Trans-Dihydroxy-Cyclohexadien-Carbonsäure (trans-DCHCs) stellen im Rahmen des Shikimisäure-Biosyntheseweges (Fig. 2) die Folgemetabolite des Chorismats dar. Bei den trans-DCHCs unterscheidet man zwischen zwei Konstitutionsisomeren (Stereoisomeren), nämlich 2,3-trans-DCHC (entsprechend (5S, 6S)-Dihydroxy-cyclohexa-1, 3-diencarbonsäure) und 3,4-trans-DCHC (entsprechend (3R, 4R)-Dihydroxy-cyclohexa1, 5- diencarbonsäure), wie in Fig. 1 dargestellt. Ausgehend von Chorismat entsteht über intermediäres Isochorismat das 2,3-trans-DCHC. Die Transformation erfolgt über zwei Enzyme : Isochorismatsynthase (kodiert durch das Gen entC) und Isochorismatase (kodiert durch das Gen entB).

2,3-trans-DCHC ist ein Zwischenprodukt auf dem Biosyntheseweg des Enterobactin, welches als Chelatbildner im Fall von Eisenmangel in der Zelle gebildet und sekretiert wird. Das für den Abbau von 2,3-trans-DCHC verantwortliche Enzym ist die 2,3-Dihydroxybenzoatsynthase (kodiert durch das Gen entA). Eine Übersicht ist in Fig. 3 dargestellt. 3,4-trans- DCHC konnte bislang in Prokaryonten nicht beobachtet werden. Nach bisherigem Kenntnisstand entsteht es in kleineren Mengen bei Überexpression von eut8, besitzt jedoch keine biologische Funktion.

Die Herstellung von Metaboliten des Aromatenbiosyntheseweges und insbesondere von trans-Dihydroxy-Cyclohexadien-Carbonsäuren (trans- DCHC) sowohl auf enzymatisch-fermentativem als auch auf rein chemischem Wege ist bereits beschrieben. Die chemische Synthese ist dabei sehr aufwendig und mit zahlreichen in der Literatur beschriebenen Nachteilen behaftet. Kennzeichnend für die chemischen Synthesen ist, daß sie keine oder nur eine sehr geringe Enantioselektivität aufweisen und aufgrund der sehr hohen Aromatisierungs-Empfindlichkeit der trans-DCHC mit schlechten Ausbeuten verbunden sind. Außerdem sind zur chemischen Herstellung vielstufige Synthesesequenzen und meist hohe Reaktionstemperaturen mit hohem Energieeintrag notwendig. Darüber hinaus sind die chemischen Synthesen durch die Verwendung giftiger, explosiver oder umweltgefährdender Substanzen und die erforderlichen Sicherheits-und Entsorgungsmaßnahmen unökonomisch. Nachfolgend wird deshalb insbesondere auf die enzymatisch-fermentative Herstellung eingegangen. Hierbei sind zur Herstellung von trans-Dihydroxy- Cyclohexadien-Carbonsäuren sowohl in-vitro-als auch in-vivo-Verfahren bekannt.

So beschreiben Rusnak, F., et al. (Biochemistry, 1990,29 : 1425-1435 und Liu, J. et al. (Biochemistry, 1990,29 : 1417-1425) generell NMR- Messungen zur in-vitro-Umsetzung von Isochorismat zu 2,3-trans-DCHC mit gereinigter Isochorismatsynthase (EntC) bzw. Isochorismatase (EntB).

Die in-vitro-Herstellung von trans-DCHC ausgehend von Chorismat mit Hilfe von Zellextrakten aus E. coli-Stämmen, die entweder eine Mutation in den Genen entA, entB oder entC aufwiesen ist bei Young, I. G. et al. (J.

Bacteriology, 1971,106 : 51-57) beschrieben. Die in-vitro Umsetzung von vorgelegtem Chorismat zu 2,3-trans-DCHC mittels eines Zellextraktes aus Klebsiella-Stämmen beschreiben Young, I. G. et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1969,177 : 381-388 und Biochimica et Biophysica Acta, 1969,177 : 401-411). Nachteilig bei den hier beschrieben Verfahren ist

jedoch die sehr kurze Haltbarkeit der verwendeten Zellaufschlüsse.

Weitaus nachteiliger ist jedoch, daß Chorismat als Ausgangssubstrat nur in geringen Mengen verfügbar und zudem sehr teuer ist (ca. 1.400,- DM/Gramm).

Eine enzymatisch-fermentative Synthese von Chorismat, als Vorstufe der trans-DCHC, mit Hilfe eines lebenden Systems, bei dem die verwendeten E. coli-Stämme Auxotrophien für die aromatischen Aminosäuren aufweisen, ist bei Grisostomi, G. et al. (Bioorganic Chemistry, 1997,25 : 297-305) beschrieben. Allerdings wurden nur geringe Mengen an Chorismat (520 mg/1) produziert. Aufgrund der Instabilität des Chorismats ist eine weitere Aufarbeitung von hohen Verlusten gekennzeichnet.

Die in-vivo-Produktion einer weiteren Vorstufe von trans-DCHC, nämlich von Isochorismat mit Klebsiella pneumoniae ist bei Schmidt, K. et al.

(Biotechnol. Bioeng. 1995,45 : 285-291) beschrieben. Hierbei entstehen lediglich 90 mg/l Isochorismat. Isochorismat weist eine noch größere Instabilität auf als Chorismat, so daß auch dieses Verfahren zur Bereitstellung größerer Mengen an Vorstufen bzw. Bausteinen zur Herstellung von trans-DCHC und deren Folgeprodukte ungeeignet ist.

Bei Müller, R. et al. (Microbiology, 1996,142 : 1005-1012) wird die Exkretion von trans-DCHC durch ein in-vivo-System, nämlich aus einem potentiell human-pathogenen Klebsiella pneumoniae-Stamm beschrieben.

Diese Stämme wiesen eine Anzahl verschiedener Nachteile auf. So zeigen die Klebsiella-pneumoniae-Stämme aufgrund verschiedener Punktmutationen Auxotrophien für die drei aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan, so daß diese essentiellen Aminosäuren dem Kulturmedium zugesetzt werden müssen. Der Organismus neigt ferner aufgrund der Punktmutationen relativ schnell zu spontanen Rückmutationen, ist aufgrund dessen genetisch relativ instabil und für großtechnische Fermentationsprozesse wenig geeignet. Zusätzlich

enthielten die Klebsiella-Stämme heterologe Gene aus E. coli und zwar die Gene entB/entC oder entB alleine (Gibson, M. I. et al. ; Biochem. J., 1964,90 : 248-256). Eine Veränderung des entA-Gens ist für diese Stämme nicht offenbart. Nachteilig bei dem hier beschriebenen Verfahren ist insbesondere, daß die gewünschten Produkte trans-DCHC nicht exklusiv entstehen, sondern stark mit diversen Metaboliten, insbesondere Chorismat verunreinigt sind. Neben Chorismat konnten hier etwa 90 mg/l 2,3-trans-DCHC bei Überexpression von entBlentC und etwa 70 mg/i 3,4- trans-DCHC bei Uberexpression von entB aus dem Kulturmedium isoliert werden. Allerdings ist die Isolierung und Aufreinigung solcher Gemische schwierig und erfordert weiteren Zeit-und Kostenaufwand, verbunden mit weiteren Verlusten an gewünschtem Produkt. Darüber hinaus ist das Bakterium Klebsiella pneumoniae pathogen, d. h. potentiell human- pathogen und den Sicherheitsanforderungen der Risikogruppe 2 unterlegen. Der industrielle Einsatz von pathogenen oder potentiell pathogenen Organismen zur Herstellung biotechnologischer Produkte ist aufgrund hoher produktionstechnischer Sicherheitsauflagen und einer geringen marktwirtschaftlichen Akzeptanz, insbesondere zur Darstellung von Arzneimitteln, äußerst problematisch.

Ferner muß neben der eigentlichen Synthese von trans-DCHC aus Gründen der Wirtschaftlichkeit auch die Isolierung der gewünschten Verbindungen aus dem jeweiligen Produktionsansatz mit zufriedenstellenden Ausbeuten und entsprechender Selektivität gewährleistet sein. Hierbei stellen insbesondere Verunreinigungen des Produktionsansatzes mit ähnlichen Verbindungen, wie z. B. Chorismat, ein Problem dar. Weniger selektive oder"nicht-selektive"Verfahren, wie z. B.

Flüssig-Flüssig-Extraktion oder Adsorption/Elution, wie u. a. lonenchromatochraphie sind in diesem Fall nicht geeignet. Ferner schränkt die hohe Empfindlichkeit der trans-DCHC gegenüber Säure-

/Base-sowie Hitzeeinwirkung die zur Produktaufreinigung in Frage kommenden Separationsverfahren ein.

Daneben stellt die Reaktivextraktion/Reextraktion mit anionischen oder kationischen Carriern ein allgemeines Aufarbeitungsverfahren dar, welches bislang jedoch hauptsächlich zur Trennung von Schwermetallsalzen eingesetzt wird. Beispiele für die Verwendung der Reaktivextraktion zur Produktisolierung in biotechnologischen Prozessen, ebenso wie die Aufkonzentrierung von trans-DCHC durch Extraktion sind beschrieben (Müller, R. et al., Microbiology, 1996,142 : 1005-1012).

Allerdings sind die Verfahren allesamt darauf ausgelegt, das jeweilige Produkt für analytische Zwecke in hoher Reinheit darzustellen. D. h. zur präparativen Isolierung von trans-DCHC aus großtechnischen Produktionsansätzen sind die bislang bekannten Verfahren ungeeignet.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war somit ein verbessertes Verfahren zur Herstellung und Isolierung von trans-Dihydroxy-Cyclohexadien- Carbonsäuren zur Verfügung zu stellen, das zufriedenstellende Ausbeuten an reinen trans-DCHCs liefert und die zuvor genannten Nachteile nicht mehr aufweist.

Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung in vorteilhafter Weise gelöst.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur verbesserten Herstellung von trans-Dihydroxy-Cyclohexadien-Carbonsäuren und/oder deren Folgeprodukte, wobei die Synthese der trans-Dihydroxy- Cyclohexadien-Carbonsäuren in enantiomerenreiner Form ohne nachweisbare Verunreinigungen mit Chorismat ausgehend von erneuerbaren Kohlenstoffquellen durch Kultivierung wenigstens eines genetisch veränderten nicht-pathogenen Organismus erfolgt, welcher über

einen Aromatenstoffwechsel verfügt und im Vergleich zu einem entsprechend nicht genetisch veränderten Organismus a) eine erhöhte Aktivität der Isochorismatsynthase (EntC) und Isochorismatase (EntB) und eine Aktivität der 2,3- Dihydroxybenzoatsynthase (EntA) von nahezu Null aufweist oder b) eine erhöhte Aktivität der Isochorismatase (EntB) und eine erniedrigte Aktivität der Isochorismatsynthase (EntC) und eine Aktivität der 2,3- Dihydroxybenzoatsynthase (EntA) von nahezu Null aufweist.

Erfindungsgemäß) umfaßt sind hierbei auch die in entsprechender Weise veränderten Aktivitäten von Isoenzymen der Isochorismatase und/oder Isochorismatsynthase. Insbesondere umfaßt ist dabei das Isoenzym der Isochorismatsynthase (EntC), welches mit MenF bezeichnet wird und durch das Gen menF kodiert ist (Dahm, C. et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1998,1425 : 377-386). Unter Isoenzymen sind Enzyme mit gleicher oder vergleichbarer Substrat-und Wirkungsspezifität zu verstehen, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen. Die Erläuterungen der vorliegenden Erfindung beziehen sich somit gleichermaßen auf EntC und MenF und möglicherweise noch weitere Isoenzyme der Isochorismatsynthase, auch wenn aus Gründen der Klarheit nur EntC explizit genannt wird.

Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Herstellung enantiomerenreiner trans-DCHC unter Einsatz des zuvor beschriebenen genetisch veränderten und nicht-pathogenen Organismus. Darüber hinaus zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, daß die trans-Dihydroxy-Cyclohexadien-Carbonsäuren ohne störende Nebenprodukte ähnlicher Struktur, d. h. ohne Verunreinigungen durch Chorismat und/oder Isochorismat, gebildet und aus dem Organismus in ein wässriges Permeat (Kulturmedium) abgegeben werden. Ein weiterer

wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die Isolierung der trans-Dihydroxy-Cyclohexadien-Carbonsäure aus dem wässrigen Permeat durch ein einstufiges Verfahren, d. h. in einem einzigen Schritt erfolgt, ohne zuvor weitere Aufreinigungsschritte, wie z. B. HPLC, durchführen zu müssen. Beispiele für erfindungsgemäß) geeignete einstufige Isolierungsverfahren sind die Reaktivextraktion mittels eines kationischen Carriers oder die Adsorption/Desorption an einem Anionenaustauscher oder eine Extraktion (z. B. flüssig-flüssig-Extraktion bei pH 1-3). Hierdurch werden in vorteilhafter Weise erfindungsgemäß, hohe Produkt-Reinheiten an enantiomerenreinen trans-DCHC von wenigstens 90% erreicht.

Erfindungsgemäß, umfaßt sind auch Verfahren, bei denen die Herstellung und Isolierung der gewünschten Produkte nicht nur sukzessive erfolgt, sondern bei denen auch eine integrierte Produktion und Isolierung möglich ist, z. B. im Rahmen kontinuierlich betriebener Fermentationsanlagen bei gleichzeitiger kontinuierlicher Separation der Produkte.

Erfindungsgemäß, werden in dem zuvor genannten Verfahren nicht- pathogene Organismen, bevorzugt Bakterien, Hefen, Pilze und/oder Pflanzen eingesetzt, die höchstens den Sicherheitsanforderungen der Risikogruppe 1 (definiert durch das Gentechnikgesetz, 1990 BGBI I 1080 ; 1993 BGBI I 2066 ; 1993 BGBI 111 2121-60-1 ; 1997 BGBI I 2390) zugeordnet sind und die über einen eigenen Aromaten-Biosyntheseweg verfügen oder in die durch gentechnische Methoden die entsprechenden Informationen eines heterologen Aromaten-Biosyntheseweges eingebracht wurden. Hierunter ist die Einschleusung der Aromaten- Biosynthesegene zu verstehen, die z. B. plasmidkodiert sein können und durch gängige Methoden, wie z. B. Transformation, Konjugation oder Elektroporation übertragen werden und ggf. in das Chromosom der Wirtszellen integriert werden können.

Erfindungsgemäß, bevorzugt werden Bakterien und hierbei solche der Gattung der Enterobakterien, insbesondere Escherichia coli. Bevorzugte

Vertreter können sein : E. coli MC4100 (ATCC 35695, DSM 6574) (M. J.

Casadaban, J. Mol. Biol. 1976,104,541-555 und M. J. Casadaban, S. N.

Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci USA 1979,76,4530-4533 sowie bei Y.

Komeda, T. lino, J. Bacteriol 1979, 139, 721-729), E coli H1882, der dem Stamm MC4100 entspricht und sich zusätzlich durch eine Dihydroxybenzoatsynthase-Defizienz (entA-Deletion ; A (fepA-ent)) auszeichnet oder E. coli AN193 (G. B. Cox et al., J. Bacteriol. 1970,104, 219-226 und in B. A. Ozenberger, T. J. Brickman, M. A. Mcintosh, J.

Bacteriol. 1989,171,775-783), der ebenfalls eine entA-Negativmutante darstellt. Diese Auswahl ist jedoch nicht limitierend für die vorliegende Erfindung.

Die Herstellung der trans-DCHC erfolgt erfindungsgemäß bevorzugt ausgehend von Kohlenhydraten, besonders bevorzugt von Glukose und/oder D-Galaktose und/oder Glyzerin als Kohlenstoffquelle. Dies trifft vor allem für die mikrobielle Herstellung von trans-DCHC zu. D-Galaktose und/oder Glyzerin müssen dazu nicht als primäre C-Quelle genutzt werden können, sondern können auch erst während der bereits laufenden Fermentation also während des Wachstums zudosiert werden. Die erfindungsgemäße Herstellung von trans-DCHC ausgehend von erneuerbaren C-Quellen wirkt sich insbesondere aufgrund einer enormen Kostenreduzierung gegenüber den herkömmlichen Verfahren, welche die extrem teure Vorstufe Chorismat einsetzen, als besonders vorteilhaft aus.

Das Verfahren zeichnet sich ferner dadurch aus, daß bereits aufgrund einer nur geringfügigen oder bevorzugt gänzlich fehlenden Aktivität der 2,3-Dihydroxybenzoatsynthase (EntA) eine Steigerung des Titers an <BR> <BR> <BR> enantiomerenreinen trans-Dihydroxy-Cyclohexadien-Carbonsäuren gegenüber einem nicht genetisch veränderten Organismus wenigstens um den Faktor 10-30 erreicht wird. Hierbei beruht die geringfügige oder ganz fehlende 2,3-Dihydroxybenzoatsynthase-Aktivität auf einer partiellen oder

vollständigen, bevorzugt 1-99% igen, besonders bevorzugt 5-90% igen Inaktivierung des entA-Gens, beispielsweise durch Deletion des gesamten Gens oder Teilen davon. Bevorzugt werden sogenannte entA-Negativ- Mutanten (entA~).

In einer bevorzugten Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung wird dieses zuvor genannte Ergebnis an enantiomerenreinen trans-Dihydroxy- Cyclohexadien-Carbonsäuren mit einem E. coli-Stamm und ausgehend von Glukose als C-Quelle erreicht. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ferner, daß es in den erfindungsgemäßen E coli-Stämmen nicht zu einer Nebenproduktbildung in Form von Chorismat und/oder Isochorismat kommt, d. h. auch in den gewünschten Produkten sind keine Verunreinigungen mit stukturell ähnlichen Verbindungen, wie dem Chorismat und/oder Isochorismat nachweisbar, d. h. sie liegen unterhalb der Nachweisgrenze. Unter der Nachweisgrenze im Sinne der vorliegenden Erfindung ist erfindungsgemäß eine Konzentration an störenden Verbindungen ähnlicher Struktur im Bereich von 0,5 mg/ ! zu verstehen. D. h. daß Chorismat und/oder lsochorismat als störende Nebenprodukte in Konzentrationen von weniger als 0,5 mg/l Fermentationsmedium vorliegen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung wird mit einem genetisch veränderten E. coli-Stamm, dessen entA-Gen inaktiv ist (entA-) und dessen Gene entB und entC überexprimiert werden, eine sehr hohe Ausbeute an 2,3-trans-DCHC im Bereich mehrerer Gramm pro Liter, nämlich wenigstens 5 g/I erzielt.

Hierbei wurde das Kulturmedium nach Pan, J. et al. (Biotechnol. Lett., 1987,9 : 89-94) hinsichtlich seiner Ammoniumkonzentrationen optimiert.

Die bevorzugten Stämme weisen gegenüber dem entsprechend nicht genetisch veränderten Organismus erhöhte Aktivitäten der Enzyme

Isochorismatsynthase und Isochorismatase und idealerweise keine oder nur eine 2,3-Dihydroxybenzoatsynthase-Aktivität von nahezu Null auf.

Zur näheren Erläuterung der vorliegenden Erfindung sind nachfolgend einige Enzymaktivitäten durch konkrete Meßwerte angegeben. Diese Ausführungen sind beispielhaft und in keiner Weise limitierend für die vorliegende Erfindung. Es handelt sich dabei um Meßwerte, die in dem nicht pathogenen E. coli-Stamm AN193 erzielt wurden, der sozusagen der "Kontrollstamm"ist. Dieser Stamm E. coli AN193 ist beschrieben bei G. B.

Cox et al., J. Bacteriol. 1970,104,219-226 und in B. A. Ozenberger, T. J.

Brickman, M. A. Mdntosh, J. Bacteriol. 1989,171,775-783. Er weist eine spezifische Enzymaktivität der Isochorismatsynthase (chromosomal kodiert durch entC) von etwa 0,10 U/mg Protein und der Isochorismatase (chromosomal kodiert durch entB) von etwa 0,012 U/mg Protein auf.

Durch Überexpression des entB-Gens wurde im Vergleich hierzu eine erhöhte Aktivität von etwa 0,29 U/mg Protein und durch Überexpression des entC-Gens eine vergleichsweise erhöhte Aktivität von etwa 1,17 U/mg Protein erreicht.

Überraschender Weise führt die Überexpression von entB alleine in dem E coli-(entA-)-Stamm, der eine unveränderte Isochorismatsynthaseaktivität aufweist, nicht zu einer Exkretion von 3,4- trans-DCHC. Dies war insbesondere vor dem Hintergrund der bekannten Untersuchungen mit pathogenen Klebsiella pneumoniae-Stämmen nicht zu erwarten (Müller, R. et al. Microbiology, 1996,142 : 1005-1012).

Ferner ist überraschend, daß in einer weiteren Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung unter Einsatz eines E coli-Stammes, der idealerweise keine oder nur eine Aktivität der 2,3- Dihydroxybenzoatsynthase (EntA) von nahezu Null (entA--Mutante) und eine erhöhte Aktivität der Isochorismatase (EntB) und eine erniedrigte

Aktivität der Isochorismatsynthase (EntC) aufweist, die Exkretion von 3,4- trans-DCHC in enatiomerenreiner Form erreicht werden kann.

Erfindungsgemäß zeichnet sich das Verfahren vor allem dadurch aus, daß für die chiralen trans-Dihydroxy-Cyclohexadien-Carbonsäuren jeweils eine Enatiomerenreinheit (ee) im Bereich von > 99, 9 % erreicht wird. Hierbei ist zu betonen, daß erfindungsgemäß keine Verunreinigungen mit Chorismat und/oder lsochorismat als störendem Nebenprodukt ähnlicher Struktur nachweisbar sind, wobei diese Nachweisgrenze bei einem Wert im Bereich von weniger als 0,5 mg/l liegt.

Erfindungsgemäß kann die geringfügige oder fehlende Aktivität der 2,3- Dihydroxybenzoatsynthase (EntA) und/oder veränderte Aktivitäten der Isochorismatase (EntB) bzw. Isochorismatsynthase (EntC) durch Veränderungen auf transkriptionaler, translationaler und/oder posttranslationaler Ebene hervorgerufen werden. Hierunter sind beispielsweise Veränderungen regulativer Elemente, wie z. B. der Promotoraktivitäten, der Beständigkeit der gebildeten mRNAs oder Proteine gegenüber Abbau durch Nukleasen oder Proteasen oder der Inititation der Translation durch Ribosomenbindung oder Verringerung der katalytischen Enzymaktivität selbst oder durch verändertes Bindungsverhalten von Regulatoren oder andere zu verstehen. Darüber hinaus ist auch eine geringfügige oder gänzlich'fehlende Aktivität der 2,3- Dihydroxybenzoatsynthase durch die Inaktivierung des entA-Gens denkbar, welche erfindungsgemäß bevorzugt ist. Dies kann durch verschiedenartige an sich bekannte gentechnische Ansätze erreicht werden, wie z. B. Insertions-oder Deletionsmutagenese oder chemische Behandlung der Zellen mit mutagenen Agenzien. Bevorzugt sind ent4- Deletionsmutanten. Die zuvor genannten Methoden dienen dabei lediglich der Erläuterung der Erfindung und wirken nicht limitierend.

Erhöhte Aktivitäten der Enzyme Isochorismatase bzw.

Isochorismatsynthase können außerdem durch eine Überexpression der Gene entBlentC und hier beispielsweise durch eine erhöhte Kopienzahl der Gene, entweder gemeinsam in einem geeigneten Vektor oder separat in verschiedenen geeigneten und untereinander kompatiblen Vektoren, erreicht werden. Denkbar sind aber auch andere Vorgehensweisen, wie z.

B. die Expression unter Kontrolle eines starken und/oder induzierbaren Promotors oder die Stabilisierung der gebildeten mRNA und/oder der korrespondierenden Proteine gegenüber Nukleasen und/oder Proteasen.

Als Promotoren sind prinzipiell alle Promotoren geeignet, von denen aus eine Expression in dem jeweiligen Wirtsorganismus möglich ist, in den das Genkonstrukt eingebracht wird. Beispielhaft sei hier ein IPTG- induzierbarer Promotor genannt.

Eine erfindungsgemäß verringerte Aktivität der Isochorismatsynthase kann durch eine veränderte Expression des entC-Gens, also auf transkriptionaler oder translationaler Ebene, oder eine veränderte Aktivität des bereits gebildeten Enzyms (posttranslational), beispielsweise durch Zusatz spezifischer Effektoren (Inhibitoren) der Isochorismatsynthase erfolgen.

Eine Verminderung der Genexpression, insbesondere der entC- Expression, kann Eingriffe auf chromosomaler und/oder plasmidkodierter Ebene erfordern. Hierbei kann die Expression eines Gens durch die Aktivität des Promotors kontrolliert werden, dem das Gen unterliegt.

Erfindungsgemäß bevorzugt wird hier ein Promotor, der in seiner Aktivität "leaky"ist, d. h. der derart regulierbar ist, daß die Genexpression stark vermindert ist, idealerweise aber nicht ganz ausgeschaltet wird Unter "leaky"ist somit eine Promotoraktivität zu verstehen, die nicht ganz abgeschaltet ist, sondern noch eine geringe Restaktivität erlaubt und somit "undicht", also etwas durchlässig ist. Unterschiedliche Möglichkeit der Feinregulierung von Promotoren sind dem Fachmann zahlreich bekannt.

Darüber hinaus sind auch der Einsatz und/oder die genetische Veränderung anderer regulatorisch wirkender Elemente, wie u. a.

Enhancer oder Silencer, erfindungsgemäß umfaßt.

Ferner ist zur Regulierung der entC-Genexpression auch eine Repression der Genexpression durch eine Blockierung der gebildeten mRNA mittels gebildeter antisense-RNA denkbar. Vorgehensweisen, die zu einer sogenannten Antisense-Repression führen, sind dem Fachmann bekannt.

Gegenstand der Erfindung sind somit auch die Genkonstrukte und/oder Vektoren zur Erzielung der zuvor beschriebenen veränderten Gen-bzw.

Enzymaktivitäten. Im Sinne der vorliegenden Erfindung enthält ein Genkonstrukt wenigstens eine kodierende Nukleotidsequenz der Gene entb und/oder entC und/oder ggf. entA sowie mit diesen operativ verknüpfte regulative Nukleotidsequenzen, wie Promotoren, Enhancer, Silencer, Transkriptionsterminatoren, Targeting-Sequenzen (Transitsignalsequenzen) und/oder Translationsverstärker. Vektoren im Sinne der vorliegenden Erfindung enthalten zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion transformierter Wirtszellen und/oder für die Replikation innerhalb der Wirtszelle oder zur Integration in das entsprechende Wirtszell-Genom. Die Herstellung dieser Konstrukte und Vektoren sind dem Fachmann bekannt und werden daher nicht im Detail beschrieben. Hierbei sind wie bereits zuvor erwähnt auch Konstrukte und/oder Vektoren enthaltend Nukleotidsequenzen kodierend für die Isochorismatmutase und/oder Isochorismatsynthase und/oder deren Isoenzyme, z. B. menF, umfaßt.

Ferner ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß die gebildeten trans-DCHC durch Reaktivextraktion/Reextraktion nahezu quantitativ aus dem Permeat (wässriges Kulturmedium) isoliert werden.

Unter Berücksichtigung der Produkteigenschaften in neutraler wässriger Lösung erfolgt diese Isolierung mit Hilfe von kationischen Carriern, d. h.

Anionen-selektiven Carriern. Hierbei binden die in wässriger (Kultur)- Lösung als Anionen vorliegenden trans-DCHC über ionische Wechselwirkungen an einen kationischen Carrier. Als Carrier werden erfindungsgemäß Ammoniumderivate bevorzugt. Besonders bevorzugt wird Trioctylmethyl-ammoniumchlorid (Aliquats 336, Aldrich Chemicals Co.). Einer möglicherweise auftretenden Toxizität des Carriers auf das Biosystem, insbesondere bei einer Anwendung in einem integrierten Produktions-und-Isolierungsverfahren, wird erfindungsgemäß dadurch begegnet, daß das Konzentrationsgleichgewicht des Carriers in der wässrigen und der organischen Phase derart beeinflußt wird, daß die Carrierkonzentration in der wässrigen Phase des Kulturmediums unter der Toxizitätsgrenze der für das biologische System kritischen Konzentration gehalten wird. Die Vorgehensweisen hierzu sind dem Fachmann geläufig.

Erfindungsgemäß bevorzugt werden kationische Carrier und hierbei Ammoniumderivate verwendet, die durch sterisch anspruchsvolle Substituenten nicht oder nur extrem geringfügig membrandurchgängig sind und aufgrund dessen die Toxizitätsgrenze für das biologische System, d. h. den erfindungsgemäß nicht pathogenen Organismus, nicht überschreiten. Unter Membrandurchgängigkeit ist die Einschleusung des Carriers durch die Zellmembran in das biologische System zu verstehen, die passiv durch Diffusion oder aktiv durch Transportvorgänge (z. B.

Symport und/oder Antiport) erfolgen kann.

Erfindungsgemäß sind auch komplexere Anionen-selektive Verbindungen als Carrier z. B. aus der Gruppe der Cyclodextrin-Kationen, endrohedral- kationische Fullerene, kationische geladene Kronenether und/oder Kryptanden umfaßt.

Erfindungsgemäß werden bei der Reaktivextraktion kationische Carrier in einer Konzentration im Bereich von 1-30 Voi.-%, bevorzugt 3-20 Vol.-%, besonders bevorzugt 5-15 Vol.-% bezogen auf das Kultivierungsmedium eingesetzt. Erfindungsgemäß nimmt dabei die Extraktionsleistung

annähernd proportional zur eingesetzten Carrierkonzentration zu. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich ferner dadurch aus, daß bei der Reaktivextraktion als organisches Lösungsmittel Sauerstoff- enthaltende Lösungsmittel mittlerer Kettenzahl mit C6 bis C20, bevorzugt C4 bis C12, wie z. B. 2-Undecanon und/oder Diphenylether und/oder Butylbenzol und/oder 1-Octanol eingesetzt werden, wobei 1-Octanol besonders bevorzugt wird.

Als ungeladenes und weitgehend unpolares trans-DCHC/Carrier- lonenpaar werden beide in eine unpolare, organische Phase überführt.

Aus dieser organischen Phase werden die 2,3-trans-DCHC dann durch eine dritte Phase (Reinphase) mit hoher Gegenionenkonzentration wieder reextrahiert. Die Triebkraft zur Anreicherung der Produkte in der Reinphase ist das hohe Konzentrationsgefälle der Gegenionen. Es wurden keine Effekte einer irreversiblen Produktbindung an den Carrier beobachtet, so daß die trans-DCHC erfindungsgemäß nahezu quantitativ aus der organischen Phase reextrahiert werden können.

Erfindungsgemäß werden bei der Reaktivextraktion als Reextraktionsmittel gesättigte anorganische Salzlösungen, bevorzugt mit Chlorid-und/oder Carbonat-lonen, besonders bevorzugt in Form einer gesättigten Natriumchloridlösung, eingesetzt. Ferner zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, daß die Reextraktionsleistung proportional zur Anionenkonzentration zunimmt und keine direkte Abhängigkeit zum pH-Wert vorliegt.

Ferner hat es sich als vorteilhaft erwiesen die reextrahierten trans-DCHC der Reinphase durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln ohne Carrier vom Wasser zu befreien und dann destillativ aufzukonzentrieren.

Hierbei treten keine Verluste auf, sofern der Vorgang bei Raumtemperatur und einem sauren pH-Wert durchgeführt wird und keine katalytisch

wirkenden Oberflächen, wie z. B. Kieselgele verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dabei dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion der enantiomerenreinen trans-Dihydroxy-Cyclohexadien- Carbonsäure aus der Salzfracht nahezu quantitativ mit organischen Lösungsmitteln, wie z. B. mittelkettige Alkohole, fiüchtige Carbonsäureester, Ketone und/oder funktionalisierte Aromaten, bei einem sauren pH-Wert, bevorzugt im Bereich von pH 0 bis pH 5, besonders bevorzugt bei pH 3 erfolgt. Beispiele für erfindungsgemäß, bevorzugte organische Lösungsmittel sind verschiedene Essigester, Aceton, Diphenylether und/oder 1-Butanol, wobei letzteres erfindungsgemäß besonders bevorzugt wird. Diese Angaben dienen der Erläuterung der Erfindung und sind nicht limitierend. Eine schematische Übersicht der erfindungsgemäßen Aufreinigung der trans-DCHC ist in Fig. 4 dargestellt.

Besondere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens und hier insbesondere bei der Reaktivextraktion/Reextraktion ist, daß die Aufbereitung der trans-DCHC unter sehr milden Bedingungen erfolgt, so daß keine Aromatisierung der Produkte eintritt.

In einer weiteren Ausführungsvariante erfolgt die Isolierung der trans- DCHC aus dem wässrigen Permeat (Kulturlösung) durch Adsorption/Desorption auf einem ionenaustauscher, bevorzugt auf einem Anionenaustauscher, wie z. B. auf dem Harz DOWEX 1x8 (100-200 Mesh). Dabei kann die Kulturlösung unmittelbar, d. h. ohne weitere Aufarbeitung auf ein Fließbett oder Festbett aus geeigneten Adsorberpartikeln aufgetragen werden. Gegebenenfalls ist hierzu zunächst eine Abtrennung der partikulären (festen) Bestandteile vorzunehmen, insbesondere bei der Adsorption in einem Festbett.

Unabhängig von einer ggf. vorgeschalteten Abtrennung partikulären Bestandteile wird die auf den Adsorber aufzutragende Kulturlösung auf einen pH-Wert im alkalischen Bereich, bevorzugt auf einen pH-Wert im

Bereich zwischen 7,5-11, besonders bevorzugt von pH 8 eingestellt. Die Leitfähigkeit der Lösung wird durch geeignete Maßnahmen auf einen Wert zwischen 2,5-20 mS/cm, bevorzugt 8-15 mS/cm, besonders bevorzugt 13,5 mS/cm eingestellt. Ein besonderer Vorteil dieser Ausführungsvariante liegt darin, daß sich die zuvor beschriebene Vorgehensweise erfindungsgemäß, durch eine hohe Selektivität auszeichnet und die während der Fermentation gebildeten und in das wässrige Permeat abgegebenen trans-DCHC überraschender Weise als überwiegende Komponente auf dem Adsorber gebunden wird. Die Desorption der trans- DCHC erfolgt beispielsweise durch Waschen des Adsorbers mit wässrigen Lösungen, welche einen sauren pH-Wert aufweisen. Erfindungsgemäß, bevorzugt werden flüchtige Säuren, besonders bevorzugt Ameinsensäure.

Zur Isolierung der trans-DCHC in fester Form kann beispielsweise eine Gefriertrocknung vorgenommen werden. Überraschender Weise bleiben die trans-DCHC durch den Einsatz der zuvor genannten Desorptionsmittel als überwiegend fester Rückstand erhalten. Durch die zuvor beschriebene Vorgehensweise werden erfindungsgemäß) Produktreinheiten an trans- DCHC von wenigstens 90 % erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein genetisch veränderter Organismus zur verbesserten Herstellung von trans-Dihydroxy- Cyclohexadien-Carbonsäuren in enantiomerenreiner Form ohne nachweisbare Verunreinigungen mit Chorismat und/oder Isochorismat, der sich dadurch auszeichnet, daß er ein nicht pathogener Organismus ist, der höchstens den Sicherheitsanforderungen der Risikogruppe 1 zugeordnet ist und im Vergleich zu einem entsprechenden nicht genetisch veränderten nicht pathogenen Organismus keine oder nur eine 2,3- Dihydroxybenzoatsynthase-Aktivität (EntA) von nahezu Null, d. h. idealerweise von Null, und eine gesteigerte Aktivität der Isochorismatase (EntB) und eine gesteigerte oder verminderte Aktivität der Isochorismatsynthase (EntC) aufweist.

Hierbei kann eine nur geringfügige oder fehlende Aktivität der 2,3- Dihydroxybenzoatsyntase dadurch erzielt werden, daß das entsprechende Gen entA inaktiviert wurde. Dies kann ungerichtet durch klassische chemische Mutagenese und Selektion auxotropher Mutanten erfolgen oder durch z. B : gerichtete gentechnische Inaktivierungen (z. B.

Insertionen, Deletionen) des Gens und anschließende Selektion eindeutig definierter Mutanten. Ferner kann die Expression auf transkriptionaler und/oder tranlationaler Ebene verringert oder blockiert sein. Ebenfalls denkbar ist eine auf Proteinebene (posttranslational) verringerte katalytische Aktivität oder ein verändertes Bindungsverhalten von Effektoren (Aktivatoren oder Inhibitoren).

In einer besonderen Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung zeichnet sich der genetisch veränderte Organismus dadurch aus, daß dessen entA-Gen kodierend für die 2,3-Dihydroxybenzoatsyntase deletiert ist und dessen Gene entC und entB kodierend für die Isochorismatsynthase und Isochorismatase verstärkt exprimiert werden.

Erfindungsgemäß, ist dabei ein genetisch veränderter Organismus umfaßt, bei dem das entA-Gen vollständig oder partiell, bevorzugt über einem Bereich von wenigstens 1-99% und bevorzugt 5-90% deletiert ist und das entB-Gen verstärkt exprimiert wird und die Expression des entC-Gens, je nach gewünschtem Produkt, verstärkt oder vermindert wird. Ferner kann die Aktivität der Isochorismatsynthase kodiert durch entC auch auf translationaler und/oder posttranslationaler Ebene reguliert werden.

Hierbei sind Vorgehensweisen zur Antisense-Repression oder eine Hemmung mit spezifischen Effektoren denkbar.

In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung ist ein genetisch veränderter Organismus umfaßt, enthaltend wenigstens eines der Gene

entB und/oder entC und/oder Homologe davon, wobei die Gene sowohl aus homologen. als auch heterologen Organismen isoliert sein können.

Unter homologen Nukleotidsequenzen sind erfindungsgemäß, solche Sequenzen zu verstehen, die zu den Nukleotidsequenzen des verwendeten Wirtsorganismus komplementär sind und/oder mit diesen Nukleotidsequenzen hybridisieren. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein, die unter an sich bekannten stringenten Bedingungen eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den zuvor genannten Nukleotidsequenzen eingehen. Die in den erfindungsgemäßen Organismus eingebrachten Nukleotidsequenzen kodierend für die Gene entB oder entC können natürlich vorkommende Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenzen sein. Unter homologen Organismen sind solche zu verstehen, die einer verwandten Familie angehören.

Entsprechend repräsentieren heterologe Organismen weniger verwandte Vertreter.

Erfindungsgemäß zeichnet sich ein genetisch veränderter Organismus der zuvor beschriebenen Art dadurch aus, daß er durch eine verstärkte Expression des entC-Gens, zusammen mit der verstärkten Expression des entB-Gens in einer entA-Negativ-Mutante, vermehrt 2,3-trans-Dihydroxy- Cyclohexadien-Carbonsäure bildet.

In einer weiteren Varianten eines erfindungsgemäß genetisch veränderten Organismus zeichnet sich dieser dadurch aus, daß er aufgrund einer verminderten Expression des entC-Gens (bei gleichzeitiger verstärkter entB-Expression in einer entA-Negativ-Mutante) vermehrt 3,4-trans- Dihydroxy-Cyclohexadien-Carbonsäure bildet. Hierbei kann die verminderte Expression des entC-Gens beispielsweise durch eine

regulierbare Promotoraktivität erreicht werden, der das entC-Gen unterliegt. Diese Promotoraktivität kann leaky" sein, d. h. sie kann sehr gering sein, muR aber nicht zwingendermaßen zu einer 100% igen Blockade der Expression führen. Ferner ist eine Antisense-Represson des entC-Gens denkbar. Prinzipiell wird hierbei anhand der kodierenden entC- Gensequenz eine mRNA transkribiert, die dann mit einer entsprechenden antisense-mRNA hybridisiert und aufgrund dessen nicht translatiert werden kann, so daß das entC-Gen nicht zur Ausprägung kommt. Die entsprechende antisense-mRNA kann beispielsweise anhand eines Genkonstrukts enthaltend das entC-Gen in"antisense"-Orientierung unter Kontrolle eines, bevorzugt regulierbaren, Promotors gebildet werden, wobei dieses Genkonstrukt nach allgemein bekannten Methoden der Gentechnik hergestellt und in den erfindungsgemäß nicht pathogenen genetisch veränderten Organismus übertragen wird.

Generell sind alle an sich bekannten regulativen Elemente erfindungsgemäß erfaßt, die die Expression von Genen in den Wirtszellen kontrollieren können. Hierzu zählen neben Promotoren u. a. auch Enhancer oder Silencer.

Generell kann eine verringerte Isochorismatsynthase-Aktivität auch durch eine Regulation auf posttranslationaler Ebene zu einer erfindungsgemäß vermehrten Bildung von 3,4-trans-DCHC führen, beispielsweise durch die Zugabe von spezifische Effektoren zum Kulturansatz.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein genetisch veränderter Organismus, der ein Genkonstrukt enthält, das wenigstens einen regulierbaren Promotor aufweist, der am 5'-Ende mit dem entC- Strukturgen operativ verknüpft ist. Hierbei liegt das entC-Strukturgen in der sogenannten , sense"-Orientierung vor. Erfindungsgemäß umfaßt ist auch ein genetisch veränderter Organismus, enthaltend ein Genkonstrukt, welches selbst einen, bevorzugt regulierbaren, Promotor enthält, der

operativ mit einer entC-Nukleotidsequenz in"antisense"-Orientierung verknüpft ist.

Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden. Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern kann. Hierbei kann es sich erfindungsgemäß, auch um einen chemisch induzierbaren Promotor handeln, durch den die Expression der ihm unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann.

Beispielhaft sei hier ein durch IPTG (Isopropyl-ß-thiogalactosid) induzierbarer Promotor genannt.

Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit wenigstens einer Nukleotidsequenz nach gängigen Rekombinations-und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratury, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben sind. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz der zuvor beschriebenen Art, mit diesen operativ verknüpfte regulative Nukleotidsequenzen sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion transformierter Wirtszellen, für die Replikation innerhalb der Wirtszelle oder zur Integration in das

entsprechende Wirtszell-Genom. Ferner kann der erfindungsgemäße Vektor eine Genstruktur der vorgenannten Art enthalten.

Die genetischen Veränderungen des erfindungsgemäßen Organismus können chromosomal und/oder extrachromosomal, und hierbei bevorzugt plasmidkodiert, vorliegen.

Gegenstand der Erfindung sind ferner enantiomerenreine trans-Dihydroxy- Cyclohexadien-Carbonsäuren hergestellt durch ein Verfahren der zuvor genannten Art, die eine Säurekonstante pKs im Bereich zwischen 3 und 5 aufweisen und bei Raumtemperatur und einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 13, bevorzugt 5 bis 11, mit Zerfalikonstanten von weniger als 0,1 d~1 entsprechend einer Halbwertszeit von wenigstens 7 Tagen sehr stabil sind.

Erfindungsgemäß umfaßt ist außerdem die Verwendung der jeweiligen enantiomerenreinen trans-Dihydroxy-Cyclohexadien-Carbonsäure zur Herstellung von komplexen biologisch aktiven Stoffwechselmetaboliten, z.

B. Pflanzenmetaboliten, besonders bevorzugt Cyclohexandiol-Epoxiden und/oder von Kohlenhydratmimetika, höchst bevorzugt Carbazucker und insbesondere Amino-Carbazucker.

Die Verwendung von cis-Dihydroxy-Cyclohexadien-Carbonsäuren ist ebenfalls bekannt. Allerdings beruht die Darstellung der cis-DCHC auf einer oxidativen Dioxygenierung von Aromaten, welche in einem fermentativen Herstellungsprozeß dem Medium zugefügt werden müssen.

Durch die erfindungsgemäß fermentative Bereitstellung enantiomerenreiner trans-DCHC in hohen Ausbeuten eröffnen sich nun wesentlich wirtschaftlichere Möglichkeiten und z. T. völlig neue Wege der Natur-und Wirkstoffsynthese.

So können die erfindungsgemäßen trans-DCHC zum Beispiel als Ausgangsverbindungen zur Darstellung von Derivaten biologisch aktiver Stoffwechselmetabolite, z. B. Pflanzenmetabolite, verwendet werden.

Charakteristisch für die Stoffklasse dieser Metabolite ist das 2,3- Dihydroxycyclohexylmethanol-Grundgerüst, welches an 4-, 5-oder 6- Position epoxidiert ist. Bekannteste Vertreter sind u. a. Crotepoxid, iso- Crotepoxid, epi-Crotepoxid, Senepoxid, ß-Senepoxid, Pipoxid, Cyclophellitol, Boesenoxid und Tingtanoxid, die in Fig. 7 dargestellt sind.

Für diese Stoffklassen konnte gezeigt werden, daß sie als Kohlenhydratmimetika inhibitorische Wirkung, z. B. Tumor-inhibitorische Wirkung auf verschiedenartige Karzinome, zeigen und somit für die pharmazeutische Anwendung potentiell geeignet sind. Die Darstellung erfolgt bislang durch aufwendige chemische Synthesen mit den bekannten Nachteilen, wie hoher Kosten und Zeitaufwand, geringe Enantioselektivität, um nur die wichtigsten zu nennen. Bei diesen Synthesen treten als Zwischenverbindungen auch Derivate der trans- DCHC auf. Eine Übersicht über wichtige Synthesen der Cyclohexandiol- Epoxid-Pflanzenmetabolite, bei denen ein 2,3-trans-DCHC-Derivat jeweils eine Schlüsselsubstanz darstellt ist in Fig. 8 dargestellt. Die erfindungsgemäße Bereitstellung der trans-DCHC ermöglicht somit ein weites Einsatzspektrum dieser Verbindungen und trägt zu wesentlichen Vereinfachungen der aufwendigen Synthesen komplexer Natur-und Wirkstoffe bei, da die Synthesen nun direkt von den fermentativ hergestellten erfindungsgemäßen trans-DCHC ausgehen können und vorausgehende aufwendige Synthese-und Aufreinigungsschritte zur Bereitstellung der trans-DCHC aufgrund der vorliegenden Erfindung nicht mehr erforderlich sind und entfallen. Die vorliegende Erfindung birgt somit ein enormes wirtschaftliches Potential in sich.

Darüber hinaus ist ausgehend von den erfindungsgemäßen trans-DCHC auch die Synthese von Carbazuckern und insbesondere Amino-

Carbazuckern möglich, die ebenfalls als Kohlenhydratmimetika ein hohes pharmazeutisches Potential besitzen. Wichtige Vertreter dieser Stoffklasse sind z. B. Valienamine (Fig. 9).

Valienamin-Derivate sind insbesondere als Ausgangsstoffe zur Synthese von Kohlenhydrat-Mimetika, wie z. B. Acarbose oder Voglibose, welche u. a. als a-Glucosidaseinhibitor zur Bekämpfung von Altersdiabetes oder Fettsüchtigkeit Einsatz finden, höchst interessant.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung der trans-DCHC (z. B. gebunden an einen polymeren Träger) zur Identifizierung und/oder Darstellung weiterer Wirkstoffe, z. B.

Polysaccharid-Mimetika und/oder zum Aufbau von Substanzbibliotheken, z. B. für sogenannte"high throughput screening"-Experimente.

Als weitere Verwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen trans- DCHC ist ein großes Spektrum an biologisch aktiven Substanzen denkbar, wie z. B. die Wirkstoffklasse der Immunosuppressiva oder Antitumor- Pharmaka um nur einige zu nennen. Eine Auswahl solcher Verbindungen ist in Fig. 10 dargestellt.

Darüber hinaus ist ausgehend von den erfindungsgemäßen trans-DCHC eine weitere Vielzahl an komplexen Verbindungen darstellbar, die hier allgemein als Folgechemie bezeichnet wird. Hierbei ist erfindungsgemäß insbesondere eine gezielte Reaktionsführung, z. B. durch selektive Reduzierung der Carboxylgruppe, selektive Epoxidierung der Doppelbindungen und/oder weitere Folgemodifikationen möglich. Ein Ausblick denkbarer folgechemischer Verbindungen sind am Beispiel der erfindungsgemäßen 2,3-trans-DCHC als Ausgangssubstanz in Fig. 11 zusammengefaßt.

Die nachfolgenden Ausführungsbeipiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern, ohne jedoch limitiernd zu wirken.

1. Aligemeine genetische Techniken : Die Isolierung von genomischer DNA und Plasmid-DNA sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow-und alkalische Phosphatasebehandlung, ferner Methoden zur Klonierung und Sequenzierung und Amplifikation (PCR) von DNA sowie die Transformation, Kultivierung und Selektion von Wirtszellen wurden nach Sambrook, J. et al. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1998) durchgeführt.

2. Isolierung der Gene entB und entC und Klonierung in den Expressionsvektor pJF119EH1 : Die Isolierung der Gene enfß und entC erfolgte aus E. coli Stamm W3110 (J. Lederberg, Yale University, USA). Eine Beschreibung dieses Wildstammes findet sich bei C. W. Hill, B. W. Harnish, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 1981,78,7069-7072. Die Präparation der chromosomalen DNA erfolgte gemäß einem Standardprotokoll aus R. Süßmund, J. Eberspächer, R. Haag, W. Springer, Mikrobiologisch-Biochemisches Praktikum, 2. Auflage, Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 1999. Von der chromosomalen DNA wurde entB durch PCR amplifiziert. Die verwendeten Oligonucleotide waren TAT GGA TCC ACG CGC ATC AGC CTG AA und GGG CTG CAG ACA TTT TTA CCG CTG. Die PCR- Bedingungen waren : Denaturieren 5 min (94 °C), 34 Zyklen :- Denaturieren 4 min (94 °C), Annealen 2 min (57 °C), Prolongieren 1.5 min (75 °C)-, Halten 7 min (75 °C), Kühlen auf 4 °C. Das amplifizierte entB- Fragment (855 bp) wurde durch Gelelektrophorese (0.8 % Agarose-Gel, Ethidiumbromid-Detektion) isoliert und durch Affinitätschromatographie gereinigt (Qiagen Extraction Kid, Qiagen). Das Fragment wurde mit den Endonucleasen BamHl und Pstl geschnitten und gereinigt durch lonentauscherchromatographie (midi-Kid, Qiagen).

Das Gen entC wurde auf entsprechende Weise generiert. Mit chromosomaler DNA aus E. coli W3110 wurde eine PCR mit den Oligonucleotiden GGC GAG CTC ATT ATT AAA GCC TTT und TGC GGA TCC TCG CTC CTT ATT GC durchgeführt. Die PCR-Bedingungen waren : 2 min (94 °C), 10 Zyklen :-Denaturieren 0.5 min (94 °C), Annalen 0.75 min (40 °C), Prolongieren 1 min (72 °C)-, 20 Zyklen :-Denaturieren 0.5 min (94 °C), Annealen 0.75 min (55 °C), Prolongieren 1 min + 10 sec/Zyklus (72 °C)-, Kühlen auf 4 °C.

Das DNA-Produkt (1220 bp) wurde wie entB elektrophoretisch gereinigt und extrahiert. Das Produkt wurde mit den Endonucleasen BamHl und Sacl geschnitten und durch lonentauscherchromatographie gereinigt.

Konstruktion der Plasmide pDF1 und pDF2 Das entB Gen wurde mit T4 DNA-Ligase in den geschnittenen Vektor pJF119EH1 (Fürste, J. P. et al., Gene, 1986,48 : 119-131) ligiert (Schnittstellen BamHl, Pstl). Das Plasmid wurde in den Klonier-und Expressionsstamm E coli DH5a transformiert und anschließend auf Agar- Platten (LB, 100 mg/l Ampicillin) zu Einzelkolonien kultiviert. Das Plasmid pDF1 (pJF119EH1 mit Insert entB) wurde selektiert und durch eine Restriktionsanalyse verifiziert.

In analoger Weise wurde das entC-Gen in den geschnittenen Vektor pDF1 (Schnittstellen Pstl, Sacl) insertiert. Verifikation des DNA-Produktes erfolgte wieder durch Restriktionsanalyse. Mit beiden Plasmiden wurden entlang der inserierten Gene eine Sequenzierung durchgeführt. Eine Illustration der Plasmidkonstruktion ist in Fig. 5 dargestellt.

Die Plasmide wurden in die E. coli-Stämme AN193 und H1882 transformiert. Die Expression von aktiven Proteinen wurde durch SDS- PAGE und Enzymaktivitätstests bestätigt. Die verwendeten E. coli- Stämme sind wie folgt charakterisiert : Der Stamm AN193 entspricht Elter AB1515, hat jedoch eine Anzahl an Deletionen (trp leu proC lac fhuA rpsL entA403). Der Stamm AN193 ist

beschrieben bei G. B. Cox et al., J. Bacteriol. 1970,104,219-226 und in B. A. Ozenberger, T. J. Brickman, M. A. Mdntosh, J. Bacteriol. 1989,171, 775-783. Der Stamm H1882 entspricht dem Stamm MC4100 (DSM 6574, ATCC 35695), hat aber die Dihydroxybenzoatsynthase-Defizienz (A (fepA- ent)). Nähere Beschreibung zu dem Stamm MC4100 findet sich bei M. J.

Casadaban, J. Mol. Biol. 1976,104,541-555 und bei M. J. Casadaban, S.

N. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci USA 1979,76,4530-4533, sowie bei Y.

Komeda, T. lino, J. Bacteriol 1979, 139, 721-729.

3. Fermentation zur Herstellung von trans-DCHC : 100 ut einer 50 %-Glycerin-Kultur (feed-stock) des Stammes AN193/pDF2 dient zur Inokulation von Vorkultur 1 bestehend aus 5 ml Hefeextraktmedium (Hefeextrakt 5 gel, Caseinpepton 10 g/I, NaCI 5 g/l, Ampicillin 100 mg/l) in einem 20 mi Reagenzglas. Die Zellen wurden kultiviert bei 37 °C unter Schütteln (150 rpm) für 12 h. Mit 500 pi von Vorkultur 1 wurde das Medium für Vorkultur 2 inokuliert, bestehend aus 3 x 100 ml Hefeextraktmedium (Hefeextrakt 5 g/I, Caseinpepton 10 g/i, NaCI 5 g/I, Ampicillin 100 mg/1) in 1 Liter schikanierten Schüttelkolben.

Kultivierung der Zellen erfolgte bei 37 °C unter Schütteln (150 rpm) für 12 h. Vorkultur 2 wurde überführt in einen 7.5 Liter belüfteten und pH- kontrollierten Rührkesselreaktor mit 5 Liter steril-filtriertem Hauptkulturmedium (KH2PO4 13 g/I, K2HPO4 10 g/I, NaH2PO4#2h2O 6#g/l, (NH4) 2PO4 2 g/I, NH4Cl 0.2 g/l, MgSO4#7H2O 3 g/I, Spurenlösung 1 ml/l, Ampicillin 100 mg/l, Thiamin 20 mg/l, Leucin 20 mg/i, Prolin 20 mg/l, Adenin 20 mg/l, Tryptophan 20 mg/l, 2,3-Dihydroxybenzoesäure 20 mg/l, Glucose 30 g/l).

Die Spurenlösung enthielt in 5 N HCI-Lösung gelöst : FeS047H20 40g/l, CaCl2H2O 40 g/l, MnS04nH20 10 g/l, AlCl36H2O 10 g/l, COC12 4 g/l, ZnS047H20 2 g/l, Na2MoO4H2O 2 g/l CuCl2#2H2O 1 g/l, H3BO3 0.5 g/l.

Die Fermentation wurde mit einem Gasstrom von 4.03 I/min belüftet. Der pH wurde mit 25 % wäßriger Ammoniaklösung auf 7.0 geregelt. Die

Temperatur wurde auf 37 °C eingestellt. Die Rührgeschwindigkeit betrug 500 rpm. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wurde durch Regulation der Zuluft und der Rührdrehzahl auf größer 20 % Luftsättigung eingestellt. Antischaum AF 298 (Sigma) wurde bei Bedarf zugegeben.

Nach Erreichen einer Biotrockenmassen von 6 g/l wurde IPTG (132 mg in 5 ml Wasser) zur Induktion steril-filtriert zugegeben. Nach Verbrauch der Anfangsgiucose wird ein sterilisiertes Glucosekonzentrat (700 g/I) zugefüttert. Der Flow betrug 0.17 ml/min. Die Konzentration an 2,3-trans- DCHC betrug nach 50 h Prozeßzeit 930 mg/ ! (6 mM).

Durch weitere Optimierung der Medienzusammensetzung, beispielsweise durch Erhöhung der Ammoniumkonzentration und Optimierung der Fermentationsbedingungen, insbesondere des pH-Wertes und der Temperatur, kann eine Erhöhung der Biotrockenmasse (über 20 g/l BTM) erzielt werden. Mit höheren Biotrockenmassen können höhere Produktbildungsraten (größer 60 mgl-1h-1g (BTM) ~1), einhergehend mit höheren Produkttiter (über 5 g/l für 2,3-trans-DCHC mit Stamm AN193/pDF2) erreicht werden. Eine Erhöhung der Biotrockenmassen kann insbesondere auch dadurch erreicht werden, daß nach oder während der Wachstumsphase statt Glucose andere Kohlenstoffquellen zur Produktion von trans-DCHC eingesetzt werden, insbesondere D- Galactose oder Glycerin.

Die Prozeßdaten einer beispielhaften Fermentation unter weiter optimierten Bedingungen ist in Fig. 6 zu sehen.

4. Reaktivextraktion der 2, 3-trans-DCHC und Abtrennung der Salzfracht : Der kationische Carrier Aliquante 336 wurde zu 5 Vol.-% in dem organischen Lösungsmittel 1-Octanol bei pH 7 gelöst und zur Extraktion der gebildeten 2,3-trans-DCHC aus dem Kulturmedium (Fermentationspermeat) eingesetzt.

Die Reextraktion (Ruck-Extraktion) von 2,3-trans-DCHC erfolgte mit gesättigter Natriumchloridlösung bei pH 7.

Die Reinphase der Reaktivextraktion enthält neben den trans-DCHC größere Mengen Salze in wäßriger Lösung. Durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln faßt sich das Produkt quantitativ von der Salzfracht trennen. Dies erfolgte mit 1-Butanol bei pH 3, wobei Extraktionskoeffizienten von wenigstens 30 % erreicht wurden. Nach dem Trocknen des Produktes mit Magnesiumsulfat über Nacht, anschließende Filtration und Trocknung im Vakuum wird das Produkt salz-und wasserfrei erhalten. Im 1H-NMR-und 13C-NMR-Spektrum des so erhaltenen weiß- gelben Feststoffes sind keine Verunreinigungen, insbesondere durch Chorismat und/oder Isochorismat, festzustellen.

5. Isolierung der 2,3-trans-DCHC durch Adsorption und Desorption : 2,2 I der Kulturlösung werden nach der Fermentation durch Zentrifugation von festen partikulären Bestandteilen befreit und auf einen pH-Wert von 8 und eine Leitfähigkeit von 13,5 mS/cm eingestellt. Als Adsorber werden 530 ml DOWEX 1x8 (CL-Form, 100-200 Mesh) in eine Säule zu 27 cm sedimentierter Bettlänge gefüllt und mit 50 mM Di- Kaliumhydrogenphosphatpuffer (pH 8) equilibriert. Der Adsorber wird mit 2,2 I der Kulturlösung bei 2,4 x 10-4 m/s beladen. Nach erfolgter Beladung wird mit dem 5-fachem Säulenvolumen an 50 mM Di- Kaliumhydrogenphosphatpuffer (pH 8) bei gleicher Fließgeschwindigkeit gewaschen. Anschließend erfolgt die Desorption bei gleicher Fließgeschwindigkeit mit dem 8-fachen Säulenvolumen 50 mM Ameisensäure. Die erhaltene Desoptionsfraktion wird gefriergetrocknet.

Bei einer Analyse durch H-NMR und HPLC-Chromatographie des erhaltenen Feststoffes sind keine Verunreinigungen festzustellen.

Legende zu den Figuren : Fig. 1 : Strukturformeln der trans-Dihydroxy-Cyclohexadien-Carbonsäure- Stereoisomere. Dargestellt sind (5S, 6S)-Dihydroxy-cyclohexa-1, 3- diencarbonsäure und (3R, 4R)-Dihydroxy-cyclohexy-1, 5- diencarbonsäure.

Fig. 2 : Übersicht über den Shikimatbiosyntheseweg. Chorismat ist Schlüsselsubstanz der Biosynthese der aromatischen Aminosäuren, des Chelatbildners Enterobactin sowie der Folate, der Menaquinone und der Ubiquinone.

Fig. 3 : Biosyntheseweg von Chorismat zu 2,3-trans-DCHC (über lsochorismat) und 3,4-trans-DCHC, entC kodiert lsochorismatsynthase, enfß kodiert Isochorismatase, entA kodiert 2,3-Dihydroxybenzoatsynthase.

Fig. 4 : Aufreinigung von trans-DCHC durch Reaktivextraktion. Die organische Phase dient als sogenannte"selektive Drehtür"zur Produktextraktion. trans-DCHC werden aus der wässerigen Phase als lipophiles lonenpaar Carrier-DCHC durch die organische Phase in die wäßrige Produktphase transportiert. Triebkraft der Anreicherung der trans-DCHC in der Produktphase ist das Konzentrationsgefälle an Gegenionen. Der Ladungsausgleich beider Phasen erfolgt durch Rücktransport des Chlorids.

Fig. 5 : Schematische Darstellung der Konstruktion der Plasmide pDF1 und pDF2.

Fig. 6 : Beispiel einer Fermentation von E coli Stamm AN193 mit Plasmid pDF2 zur Produktion von 2,3-trans-DCHC. Dargestellt ist der

zeitliche Verlauf der Biotrockenmasse, der Glucosekonzentration und des Produkttiters.

Fig. 7 : Strukturformeln biologisch aktiver Pflanzenmetabolite. Die Grundstruktur des 2,3-Dihydroxy-cyclohexylmethanol-Gerüst mit trans-ständiger, vicinaler Diol-Einheit ist in allen Stubstanzen enthalten.

Fig. 8 : Übersicht über wichtige Synthesen der Cyclohexandiol-Epoxid- Pflanzenmetabolite. Schlüssèlsubstanz ist jeweils ein Derivat der 2,3-trans-DCHC.

Fig. 9 : Übersicht von Strukturformeln der Stoffklasse der Amino- Carbazucker.

Fig. 10 : Übersicht von Strukturformeln weiterer Zielklassen.

Fig. 11 : Übersicht von allgemeinen Strukturformeln von Ziel-Verbindungen (Folgechemie), die ausgehend von den erfindungsgemäßen trans- DCHC gezielt, d. h. durch selektive Reduktion, Epoxidierung und Modifikation hergestellt werden können. Beispielhaft ist als Ausgangssubstanz eine 2,3-trans-Dihydroxy-Cyclohexadien- Carbonsäure dargestellt.