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC GACGCTCTTCCGATCTG AGTTGTGGGGTTTTCTG GACGCTCTTCCGATCTG GTGTGCTCTTCCGATCT

HE 4_8

CCAACTAGAGGCAGACA CTG CCAACTAGAGGCAGACA ATTCTGGAGGCAACTCC GG GG TCA

GTGACTGGAGTTCAGAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

GGCAAAACCCATTCCAG GTGTGCTCTTCCGATCT GACGCTCTTCCGATCTA GTGTGCTCTTCCGATCT

HE 4_9

AAG TGTTAGGAGCTCCCCAT CCACGTCAGGACTTGTG TGTTAGGAGCTCCCCAT CAC TG CAC

GTGACTGGAGTTCAGAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

ATGTTAGCCGGGATGGT GTGTGCTCTTCCGATCT GACGCTCTTCCGATCTG GTGTGCTCTTCCGATCT

HEK4_10

CTA TCCAGGGTATCAGGAAA ATCTCTTGACTTGGTGA TCCAGGGTATCAGGAAA GGTT TCCA GGTT

ACACTCTTTCCCTACAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC GACGCTCTTCCGATCTA CACAGCCCATCTCTCCA GACGCTCTTCCGATCTA GTGTGCTCTTCCGATCT

HEK4_11

AATCCTCAGCACACGAC CTC AATCCTCAGCACACGAC TGGGCTCCAACCTCTTC AA AA TAA

GTGACTGGAGTTCAGAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

CCCTGGTGAGCAAACAC GTGTGCTCTTCCGATCT GACGCTCTTCCGATCTC GTGTGCTCTTCCGATCT

HE 4_12

AC CAGGTCCTGTGCCACCT CCACGTGGTATTCACCT CAGGTCCTGTGCCACCT C CT C

GTGACTGGAGTTCAGAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

GCCATCTAATCACAGCC GTGTGCTCTTCCGATCT GACGCTCTTCCGATCTC GTGTGCTCTTCCGATCT

HEK4— 13

ACA GCATCTTGTCCCTTCTC TCCTGGGTGCTCAGACT GCATCTTGTCCCTTCTC AGC TC AGC

ACACTCTTTCCCTACAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC GACGCTCTTCCGATCTG CACCATGCCTGGCTAAT GACGCTCTTCCGATCTG GTGTGCTCTTCCGATCT

HE 4_14

TTGAGAAGCAGCAAGGT TTT TTGAGAAGCAGCAAGGT TTAGTAGGGACGGGGTT GA GA TCA

GTGACTGGAGTTCAGAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

CAGAACCCAAGGCTCTT GTGTGCTCTTCCGATCT GACGCTCTTCCGATCTT GTGTGCTCTTCCGATCT

HEK4_15

GAC ATTTTGCTCAGACCCAG CCAAGATGCCTTCTGCT ATTTTGCTCAGACCCAG CAT CT CAT

ACACTCTTTCCCTACAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC GACGCTCTTCCGATCTA TTTCTCACGATGACATT GACGCTCTTCCGATCTA GTGTGCTCTTCCGATCT

HEK4—16

ACAGAGCCCTGCAGAAC TTGG ACAGAGCCCTGCAGAAC CGGAGGAGGTAGATTGG AT AT AGA

ACACTCTTTCCCTACAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC GACGCTCTTCCGATCTC TGTTCCTAGAGCAACCT GACGCTCTTCCGATCTC GTGTGCTCTTCCGATCT

HEK4_17

ATGTATGCAGCTGCTTT TCACA ATGTATGCAGCTGCTTT GGAGAGCCAGAGTGGCT TGA TGA AAA

GTGACTGGAGTTCAGAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

CTGAAAGAGGGAGGGGA GTGTGCTCTTCCGATCT GACGCTCTTCCGATCTC GTGTGCTCTTCCGATCT

HEK4_18

GAC CTTCGCCAGGTCTTCTG TCGGGAGAGAGGAAAGG CTTCGCCAGGTCTTCTG TTC AC TTC

ACACTCTTTCCCTACAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC GACGCTCTTCCGATCTC GACGCATCCCACCTCCT GACGCTCTTCCGATCTC GTGTGCTCTTCCGATCT

HEK4—19

CCGGCCGATTTAACTTT C CCGGCCGATTTAACTTT CTGGGGCACGAAATGTC TA TA C GTGACTGGAGTTCAGAC ACACTCTTTCCCTACAC GTGACTGGAGTTCAGAC

CCAGGAACAGAGGGACC GTGTGCTCTTCCGATCT GACGCTCTTCCGATCTC GTGTGCTCTTCCGATCT

HE 4_20

AT CCTGGTTCCAGTCACCT CAGGTCCAGAGACAAGA CCTGGTTCCAGTCACCT

CTC CG CTC

7은 Cas9 뉴클레아제- 및 base editor-처리 유전체 DNA의

Digenome-seq에 의해 확인된 DNA 절단 점수가 2.5 이상인 부위의 수를 보여주는 벤 다이어그램이다.

상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이， 7 개의 표적 유전자에 대하여 BE3 디아미나제와 USER를 함께 사용하는 경우， 시험관 내에서， 단 1-24 (8±3) 위치에서 인간 유전체 DNA를 절단하였으며, 이는 다중 Digenome- seq 분석 (Kim, D. , Kim, S. , Kim, S. , Park, J. & Kim, J .S. Genome-wide target specificities of C ISPR-Cas9 nucleases revealed by multiplex Digenome-seq. Genome research 26， 406-415 (2016))에서 동일한 sgRNA 세트와 함께 사용되는 Cas9 뉴클레아제의 절단 위치 (70±30 위치)보다 훨씬 적은 수준이다 (도 7). 즉, BE3는 Cas9보다 비표적 사이트를 절단할 잠재성이 낮다고 할 수 있다. Digenome으로 확인 된 위치를 비교하여 얻은 서열 로고 (Sequence logos)는 PAM-원위 영역과 PAM-근위 영역 모두 BE3 디아미나제의 특이성에 기여하는 것으로 확인되었다 (도 6c, d).

잠재적인 바표적 위치를 보다 포괄적으로 식별하기 위해 컴퓨터 프로그램을 개선하였다 (Digenome 2.0이라고 함). 이를 보다 상세히 설명하면 다음과 같다: DNA 절단 점수가 0.0001에서 10 사이의 컷오프 값 이상인 위치의 개수와， 상기 컷오프 값 이상의 점수를 갖는 위치들 중에서， 표적 위치와 비교한， 10 이하의 미스매치를 가지며 PAM (5'-NGN-3' 또는 5'-顯(^-3')을 가지고 았는 후보군의 개수를 계산하였다 (도 8). 도 8은 DNA 절단 점수의 범위에 대한 총 사이트 수 (國)와 10 개 이하의 mismatches (ᄆ)가 있는 PAM 함유 사이트 수를 보여주는 그래프이다. 이는 손상되지 않은 인간 유전체 DNA (왼쪽)와 BE3 및 USER (오른쪽)에 의해 분해된 유전체 DNA에 대하여 전체 유전체 시퀀성 (whole genome sequencing )을 수행하여 얻어진 결과이다. 도 8에 나타난 바와 같이， BE3와 USER로 처리되지 않아서 손상되지 않은 유전체 DNA를 음성대조군으로 사용하여 얻은 WGS 데이터가 컷오프 점수가 0.1인 경우 false-positive sites를 생성하지 않았으므로， 컷오프 점수 0.1을 선택하였다 (도 8). 이러한 결과에 기초하여， Digenome 2.0에 의한 비표적 위치 결정에서는 DNA cleavage score가 0.1 이상이며 10 이하의 미스매치를 가지고 PAM (5'-NGN-3' 또는 5'_NNG-3') 을 가지고 있는 site를 비표적 위치로 결정한다. 한편, Digenome 1.0에 의한 비표적 위치 결정에서는 DNA cleavage score가 2.5 이상인 site를 비표적 위치 후보군으로 결정한다 .

Digenome 2.0을 사용하여， 이전의 연구 (Kim, D.， Kim, S. , Kim, S. , Park, J. & Kim, J.S. Genome-wide target specificities of CRISPR-Cas9 nucleases revealed by multiplex Digenome-seq. Genome Res (2016))에서 놓쳤으나 EMX1에 특이적인 Cas9를 사용하여 HTGTS 및 GUIDE-seq에 의해 캡쳐된 두 개의 사이트를 포함하여， 추가적인 BE3- 및 Cas9-관련 DNA 절단 위치를 확인할 수 있다. 도 9는 Cas9 nuclease- 및 Base editor- 처리 유전체 DNA의 Digenome-seq에 의해 확인 된 0.1 이상의 DNA 절단 점수를 갖는 PAM-포함 상동성 부위의 수를 보여주는 벤다이어그램이다. BE3 디아미나제는 in vitro에서 1—67 (18 ±9) 위치에서 염기 전환을 유도하는 반면， Cas9 뉴클레아제는 30-241 (90±30) 위치에서 유전체 DNA를 절단하였다. 실시예 5. Digenome-seq에 의하여 포획된 상동성 부위 (homologous sites)의 비율

도 7및 도 9에 나타난 BE3-관련 위치 및 Cas9-관련 위차를 보다 상세히 조사하였다. 도 10은 Digenome-seq에 의해 포획된 상동성 부위의 비율을 보여주는 것으로， 막대는 표적 (표적 ) 부위와 6 nt까지 다른 상동성 부위의 수를 나타내고， 사각형 (BE3)과 삼각형 (Cas9)은 미스매치 숫자의 범위에 대해 Digenome-seq 포획 사이트의 비율을 나타낸다. 도 10에 나타난 바와 같이， mismatch의 개수와 관계없이， Cas9를 사용하는 경우와 비교하여， BE3를 사용하는 경우에 Digenome-seq에 의해 확인되는 homo 1 ogous sites가 더 적었다.

도 lla 및 lib는 Digenome 1.0 (lla) 및 Digenome 2.0 (lib)에 의해 확인 된 BE3-와 Cas9-관련 사이트의 수 사이의 상관관계를 보여주는 그래프이다. 도 lla 및 lib에 나타난 바와 같이， Cas9-관련 위치와 BE3- 관련 위치의 개수 사이에 통계적으로 유의한 상관 관계가 확인되었다 ( 쒜 (Score>2.5, Digenome 1.0) 또는 0.86 (Digenome 2.0)). 이러한 결과는 sgRNA가 Cas9 특이성과 BE3 특이성 모두의 1차적 결정 인자 (pr imary determinants)임을 제안한다.

또한, 도 12a 및 12b는 Digenome 1.0 (a) 또는 Digenome 2.0 (b)에 의해 확인 된 BE3 관련 사이트의 수와 6 개 이하의 미스매치가있는 사이트의 수 사이의 상관 관계를 보여준다. 도 12a 및 12b에 나타난 바와 같이， BE3 관련 Digenome 포획 부위의 수와 인간 유전체에서 6 이하의 미스매치를 갖는 상동성 부위 (homologous 사이트) ( "orthogonal i ty" )의 수 사이에 강한 상관 관계 [R2 = 0.94 (Digenome 1.0) 또는 0.95 (Digenome 2.0) ]가 있음을 확인하였다. 특히 홍미로운 것은 BE3 단독 또는 Cas9 단독과 관련 있다는 것이다. 홍미롭게도， DNA-gRNA 경계면에서 각각 RNA 또는 DNA bulge를 생산하는 각각의 표적 사이트와 비교했을 때， BE3 단독과 관련된 사이트의 69% (=18/26)가 일부가 결실되거나 연장된 뉴클레오타이드 (mi ss ing or extra nuc leot ides)를 가지고 있다 (표 1) . 대조적으로， 이러한 bulge-type 비표적 si tes는 Cas9 관련 부위에서는 드문 경우이다. Cas9와 관련된 사이트의 « (=25/647)만 일부 결실되거나 연장된 뉴클레오타이드를 갖는 것으로 나타났다.

도 13은 posi t ions 4-9에 시토신이 없는 Cas9에만 관련된 Digenome- 포획된 비표적 사이트의 예를 보여준다. Cas9 단독과 관련된 사이트의 13% (=73/548)는 BE3 매개 deaminat ion의 창 (window) (도 13)인， pos i t ions 4-8 (5 '에서 3 '방향으로 1-20로 번호 매겨짐 )의 위치에 시토신을 갖지 않는다.

Digenome-seq에 의해 확인된 BE3—관련 사이트에서 비표적 효과를 확인하기 위하여， HEK293T 세포에서 표적 심부 시퀀싱 (targeted deep sequencing)을 수행하고 BE3 유도 치환 빈도와 Cas9 유도 indel 빈도를 측정하여， 앞서 설명한 도 6e 내지 6h 및 다음의 표 16에 나타내었다.

[표 16]

Digenome-seq에 의하여 포획된 표적 부위 및 비표적 부위에서의 Cas9 및 BE3의 돌연변이 빈도 9S

9^00T0/Z,T0ra¾/I3d

9^0010/ LlOZ i/lDd

_{/ 9} soos _Z J ₀ 2 _/ :xI _> d OAV

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_// : _/ O ₉ soos _Z J ₀ 2xI _> d z.mso ₈ sAV

^讀 ^. ε ε δs έ- ^.

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S00T0/Z.l0ZaM/X3d 7 개의 sgRNA를 사용하여 확인 된 총 75 개의 사이트를 분석하고， 7개의 표적 sites 모두를 포함하여， 시뭔싱 오류 (일반적으로 0.1 ~ 2 %의 범위 내)로 인한 노이즈 수준을 초과하는 빈도를 갖는 50 개 사이트에서 BE3 유도 점 돌연변이를 관찰하였다 (유효성 검사 비율은 67 . BE3는 background noise 수준보다 낮은 빈도를 갖는 다른 BE3-관련 Digenome- 양성 부위에서 여전히 돌연변이를 유도할 수 있다. 중요한 점은， base editing이 0.1 %의 빈도로 검출되는 BE3 비표적 sites를 확인할 수 있으며 이는 Digenome-seq은 매우 민감한 방법이라는 것을 보여 준다. Cas9 뉴클레아제는 Cas9와 BE3 모두와 연관된 사이트의 70 % (= 44/63)에서 indels을 검출 가능한 정도로 유도하지만， BE3 단독과 관련된 12 개의 각각의 사이트에서는 이러한 활성을 나타내지 않았다 (표 2-8).

도 14a 내지 14c는 3 개의 다른 Cas9 뉴클레아제와 관련된 Digenome-captured 사이트의 염기 교정 효율을 보여준다. 도 14a 내지 14c에 나타난 바와 같이， BE3은 3 개의 상이한 Cas9 뉴클레아제 단독과 관련된 24 개의 Digenome-양성 부위에서 검출 가능한 치환을 야기하지 않았다. 또한， 도 15a 내지 15c는 Digenome-음성 사이트에서 3 가지 서로 다른 BE3 디아미나제의 염기 교정 효율을 보여준다. 도 15a 내지 15c에 나타난 바와 같이， 상기 3개의 BE3 디아미나제는 Cas-0FFinder(Bae, S.， Park, J. & Kim, J.S. Cas-OFFinder： A fast and versatile algorithm that searches for potential 비표적 sites of Cas9 RNA-guided endonuc leases. Bioinformat ics (2014))를 사용하여 식별된 < 3 개 미스매치를 갖는 28 개 Digenome 음성 사이트에서 base editing을 유도하지 못하였다 (도 15a-15c). BE3 유도 치환와 빈도는 Cas9 매개 indels 빈도와 높은 상관성을 나타내었다 [R ² = 0.92 (EMX1) 또는 0.89 (HBB)] (도 6e, f). 그럼에도 불구하고ᅳ BE3에 의해 검증되지만 Cas9에 의해서는 검증되지 않은 비표적 사이트가 다수 존재한다. 이러한 유효성이 확인된 BE3 독점 오프 타겟 사이트 (BE3-exclusive 비표적 sites) 중 64 % (= 7/11)는 이들 각각의 표적 sites와 비교하여 일부 결실된 뉴클레오타이드를 갖는다. 이러한 결과는 Cas9와 BE3의 비표적 사이트가 많은 부위에서 서로 증첩되지만， Cas9 단독 또는 BE3 단독과는 서로 배타적으로 관련된 비표적 사이트가 있다는 것을 보여준다 (도 10). 실시예 6. 변형 sgRNA를통한 BE3비표적 효과의 감소

BE3 비표적 효과를 줄이기 위해, 기존의 sgRNA (gX19 또는 GX19 ; g 및 G는 각각 mi smatched 및 matched 구아닌을 의미함)을 truncated sgRNAs (gXis 또는 gX ₁₇ 에서 종결됨) 또는 5 ' 말단에 하나 또는 2개의 구아닌을 추가로 포함하는 연장 (extended) sgRNA (gX20 또는 ggX20이라고 칭함)로 대체하고 HEK293T 세포에서의 표적 및 비표적 base— edi t ing 빈도를 측정하여 그 결과를 도 16 내지 도 17 및 표 17에 나타내었다.

[표 17]

변형 sgRNA를 통한 BE3 비표적 효과 분석

L9

S00l0/Z,T0rHX/I3d Z,mS0/8l0Z OAV

/I3d

0 - ft fe ^f t &- ·

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ο ο &ο d-· - ^, a

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8 ^sj Ο.03

GX19 0.10 【 32」 Ο.Οβ 0.02

GXi e m QM G,06 ' 0,01

Si t7 0.10 0,04 0.09 0,02

^17

도 16a는 기존 sgRNA (gX19 sgRNA) , 절단된 (truncated) sgRNA (gX18 또는 gX17 sgRNA) 및 연장 (extended) sgRNA (gX20 또는 ggX20 sgRNA)를 도식적으로 보여준다. 도 16b는 HEK293T 세포의 표적 사이트 및 비표적 사이트의 염기 교정 빈도를 표적 심독 시퀀싱으로 측정한 결과를 보여준다. 특이성 비율 (speci f i ci ty rat io)은 표적 (on— target ) 위치에서의 염기 교정 빈도를 표적 밖 (of f-target )의 위치에서의 염기 교정 빈도로 나누어 계산하였다. heatmap은 기존의 sgRNA와 비교하여 변형 된 sgRNA의 상대적 특이성을 나타낸다.

도 17은 변형된 sgRNA를 사용하여 BE3 비표적 효과를 감소시킬 수 있음을 보여주는 것으로， 17a는 기존의 sgRNA (GX19 sgRNA)와 변형된 • sgRNA (GX17 sgRNA, gX18 sgRNA, gX20 sgRNA 및 ggX20 sgRNA)의 개략적으로 보여주고， 도 17b는 HEK293T 세포에서 표적 심층 시뭔싱에 의해 EMX1 표적 사이트 및 비표적 사이트에서 측정된 염기 교정 효율 (빈도)를 보여주는 결과이다.

도 16a , 16b, 17a , 및 17b에 나타난 바와 같이， Truncated sgRNAs는 많은 위치에서 비표적 효과를 감소시켰지만， 5 ' 말단에 미스매치를 갖는 사이트에서는 비표적 효과가 악화되었다 (도 16b 및 도 17b에서 별표로 표시됨) . 연장 sgRNA는 표적 효과는 유지하면서 거의 모든 사이트에서 비표적 효과를 감소시켰다. 홍미롭게도， 연장된 sgRNA 중 일부는 기존의 sgRNA보다 표적 부위에서 보다 높은 활성을 나타내었다 (표 17) . 감쇄된 (attenuated) Cas9 변이체의 사용 또는 플라스미드보다는 BE3 RNP를 전달함으로써 base edi t ing 의 유전체 -전체 특이성을 보다 향상시킬 수 있다. 요약하면, 미스매치 sgRNAs , Digenome-seq 및 표적 심층 시뭔싱을 사용하여 얻은 결과는 BE3 디아미나제가 고도로 특이적으로 in vi tro에서의 C-U 전환 및 인간 세포에서 인간 유전체의 제한된 개수의 위치에서의 base edi t ing을 촉매하는 것으로 나타났다. 또한 BE3 및 Cas9 오프 타겟 사이트가 항상 일치하는 것은 아니며， 따라서 각 유전자 편집 도구에 대해서 독립적인 평가가 이루어져야 함을 확인하였다. 우리는 우리의 결과와 방법이 연구 및 의학에서 RNA 유도 프로그램 가능한 디아미나제의 광범위한 사용을 촉진할 것으로 기대한다. 실시예 Ί . BE1 (rAP0BECl-dCas9)-매개 이중가닥절단 (DSBs) 표적 서열 (ENX1 on-target 서열; 서열번호 31)을 함유하는 PCR amp H con을 in vitro에서 BE1 (rAP0BECl-dCas9; 실시예 2)와 sgRNA (서열번호 31를 표적화하는 sgRNA)와 함께 배양하여 표적 서열 내 시토신을 우라실로 변환시켰다. rAPOBECl에 의해 변환된 Uracil은 USER (Uraci 1-Speci f ic Excision Reagent ) Enzyme (New England Biolabs)를 처리하여 제거하였다. 그 후， SI 뉴클레아제 (Catalog #M5761; Promega)를 처리하여 단일 가닥 DNA 부위의 phophodi ester 결합을 절단하여 시토신이 제거 된 부위에서 DSB를 생성하였다 (도 22의 a).

상기 반웅이 완료된 PCR ampicon을 전기영동한 결과， BEl/sgRNA, USER 및 SI Nuclease 처리에 의해 절단 생성되었음이 확인되었다 (도 22의 b). 이상의 설명으로부터， 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.