Verfahren zur Immobilisierung und Trocknung von Enzymen

Beschreibung der Erfindung Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Immobilisierung und Trocknung von Proteinen, insbesondere von Enzymen, insbesondere von Lipasen.

Stand der Technik EP382767 beschreibt ein Verfahren zur Immobilisierung von Lipasen. Dabei wird eine wässrige Lösung einer gegebenen Lipase durch Rotation mit einem Harz (beispielsweise Lewatit ® ) bei festem pH bei Raumtemperatur vermischt. Dann wurde das Harz mit immobilisierter Lipase durch Filtration gesammelt, gefolgt von Waschen mit Wasser und Trocknen im Vakuum. Die Immobilisierung von Enzymen ist generell mit Verlust an Enzym infolge des Nichtbindens an den Träger bzw. durch Desorption („Ausbluten") von bereits gebundenem Enzym begleitet. Weiterhin erfährt das immobilisierte Enzym durch die Verfahrensschritte der Immobilisierung häufig einen Verlust an Enzymaktivität, was gerade im technischen Maßstab zu signifikanten Ausbeuteverlusten und damit erhöhten Kosten führt.

Beschreibung der Erfindung

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren aufzufinden, das es gestattet, eine effiziente Immobilisierung des Proteins an den Träger zu erreichen, was bedeutet, dass mög- liehst die gesamte Menge des vorhandenen Enzyms am Träger permanent gebunden wird und verbleibt und dass im Falle eines enzymatisch aktiven Proteins nach Immobilisierung möglichst die gleiche hohe enzymatische Aktivität erhalten wird t wie vor Immobilisierung.

Gefunden wurde ein Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen auf einem Träger, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation des Proteins mit dem Träger in einer wässrigen Phase in einem diskontinuierlichen Kontakt-Vakuummischertrockner erfolgt und daran unmittelbar anschließend ggf. nach einem optionalen Waschschritt die Trocknung des immobilisierten Proteins in demselben Kontakt-Vakuummischertrockner durchgeführt wird Es wurde nun gefunden, dass das eingangs definierte Verfahren zu besonders vorteilhaften Ergebnissen führt, da die gesamten Schritte der Immobilisierung wie effizientes Inkubieren von Protein mit Träger, ggf. Waschen des immobilisierten Proteins und Trocknen des immobilisierten Proteins zu einem stabilen, gut lager- und transportfähigen Produkt in einem einzigen Apparat durchzuführen sind. Dieses Verfahren eignet sich besonders gut im technischen Maßstab, wenn immobilisiertes Protein im dreistelligen Kilogramm- bis hin zu Tonnenmaßstab hergestellt werden soll. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können eine Vielzahl von Proteinen immobilisiert werden. Besonders geeignet ist es für die Immobilisierung von Enzymen, wie Oxidoreduktasen Hydrola- sen, Isomerasen und Transferasen.

Besonders gut geeignet ist es für die Immobilisierung von Hydrolasen, insbesondere von Lipa- sen.

Innerhalb der Lipasen lassen sich besonders gut diejenigen Lipasen aus Candida antarctica immobilisieren, insbesondere die Candida Antarctica Lipase B (CALB) oder solche Enzyme, die davon strukturell abgeleitet sind. Solche strukturell von CALB abgeleitete Lipasen sind Lipasen, die mindestens eine, bevorzugt zwei oder mehrere Aminosäureveränderungen, wie Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, gegenüber der CALB Polypeptidsequenz aufweisen.

Beispiele für solche von CALB strukturell abgeleitete Lipasen sind in der WO 2009/080676 beschrieben („CALB-Muteine"), wobei auf die WO2009/080676 hinsichtlich des Offenbarungsgehal- tes der CALB-Muteine ausdrücklich Bezug genommen wird.

Die zu immobilisierenden Enzyme können aus dem ursprünglichen Organismus durch bekannte Verfahren isoliert oder auch durch rekombinante DNA-Techniken in geeigneten Wirtsorganismen wie Bacillus, E.coli, Pichia, Chrysosporium, Aspergillus, Saccharomyces hergestellt werden.

Als Träger sind verschiedene organische oder anorganische Materialien wie Kieselgel, Aktivkohle oder Polymerträger geeignet. Als polymerer Träger sind makroporöse vernetzte Polymere mit einer Teilchengröße von 100 bis 1000 um und einem mittleren Porenradius von 10-20 nm geeignet. Besonders geeignet sind makroporöse vernetzte Acrylat-Polymere wie z.B. Po- ly(meth)acrylate, die mit Divinylbenzol vernetzt sind, welche beispielsweise Acrylsäure, Acrylsäu- reester, Methacrylsäure und Methacrylsäureester enthalten können. Solche Polymere werden z.B. von der Firma Lanxess unter der Bezeichnung Lewatit® VP OC 1600 oder von der Firma DOW unter der Bezeichnung Amberlite ® XAD-7 vertrieben.. Geeignete diskontinuierliche Kontakt-Vakuummischertrockner sind dem Fachmann aus der Literatur (z.B. Friedrich Kneule,„Das Trocknen", Sauerländer AG, Aarau, 1975, ISBN 3-7941 -0429-3 bekannt). Besonders vorteilhaft ist die Verwendung eines Vakuum-Taumel- oder Doppelkonus- trockners. Gut geeignet sind Taumeltrockner mit einem Innenvolumen von größer als 10 Litern, bevorzugt größer als 100 Litern, bevorzugt größer als ein Kubikmeter.

Die Inkubation des zu immobilisierenden Proteins mit dem Träger geschieht in einer wässrigen, in der Regel durch Puffer auf einen bestimmten pH-Wert eingestellten Phase.

Der pH-Wert hängt von der Natur des zu immobilisierenden Enzyms ab, hauptsächlich vom isol- elektischen Punkt des Enzyms. Als vorteilhaft hat sich ein pH-Bereich von 3 bis zu 1 1 , insbesondere von 4 bis 8 herausgestellt.

Für CALB Lipasen wird ein pH-Bereich von 4,8 - 5,2 empfohlen.

Als Puffer für die wässrige Phase geeignet sind beispielsweise Phosphat- und Acetatpuffer. Die Inkubation erfolgt in der Regel bei einer Temperatur zwischen 0°C und 40°C, insbesondere zwischen 4°C und 30°C. Wenn das zu immobilisierende Enzym besonders temperaturtolerant ist, können auch Temperaturen oberhalb von 50°C in Betracht kommen.

Nach der Inkubation wird die Enzym-haltige Ausgangslösung vom immobilisierten Enzym ge- trennt. Dies geschieht am einfachsten durch Filtration über eine Siebplatte, die im Taumeltrockner angebracht wird. Anschließend kann das immobilisierte Enzym gewünschtenfalls in einem Waschschritte noch gereinigt werden. Solche Waschschritte erfolgen ebenfalls durch Mischen des immobilisierten Enzyms mit der Waschlösung, in der Regel Wasser, und anschliessendes Trennen vom immobilisierten Enzym über eine integrierte Filtrationseinrichtung.

Die anschließende Trocknung des immobilisierten Enzymes erfolgt ebenfalls ohne weiteres Umfüllen in dem diskontinuierlichen Kontakt-Vakuummischertrockner, wobei ein Unterdruck im Trockner von kleiner als 1013 mbar, bevorzugt kleiner als 100 mbar eingestellt wird. Die Manteltemperatur wird auf kleiner 100°C, bevorzugt kleiner65°C eingestellt, wobei darauf geachtet wird, dass die Produkttemperatur einen Wert von 50°C, bevorzugt einen Wert von 40°C nicht überschreitet..

Es empfiehlt sich in der Regel nicht, die Temperatur des zu trocknenden immbobilisierten En- zyms auf über 50°C einzustellen, um eine thermische Inaktivierung des Enzyms zu vermeiden. In Fällen von besonders temperaturunempfindlichen Enzymen kann jedoch auch bei über 50°C getrocknet werden. Die Trocknungszeit beträgt unter den oben angegebenen Bedingungen üblicherweise zwischen 10 und 30 Stunden, bevorzugt zwischen 15 und 20 Stunden. Angestrebt wird in der Regel ein immobilisiertes Produkt mit einer Restfeuchte von weniger als 5%, bevorzugt weniger als 2% und besonders bevorzugt zwischen 0,5 und 1 ,5 % Wasser.

Wenn das Produkt zu sehr getrocknet wird kann es zu statischer Aufladung kommen, was die Handhabbarkeit teilweise erschwert.

Ein mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestelltes Produkt ist bei Raumtemperatur gut lagerfähig, ohne dass es zu nennenswerten Aktivitätsverlusten kommt. Weiterhin ist es gut handhabbar, d.h. es lässt sich gut ein- und umfüllen. Im Einzelnen ist das neue Verfahren in dem folgenden Beispiel beschrieben.

Beispiel:

Immobilisierung von CALB auf Lewatit® im 500 kg Maßstab

Der für dieses Verfahren eingesetzte Taumeltrockner T0055 besitzt folgende technische Daten:

• Volumen: 6,3 m ³

• Heizfläche: 17 m ² 1. Eingesetzte Rohstoffe

Für die Versuchsdurchführung werden folgende Komponenten benötigt:

• Lewatit® VP OC 1600 feucht (Fa. Lanxess) [544 kg]

• Lipase Ultrafiltrat CALB-2012-01 [21 kg Protein]

• VE-Wasser (für 3 Waschgänge) [3 x 2000L]

· N ₂ - Strippgas [5-20 Nm ³ /h]

Laut Vorschrift sollen insgesamt 544 kg des feuchten Lewatit eingefüllt werden. Diese 544 kg des feuchten Lewatit entsprechen etwa 233 kg trockenem Lewatit. Für die Lipase ergibt sich eine spezifische Aktivität von 460 TBU/mg Protein und eine Reinheit von 61 %. Für die Immobilisierung wird die gesamte Menge von 21 kg Enzym verwendet. 2. Versuchsdurchführung

Beschickung des Taumeltrockners mit Lewatit ® und erster Waschvorgang

· um 8.15 Uhr wurde damit begonnen, die Lewatit- Fässer zu wiegen und anschließend über einen Trichter in den Taumeltrockner zu geben

• insgesamt wurden 544,1 kg feuchtes Lewatit VP OC 1600 in den Trockner gegeben es wurde eine Mischprobe aus allen Fässern zusammengestellt

• anschließend wurden über einen Schlauch 2000 L VE-Wasser (über Wasseruhr)mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 80 -90 l/min ebenfalls über den Trichter in den Trockner gegeben

— > der Trichter wurde dabei von Lewatitresten befreit

• der Befüllvorgang war um 8.55 Uhr beendet

• beim Blick in den Trockner konnte man erkennen, dass sich das Wasser leicht milchig ver- färbt hatte und das sich etwas eiweißartiger Schaum auf der Oberfläche gebildet hatte

• nun wurde das Siebpassstück (160 μηη) auf dem Mannlochdeckel angebracht (9.20 Uhr)

• anschließend wurde der Trockner zur Dichtheitsprüfung auf 78,6 mbar evakuiert

• danach wurde wieder auf Normaldruck (1020 mbar) entspannt (9.30 Uhr)

• dann wurde 2 Stunden, bei Normaldruck, Raumtemperatur und 0,33 upm gemischt (dazu wurde der Antriebsmotor am Taumeltrockner auf 5,5 Hz eingestellt, was 0,33 upm entspricht

— > manuell nachgemessen: 1 U /2,43 Min = 0,41 upm)

— > das Heizbad stand dabei auf voller Kühlung

• nach Ablauf der 2 Stunden (1 1 .26 Uhr) wurde der T0055 mit dem Deckel nach unten positioniert und das Waschwasser über das eingebaute 160 μηη Sieb in IBCTs abfiltriert — > dabei wurde mit einem Überdruck von 100-200 mbar filtriert

— > der Überdruck wurde durch das Zuleiten von Stickstoff erzeugt

• nach 20 L, 1000 L und 1700 L wurde jeweils eine Probe genommen

— > rein optisch wies die erste Probe eine leichte Trübung auf, allerdings setzte sich am

Boden nichts ab

— > die zweite und die dritte Probe waren klar; gegen das Licht waren einzelne kleine

Schwebeteilchen erkennbar

• insgesamt wurden 1700 L Wasser abgelassen (1 1 .30 Uhr - 12.25 Uhr)

• die IBCTs wurden nun 2 Stunden ruhen gelassen

• anschließend wurde kontrolliert, ob sich am Boden Schwebeteilchen abgesetzt hatten; dies war jedoch nicht der Fall

• die mit Waschwasser gefüllten IBCTs wurden gewogen IBC 1 : 1003 kg Netto

IBC 2: 717 kg Netto

dann wurde das Wasser ins bbA abgelassen Zweiter Waschvorgang

• das Mannloch wurde wieder nach oben positioniert

• anschließend wurden 2000 L Wasser (2000 kg), welche sich bereits in zwei 1000 L IBCTs befanden, mit 800 - 700 mbar abs. eingesaugt (12.40 Uhr - 13.22 Uhr)

• pro Container dauerte der Befüllvorgang etwa 20 Minuten

· anschließend wurde im Taumeltrockner 2 Stunden bei 0,33 upm (5,5 Hz), Raumtemperatur und Normaldruck gemischt

• nach Ablauf der 2 Stunden wurde das Mannloch nach unten positioniert und das Waschwasser über das eingebaute 160 μηη Sieb in IBCTs abfiltriert

— > hierbei wurde wieder mit einem Überdruck von 100-200 mbar filtriert

· nach 50 L, 1000 L und 2000 L wurde jeweils eine Probe genommen

• insgesamt wurden etwa 2050 L Wasser abgelassen

• die Filtration dauerte pro Container (d.h. pro 1000 L) etwa 30 Minuten

• die mit Waschwasser gefüllten IBC ^' s wurden anschließend gewogen

IBC 1 : 1002 kg Netto

IBC 2: 1043 kg Netto

• danach wurde das Waschwasser ins bbA abgelassen

• anschließend wurde eine Probe des gewaschenen Lewatits gezogen

— > hierbei fiel auf, das der Filterkuchen nach dem Stoppen der Drehung des Trockners leicht schräg an der Innenwand stand

· der Taumeltrockner wurde über Nacht jede Stunde einmal gedreht, um die Bildung von Brocken zu vermeiden

Lipasezugabe und Immobilisierung

• die gekühlt gelieferten Lipase- Fässer wurden zunächst noch einmal gewogen

-> 1749,6 kg Lipase Netto

• anschließend wurde aus jedem Fass eine 2 L Probe gezogen (9.30 Uhr - 9.50 Uhr)

• die insgesamt 9 Fässer (je 200 L) mit der Lipase CALB-2012-01 wurden in den Taumeltrockner gefüllt

• dazu wurde der Inhalt von je 3 Fässern in den Trockner eingesaugt

· hierzu wurde ein Unterdruck von 300 mbar angelegt

• zuerst wurden die Gebinde 7,8,9 eingefüllt (10.19 Uhr - 10.32 Uhr) • im Fass blieb nur eine sehr geringe Menge Enzymlösung zurück

— > nach Zugabe des Inhalts von je 3 Fässern wurde der Trockner jeweils 10 Minuten bei 0,33 upm gedreht

• Anschließend folgte das Einsaugen des Inhalts der Gebinde 3,2,1 (1 1.06 Uhr - 1 1 .23 Uhr) und das 10 minütige Drehen bei 0,33 upm

• zuletzt wurde der Inhalt der Gebinde 6,5,4 eingesaugt (1 1 .52 Uhr - 12.07 Uhr)

• von 12.20 Uhr bis 13.00 Uhr wurde mit 200 mbar abs. und 0,33 upm gedreht

• um 13.00 Uhr wurde der Taumeltrockner bis auf 900 mbar abs. entgast

• anschließend wurde bis 13.15 Uhr bei 100 - 200 mbar Unterdruck weiter gemischt

— > die Innentemperatur lag hier bei 20°C; aus diesem Grund wurde die Kühlung, welche auf

24°C eingestellt war, abgestellt

• danach wurde im Trockner ein leichter Überdruck von 100 - 200 mbar angelegt

• unter diesen Bedingungen wurde der Trockner 15 Stunden lang mit 0,33 upm bewegt

• dabei wurden jede Stunde Druck und die Temperatur notiert

· nach Ablauf der ersten 3 Stunden (15.15 Uhr) wurde die erste Probe (250 ml) vom Überstand des Immobilisats genommen und im Kühlschrank bei 8-14°C aufbewahrt

• insgesamt wurden Proben nach 3, 5, 7, 9, 12 und 15 Stunden Immobilisierung gezogen

• nach Ablauf der 15 Stunden wurde der Trockner abgestellt und nur jede Stunde einmal (1 Umdrehung) gedreht (bis nächsten Tag, 7.00 Uhr)

Filtration der Enzym-Lewatit-Lösung nach der Immobilisierung

• um 7.00 Uhr wurde der Taumeltrockner nochmals gedreht und mit dem Mannlochdeckel nach unten positioniert

• nun wurde ein Überdruck von etwa 100 mbar im Trockner angelegt

· anschließend wurde die Mutterlauge über das 160 μηη Sieb in IBCTs ablaufen gelassen (7.10 Uhr - 8.20 Uhr)

• eine erste Probe wurde nach etwa 300 L in einer Glasflasche gezogen

—►hierbei fiel auf, dass die Probe trüber und nicht mehr ganz so dunkelgrün wie am Vortag war und zudem schäumte

— >die Probe war also optische heller und trüber als die des Vortages, zudem roch sie nun anders (nach Buttersäure)

• die zweite Probe wurde nach etwa 900 L ebenfalls wieder in eine Glasflasche entnommen

• da die Mutterlauge beim Abfüllen in den IBC so stark schäumte, konnte der erste IBC nur mit 900 L Mutterlauge befüllt werden

· nachdem der zweite IBC ebenfalls mit etwa 700 L Mutterlauge gefüllt war, wurde erstmals Stickstoff mit ausgeblasen • aus diesem Grund wurden die Hähne geschlossen und 10 Minuten gewartet, um der Mutterlauge Zeit zu geben, sich unten abzusetzen

• anschließend wurde der Rest der Mutterlauge in den IBC gegeben

• dabei wurde eine dritte Probe in eine Glasflasche gezogen

· insgesamt war der zweite IBC am Ende mit 750 L Mutterlauge gefüllt

• zum Schluss wurden die beiden IBC ^' s gewogen

-> IBC 1 + 2 = 1683 kg Netto

Waschen der immobilisierten Lipase

· nach dem Ablassen der Mutterlauge wurde der Taumeltrockner zunächst einmal gedreht und mit dem Schieber nach oben positioniert

• über den Schieber wurde anschließend eine Probe des feuchten, ungewaschenen Immobi- lisats entnommen

— > das Immobilisat hatte sich wieder seitlich am Trockner abgesetzt

— > das Immobilisat hatte einen leichten Grünstich

• anschließend wurde der Trockner wieder so gedreht, dass sich der Mannlochdeckel oben befand

• im Trockner wurde ein Unterdruck von etwa 300 mbar angelegt

• dann wurden 2000 L VE-Wasser (abgefüllt in 2 IBC) in den Taumeltrockner eingesaugt (8.55 Uhr - 9.30 Uhr)

• anschließend folgte 2 Stunden mischen bei 0,33 upm, Raumtemperatur und Normaldruck

• nach Ablauf der 2 Stunden wurde der Mannlochdeckel nach unten positioniert

• im Trockner wurde ein Überdruck von 400 -580 mbar angelegt und das Waschwasser in IBC ^' s abgelassen (1 1.45 Uhr - 13.15 Uhr)

· nach 50 L wurde die erste, nach 1000 L die zweite und nach 1825 L die dritte Probe genommen

— > alle Proben waren leicht grünlich trüb; es setzte sich jedoch kein Bodensatz ab — > man konnte aber keinen großen Unterschied zwischen den Proben erkennen

• ab etwa 1750 L abgelassenem Waschwasser wurde erstmals N ₂ mit ausgeblasen

· ab etwa 1850 L abgelassenem Waschwasser wurde ein dritter IBC nach draußen gestellt und die Leitung nach draußen gelegt, da sehr große Mengen an Stickstoff mit ausgeblasen wurden

• nun wurde ein Überdruck von 900 mbar auf den Trockner gelegt, um wirklich das gesamte Wasser heraus zu filtrieren

· unter diesem Druck wurde 15 Minuten lang trocken geblasen (zum Ende hin kam nur noch Stickstoff aus der Leitung und vereinzelte Tropfen vom Waschwasser) • anschließend wurden die IBCTs gewogen

-> IBC 1 + 2 = 1921 kg Netto

• danach wurde über das Mannloch eine 1 L Probe vom Feststoff gezogen

— > auch diese Probe war ganz leicht grünlich (jedoch nicht so stark wie die zuvor gezogene Feststoffprobe)

Vakuumtrocknung

• der Taumeltrockner wurde zunächst unter Drehen (Rotation) mit 0,33 upm evakuiert

• anschließend wurde die Drehung (Rotation) stufenweise auf 2,4 upm erhöht (1/ 1 ,5/ 2,0/ 2,4 upm)

— > von außen betrachtet lief der Trockner sehr ruhig, was wiederum auf ein gleichmäßiges Abrutschen (Abgleiten) des Immobilisats von der Trocknerwand hindeutet (zu diesem Zeitpunkt haben sich also noch keine größeren Brocken gebildet)

• um 14.20 Uhr wurde die Beheizung auf 50°C gestellt

· um 17.30 Uhr wurde er wieder geschlossen und stattdessen der Stripp- Stickstoff auf

25 m ³ /h eingeregelt

• um 2.15 Uhr wurde die Kühlung eingestellt, um die erste Probe ziehen zu können

• nach einer Kühlzeit von 2 h wurde um 4.15 Uhr die erste Probe des Immobilisats gezogen — > die Innentemperatur war von 39,3°C auf 23°C gesunken

· die Probe wurde zur Restfeuchtebestimmung ins betriebseigene Labor gegeben

-> Restfeuchtebestimmung bei 105°C /60 Minuten: 35,76%

• um 8.25 Uhr wurde der Trockner mit dem Schieber nach unten positioniert und 5 Minuten zwecks Temperaturmessung so stehen gelassen

— > die Innentemperatur hat einen Temperaturunterschied von 5°C, abhängig davon, ob sich der Taumeltrockner dreht, oder ob der Messfühler in den Feststoff eingetaucht ist

• um 13.45 Uhr wurde die Kühlung eingestellt, um eine zweite Probe ziehen zu können

• nach einer Kühlzeit von 30 Minuten wurde dann die Probe gezogen

— > hierbei fiel auf, dass sich zwischen den weißen Kugeln des Immobilisats auch kleinere, dunkle (braune) Teilchen befanden

· im betriebseigenen Labor wurde dann die Restfeuchte bestimmt

-> Restfeuchtebestimmung bei 105°C /60 Minuten: 9,72%

• Probe anschließend im Kühlschrank aufbewahrt

• um 17.28 Uhr stieg die Innentemperatur auf 46°C— > Bad auf 50°C genommen

• um 17.47 Uhr war die Innentemperatur wieder auf 45, 5°C gesunken— > Bad auf 53°C ge- nommen

• ab 18.00 Uhr wurde begonnen zu kühlen • von 19.00 Uhr - 19.20 Uhr wurde die Probe genommen und zur Restfeuchtebestimmung ins betriebseigene Labor gebracht

— > Restfeuchtebestimmung bei 105°C /60 Minuten: 1 ,4%

• da die Restfeuchte unter dem Sollwert von 3% lag, wurde die Trocknung beendet

· um 20.30 Uhr wurde das Vakuum aufgehoben

— > dabei stieg die Temperatur von 25°C auf 31 ,7°C

• um 20.50 Uhr wurde der Antrieb bei einer Innentemperatur von 25,8°C abgeschaltet

• ab diesem Zeitpunkt wurde der Trockner alle 2 Stunden einmal gedreht Abfüllung

der Trockner wurde mit dem Schieber nach unten positioniert

anschließend wurde der Siebeinsatz wieder ausgebaut

— > leichter Produktrückstand am Sieb

Mannlochdeckel für Abfüllvorgang ein Stück offen stehen lassen

· Nibbler/ Passstück montiert

anschließend mit etwa 2,4 m ³ /h N ₂ inertisiert

Big-Bag Nr. 67291 120 an die Abfülleinrichtung gehängt und mit N ₂ aufgeblasen und geerdet Abluft an Abfülleinrichtung halb geöffnet

mithilfe eines Handhahnes Produkt zuerst vorsichtig ablaufen lassen; später etwa auf halbe Stellung gedreht

— > das Immobilisat ist ohne Probleme in den aufgehängten Big-Bag gerieselt, ohne dabei an der Folie oder im Trockner selbst hängen zu bleiben

— > der Big-Bag hatte sich auch nur einmal ganz kurz aufgeblasen, als für einen kurzen Moment etwas mehr Produkt kam

· anschließend wurden die Reste, die sich noch im Taumeltrockner befanden, abgeklopft — > insgesamt blieben keine großen Rückstände im Taumeltrockner (nur 3 etwa DIN A3 große Stellen, an denen sich eine vielleicht 2mm dicke Schicht gebildet hatte; sonst war die

Trocknerinnenwand nur von einer ganz feinen Staubschicht belegt)

· aus dem Big-Bag wurde noch eine 1 L Probe in einer Plastikflasche gezogen

• zuletzt wurde der Big-Bag noch gewogen und anschließend trocken gelagert

— > Tara: 25 kg

-> Brutto: 271 kg

• der Abfüllvorgang selbst dauerte nur etwa 5 Minuten (mitsamt der Vorbereitung waren es etwa 20 Minuten) 3. Analysenergebnisse

Es wurde eine theoretische absolute Aktivität von 9.460.000.000 TBU beim Start berechnet

Messwerte Aktivität / Gesamtprotein im Verlauf der Immobilisierung:

Probe VoluGesamtRestakGesamtGemenaktivität tivität im protein samtaktivität [TBU] US [%] [g/L] protein [TBU/m abs.rechn. vom CooPlus [%] L] Start/BGG CooPlu wert s

/BGG

Mischprobe Konzentrat 5390 9.270.800.000 8,63

aus Fässern CALB-2012- 01

gemischt entspr. der

jew. Massen

(kg netto) der Fässer

Uberstand nach 3h Immo2215 4.474.300.000 48

bilisierung, nativ

Uberstand nach 3h Immo2225 4.494.500.000 48 3,47 40,16 bilisierung, filtriert (PVDF

0,2μιη)

Uberstand nach 5h Immo1730 2.975.600.000 32

bilisierung, nativ

Uberstand nach 5h Immo1760 3.027.200.000 33 3,13 36,23 bilisierung, filtriert (PVDF

0,2μιη)

Uberstand nach 7h Immo1220 2.098.400.000 23

bilisierung, nativ

Überstand nach 7h Immobilisierung, filtriert (PVDF 1090 1 .874.800.000 20 1 ,79 20,68 0,2μιη)

Uberstand nach 9h Immo820 1 .410.400.000 15

bilisierung, nativ

Uberstand nach 9h Immo744 1 .279.680.000 14 1 ,45 16,85 bilisierung, filtriert (PVDF 0,2μπΊ)

Uberstand nach 12h Im502 863.440.000 9,3

mobilisierung, nativ

Uberstand nach 12h Im460 791 .200.000 8,5 0,85 9,88 mobilisierung, filtriert

(PVDF 0,2μιτι)

Überstand nach 15h Im443 761 .960.000 8,2

mobilisierung, nativ

Uberstand nach 15h Im425 731 .000.000 7,9 0,92 10,69 mobilisierung, filtriert

(PVDF 0,2μιτι)

Uberstand nach Ende 204 41 1 .070.000 4,3

Immobilisierung, nativ

Uberstand nach Ende 174 351 .480.000 3,7 0,43 4,97 Immobilisierung, filtriert

(PVDF 0,2μιτι)

Waschwasser 3 nach Im- 20,4

mob., Probe 1 nativ

Waschwasser 3 nach Im- 17,1 0,06

mob., Probe 1 filtriert

(PVDF 0,2μιτι)

Waschwasser 3 nach Im- 35,8

mob., Probe 2 nativ

Waschwasser 3 nach Im- 19,5 0,06

mob., Probe 2 filtriert

(PVDF 0,2μιτι)

Waschwasser 3 nach Im- 28,0

mob., Probe 3 nativ

Waschwasser 3 nach Im- 33,4 0,07

mob., Probe 3 filtriert

(PVDF 0,2μm)

Es wurde eine Immobilisierungseffizienz von 96,3% erreicht. Restfeuchtebestimmung im Verlauf der Vakuumtrocknung 0 53,1 - 74,2

12 35,76

18 9,72

22 1 ,40

Restfeuchte des abgefüllten Produktes

Mithilfe der Infrarotwaage wurde in einer Dreifachmessung der mittlere Trockengehalt der Probe, die aus dem abgefüllten Big-Bag entnommen wurde, bestimmt. Die Messungen ergaben folgendes Ergebnis (Infrarotwaage, Endpunkt: 30 sec. Waagenstillstand, Dreifachmessung: 5,3g /9,3g /4,6g):

Der mittlere Trockengehalt des abgefüllten Produktes liegt bei 99,1 1 %. Dies wiederum entspricht einer Restfeuchte von 0,89%.