技术领域

本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程 领域。 具体地说， 本发明涉及昆虫体 内一批新的靶基因， 可以通过植物介导的 RNAi技术特异地抑制昆虫体内这些靶基因的 表达， 进而抑制昆虫的生长， 提高植物的抗虫性。 本发明公开了这些靶基因的序列， 以 及它们在 RNAi介导的转基因抗虫领域中的应用。 背景技术

在农业生产中， 虫害一直是影响农作物产量的一个重要因素。 人们每年要投入大量 的人力、 物力来抑制虫害， 以提高作物产量。 大量施用农药造成了环境的严重污染， 严

:€破坏了农田生物多样性， 农药残留也逐渐成为威胁人类健康的一个重要 因素。 同时， 长期施用农药使害虫对农药抗性增加，导致需 要不断增加农药使用量，并改变农药种类， 导致环境问题更加严重。 出于保护环境和可持续性发展的考虑， 迫切需要建立新的抗虫 方法。

向植物中转入抗虫基因， 如 Bt基因， 使植物产生能杀虫的蛋白， 可以显著提髙植物 的抗虫性， 同时减少农药使用。 目前转基因抗虫大豆、 Bt抗虫棉等已在农业生产中广泛 使用， 带来了良好的经济和社会效益。 目前己发现随着时间的推移， 各种转基因抗虫植 物的抗虫性正在下降， 并且由于专一地抑制田间某一种害虫， 导致其他害虫开始泛滥。 因此， 需要找到新的方法， 幵发出新型的转基因抗虫植物， 以有效地和 /或特异性地对抗 植物的病虫害。 发明内容

本发明的目的在于提供一种提高植物抗虫能力 的方法。

在本发明的第一方面， 提供一种提髙植物抗昆虫能力的方法， 所述方法包括： 在植 物体内表达特异性干扰所述昆虫基因 (或其片段)表达的干扰分子；

所述的昆虫基因选自： 胰蛋白酶基因、 多巴脱羧酶基因、 NADH脱氢酶基因、 ATP 合成酶 β亚基基因、 肌球蛋白重链 Β亚型基因。

在另一优选例中， 昆虫取食该植物 (转基因植物)后， 休内该昆虫基因或片段表达被下 调或沉默， 生长或发育受到抑制或^死亡。

在另一优选例中， 所述的干扰分子选自（但不限于)： 以所述的昆虫基因或其片段或其 转录本为抑制或沉默靶标的 dsRNA、 反义核 (苷)酸、 小干扰 RNA、 微小 RNA。

在另一优选例中， 所述方法包括：

( 1 ) 提供一构建物， 所述构建物含有以下结构：

Seq -X-Seq

其中， Seq «为来 所述的昆虫基因或片段的核苷酸序列， Seq ^与 Seq ^为基本上 互补的核苷酸序列；

X为位于 Seq ^和 Seq _{S i5} 之间的间隔序列， 并且所述间隔序列与 Seq ^和 Seq 向不 互补；

(2) 将 ( 1 )的构建物转化植物。

在另一优选例中， 所述的间隔序列的长度为 30-300nt; 较佳地为 50-200 nt _; 更佳地 为 100-150 nt

在另一优选例中， 所述的 Seq 或 Seq 的长度为至少 18bp， 较佳地至少 20bp _: 更 佳地至少 50bp ; 更佳地至少 l OObp ; 更佳地为 100-700bp ; 更佳地为 200-600bp

在另一优选例中， 所述的构建物在转入植物后， 在植物细胞、 组织或器官中表达形 成式 II所示的干扰分子，

Seq正向

' ' X

Seq反向 ^

式中，

Seq Seq 反向和 X的定义如上述，

II 表示在 Seq M和 Seq 之间形成的氢键。

在另一优选例中， 步骤 (2)包括：

(a) 提供携带表达载休的农杆菌， 所述的表达载体含有（1 )所述的构建物；

(b) 将植物细胞、组织或器官与步骤 (a)中的农杆菌接触， 从而使所述构建物转入植物 细胞、 组织或器官。

在另一优选例中， 所述方法还包括- (c) 选抒出转入所述构建物的植物细胞、 组织或器官；

(d) 将步骤 （c) 中的植物细胞、 组织或器官再生成植株。

在另一优选例中， 所述的构建物位于表达载休上。

在另一优选例中， 所述的表达载休还包含能在植物中转录的启动 子、 终止子等操作 性连接的元件。

在另一优选例中， 所述的 Seq 选自：

SEQ ID NO: 1 (trypsin precursor, 棉铃虫胰蛋白酶基因）或其中第 1 -576位的序列； SEQ ID NO: 2(dopa decarboxylase, 棉铃虫多巴脱羧酶基因）或其中第 31 1 -621位的序 列；

SEQ ID NO: 3(NADH dehydrogenase ubiquinone flavoprotein,棉铃虫 NADH脱氢酶基 因）或其中第 297-771位的序列或其中第 501 -899位的序列；

SEQ ID NO: 4(ATP synthase beta, 棉铃虫 ATP合成酶 β亚基基因）或其中第 203-630 位的序列；

SEQ ID NO: 5 (Myosin heavy chain , isoform B，棉铃虫肌球蛋白重链 B亚型基因）或其 中第 372-662位的序列； 或 SEQ ID NO:8(欧洲 米螟的 NADH脱- ¾酶 因， NADH dehydrogenase ubiquinone flavoprotein)或其屮笫 25 1 -643位的序列。

在另一优选例中， 所述的植物选自： 双子叶植物、 单子叶植物、 或裸子植物。

在另一优选例中， 所述的单子叶植物选 _: 玉米、 水稻、 小麦、 大麦、 髙梁等。 在另一优选例中， 所述的双子叶植物选 (^： I·字花科、 锦葵科、 茄科等。

在另一优选例中， 所述的双孓 -叶植物选 棉花、 大豆、 油菜、 花牛:等。

在另一优选例中， 所述的昆虫选自： 植食性昆虫。

在另一优选例中， 所述的植食性昆虫是鳞翅目昆虫、 同翅目昆虫、 弹尾目昆虫、 等 翅目昆虫、 鞘翅目昆虫、 双翅目昆虫、 膜翅 S昆虫、 直翅目昆虫、 半翅目昆虫、 缕翅目 β虫。

在另一优选例中， 所述的植食性昆虫是棉铃虫、 玉米螟、 蚜虫、 稻飞虱、 大豆食心 虫等。

在另一优选例中， 所述的昆虫基因是棉铃虫的基因、 玉米螟的基因、 蚜虫的基因、 稻飞虱的基因。

一优选例屮， 针对一种昆虫（如棉铃虫）的防治， ntt物体内表达特讦性千扰该 虫：.源的 B虫 ffi[¾] ( //!!* ίι棉泠虫的 ι-λ'ΐ ) ^达的丁扰^了-。 Γ 食件. ί¾虫 m的 ff-列 ― 一致忡 ， 来 1' I小同昆虫的 ^ ( 同为 AT P合成 m ¾ w )―.般 it fi n i 的保 n 位 ^(W ij ii够 t _; 隱, 作为另一优选例， 计对 -种昆虫的防治, nw物休内表达特 异性 Γ扰 in ffi l来源的 ¾虫¾闪（ 虫屮存在 -k/所述的" il:该 虫^源的 iU.½ | ! " ί {■列 · fi性 _t ¾删源 ½ )表达的 T扰分 V。

在本发明的另一方面， 提供一种生产转基因植物的方法， 所述转基因植物具有改良 的抗虫性， 该方法包括在植物休内表达特异性千扰所述昆 虫基因表达的千扰分子； 所述的昆虫基因选 胰蛋白酶基因、 多巴脱羧酶基因、 NADH脱氢酶基因、 ATP 合成酶 β亚基基因、 肌球蛋白重链 Β亚型基因。

在本发明的另一方面， 提供由所述方法制备获得的具有抗虫能力的植 物。

在本发明的另一方面， 提供昆虫基因或其片段的用途， 用于作为制备特异性干扰昆虫 基因表达的千扰分子的抑制或沉默靶标； 所述的昆虫基因选自： 胰蛋白酶基因、 多巴脱 羧酶基因、 NADH脱氢酶基因、 ATP合成酶 β亚基基因、 肌球蛋白重链 Β亚型基因。

在另一优选例中， 所述的昆虫基因是棉铃虫的基因、 玉米螟的基因、 蚜虫的基因、 稻飞虱的基因。

在本发明的另一方面， 提供一种构建物， 所述构建物含有以下结构-

Seq -X-Seq

其中， Seq 为来自所述的昆虫基因或其片段的核苷酸序列 ， Seq ^与 Seq 为基本 h:互补的核苷酸序列；

X为位于 Seq ^和 Seq 之间的间隔序列， 并且所述间隔序列与 Seq ^和 Seq _{S fi} 不 互补；

所述的昆虫基因选自： 胰蛋白酶基因、 多巴脱羧酶基因、 NADH脱氢酶基因、 ATP 合成酶 β亚基基因、 肌球蛋白重链 Β亚型基因。

在另一优选例中， 所述的昆虫基因是棉铃虫的基因、 玉米螟的基因、 蚜虫的基因、 稻飞虱的基因。

在本发明的另一方面， 提供所述的构建物的用途， 用于制备具有抗虫能力的植物。 在本发明的另一方面， 提供一种特异性干扰昆虫基因表达的干扰分子 在植物抗虫中 的用途； 所述的昆虫基因选自： 胰蛋白酶基因、 多巴脱羧酶基因、 NADH脱氢酶基因、

ΑΤΡ合成酶 β亚基基因、 肌球蛋白重链 Β亚型基因。

在另一优选例中， 所述的昆虫基因是棉铃虫的基因、 玉米螟的基因、 蚜虫的基因、 稻飞虱的基因。

在本发明的另一方面， 提供一种作为干扰分子抑制或沉默靶标的昆虫 基因片段， 选

SEQ ID NO: 1 (trypsin precursor)中第 1 -576位的序列；

SEQ ID NO: 2(dopa decarboxylase)中第 31 1 -621位的序列；

SEQ ID NO: 3 (NADH dehydrogenase ubiquinone flavoprotein)中第 297-771位的序列；

SEQ ID NO: 4 (ATP synthase beta)中第 203-630位的序列；

SEQ ID NO: 5 (Myosin heavy chain , i so form B)中第 372-662位的序列。

SEQ ID NO: 3 (NADH dehydrogenase ubiquinone flavoprotein)中第 501 -899位的序列； 或

SEQ ID NO:8(NADH dehydrogenase ubiquinone flavoprotein)中第 251 -643位的序列。 在本发明的另一方面， 提供一种植物细胞， 所述的植物细胞表达特异性干扰昆虫基因 表达的干扰分子；

所述的昆虫基因选自： 胰蛋白酶基因、 多巴脱羧酶基因、 NADH脱氢酶基因、 ATP 合成酶 13亚基基因、 肌球蛋白重链 B亚型基因。

在另一优选例中， 所述的昆虫基因是棉铃虫的基因、 玉米螟的基因、 蚜虫的基因、 稆飞虱的基因。

在另一优选例中， 所述植物细胞为不能借助光合作用以及营养物 质直接生成植物的细 胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而 是显而易见的。 附图说明

图 1、 本发明中 dsRNA 载体以及 VIGS载休的构建示意图。 图 2、 Northern 印迹或 RT-PCR检测转基因拟南芥中胰蛋白酶、 多巴脱羧酶、 NADH 脱氢酶、 ATP 合成酶 β亚基、 肌球蛋白重链 Β亚型 5个基因的 dsRNA表达情况。 图 2A为 Northern印迹检测表达含 NADH dehydrogenase序列 dsRNA(dsWXM-12)的 转基因拟南芥 (12-2， 5, 6， 7， 8)的结果。 WT表示野生型植物对照， 具有印迹的泳道表 示对应的植物中表达了相应的 dsRNA。

图 2B为 RT-PCR检测表达含 NADH dehydrogenase序列 dsRNA(dsWXM-12)的转基因 拟南芥（12-13， 14， 15, 16， 17， 18)的结果。 WT表示野生型植物对照， 具有专一条带 的泳道表示对应的植物中表达了相应的 dsRNA。

图 2C为 Northern印迹检测表达含 ttypsiti precursor序列 dsRNA(dsWXM-2)的转基因 拟南芥 (2-1， 2， 3， 4)的结果。 WT表示野生型植物对照， 具有印迹的泳道表示对应的植 物中表达了相应的 dsRNA。

图 2D为 RT-PCR检测表达含 i/o/¾7 i/erar6ox_y/o^(dsWXM-6)的转基因拟南芥 (6-2， 3,

4, 5)结果。 WT表示野生型植物对照， 具有专一条带的泳道表示对应的植物中表达了 相 应的 dsRNA。

图 2E为 RT-PCR检测表达含 6eto(dsWXM-25)的转基因拟南芥 (2， 5， 9， 10)结果。 WT表示野生型植物对照， 具有专一条带的泳道表示对应的植物中表达了 相应 的 dsRNA。

图 2F为 RT-PCR检测表达含 M «/ 7/7eav_yc/?a/«(dsWXM-E)的转基因拟南芥 (E-1, 2，

7， 8， 10)结果。 WT表示野生型植物对照， 具有专一条带的泳道表示对应的植物中表达 了相应的 dsRNA。

3：表达 dsWXM-12载休的转基因棉花 PCR鉴 以及 RT-PCR检测 dsRNA表达情 况, >

图 3A为 DNA检测含冇 dswxm-12/2301的转基因棉花 (R15, 9, 10， 15， 16， 21， 22, 27， 145-1, 145-2， 145-3， 165-1， 165-2)的结果。 RI 5是转基因棉花受休材料， 具有专 一条带的泳道表示对应的棉花中含有 dswxm-12/2301载休。

图 3B为 RT-PCR检测表达含 NADH dehydrogenase序列 dswxm-12/230】的转基因棉 花的结果 (R15, 10， 16， 21, 27, 145-1, 165-1)。 专一条带的泳道表示对应的棺物屮表 达了相应的 dsRNA。

图 3C为 RT-PCR随机检测 5株烟草病毒感染的结果 (CK， 1， 2， 3， 4， 5)。 专一条 带泳道表示对应的植物屮表达了 TR V 1。 图 4、 饲喂转基因拟南芥 3-7天后， 棉铃虫的体重情况。

图 4A 为三日龄棉铃虫 (每组 6 头棉铃虫， i复 3 组， 共 】8 头棉铃虫)喂 WT 和 dsWXM-121i _ne 2 (12-2)三天后，称 S后计算其休重增加， 取平均值后做为纵坐标。可见， 在喂食 12-2后，棉铃虫体重的增加明显慢于喂食 WT的情况， 而喂食转入针对其他基因 的 dsRNA拟南芥（图屮的 1,5,8,11,20指的是 WXM-1,5，8,11,20)的棉铃虫休重没有明显变 化。

图 4B 为三日龄棉铃虫 (每组 6 头棉铃虫， 3 组， 共 18 头棉铃虫)喂 WT 和 dsWXM-】 2 line〗 8(】 2- 1 8)三到七天后，称 S后计算其休 i增加，取平均值后做为纵坐标。。 可见， 在喂食 12-18后， 棉铃虫休重的增加明显慢于喂食 WT的情况。 而喂食转入针对 其他基因的 dsRNA拟南芥 (图中的 27指的是 WXM-27)的棉铃虫休重没有明显变化。

图 4C为三日龄棉铃虫 (每组 6头棉铃虫，重复 3组，共 1 8头棉铃虫)喂 WT和 dsWXM-2 line 4 (2-4)三天后， 称重后计算其休重增加， 取平均值后做为纵坐标。 可见， 在喂食 2-4 后， 棉铃虫休重的增加慢于喂食 WT的情况。

图 4D为三日龄棉铃虫 (每组 6头棉铃虫， S复 3组，共 18头棉铃虫)喂 WT和 dsWXM-6 line 2 (6-2)四天后， 称重后计算其休重增加， 取平均值后做为纵^标。 可见， 在喂食 6-2 后， 棉铃虫休重的增加慢于喂食 WT的情况。

图 4E为三日龄棉铃虫 (每组 6头棉铃虫，至 ¾ 3组，共 1 8头棉铃虫)喂 WT和 dsWXM-E line 2 (E-2) 、 dsWXM-25 line 2 (25-2) 四天后， 称重后计算其休重增加， 取平均值后做 为纵坐标。 可见， 在喂食 E-2和 25-2后， 棉铃虫休重的增加慢于喂食 WT的情况。 图 5、 饲喂转基因拟南芥 3-7天后棉铃虫体内相应基因的表达情况。

图 5A为在喂食 dsWXM-12 line 2 (12-2)三天后， 棉铃虫肠内 NADH dehydrogenase的 转录明显低于喂食 WT的情况。

图 5B为在喂食 dsWXM-12 line 18 ( 12-1 8)七天后， 棉铃虫肠内 NADH dehydrogenase 的转录明显低于喂食 WT的情况。

图 5C为在喂食 dsWXM-E line 2 (E-2)四天后，棉铃虫肠内 Myosin heavy chain的转录 明显低于喂食 WT的情况。 图 6、词喂 dsWXM-12/2301的转基因棉花和 dsWXM-12/TRV2、dsWXM- l 2(501 )/TRV2 和 ds _WX m- _C orn/TRV2的烟草后， 棉铃虫死亡牛.和休重的变化， 以及饲喂卫米螟含相应基 因的烟草后， 玉米螟死亡宇.的变化

阁 6 A 为二 R龄棉铃虫 (每组 6 头棉铃虫， £复 3 组， 共 1 8 头棉铃虫)喂 R1 5 和 dswxm- 12/2301转: 因棉花五大后统计 ¾ ^亡申.。 可见在喂食 dswxm-12/2301转基因棉 花 天后， 取食转基因棉花的棉铃虫死亡率 ¾高于取食未转基因棉花材料的对照组。

m 6B 为二日龄棉铃虫 (每组 6 头棉铃虫， 重复 3 组， 共 18 头棉铃虫)喂 WT 和 dswxm- 12/2301转基因棉花五天后统计其死亡率。 可见在喂食 dswxm-12/2301五天后， 取食转基因棉花的棉铃虫死亡宇.明显高于取� �未转基因棉花材料的对照组。

m 6C 为二日龄棉铃虫（每组 6 头棉铃虫， 重复 3 组， 共 18 头棉铃虫）取食含 dswxm- 12/TRV2病毒感染的烟草，五大后称重计算其休� �增加，取平均值后做为纵坐标。 可见， 在喂食 dswxm- 12/TRV2后， 棉铃虫（ 12V2)休 £的增加明显慢于喂食 WT的情况。 6D 为三日龄棉铃虫（每组 6 头棉铃虫， 重复 3 组， 共 18 头棉铃虫）取食含 dswxm-12(501 )/TRV2 病毒感染的烟草， fi.天后称重计算其休重增加， 取平均值后做为 纵 标。 可见， 在喂食 dswxm- 12(501 )/TRV2后， 棉铃虫休重的增加明 慢于喂食 WT 的情况。

m 6E 为二日龄玉米螟 (每组 6 头卫米螟， 重复 3 组， 共 18 头玉米螟)喂 WT 和 dswxm-corn/TRV2(玉米螟屮 NADH dehydrogenase同源基因） VIGS烟草 天后统计其死 亡 。可见在喂食 dswxm-corn/TRV2三大后，取食含 dswxm-corn/TRV2的 VIGS烟草的 玉米螟 (Com- 1 2)死亡宇.明 ¾高于取食接种对照载休的 VIGS烟亨.的对照组。 阁 7、 饲喂 dsWXM- 12(501 ) /TRV2的烟苹.后， 棉铃虫体内基因表达的变化。

图 7八为在喂食0^ 111- 12/丁1 ¥2五天后，棉铃虫肠内 NADH dehydrogenase的转录明显 低干喂食 WT的情况。

M 7B为在喂食 dswxm- 12(501 ) /TRV2 ή大后, 棉铃虫肠内 NADH dehydrogenase的 转录明 ¾低于喂食 WT的情况。 具休实施方式

本发明人经过广泛的研究， 找到了一些米源于昆虫的靶基因， 基于这些靶基因的核 酸序列设计构建物以在植物体内形成干扰这些 靶基因表达的 RNA,所述植物在被昆虫服 食后， 可达到显著抑制相关基因表达的目的， 受昆虫休内消化系统等屏障的影响较小或 不受影响。 因此， 可利用在转基因植物休内产生的昆虫基因的干 扰 RNA， 藉由植食性昆 虫取食进入到昆虫体内， 行使对昆虫靶基因表达的下调， 达到抑制昆虫的作用。 术语

如本文所用， 所述的 "植物 " 没有特别的限制， 只要所述 "植物" 是易于被昆虫 (如 鳞翅目昆虫)侵染的， 如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所 述的植物比如可以是（不 限于)： 双子叶植物、 单子叶植物、 或裸子植物。 更具体地， 所述的植物包括 （但不限于)： 棉花、 小麦、 大麦、 黑麦、 水稻、 玉米、 高梁、 甜菜、 苹果、 梨、 李、 桃、 杏、 樱桃、 草莓、 木莓、 黑莓、 豆、 扁豆、 豌豆、 大豆、 油菜、 芥、 罂粟、 齐墩果、 向日葵、 椰子、 蓖麻油植 物、 可可豆、 花生、 葫芦、 黄瓜、 西瓜、 亚麻、 大麻、 黄麻、 柑桔、 柠檬、 葡萄柚、 菠菜、 苘苣.、 芦笋、 洋白菜、 大白菜、 小白菜、 胡萝卜、 洋葱、 土豆、 西红柿、 青椒、 鳄梨、 桂皮、 樟脑、 烟叶、 坚果、 咖啡、 茄子、 甘蔗、 茶叶、 胡椒、 葡萄树、 蚝麻草、 香蕉、 天然橡胶树 和观赏植物等。

如本文所用， 所述的 "昆虫 " 是指任何基因组中包括有选自胰蛋白酶基因、 多巴脱 羧酶基因、 NADH脱氨酶基因、 ATP合成酵 β亚基基因、肌球蛋白重链 Β亚型基因的昆 虫， 且这些基因在所述的昆虫中作为该昆虫生长或 生存所必需的基因。 较佳地， 所述昆 虫可以是一种能以植物为食的植食性昆虫， 比如其可以是弹尾目、 等翅目、 鞘翅目、 双 翅目、 膜翅目、 鳞翅目、 直翅目、 半翅目、 缨翅目的昆虫或农业害虫， 具休例如是长翅 卷蛾属种、 褐带卷蛾属、 透翅蛾属、 地老虎属、 棉叶波纹夜蛾、 黎豆夜蛾、 黄卷蛾属、 带卷蛾属、 夜蛾属、 玉米楷夜蛾、 粉斑蟆、 桃蛀果蛾、 蟆属、 色卷蛾属、 葡萄果蠹蛾、 卷叶蟆属、 云卷蛾属、 鞘蛾属、 苹果异型小卷蛾、 卷叶蛾属、 玉米蟆属、 展叶松夜蛾、 金刚钻属、 粉蟆属、 花小卷蛾属、 黄毒蛾属、 切根虫属、 食心虫属、 广翅小卷蛾、 夜蛾 属、 菜蟆、 美国白蛾、 番茄蠹蛾、 旋纹潜叶蛾、 细蛾属、 毒蛾属、 潜叶蛾属、 天幕毛虫 属、 甘蓝夜蛾、 烟草天蛾、 尺蠖属、 欧洲玉米蟆、 超小卷蛾属、 小眼夜蛾、 红铃虫、 棉 铃虫、 马铃薯块茎蛾菜粉蝶、 粉蝶属、 小菜蛾、 巢蛾属、 白野蟆属、 大蟆属、 卷叶蛾属、 粘虫属、 透翅蛾属、 带蛾属、 卷蛾属、 粉纹夜蛾、 树巢蛾属、 叩甲属、 象甲属、 甜菜隐 食甲、 甜菜茎跳甲、 谷象属、 实象属、 皮蠹属、 叶甲属、 瓢虫属、 马铃薯甲虫、 稻象甲 属、 金龟属、 谷盗属、 耳喙象属、 丽金龟属、 跳甲属、 蠹属、 金龟子、 米象属、 麦蛾属、 粉甲属、 拟谷盗属、 斑皮蠹属、 非蠊属、 蠊属、 蝼蛄属、 马得拉非蠊、 飞蝗属、 大蠊属、 蚱蜢属、 白蚁属、 蓟马属、 条蓟马属、 单蓟马属、 棕黄蓟马、 棉蓟马、 非洲桔硬蓟马。 更佳地， 所述的 "昆虫"是对植物有害的昆虫， 中国专利屮请号为 200680042821.5的专 利申请文本及 US 2009/0306189 Al, WO 2007/080127 A2, AU 2006/335978 Al, US 2009/0285784 Al 的申请文本作为发明的参考文献， CN101365795中 41 -47页对于昆虫 的描述可以纳入本发明的说明书内容。

如本文所用， 术语 " RNA干扰 (RNA interference , RNAi) " 是指一些双链 RNA可以 高效、特异地阻断休内特定基因的表达， 促使 mRNA降解， 诱使细胞表现出特定基因缺 失的表型， 其也称为 RNA干预或者干涉。 RNA干扰是高度特异的在 mRNA水平上的基 因沉默机制。

在本发明中， 所述的 RNA干扰的基本原理是： 以植物作为媒介， 使昆虫服食可干扰 昆虫基因 （包括： 胰蛋白酶基因、 多巴脱羧酶基因、 NADH脱氢酶基因、 ATP合成酶 β 亚基基因、肌球蛋白重链 Β亚型基因） 表达的干扰 RNA, 从而抑制昆虫的生长或杀灭昆 虫。更具体地，所述的原理为：通过转基因的 方法让植物体内表达昆虫基因 (全长或部分) 的双链 RNA(dsRNA) , 在植物体内形成高丰度的干扰 RNA, 当昆虫取食这种转基因植物 的同时也摄入了大量的干扰 RNA， 所述的干扰 RNA在进入昆虫休内后能够抑制所述昆 虫基因在表达， 干扰昆虫正常的生长发育甚至引起其死亡。 利用所述原理， 可以有效地 改良植物对于昆虫的抵抗能力。 将 RNA 干扰技术应用到转基因植物上， 开发新型的转 基因抗性植物， 对农业的发展具有重大的意义。

如本文所用， 所述的 "干扰分子" 是指基于本发明提供的作为靶标的昆虫基因或 其 片段 (截短形式)制备或加工 (如被休内加工)获得的、 具有防治昆虫活性的一类物质的总 称。 所述的 "干扰分子"例如包括 dsRNA、 反义核 (苷)酸、 小千扰 RNA、 微小 RNA等。

如本文所用，术语" dsRNA "是指一种双链 RNA分子，能够以同源互补序列的 mRNA 为靶目标降解特定的 mRNA, 这个过程就是 RNA干扰途径 (RNA interference pathway) » 如本文所用， "基本上互补" 是指核苷酸的序列是足够互补的， 可以以一种可预见 的方式发生相互作用， 如形成二级结构 (如茎环结构）。 通常， 两条 "基本上互补" 的核 苷酸序列互相之间至少有 70%的核苷酸是互补的； 优选的， 至少有 80°/。的核苷酸是互补 的； 更优选的， 至少有 90°/。的核苷酸是互补的： 进一步优选的， 至少有 95%的核苷酸是 互补的； 如 98%、 99%或 100%。 一般地， 两条足够互补的分子之间可以具有最多 7个 不匹配的核苷酸； 优选的， 具有最多 6个不匹配的核苷酸； 更优选的， 具有最多 5个不 匹配的核苷酸； 进一步优选的， 具有最多 4个不匹配的核苷酸， 如具有 0、 1、 2、 3、 4 个不匹配的核苷酸。

如本文所用， "互补" 的序列通常是指将 5 '-3 '方向的序列转换为其 3 '-5 '方向的序列

(如 5 'ATCG 3 '→GCTA)， 然后再取其互补序列（如 GCTA→5 'CGAT 3 ')。

如本文所用， "茎环 " 结构也被称作 "发夹" 结构， 是指一种核苷酸分子， 其可形 成一种包括双链区域 (茎部)的二级结构， 所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域 (位 于同一分子上)形成， 两个区域分列双链部分的两侧； 其还包括至少一个 "环"结构， 包 括非互补的核苷酸分子， 即单链区域。 即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的 ， 核苷酸的双链部分也可保持双链状态。 例如， 插入、 缺失、 取代等可导致一个小区域的 不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形 式的二级结构， 然而， 该两个区域仍可基 本上互补， 并在可预见的方式中发生相互作用， 形成茎环结构的双链区域。 茎环结构是 本领域技术人员所熟知的， 通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列 的核酸后， 本 领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环 结构。

如本文所用， 所述的 "可操作 (性)地连接" 或 "操作性连接" 是指两个或多个核酸区 域或核酸序列的功能性的空间排列。 例如： 启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的 特定位置， 使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导 ， 从而， 启动子区域被 "可操 作地连接" 到该核酸序列上。

木 所 UJ , 除 |卜»外说 ， 术 ffi "杭虫 ·Ι ·: " 屮， 所述的 "虫" 小. " β虫" 如本文所用， 所述的 "含有" ， "具有 " 或 "包括"包括了 "包含" 、 "主要由 ... ... 构成" 、 "基本上由 ... ...构成" 、 和 "由 ... ...构成" ； "主要由 ... ...构成" 、 "基本上 由 ... ...构成" 和 "由 ... ...构成" 属于 "含有" 、 "具有" 或 "包括" 的下位概念。

用于确定序列一致性 的方法是本领域常规的， 其包括使用 Blast软件和 EMBOSS软件 (The European Molecular Biology Open Software Suite(2000) , Rice , P.Longden . I. and Bleasby, A.Trends in Genetics 16, (6)pp276-277)。 本文使用的术语 "一致性"是指序列之间 在核苷酸水平上的关系。 通过在比较窗屮对最优比对的序列 (例如， 两条或更多)进行比较 确； 一致件百分比"， 其屮所述比较窗屮的序列部分与最优序列比对 的参考序列相比可 包含插入或缺失。 所述参考序列不包^插入或缺失。 所述参考窗选 ft至少 10个连续核苷酸 约 50、 约 100或者至约 150个核苷酸， 优选约 50〜1 50个核苷酸。 然后， 通过测 ^所述 窗中的序列之间一致的核苷酸数目并将该数 除以所述窗中的核苷酸数并乘以 loo來计算

"一致性百分比"。

基因

编码^ ΰ质或 RNA等 Λ冇特定功能产物的遗传信息的基本单位， 是染色休或基因组的一 段 DNA序列（对以 RNA作为遗传信息载体的 RNA病毒而自则是 RNA序列）。 包括编码序列（夕卜 ½ )、 编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列 和单个编码序列间的间隔序列（内含

靶标基因

本发明的方法以植物作为媒介， 通过使昆虫服食可干扰昆虫基因表达的干扰 RNA， 从而抑制昆虫的生长或杀灭昆虫。 为了寻找适合于此操作的昆虫基因， 本发明人经过了 广泛而深入的研究， 最终找到了适合的基因， 所述基因包括： 胰蛋白酶基因、 多巴脱羧 酶基因、 NADH脱氢酶基因、 ATP合成酶 β亚基基因、 肌球蛋白重链 B亚型基因。 这些 基因编码的蛋白的主要作用或功能如下：

胰蛋白酶 (trypsin precursor)是一类消化酶， 主要存在于一些昆虫的中肠中， 用于消化 摄入的蛋白质， 使其成为更小的多肽或氨基酸， 进而进一步被吸收代谢。

多巴脱羧酶 (dopa decarboxylase)是氨基酸脱羧酶的一种， 催化多巴脱羧产生多巴胺。 在昆虫休内是鞣化剂 N-乙酰多巴胺生物合成过程中的关键酶，与昆� ��的蛹形成时期表皮 角质层鞣化有关。

NADH脱氢酶 (NADH dehydrogenase ubiquinone flavoprotein)是线粒休上能量代谢复 合物 Complex I的一个亚基， 催化 NADH氧化成 NAD+和 H ⁺ , 并释放出电子用于后续的 能量传递反应。

A TP合成酶 (ATP synthase beta)广泛存在于动物的线粒休中， 是生物体能量代谢的关 键酶， 参与氧化磷酸化反应， 在跨膜质子动力势的推动下催化合成 ATP。 ATP合成酶是 一个复杂的复合休， 由多个亚基组成， 包括 β亚基。

肌球蛋白 (Myosin heavy chain , isoform B)是肌原纤维粗丝的组成单位，存在于平滑肌 中， 在肌肉运动中起重要作用。 肌球蛋白由两条相同的重链和两对轻链组成。 重链的头 部具有 ATP酶活性， 并与肌动蛋白结合。

这些基因的表达下调或抑制可以导致昆虫牛. 发生问题或死亡。 以上述基因作为抑 制或沉默靶标， 可制备特异性千扰分了 ·， 抑制棉铃虫生 K或发育或使棉铃虫死亡。 本发 明还在玉米螟中获得上述基因的髙度同源基因 ， 将其作为抑制或沉默靶标， 可制备特异 性 '·扰分了-，抑制玉米螟牛： K或发冇或使玉米螟死亡。上述基因还可以是� � 其它牛物， 所述 ¾因的功能已被逑、〉:于文献中， 其核苷酸序列与棉铃虫基因具有髙度同源件， 可预 见这^卨度同源基因可作为靶标， 制各特异性千扰分子， 抑制其来源生物的生长或发育 或使 死亡。 这些基因或它们所编码的蛋白都保守性地普遍 存在于在昆虫体内， 包括蚜虫、 玉米 螟、 稻飞虱等主要害虫。 这些基因或它们所编码的蛋白在上述主要害虫 中发挥的功能相 同， 部分基因序列的同源性比较请见表 1。 可以预见， 来源于蚜虫、 玉米螟、 稻飞虱等 的胰蛋白酶基因、 多巴脱羧酶基因、 NADH脱氢酶基因、 ATP合成酶 β亚基基因、 肌球 5 蛋白重链 Β亚型基因分别可以作为设计抵抗蚜虫、 卫米螟、 稻飞虱等的干扰 RNA的靶 基因。

表 1 (如冇， 可以补充其他农作物主要害虫的相关同源基因 ， 比如大豆的主要害虫， 如大豆蚜 Aphis glycines Matsumura, 大豆食心虫、 卷叶螟等)

*为该昆虫休内的基因相较于棉铃虫休内该蛋� � /基因的同源性。 由于上述各基因编码的蛋白各! ¾在不同的昆虫体内的功能是相同的， 因此存在于其 它昆虫中的、 与棉铃虫中的胰蛋白酶基因、 多巴脱羧酶基因、 NADH脱氢酶基因、 ATP 合成酶 13亚基基因或肌球蛋白重链 B亚型基因的核酸序列的一致性不低于 50%的多核苷 酸也包括在本发明中， 作为设计干扰 RNA的靶标。 优选的， 存在于其他昆虫的、 与棉 铃虫的胰蛋白酶基因、 多巴脱羧酶基因、 NADH脱氢酶基因、 ATP合成酶 β亚基基因或 肌球蛋白重链 B亚型基因的核酸序列的一致性不低于 55%、 60%、 65%或 68%的多核苷 酸也包括在本发明中， 作为设计干扰 RNA的靶标； 更优选地， 存在于其它昆虫中的、 与棉铃虫中的胰蛋白酶基因、 多巴脱羧酶基因、 NADH脱氢酶基因、 ATP合成酶 β亚基 基因或肌球蛋白重链 Β亚型基因的核酸序列的一致性不低于 70%、 71%、 75%, 79%或 80%的多核苷酸也包括在本发明中， 作为设计干扰 RNA的靶标。 更优选地， 存在于其 它昆虫中的、 与棉铃虫中的胰蛋白酶基因、 多巴脱羧酶基因、 NADH脱氢酶基因、 ΑΤΡ 合成酶 β亚基基因或肌球蛋白重链 Β亚型基因的核酸序列的 - -致性不低于 83%、 85%、 90%、 92%、 95%、 ％%、 97%、 98%或 99%的多核苷酸也包括在本发明中， 作为设计干 扰 RNA的靶标。

本发明人在深入研究基础上发现， 这些靶标基因或其片段所编码的蛋白在昆虫休 内 发挥着重要的作用， 它们被抑制、 干扰或沉默将导致昆虫生长受到显著抑制或存 活率显 著下降。因此，可基于这些靶标基因或其同源 基因以及它们的片段来设计各种干扰分子， 从而用于害虫的防治。

可基于以上基因或基因片段或它们的同源基因 的序列来设计构建物， 从而在植物休 内表达特异性干扰昆虫基因表达的双链 RNA(dsRNA)。 所述的基因片段的长度为至少 I 8bp， 较佳地至少 20bp， 更佳地至少 50bp , 更佳地至少 l OObp; 更佳地为 100-700bp; 更佳地为 200-600bp。

例如， 所述的基因片段选自： SEQ ID NO: 1中第 1 -576位的序列 (trypsin precursor); SEQ ID NO: 2中第 31 1 -621位的序列（dopa decarboxylase); SEQ ID NO: 3中第 297-771 位的序列 (NADH dehydrogenase ubiquinone flavoprotein); SEQ ID NO: 4中第 203-630位 的序列（ATP synthase beta);或 SEQ ID NO: 5中第 372-662位的序列（Myosin heavy chain , isoform B) ₀

本发明还提供了一种多核苷酸集合， 所述多核苷酸集合包括以下序列： SEQ ID NO: 1 或其中第 1 -576位的序列； SEQ ID NO: 2或其中第 31 1 -621位的序列； SEQ ID NO: 3或 其中第 297-77】位的序列； SEQ ID NO: 4或其中第 203-630位的序列； 或 SEQ ID NO: 5 或其中第 372-662位的序列。 当需要制备抗虫性的转基因植物或制备防治昆 虫的干扰分 7时， 可从所述的多核苷酸集中获取 1条或条多核苷酸。 当同时应用时， 可达到更为广 谱、 更为有效的杀灭昆虫的效果。 构建物

根据本发明所提供的基因及其序列， 可设计出在被导入植物中后可被植物加工成可 影响相应的 mRNA表达的干扰分子 (如 dsRNA)的多核苷酸构建物。因此，本发明提供了 - 种人工构建的构建物。根据本发明提供的基因 及其序列米设计所述的构建物是本领域 技术人员可了解的， 通常可使该构建物包含一个内含子序列 (与两侧序列不互补）， 两端 连接上互补的基因序列， 导入细胞后， 能产生 "茎 -环" 结构， 并且 "茎"状部分能够 在植物休内被植物加工成干扰分子 (如 dsRNA) , 这种干扰分子能特别有效的抑制目的基 因的表达。

作为本发明的一种优选方式， 所述的构建物含有至少一个如下所示的结构-

Seq _X_Seq

其中， Seq 与 Seq 为基本上互补的核苷酸序列， 在导入植物后 Seq 与 Seq 能形成特异性干扰昆虫基因表达的干扰分子；

X为位于 Seq 和 Seq _{S P5} 之间的间隔序列， 并且所述间隔序列与 Seq ^和 Seq _s 向不 互补；

式 I所示的结构在转入植物细胞后， 形成如下所示的二级结构：

Seq 正向一^

I ' X

seq反向 。

该结构在植物体内进一步被剪切、 加工形成干扰分子 (如 dsRNA) , 从而发挥基因沉默 的作用。

所述的构建物可以制备成可形成多于 1个茎环结构的形式， 例如， 可以包含 2个或 2个 以上的茎环结构， 这些茎环结构 "茎" 状部分 (即由 Seq^和 Seq^相互作用形成)。 提高植物抗虫能力的方法

本发明还提供了一种提高植物抗虫能力的方法 ， 包括在植物体内表达特异性干扰昆 虫基因表达的千扰分子 (如双链 RNA(dsRNA)); 所述的昆虫基因选自： 胰蛋白酶基因、 多巴脱羧酶基因、 NADH脱氢酶基因、 ATP合成酶 β亚基基因、肌球蛋白重链 B亚型基 因。 从而， 昆虫取食该植物 (转基因植物)后， 体内该昆虫基因表达被下调， 生长受到抑 制。

作为本发明的优选方式，所述的方法包括步骤 ：（a) 提供所述的构建物；（b) 将 （a) 中 所述的构建物导入到植物中， 从而表达其中包括的所述的干扰分子（如 dsRNA) , 所述干 扰分子能够抑制取食该植物的昆虫相应基因的 表达， 从而提髙植物抗虫能力。

用重组 DNA转化植物可用本领域技术人员熟知的常规技 术进行，具休视植物种类的 不同而定。 例如， 可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法， 例如叶盘法、 水稻幼胚转化 法等。 对于转化的植物细胞、 组织或器官可以用常规方法再生成植株。

通常， 所述的构建物位于表达载休上。 因此， 本发明还包括一种载休， 它含有所述 的构建物。 所述的表达载休通常还含有与所述的构建物操 作性相连的启动子、 复制起点 和 /或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方� �能用于构建本发明所需的表达载休。这 些方法包括体外重组 DNA技术、 DNA合成技术、 休内重组技术等。 所述的表达载体优 选地包含一个或多个选择性标记基因， 以提供用于选抒转化的宿主细胞的表型性状， 如 卡那霉素、 庆大霉素、 潮霉素、 氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者 控制序列的载体，可以用于转化适当 的宿主。 在本发明的方法中， 所述的宿主可以是任何适合于携带所述表达载 体并能够将 所述表达载体传递给植物细胞的宿主。 优选的， 所述的宿主为农杆菌。

作为一种优选的实施方式， 所述的将构建物导入到植物的方法包括：

( 1 ) 提供携带表达载休的农杆菌， 所述的表达载休含有所述的构建物；

(2) 将植物细胞或组织或器官与步骤 ( 1 )中的农杆菌接触， 从而使所述的构建物转入 植物细胞或组织或器官；

(3) 选择出转入所述构建物的植物细胞或组织或器 官；

(4) 将步骤 （ ³ ) 中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

本发明还提供一种植物， 其体内表达所述的特异性干扰昆虫基因表达的 干扰分子； 或其休内包括所述的多核苷酸构建物。 所述的植物由前述的转基因方法制备获得。 本发明的主要优点在于-

( 1 ) 本发明的技术方案利用植物作为媒介、 通过 RNA干扰机制来抑制昆虫的生长 或生存， 且找到了适于进行 RNA干扰操作的昆虫基因。 基于这些基因的序列设计的构 建物在转入植物休后， 形成的干扰分子被昆虫取食后受昆虫体内消化 系统等屏障的影响 较小或不受影响。

(2) 本发明的方法可以提髙植物的抗病虫害能力， 减少农药使用， 降低农业生产成 本， 保护生态环境。 下面结合具休实施例， 进一步闸述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规 条件如 Sambrook and Russell (200】)· Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed. ) ; Cold Spring Harbor Laboratory Press中所述的条件，或按照制造厂商所建议的� ��件。除非 另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟 练人员所熟悉的意义 相同。 此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆 可应用于本发明中。 文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 实施例 1、 用于构建 dsRNA载休的序列片段

以亚洲棉铃虫 、Helicovepa a隱 ge ) cDNA文痄（ZAP express) (以进食含冇 l mg g" ¹ 棉酚浓度的人 T.词料一天后的 龄棉铃虫中肠总 RNA为材料构建 cDNA文库)为模板， 扩增到 29个用于构建 dsRNA表达载休的 EST片段， ¾为 WX - I〜WXM-29。 屮 EST i l¾ 4!-; i' il'J頻如表 2。

表 2

WXM- 1 胰凝乳蛋 ΰ酶（ l 休） (Chymotrypsin precursor) WXM-2 脑ά ' χ Γ 1贿 < II J ) (Trypsin precursor)

WXM-5 Juvenile hormone diol kinase

WXM-6 ¾i巴脱 l (Dopa decarboxylase)

WXM-8 ΛΤΡ 、ii ^; ¾(ATP synthase beta subunit)

WXM- 1 1 NADH \ K'H化还 ΙίΗ酶 (NADH-ubiquinone

oxidoreductase)

WXM- 12 NADH 脱 ¾酶（NADH dehydrogenase)

WXM-20 线粒休 ATP f 麵 (i （l'i;j休) (Mitochondrial ATP

synthase alpha subunit precursor)

WXM-25 Α ΓΡ 成! ¾ β ^. ¾(ATP synthase beta)

WXM-27 ]Ju H/j i¾ 1 (Lipase- ! )

WXM-E 肌球 ifi 链 B亚— (Myosin heavy chain , isoform B) 本发明中， 使用胰蛋白酶、 多巴脱羧酶、 NADH 脱氢酶、 ATP合成酶 β亚基、 肌球 蛋白重链 Β亚型的编码序列以及 RTM内含子序列。 其中， 灰色加深部分为用于构建 dsRNA载休的片段。

SEQ ID NO: 1 (WXM-2, 胰蛋白嗨（trypsin precursor)编码序列， GenBank:

SEQ ID NO: 2(WXM-6，多巴脱羧酵 (dopa decarboxylase)编码序列， GenBank: EE399464.1): TGCCTATAAAAAAACAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 3(WXM-12 , NADH 脱氢酶 (NADH dehydrogenase ubiquinone flavoprotein 2)编码序列， 24kDa , GenBank: EE399580.1):

TAAATCATGTTAGAATCGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 4(WXM-25, ATP合成酵 β亚基 (ATP synthase beta)编码序列， GenBank: EE399658.1 ):

AAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 5(WXM-E ,肌球蛋白重链 B亚型 (Myosin heavy chain , isoform B) 编码序列， GenBank: EE399482.1 ):

ODD'' '{XL:»:):)VO:)I:)OV:»:)VOV:)D1

DD3',

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(Sfr€666HO : |UBauao '雜 ¾^ HQVM ⁴ UJO3-I I A )≤f :O QI 03S

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TCCGAGCCTCTGGGAGGGCTCA CC GTCCCTCA CGGAAGAACCCAC GGC GACGCCCTGAAGGCCTAGGCAG TGTACATTGT TTGTAATTTTAT TCATAGGTATTTAATAAATC ATGTTAGATC

】（）

15

GGAAGAACTGAACAGTTCGGATTACATTGAAGGCGATTTTACCGATCAAGAGGTTTTCGG TGAGTTCAT

GTCTTTGAAACAAGTGGAGATGAAGACGATTGAGGCGAAGTACGATGGTCCTTACAG ACCAGCTACTAC

TAGACCTAAGTCATTATTGTCAAGTGAAGATGTTAAGAGAGCGTCTAATAAGAAAAA CTCGTCTTAA 0 实施例 2、 胰蛋白酵、 多巴脱羧酶等基因片段的分离

以亚洲棉铃虫 (Jielicovepa armigera) cDNA文库 (ZAP express)(以进食含有 1 mg g 棉酚浓度的人工饲料一天后的五龄棉铃虫中肠 总 RNA为材料构建 cDNA文库)为模扳， 进行 PCR扩增， 分别得到用于构建 dsRNA表达载体的 EST片段。 反应液为： 5 L 10 X缓冲液， 2.5 μ L 10mM dNTP， 2 P L引物 F， 2 P L引物 R， 2 u L cDNA , l w L pfu酶， 5 加水补充体积到 50 μ L。 PCR反应条件为 94 °C 4min , 94 °C 30s , 55 °C 30s , 72 °C 2min， 30个循环， 72°C lOmino PCR产物电泳后回收预期大小的 DNA片段。

以棉铃虫 wxm- 12(NADH dehydrogenase)为模板，从卫米螟 nubilalis)EST数 据) 中通过同源比对获得玉米螟相应基因的 cDNA序列， 命名为 \vxm-corn。 以生工合 成的玉米螟 EST为模板，进行 PCR扩增，分别得到用于构建 dsRNA表达载体以及 V1GS 0 载休的 EST片段。 PCR反应条件同上。

基因专一引物对如下：

胰蛋白酶， WXM-2 , trypsin precursor:

wxm-2-F-BamHI: CGGGATCCACCCTACTATTGCGGCTCTT(SEQ ID NO: 7) wxm-2-R-XbaI: CGTCTAGAAGGAGCAGACACCGACAA(SEQ ID NO: 8)

wxm-2-F-SacI: CGGAGCTCACCCTACTATTGCGGCTCTT(SEQ ID NO: 9)

wxm-2-R-NotI: CGGCGGCCGCAGGAGCAGACACCGACAA(SEQ ID NO: 10) 多巴脱羧酶， WXM-6， dopa decarboxylase:

wxm-6-F-BamHI： CGGGATCCTGTATGGCGTGGAGAATC(SEQ ID NO : 1 1 )

0 wxm-6-R-XbaI: CGTCTAGACAGCAGCAGCCTTTACTT(SEQ ID NO: 12)

wxm-6-F-SacI: CGGAGCTCTGTATGGCGTGGAGAATC(SEQ ID NO: 13)

wxm-6-R-NotI : CGGCGGCCGCCAGCAGCAGCCTTTACTT(SEQ ID NO: 14) NADH脱氢酶， WXM-12, NADH dehydrogenase

wxm-12-F-BamHI: CGGGATCCCAACAAGAAGAGAGTGGAAGC(SEQ ID NO: 15) wxm-12-R-XbaI: CGTCTAGATTTCGGTTTCTCGTCCCT(SEQ ID NO: 16)

wxm-12-F-SacI: CGGAGCTCCAACAAGAAGAGAGTGGAAGC(SEQ ID NO: 17) wxm-12-R-NotI: CGGCGGCCGCTTTCGGTTTCTCGTCCCT (SEQ ID NO: 18) 肌球蛋白重链 B亚型， WXM-E Myosin heavy chain, isoform B

wxm-E-F-BamHI: CGGGATCCGAGGACCGCAAGAACCAC(SEQ ID NO: 19) wxm-E-R-Xbal ： CGTCTAGATGGGAAGGTGCCGAAA(SEQ ID NO 20)

wxm-E-F-SacI: CGGAGCTCGAGGACCGCAAGAACCAC(SEQ ID NO: 21)

wxm-E-R-Notl: CGGCGGCCGCTGGGAAGGTGCCGAAA(SEQ ID NO: 22)

ATP合成酶 β亚基， WXM-25， ATP synthase beta

wxm-25-F-BamHI: CGGGATCCCTACCTTGCTGTGAACCCTC(SEQ ID NO: 23) wxm-25-R-XbaI: CGTCTAGAAATGGTGCCTGCCTCAAC(SEQ ID NO: 24)

wxm-25-F-SacI: CGGAGCTCCTACCTTGCTGTGAACCCTC(SEQ ID NO: 25) wxm-25-R-NotI: CGGCGGCCGCAATGGTGCCTGCCTCAAC(SEQ ID NO: 26) NADH脱氢酶， WXM-12第二个区段， WXM- 12 (501 ) :

wxm-12(501 )-F-BamHI _: CGGGATCCACCAATCGGCAAGTACCATA (SEQ ID NO: 47) wxm-12(501)-R-XbaI: CGTCTAGAAACGGAAACTTTTTGTTCTAGG (SEQ ID NO: 48)

NADH脱氢酶， WXM-12在玉米螟屮的同源基因（WXM-corn):

wxm-corn-F-BamHI: CGGGATCCCTAGCAATTTATCCCGAAGG (SEQ ID NO: 49) wxm-corn-R-Xbal: CGTCTAGACAGGTCCTCATAATAGTCATCG (SEQ ID NO: 50) 实施例 3、 载休构建和农杆菌转化

1. 载体构建

所需构建的 dsRNA载体结构如图 1 A中所示， 包括植物表达启动子 CaMV35S启动 子，一个正向（即 Sense, S)的基因片段，一个拟南芥 RTM基因的内元 （即 Intron，约 128bp， 和一个反向的基因片段（即 Antisense , AS)以及 NOS 终止子。 其是通过用包含 Sense-lntron-Antisense的序列插入到 pCambia2301 载体（购自 Cambia公司）上的 BamHI 和 Sacl位点间而构建获得。

以拟南芥基因组为模板， 首先将拟南芥 RTM 基因 (AT2G43730)的内元 (约】 28bp)用 含有 Xbal和 Notl的特异引物 RTM+ (5 '-TCTAGAACGTTGTAAGTCTATTTTTG-3 ' (SEQ ID NO: 27))和 RTM- (5 '-GCGGCCGCTCTGCTGGGTCCAAATCACA-3 ' (SEQ ID NO: 28)) 通过高保真酶 pfu进行 PCR扩增， 用 Xbal和 Notl 限制性内切酶对 PCR产物进行双酶 切， 克隆到 pBSK (购自 Clontech 公司）的多克隆位点 Xbal和 Notl 之间。

分别用实施例 2中所列的含有 Notl和 Sacl酶切位点的各基因专一引物对 (例如扩增

NADH脱氢酶的 wxm-12-F-SacI和 wxm-12-R-NotI; 扩增多巴脱羧酶的 wxm-6-F-SacI和 wxm-6-R-NotI等）以棉铃虫 cDNA文库为模板， 通过高保真酶 pfu分别进行 PCR扩增， 克隆得到相应的片段， 用 Notl 和 Sacl 进行双酶切， 分别插入到含有 RTM 内元的 pBSK 载休上的克隆位点 （Notl/Sacl) 之间。

同时， 用同样的方法分别用实施例 2中所列的含有 BamHI和 Xbal 酶切位点的各基 因专一引物对 （例如扩增 NADH脱氢酶的 wxm-12-F-BamHI和 wxm- 12-R-XbaI; 扩增多 巴脱羧酶的 wxm-6-F-BamHI和 wxm-6-R-XbaI 等)用高保真酶 pfii分别进行 PCR扩增， 将获得的片段分别克隆到前述插入了反向 (AS)片段的 pBSK 的 BamHI和 Xbal 之间， 获得双链 RNA载休。

从 pBI121载体 (购自 Clonetech 公司）上用 Hindlll和 BamHI切下 CaMV35S启动子， 用 Sacl和 EcoRI切下 NOS终止子， 分别装入 pCAMBIA2301载体的 Hindlll/Bamffl位 点、 SacI/EcoRI位点， 得到含 CaMV35S-NOS的载休， 命名为 p35SNOS。

将构建好的双链 RNA载休分别用 BamHI和 Sacl进行双酶切，同时将 p35SNOS载体用 BamHI和 Sacl进行双酶切， 将酶切下来的双链片段插入到 BamHI和 Sacl之间， 分别命名 为 dstrypsin/2301、 dsdopa/2301、 dsNADH/2301和 ds ATP synthase beta/2301和 ds Myosin heavy chain /2301。

2. dswxm-12/TRV2、 dswxm-12(501 )/TRV2和 dswxm-corn/TRV2病毒载休的构建 针对 WX - 12 > WXM- 12(501 )和 dswxm-corn i†:列, 制备 '¾载休 <, 用实施例 2屮 所列的含冇 BamHI和 Xbal 酶切位点的基因特异引物对 （如 wxm- 12(501 )-F-BamH】： CGGGATCCACCAATCGGCAAGTACCATA(SEQ ID NO: 51 )和 wxm-12(50] )-R-Xbal : CGTCTAGAAACGGAAACTTTTTGTTCTAGG(SEQ ID NO: 52) , 通过 PCR 扩增得到目 标片段。 ^收 标片段， 用 BamHI 和 Sacl 进行双酶切。 将回收的双酶切产物片段与 pYL 156载休 （|冬 I 1 13，获|' |浙'; 1:大 ） 连接，得到目标载休，分别命名为 dswxm-12/TRV2、 dswxm-12(501 )/TRV2和 dswxm-corn/TRV2。

2. 根癌农杆菌的转化

根癌农杆菌的转化釆用冻融法。 农杆菌菌株 ¾用常用根癌农杆菌 LBA4404(可参见 US7321031 ) _o 前述构建的植物表达载体和 50 μΐ/管感受态细胞， 在冰上放置 30分钟， 液 氮速冻 1分钟。 在 37 °C水浴中 5 分钟使菌液融化， 加 1 ml LB培养基， 28°C， 220 rpm , 培养 2〜4 小时。 取 50〜100 μΐ涂 LB培养基平板 (25mg/L利福平、 50 mg/L 卡那霉素和 100mg/L链霉素）， 2天后挑单菌落进行 PCR鉴定。 实施例 4、 植物遗传转化以及转基因后代的筛选

1、 拟南芥转化与筛选

拟南芥 (ColO)植物的转化釆用花芽浸泡法 （floral dip) (Clough和 Bent, 1998， Plant J. 16， 735-743)。 一个含双元载体的单菌落 LBA4404接种于 3 ml LB 培养基 (含 25 g/ml Rif、 25 g/ml Str和 50 g/ml Kan), 于 28 °C, 220 rpm生长 12小时。将菌液接种于 50 ml LB 培养基 （25 g/ml Rif、 25 g/ml Str和 50 g/ml Kan)于 28°C， 220 rpm生长 12小时。 将 50 ml菌液接种于 250 ml LB 培养基 (25 μ^τ ΐ Rif、 25 g/ml Str和 50 μ _δ /πι1 Kan)于 28 °C， 220 rpm生长 12小时。

菌液 5000 rpm室温离心 5分钟， 弃上清。 菌休重悬于 300 ml含 0.02% Silwet L-77 的 5%蔗糖溶液中。 将拟南芥植株花芽部分在菌液中浸泡 5秒钟， 平放于塑料盆内， 保 湿， 避光， 16〜24 小时， 然后在温室中生长至开花结籽。

将收获的 T _Q 代种子于 4°C春化 2天。 用 20% 漂水处理 15分钟， 无菌水清洗 3〜4 遍。 将种子重悬于 0.5%的琼脂糖 (55°C)中， 铺在含 0.8%琼脂的 MS 培养基 (含 50 _μ§ /πι1 Kan)上， 22°C， 连续光照条件下生长约一周。 绿色抗性苗移栽到营养土 (泥炭 ： 蛭石 ： 珍珠岩 = 1:】：】）中生长。 2、 棉花转化与筛选

¾用农杆菌介导的方法转化棉花。 含载休质粒 dswxm-12/2301 的农杆菌于添加卡那 霉素 50mg/L、 利福平 25 mg/L、 链霉素 25 mg/L的 YEB细菌培养基上培养 2〜3天后， 挑单菌落接种于含相同抗生素的 YEB液休培养基屮， 于 28°C、 200 rpm的摇床上悬浮培 养过夜。 菌液于 4000rpm离心 10min， 沉淀用含葡萄糖 30 g/L和乙酰丁香酮 100 μιηοΙ/L 的 1/2 MS液体培养基重新悬浮， 调 OD600值为 0.4〜0.6左右， 作为感染液备用。

棉花 R15(常规的陆地棉， 来源于山两省农业科学院棉花研究所， 参考上官小霞，李 燕娥,梁运生,吴霞,杜存芳,张林水， GUS基因和 NPT II基因表达的相关性及其在转基因棉 花检测研究中的应用， 棉花学报 200719(3)))种子经常规消毒后置于 1/2 MS0(1/2MS盐 +5g/L葡萄糖 +7g/L琼脂粉， pH 6.0)培养基， 在黑暗屮萌发培养， 5〜7天后将无菌苗下 胚轴切成 1.0cm左右的切段作为转化外植休备用。

外植体在农杆菌菌液中浸泡感染 15〜20分钟，转移到共培养培养基 MSB1(MS盐 + B5有机 + 30g/L葡萄糖 + 0.1mg/L KT + 0.1mg/L2,4-D + 2.2g/LGelrite， pH6.0)上， 22°C 养 2天后， 将外植休转移到培养基 MSB2 (MSB1 +500 mg/L头孢霉素 + 80mg/L - t:进行愈伤组织的诱 。 外植休经过抗性愈伤组织的诱 、 愈伤组织的增殖及胚 性愈伤的诱导（揞养基 MSB3: MS盐 + B5有机 + 30g/L葡萄糖 +2.5g/L Gelrite, pH 6.0)、 休细胞胚胎发生 (培养基 MSB4: MS盐 + B5冇机 + 30g/L葡萄糖 + 1 .0 g/L大门冬酰氨胺 + 2.0 g/L谷氨酰胺 + 3.0g/L Gelrite， pH 6.0； MS盐屮 KN03加倍， 去除 NH4N03) , 再 牛抗性试管苗。 待试管苗 K到 3-4片真叶时， 移栽到花盆屮， 放入人工气候室牛长。

经过筛选， dswxni- 1 2/230 1载休转化棉花获得了 1 1个株系 15株可以结种子的转基 因棉花。

3、 烟草 VIGS侵染

利用烟草脆裂病毒 Tobacco Rattle Virus (TRV)系统获 A浙江大学。包括实施例 3提到 的 pYL 1 56， pTRV l痫毒载休和对照 PDS/TRV2载休。 本系统的应 ffl参见 Current Protocols in Microbiology (2006) 161.6.1 - 161.6 13 Tobacco rattle virus R A- 1 complete sequence(TRV l ) GenBank: X06172. 1 Nicotiana benthamiana phytoene desaturase (PDS) complete cds GenBank: EU165355. 1. TRV系统。

将携带 TRV1分别与 dswxm-12/TRV2、 dswxm-12(501 )/TRV2 , dswxm-corn/TRV2及 对照 PDS/TRV2的农杆菌单克隆用 LB液休培养基 (25mg/L利福平、 50 mg/L μ·那霉素和 100mg/L链霉素)过夜培养， 用 VIGS转染液（10 inM MES, 10 mM氯化镁， O l mM乙酰 丁香酮)调至 OD为 2.0。室温静置 4-6个小时后， 将 TRV1和携带目标基因的 pTRV2 农 杆菌桉照 1 : 1 的比例混匀， 用注射器在烟草叶片上渗透注射。 接种后的烟草置于 21 °C 养 7天后， 用携带烟亨. PDS基因的农杆菌作为正对照 (新' 4·:叶片白化）， 判断感染阶段 和感染效书。 对照 PDS/TRV2 病毒感染的烟草其新生叶片变白（表明感染成 功）。 取 dswxn卜 12/TRV2、 dswxm- 12(501 )/TRV2 以及 dswxm-corn/TRV2 病毒感染的烟草新生 叶 J 于虫试。 实施例 5、 转基因植物的分子生物学鉴定

1、 转基因拟南芥鉴定

在本实施例中， 针对前述制备的每种载休 (dstrypsin/2301、 dsdopa/230 K

dsNADH/2301、 ds ATP synthase beta /2301禾卩 ds Myosin heavy chain /2301 )均筛选得到 10 株以上实施例 3获得的转基因拟南芥植株（各植株称为： dsNADH dehydrogenase, ds trypsin precursor, ds dopa decarboxylase, ds ATP synthase beta禾口 ds Myosin heavy chain; W.， 针对同一类型植株的株系依次以 -1 , -2...表示)， 釆用 GUS染色法对转基因植株进 行验证。 由于 pCAMBIA 2301 载体自带 GUS基因， 因此检测 GUS在植株中的存在情 况即可获得鉴定结果。

GUS染色液浸泡植物材料， 37 °C， 12〜24 小时。 70%乙醇脱色， 样品在 70%乙醇 中保存。 GUS染色液（100 mM pH7.0 磷酸缓冲液， 50 mM K3[Fe(CN)6]， 50 mM

K4[Fe(CN)6]， 10 mM EDTA, 1 mM X-gluc , 0.1% Triton X-100。 2、 转基因棉花鉴定

DNA提取采用如下方法： 取 0.5克转基因棉花叶片， 用液氮研磨至粉状， 转移到 8 mL 离心管屮， 加入 5 mL研磨缓冲液 (1 M 葡萄糖， 0.1 M 柠檬酸， 5% Triton X-100(pH 5.0)), 混匀。 22"C、 lOOOg离心 lOmin, 收集沉淀， 重悬在研磨缓冲液中， 再离心， 重复三次， 直 ^沉淀出现灰白色。 5 mL洗涤缓冲液 (0.5 M 葡萄糖，0.05 M 柠檬酸 (pH 5.0))洗涤沉淀， 22 °C、 1000g离心 10min， 去除上淸， jgg 2-4次直到沉淀早.现乳白色。 加入 5 mL裂解缓冲液 (1% SDS' 1.4MNaCl， 0.1 M EDTA(pH 8.3)), 60°C水浴中裂解 15min。22°C、 5000 g离心 10 min, 收集上清， 加入 2倍休积的无水乙醇， 4°C、 10，000g离心 5min。 弃上清， 沉淀吹千， 溶于 2 mL O.lxSSC溶液， 充分溶解后离心去除不溶物。 补充 NaCI至终浓度达到 1M (约 0.058 g NaCl/mL 0.1 xSSC(0.015 M NaCI, 0.015M柠檬酸钠))。 加入等休积的氯仿:异戊醇 (24: 1)混匀， 12,000 rpm, 4°C离心 10min， 取上淸， 复抽提一次。 上清屮加入 2倍休积的无水乙醇， 于 -20C静置 lOmin, 12,000 rpm、 4°C离心 10 min， 沉淀溶于 0.1xSSC。 测定 OD 260/280的比 值， ·股在 1.8-2.0之间。 DNA 浓度 0tg/mL)=50xA260x稀释倍数。

PCR检测引物为 wxm- 12-F和 wxm- 12-R。 序列为：

wxm-12-F-BamHI: CGGGATCCCAACAAGAAGAGAGTGGAAGC (SEQ ID NO: 15) wxm-12-R-XbaI: CGTCTAGATTTCGGTTTCTCGTCCCT (SEQ ID NO: 16)

PCR反应条件： 94°C预变性 5min; 然后 94°C预变性 30s， 55°C复性 30s， 72°C延伸 30s, 共 30个循环； 最后 72°C延伸 lOmin, 扩增片段大小约 500bp。

l 3A 为 DNA检测含冇 dswxm-12/2301 的转基因棉花 (R15， 9， 10, 15， 16, 21, 22， 27, 145-1, 145-2, 145-3, 165-1, 165-2)的结果。 R15是转基因棉花受休材料， 具 冇专一条带的泳道表示对应的棉花中含有 dswxm-12/230】 载休。 实施例 6、 双链 RNA表达水平检测

1、 拟南芥 RNA提取

取转基因拟南芥材料 (约 100 mg)于液氮中充分研磨。转移至 1.5 ml离心管中，加入 1 mL Trizol (Invitrogen, Cat.15596-018), 混匀， 室温放置 5 min。 加入 200 P L三氯甲烷， 混匀， 12,000 rpm离心 10 min。 取上淸， 加入 500 μ L异丙醇混匀后 12,000 rpm离心 10 min。 沉淀用 70%乙醇洗涤， 真空干燥， 溶于 20-50 H ₂ 0 (RNase free)。 2、 棉花 RNA提取

棉花 RNA提取方法如下： 棉花材料用液氮研麽， 每 200 mg材料加 l ml65°C预热的 RNA提取液 （0.2 M Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA, 1 M NaCI, 】％ CTAB和 1% β -巯基乙 醉）， 65°C保温 30分钟。 加 0.6 nil氯仿抽提 2次。 上清加 LiCl至终浓度 2 M。 -20°C静 'ι¾ 3小时， 13000 g离心 10分钟。 沉淀用 70%乙醉洗一次， 加水溶解， -20Ό保存。 3、 烟草 RNA提取

棉花 RNA提取 如下： 病毒感染的烟草新 叶片用液氮研磨， 每 200 mg材料加 1 ml 65°C预热的 RNA提取液 (0.2 M Tris， pH 8.0， 50 mM EDTA, 1 MNaCl, 1% CTAB 和 1%β -巯基乙醇）， 65°C保温 30分钟。 加 0.6 ml氯仿抽提 2次。 上淸加 LiCl至终浓度 2 M。 -20°C静置 3小时， Π000 g离心 10分钟。 沉淀用 70%乙醇洗一次， 加水溶解， -20

°C保存。

4、 Northern印迹检测双链 RNA表达水平

在 RNA样品中加入 5XRNA样品缓冲液和 10XRNA (甲醛）电泳加样液， 混匀， 65 °C放置 10 min， 冰上冷却。 每泳道加样量为 15 总 RNA, 进行甲醛变性电泳。 电泳 使用 1.1%变性琼脂糖凝胶， 1XMOPS 电泳缓冲液， 电场强度 8 V/cm。 电泳至溴芬兰 染料迁移至凝胶的 2/3 时结束。 用 ddH ₂ 0漂洗凝胶， 并用 20XSSC 平衡 40 min。 加 筑转移平台， 以 10XSSC 为转移缓冲液， 利用毛细管法将 RNA 转移到 Hybond-XL (Amersham, Cat.RPN303S)尼龙膜上 (约 18 h)。 转移结束后， 用铅笔在膜上标记出加样 孔的位置， 并剪去膜的左上角作为标记。 膜经 6XSSC溶液短暂漂洗后， 紫外交联 (120 mJ), 夹在两层滤纸之间， 80°C烘烤 2 h， 密封保存备用。

探针标记： 取 25 ng 纯化 PCR 产物作为模板标记探针（使用引物 wxm-12-F 和 wxm-12- R，PCR扩增 NADH dehydrogenase的片段，探针长度为 475 bp;使用引物 wxm-2-F 和 wxm-2-R 扩增 trypsin precursor 的片段）。 探针的标记使用 Prime-a-Gene Labeling System (Promega, Cat.U1100)。 37°C温浴 1 小时。 标记探针在沸水中放置 5 min， 立刻 置于冰上， 各用。

预杂交和杂交釆用 Clontech的 ExpressHyb休系：将尼龙膜放入杂交管中，以 6 X SSC 润湿，保证膜和管壁间没有气泡。倒掉 6XSSC，加入 5mL 杂交液，37°C预杂交 60 min。 预杂交结束后， 更换 5 mL 新鲜杂交液， 加入探针， 混匀， 杂交过夜.

洗膜与压片： 杂交结束后， 倒出杂交液。 在室温下， 用 2XSSC, 0.05% SDS洗膜 两次， 每次 5 分钟， 然后用 0.2XSSC, 0.1% SDS, 再洗涤两次， 每次 20分钟。 用保 鲜膜包裹， 胶带固定， 压增感屏和 X-ray 胶片， -70°C, 2 天。 胶片用 D-72 液显影。 图 2A为 Northern印迹检测表达含 NADH dehydrogenase序列 dsRNA的转基因拟南芥的 结果。 WT 表示野生型植物对照， 具有印迹的泳道表示对应的植物中表达了相应 的 dsRNA。

5 RT-PCR检测双链 RNA的表达水平

将 RNA 用 RNaseFree水做适当稀释， 测定波长在 200 nm-300 nm之间的 UV吸收 值。 1^八浓度=4(^ _§ /1 ₀ 1^八260 稀释倍数。 反转录使用 RNAPCRKit(Takara)。 反应 体系参考试剂盒说明书。 20 μ ΐ休系中加 1 总 RNA。 42°C反应 40分钟， 合成第一 链。 PCR反应休系为： 2 L 10 X缓冲液， 0.5 μ L 10mM dNTP , 1 μ L 引物 F， 1 μ L 弓 I 物 R， 0.5 L cDNA, 0.2 L ExTaq M, 加水补充体积到 20 y L。 PCR反应条件为 94 °C 4 min , 94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 30s , 30个循环， ，2。C 10min。 PCR产物电泳检 测。 各基因对应的引物 F和引物 R序列见表 3。

表 3、 各基因引物信息表

图 2B为 RT-PCR检测表达含 NADH dehydrogenase序列 dsRNA的转基因拟南芥的结 果。 WT表示野生型植物对照， 具有专一条带的泳道表示对应的植物中表达了 相应的 dsRNA。

图 2C为 Northern印迹检测表达含 trypsin precursor序列 dsRNA的转基因拟南芥的结 果。 WT表示野生型植物对照，具有印迹的泳道表示� ��应的植物中表达了相应的 dsRNA。 图 2D为 RT-PCR检测表达含 dopa decarboxylase的转基因拟南芥结果。 WT表示野 生型植物对照， 具有专一条带的泳道表示对应的植物中表达了 相应的 dsRNA。

图 2£为 RT-PCR检测表达含 i7P^^w^^to的转基因拟南芥结果。 WT表示野生 : 植物对照， 具有专一条带的泳道表示对应的植物中表达了 相应的 dsRNA。

图 2F为 RT-PCR检测表达含 Myosin heavy chain的转基因拟南芥结果。 WT表示野 生型植物对照， 具有专一条带的泳道表示对应的植物中表达了 相应的 dsRNA。

3B为 RT-PCR检测表达含 NADH脱氢酶序列 dswxm-12/2301的转基因棉花的结 （10， 16， 21, 27, 145-1， 165-1)。 专一条带的泳道表示对应的植物屮表达了相应 的 dsRNA。

图 3C为 RT-PCR随机检测 5株烟草病毒感染的结果 (CK， 1, 2， 3, 4， 5)。 专一条 带泳道表示对应的植物中表达了 TRV1。 实施例 7、 检测表达 dsRNA转基因植物对棉铃虫和玉米螟生长的影响

1. 棉铃虫、 玉米螟 RNA提取

取棉铃虫或玉米螟的屮肠 (约 100 mg)于液氮屮充分研磨。 转移至 1.5 ml离心管中， 加入 1 mL Trizol (Invitrogen, Cat.15596-018), 混匀， 室温放置 5 min。 12,000 rpm 离心 10 min, 弃沉淀。上淸屮加入 200μ L =氯甲垸， 混匀， 12,000 rpm离心 10 min。取上清， 加入 500 L异丙醇沉淀 RNA。 12,000 rpm离心 10 min, 沉淀用 70%乙醇洗涤， 真 ⁵ ； ^Τ· 燥， 溶十 20-50 H ₂ 0 (RNase free)。

将 RNA用 RNase Free水做适当稀释， 测定波长在 200 nm-300 nm之间的 UV吸收 值。 RNA浓度 =40 μ g/mL X A260 X稀释倍数。

RT-PCR 检测中肠 RNA 样品中相应基因的表达水平。 反转录使用 RNA PCR Kit (Takara)。 反应休系参考试剂盒说明书。 20 μ 1休系中加 1 μ g总 RN A。 42 °C反应 40分 钟， 合成第一链。 PCR反应休系为： 2 L 10X缓冲液， 0.5 μ L 10mM dNTP, 1 μ L 引 物 F， 1 μ L 引物 R, 0.5 μ L cDNA, 0.2 L ExTaq酶， 加水补充休积到 20 μ L。 PCR反 应条件为 94。C 4 min, 94 Γ 30s, 55 °C 30s, 72 °C 30s, 30个循环， 72°C 10min。 PCR 产物电泳检测。 各基因对应的引物 F和引物 R序列见表 3。

2. 表达 dsRNA转基因植物对棉铃虫和玉米螟牛：长的影� ��

取生长一致的三日龄棉铃虫 (每组 6头棉铃虫， 塁复 3组， 共 18头棉铃虫)分别喂以 未转基因的 WT拟南芥，转入 dstrypsin/2301、dsdopa/2301、dsNADH/2301、dsATP synthase beta/2301或 dsMyosin heavy chain/2301的转基因拟南芥。 3-7天后， 称重后计算其休！; 增加， 取平均值后做为纵坐标， 检测棉铃虫休重的增加情况, 并解剖取中肠， 按照该实 施例 1所述的方法提取 RNA， RT-PCR检测相应基因的表达。 结果显示， 进食 dsNADH dehydrogenase-2 (dsWXM-12 line 2； 12-2)和 dsNADH dehydrogenase- 18 (dsWXM-12 line 1 8； 12- 18)拟南芥的棉铃虫相对于进食野生 34拟南芥的棉铃虫 (对照）， 其中肠内 NADH dehydrogenase 的转录被抑制， 并 目. ' U;缓慢， I羊见 ffl 4、 阁 5。 进食 ds trypsin precursor-4(dsWXM-2 line 4； 2-4)、 ds dopa decarboxylase-2(dsWXM-6 line 2； 6-2)、 ds ATP synthase beta-2(dsWXM-25 line 2； 25-2)和 ds Myosin heavy chain-2(dsWXM-E line 2； E-2) 拟南芥的棉铃虫相对于进食野生型拟南芥的棉 铃虫 (对照）， 其生长缓慢， 详见图 4、 图 5。

取生长一致的二日龄棉铃虫 (每组 6头棉铃虫， 3组重复， 共 1 8头棉铃虫)， 分别喂 以未转基因的棉花 R15(CK)和 dswxm- 1 2/2301转基因棉花。 5天后， 统计死亡率。 进行 了两次独、' /.的实验， 结果如 Ι 6Α .ί'Π 6Β所示， 可见在喂食 dswxm- 12/2301 五天后， 取食 转基因棉花的棉铃虫死亡宇.明 ¾高于取食未转基因棉花材料的对照组 (CK)。

取生长 · -致的三日龄棉铃虫 (每组 6头棉铃虫， 3组重复， 共 1 8头棉铃虫)， 分别喂 以未转基因的 WT、 转入 dswxm-】2/TRV2的病毒感染烟亨.、 转入 dswxm- 12(501 ) /TRV2 的病毒感染烟草， 五天后称重计算其休重增加， 取平均值后做为纵坐标。 结果显示， 在 喂食 dswxm- 12/TRV2或 dswxm- 12(501 )/TRV2病毒感染的烟草后， 棉铃虫休重的增加明 显慢于喂食 WT 的情况 (如阁 6〔：、 D所示）。 解剖取中肠， 提取 RNA， RT-PCR 检测相 应基因的表达。 结果显示在喂食转入 dswxm- 12/TRV2或 dswxm- 1 2(501 ) /TRV2的烟亨. 叶片三天后， 棉铃虫肠内 NADH dehydrogenase的转录明显低于喂食 WT的情况 7 A II； 7B)。这些结果表明， 在烟草屮转入能降低棉铃虫体内 NADH dehydrogenase的转录的 dsRNA 能够提高其对棉铃虫的抗性。 同珲， 可以推测， 转入其他可以抑制棉铃虫休内 NADH dehydrogenase的转录的分子也能提 β烟草对棉铃虫的抗性。 取 4 <:—致的二 R龄玉米螟 (毎组 6头玉米螟， 3组重复， 共 1 8头玉米螟)， 分别喂 以未转基因的 WT , 转入 dswxm-corn/TRV2(玉米螟中 NADH dehydrogenase 同源基因） 的病毒感染烟草。 3天后， 统计死亡宇.。 可见在喂食 dswxm-corn/TRV2三天后， 取食含 dswxm-corn/TRV2的 VIGS烟亨.的玉米螟死亡宇明 高于取食接种对照载休的 VIGS烟 草的对照组。 解剖取中肠， 桉照该 '¾施例 1所述的方法提取 RN A， RT-PCR检测卫米螟 屮肠内 NADH dehydrogenase表达， 在喂食转入 dswxm-corn/TRV2的烟草叶片二天后， :11米螟肠内 NADH dehydrogenase的转录明显低于喂食 WT的情况。 尽管在本发明的实例中所举例的昆虫为棉铃虫 、 玉米螟。 然而应理解， 本发明对于 适用于本发明的昆虫没有特别的限制， 所述昆虫可以是多种能以植物为食的植食性昆 虫， 比如其可以是鳞翅目昆虫。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作 为参考， 就如同每一篇文献被单独引 用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员 可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书 所限定 的范围。