Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in Form eines Trockenschnelltestes Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik von Nukleinsäuren. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein hoch sensitives Verfahren zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren in Form eines Trocken- schnelltestes ; der Trockenschnelltest enthaltend ein chromatographisches Material umfassend - eine Probenaufnahmezone, - eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nu- kleinsäuresonden immobilisiert sind und - eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifischen Nukleinsäuresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind und weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte umfaßt : i) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Falle doppelsträngiger Nukleinsäuren denaturiert und anschließend neutralisiert, ii) die nachzuweisende Nukleinsäure wird auf die Probenaufnahmezone in einem Laufpuffer, welcher mild denaturierende Agenzien enthält, aufgetragen, iii) die nachzuweisende Nukleinsäure bewegt sich von der Probenaufnahmezone in Richtung Flüssigkeit absorbierende Zone, iv) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Bindungsbereich der Trennstrecke mit der se- quenzspezifischen Nukleinsäuresonde in Kontakt gebracht und hybridisiert an die sequenz- spezifische Nukleinsäuresonde v) die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisen- den Nukleinsäure an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde wird detektiert über eine Markierung, die an der nachzuweisenden Nukleinsäure angebracht ist oder über eine Markie- rung des Nukleinsäuredoppelstranges. Als Markierung gilt somit beispielsweise auch die De- tektion mit einem Antikörperkonjugat gegen einen DNS-Doppelstrang oder einen DNS/RNS- Doppelstrang (letzteres z. B. im Falle, daß die Sonde oder die Zielsequenz RNS ist.) Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Der Nachweis von Nukleinsäuren mit Sonden ist im Stand der Technik beschrieben.

Methoden für einen schnellen und einfachen Nachweis von Nukleinsäuren gewinnen in den Bereichen Medizin, Umwelt, Lebensmittel und der Forensik zunehmend an Bedeutung. Auf- grund der hohen Spezifität und Sensitivität nukleinsäurebasierender Verfahren kommt diesen Testen für die Identifizierung und Differenzierung von Krankheitserregern, kontaminierenden Organismen oder auch für die Subtypisierung von Bakterien oder Viren und der Untersu- chung genetischer Polymorphismen ein hoher Stellenwert zu.

Liegt die nachzuweisende Nukleinsäure nur in geringen Mengen in der Probe vor, wird die nachzuweisende Nukleinsäure amplifiziert. Als Nukleinsäureamplifikationsreaktion können verschiedene Reaktionen eingesetzt werden. Bevorzugt wird die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt. Die verschiedenen Ausgestaltungen der PCR-Technik sind dem Fachmann bekannt, siehe z. B. Mullis (1990) Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Chem (Paris) 48 (8), 579-582. Weitere Amplifikationstechniken, die zur Anwendung kommen können, sind die Nukleinsäurestrang basierende Amplifikation (NASBA), die Transkriptase vermittelte Amplifikation (TMA), ), Reverse Transkriptase Po- lymerase Kettenreaktion (RT-PCR), Q-beta Replicase Amplifikation (ß-Q-Replicase) und die Einzelstrangverdrängungs Amplifikation (SDA). NASBA und andere Transkriptions-basierte Amplifikationsmethoden werden in Chan und Fox, Reviews in Medical Microbiology (1999), 10 (4), 185-196 erläutert.

In der einfachsten Form der Detektion der nachzuweisenden Nukleinsäure wird das Amplifi- kat z. B. durch Verdau mit einem Restriktionsenzym spezifisch geschnitten und die entstande- nen ethidiumbromidgefärbten Fragmente auf einem Agarosegel analysiert. Weit verbreitet sind auch Hybridisierungsysteme. Die Hybridisierung findet üblicherweise so statt, daß ent- weder die Zusammensetzung, die das Amplifikationsprodukt oder einen Teil davon enthält, oder die Sonde auf einer festen Phase immobilisiert wird und mit dem jeweils anderen Hybri- disierungspartner in Kontakt gebracht wird. Als feste Phasen sind verschiedenste Materialien vorstellbar, beispielsweise Nylon, Nitrozellulose, Polystyrol, silikatische Materialien usw. Es ist auch denkbar, daß als feste Phase eine Mikrotiterplatte eingesetzt wird. Die Zielsequenz kann dabei auch in Lösung zuvor mit einer Fangsonde hybridisieren und danach wird die Fangsonde an eine feste Phase gebunden.

In der Regel ist wenigstens eine Sonde oder wenigstens ein Primer bei der Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäure markiert. Verschiedenste Markierungen sind dabei denkbar, wie z. B. Fluoreszenzfarbstoffe, Biotin oder Digoxigenin. Bekannte Fluoreszenzmarkierungen sind Fluoreszein, FITC (Fluorisothiocyanat), Cyaninfarbstoffe usw. Die Markierungen sind üblicherweise kovalent mit den Oligonukleotiden verbunden. Während eine Fluoreszenzmar- kierung direkt nachgewiesen werden kann, können Biotin-und Digoxigeninmarkierungen nach Inkubation mit geeigneten Bindemolekülen nachgewiesen werden. Beispielsweise kann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden, indem es mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die Streptavidin gekoppelt an ein Enzym enthält, wobei das Enzym, z. B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, ein Substrat umsetzt, das einen Farbstoff erzeugt oder zu Chemielumineszenz führt.

Alle diese Verfahren sind arbeitsaufwendig und benötigen in der Regel mehrere Stunden. Ei- ne Automatisierung dieser Verfahren kann den manuellen Aufwand und die Analysezeit dra- stisch verkürzen, benötigt aber Geräte mit einem hohen Preis für Anschaffung und Unterhalt, die nur bei hohen Probenzahlen und in spezialisierten Laboratorien zum Einsatz kommen.

Dies steht vor allem bei den Anforderungen einer"point of care"Diagnostik im Wege, wo schnell und möglichst ohne für Nukleinsäuretechniken speziell geschultes Personal nuklein- säurebasierende Diagnostik auch als Einzelnachweis betrieben werden soll.

Ein einfaches Verfahren zum Nachweis von nicht denaturierten Nukleinsäuren ist in U. S.

6,037, 127 beschrieben. Dieser Test wird in Form eines Trockenschnelltestes durchgeführt, bei dem in einer Ausführungsform Nukleinsäuresonden auf dem chromatographischen Material des Teststreifens immobilisiert sind. Die hier beschriebenen Testverfahren sind jedoch nicht hoch sensitiv.

Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine hoch sensitives Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren zu entwickeln, welches als Schnelltest einfach durchzuführen ist und welches eine sequenzspezifische Identifizierung, Differenzierung und Charakterisie- rung von Nukleinsäuren ermöglicht.

Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein hoch sensitives Verfahren zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren in Form eines Trockenschnelltestes ; der Trockenschnelltest enthaltend ein chromatographisches Material umfassend <BR> eine Probenaufnahmezone, - eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nu- kleinsäuresonden immobilisiert sind und - eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifischen Nukleinsäuresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind und weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte umfaßt : i) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Falle doppelsträngiger Nukleinsäuren denaturiert und anschließend neutralisiert, ii) die nachzuweisende Nukleinsäure wird auf die Probenaufnahmezone in einem Laufpuffer, welcher mild denaturierende Agenzien enthält, aufgetragen, iii) die nachzuweisende Nukleinsäure bewegt sich von der Probenaufnahmezone in Richtung Flüssigkeit absorbierende Zone, iv) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Bindungsbereich der Trennstrecke mit der se- quenzspezifischen Nukleinsäuresonde in Kontakt gebracht und hybridisiert an die sequenz- spezifische Nukleinsäuresonde v) die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisen- den Nukleinsäure an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde wird detektiert über eine Markierung, die an der nachzuweisenden Nukleinsäure angebracht ist oder über eine Markie- rung des Nukleinsäuredoppelstranges. Als Markierung gilt somit beispielsweise auch die De- tektion mit einem Antikörperkonjugat gegen einen DNS-Doppelstrang oder einen DNS/RNS- Doppelstrang (letzteres z. B. im Falle, daß die Sonde oder die Zielsequenz RNS ist.) Der Begriff Nukleinsäure und Oligonukleotid bezieht sich im Sinne der vorliegenden Erfin- dung auf Primer, Proben, Sonden und Oligomerfragmente, welche detektiert werden. Der Be- griff Nukleinsäure und Oligonukleotid ist weiterhin generisch zu Polydesoxyribonukleotiden (enthaltend 2-Deoxy-D-Ribose) und zu Polyribonukleotiden (enthaltend D-Ribose) oder zu jedem weiteren Typ von Polynukleotid, das ein N-Glykosid einer Purinbase oder einer Pyri- midinbase ist, beziehungsweise einer modifizierten Purinbase oder einer modifizierten Pyri- midinbase. Eingeschlossen sind somit erfindungsgemäß auch PNA's, d. h. Polyamide mit Purin-/Pyrimidin-Basen. Die Begriffe Nukleinsäure und Oligonukleotid werden im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht als verschieden angesehen, insbesondere soll die Verwendung der Begriffe keine Unterscheidung in Bezug auf die Länge bedeuten. Diese Begriffe schließen sowohl doppel-beziehungsweise einzelsträngige DNA, als auch doppel-beziehungsweise einzelsträngige RNA ein.

Unter Trockenschnelltest im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zu ver- stehen, welche eine chromatographische Auftrennnung des zu analysierenden Produkts er- möglicht. Besonders bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung ei- nes chromatographischen Materials mit einer Porengröße von 4 um und größer, am meisten bevorzugt größer als 8 um. Der Analyt wird durch Kapillarkräfte des chromatographischen Materials zu den Reaktionszonen wie z. B. die Trennzone gebracht.

Da der Analyt hauptsächlich hydrophiler Natur ist, sind hydrophile Eigenschaften des chro- matographischen Materials des Teststreifens wichtig für die Durchführung des erfindungsge- mäßen Verfahrens. Das chromatographische Material kann umfassen anorganische Puder wie silikatische Materialien, Magnesiumsulfat und Aluminium, kann weiterhin umfassen synthe- tische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere wie Nitrozellulose, Zelluloseace- tat, Zellulose, Polyvinylchlorid oder-acetat, Polyacrylamid, Nylon, vernetztes Dextran, Aga- rose, Polyacrylat u. s. w., kann weiterhin umfassen beschichtete Werkstoffe wie keramische Materialien und Glas. Am meisten bevorzugt ist die Verwendung von Nitrozellulose als chromatographisches Material. Zusätzlich kann die Einführung von positiv geladenen Ionen- gruppen in z. B. Nitrozellulose oder Nylonmembranen die hydrophilen Eigenschaften des chromatographischen Materials verbessern.

Der Trockenschnelltest umfaßt eine Probenaufnahmezone, eine Trennzone mit Bindungsbe- reich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind und eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone. Der Trockenschnelltest kann mehrere Trennzonen aufweisen. Der Trockenschnelltest kann zusätzlich Zonen umfassen, die markierende Substanzen enthalten, welche an den Ana- lyten beim Passieren dieser Zone binden. Üblich ist zum Beispiel eine Zone enthaltend ein Goldkonjugat zum Markieren des passierenden Analyten. Der Trockenschnelltest kann insbe- sondere die Form eines Teststreifens aufweisen.

Weitere gebräuchliche Varianten den Trockenschnelltest betreffend sowie das chromatogra- phische Material betreffend, sind im Stand der Technik, insbesondere in US 6,103, 127 be- schrieben.

Das chromatographische Material kann in einem Gehäuse oder ähnlichem montiert sein. Die- ses Gehäuse ist in der Regel Wasser unlöslich, rigid und kann aus einer Vielzahl von organi- schen und anorganischen Materialien bestehen. Wichtig ist, daß das Gehäuse nicht mit den kapillaren Eigenschaften des chromatographischen Materials interferiert, daß das Gehäuse nicht Testkomponenten unspezifisch bindet, und daß das Gehäuse nicht mit dem Detektions- system interferiert.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist, daß die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül mehr als 30 nm beträgt.

Die Länge des Linkers ist von entscheidender Bedeutung, um eine hohe Sensitivität der im- mobilisierten Sonde zu erreichen. Der Linker fungiert als Abstandshalter der Sonde zur Membran. Dies sind im vorliegenden Falle meist Polymere, die den zur Zielsequenz komple- mentären Teil der Sonde am 5'-oder 3'-Ende verlängern, aber selbst nicht kodierend sind.

Dies können Basenabfolgen einer nichtkodierender Nukleinsäuresäurestruktur sein oder ande- re Polymereinheiten wie z. B. Polyether, Polyester u. ä. Der Linker muß so beschaffen sein, daß er die Hybridisierungseigenschaften der Sonde nicht oder nur schwach negativ beeinflußt wird. Dies kann dadurch vermieden werden, daß keine selbstkomplementären Strukturen vor- handen sind. Auch müssen die chemischen Voraussetzungen für die irreversible Kopplung der Sonde an das Trägermaterial gegeben sein. Eine entscheidende Voraussetzung für ein gutes Funktionieren der Sonde über ihre Eigenschaften ein stabiles Hybrid mit der Zielsequenz zu bilden hinaus, ist die Chemie der Kopplung an die Oberfläche. Es müssen chemische Gruppen vorhanden sein, die bei den verwendeten Immobilisierungstechniken eine irreversible Bin- dung ermöglichen. Dies können Amine-, Thiolgruppen, Carboimide, Succinimide u. ä. sein.

Bevorzugt ist, daß die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Veranke- rungsmolekül mehr als 30 nm beträgt, insbesondere bevorzugt mehr als 40 nm. Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß der Linker Polythymidin ist. Die Länge synthetischer Linker ist oft limitiert. Bei der chemischen Synthese von Oligonukleotiden als Linker nach der Phos- phoramidit-Methode beispielsweise werden Ausbeute und Produktqualität nach einer Anzahl von Syntheseschritten so stark reduziert, daß die Länge des Oligonukleotids auf ca. 100 Mo- nomere beschränkt ist. Dies entspricht je nach Monomer in etwa einer Länge von ca. 30-40 nm. Bei enzymatischen Methoden der Oligonukleotidverlängerung z. B. durch eine terminale Transferase, ergibt sich immer ein Gemisch aus langen (bis mehreren hundert Monomeren) und sehr kurzen Oligonukleotiden.

Die Immobilisierung der sequenzspezifische Nukleinsäuresonden an die Membran bzw. das chromatographische Material erfolgt bevorzugt über einen Polymerlinker, der mit einem Ver- ankerungsmolekül verbunden ist. Am meisten bevorzugt ist, daß das Verankerungsmolekül Psoralen ist. Psoralen bietet als Crosslinkingreagenz die Möglichkeit, sehr lange Linker aus vollsynthetischen Oligonukleotiden zu bilden. Psoralen ist eine polyzyklische Verbindung, die in der Lage ist, bei UV-Licht einer Wellenlänge von ca. 360 nm photochemisch mit Pyri- midinresten zu koppeln. Besonders gut ist die Reaktion mit Thymidinresten. Durch die Kopplung von Sonden, die beispielsweise 5'endig eine Psoralen-haltige Polythymidinverlän- gerung besitzen, können durch Einwirkung von UV-Licht mittels Quervernetzung der Mole- küle Verlängerungen der Abstandshalter bzw. Linker entstehen. Durch eine Mischung von reinem Polythymidin ohne Verankerungsmolekül und Polythymidin mit Psoralenmodifikation als Verankerungsmolekül am Ende des Polythymidin-Linkers können Netzwerkstrukturen aufgebaut werden, die sich für die Hybridisierungseffizienz und die Sensitivität der Sonden als vorteilhaft erweisen. Des weiteren kann die DNS mit Psoralen-markierten Oligonukleoti- den gemischt und photo-vernetzt werden. Dies verbessert die Anheftung der Sonde an die Oberfläche. Als Verankerungsmolekül können erfindungsgemäß auch weitere Moleküle ein- gesetzt werden, wie z. B : Derivate des Psoralen, wie z. B. Bis (PIP) Cn-Psoralen oder andere dem Fachmann bekannte photoreaktive Vernetzungs-und Markierungsreagenzien, wie z. B. einfache Aryl-Azid-Vernetzer, fluorinierte Aryl-Azid-Vernetzer oder auf Benzophenon basie- rende Vernetzer.

Dem Fachmann sind jedoch auch andere Möglichkeiten bekannt, Abstandshalter beziehungs- weise Linker zwischen der Sonde und der Membran zu schaffen. Sondenoligonukleotide kön- nen beispielsweise über Proteine an die Membranoberfläche gebunden werden. Die mit der Sonde beladenen Proteine können dann nach Standardverfahren an die poröse Membran ge- bunden werden. Standardverfahren sind zum Beispiel die Kopplung über homobifunktionelle Kopplungsreagenzien oder heterobifunktionelle Kopplungsreagenzien. Bei homobifunktio- nellen sind die reaktiven Gruppen gleich. Typischerweise sind dies Amine und/oder Thiole.

Thiole können synthetisch direkt an Oligonukleotide gekoppelt werden und unter oxidativen Bedingungen mit z. B. Cysteinresten zu Disulfidbrücken reagieren. Für die Kopplung Amin- Amin können Amine als homobifunktionelle Kopplungsreagenzien direkt synthetisch an Oli- gonukleotide gekoppelt werden und über Imidoester oder Succinimidester an die Oberfläche oder das Protein gebunden werden. Bei heterobifunktionelle Kopplungsreagenzien sind die reaktiven Gruppen unterschiedlich und erlauben die Kopplung von verschiedenen funktio- nellen Gruppen. Bevorzugt ist die Ausbildung von Amino-Thiol-Kopplungen. Mit einem he- terobifunktionellen Kopplungsreagenz, welches sowohl eine Succinimidester-Maleimid oder Iodacetimid beinhaltet, können thiolierte Oligonukleotide gekoppelt werden. Ein weiteres wichtiges Kopplungsagenz sind die Carbodiimide, die Carbinylreste an Amine koppeln.

Wichtigster Vertreter ist hier das 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDAC).

Hier können an Membranen mit Carbonylresten aminmodifizierte Oligonukleotide gekoppelt werden. Bei dieser Chemie wird das Kopplungsreagenz nicht in die Verbindung eingebaut.

Erfindungsgemäß werden die Nukleinsäuresonden auf der festen Phase immobilisiert, und anschließend wird diese feste Phase mit der Zusammensetzung, welche die nachzuweisenden markierten Nukleinsäuren oder einen Teil davon enthält, in Kontakt gebracht. Vorzugsweise werden wenigstens zwei Sonden auf der festen Phase immobilisiert, bevorzugter wenigstens fünf Sonden, noch bevorzugter wenigstens zehn Sonden. Verschiedene Sonden können in verschiedenen Zonen immobilisiert sein.

Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren ist die nachzuweisende Nukleinsäure markiert.

Verschiedenste Markierungen sind dabei denkbar, wie z. B. Fluoreszenzfarbstoffe, Biotin oder Digoxigenin.

Bekannte Fluoreszenzmarkierungen sind Fluoreszein, FITC, Cyaninfarbstoffe, Rhodamine, Rhodamin6ooR-phycoerythrin, Texas Red usw.

Vorstellbar ist auch eine radioaktive Markierung, wie z. B. l25I, 35S, 32p, 35p.

Vorstellbar ist auch eine Partikelmarkierung wie z. B. mit Latex. Solche Partikel sind übli- cherweise trocken, im Micron-Bereich und uniform.

Die Markierungen sind üblicherweise kovalent mit den Oligonukleotiden verbunden. Wäh- rend eine Fluoreszenzmarkierung beispielsweise direkt nachgewiesen werden kann, können Biotin-und Digoxigeninmarkierungen nach Inkubation mit geeigneten Bindemolekülen oder Konjugatspartnem nachgewiesen werden. Andere Bindungspartner als beispielsweise Bio- tin/Streptavidin sind Antigen/Antibody-Systeme, Hapten/Anti-Hapten-Systeme, Bio- tin/Avidin, Folsäure/Folat-bindende Proteine, Komplementäre Nukleinsäuren, Proteine A, G und Immunoglobulin usw. (M : N : Bobrov, et al. J. Immunol. Methods, 125,279, (1989).

Beispielsweise kann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden, indem es mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die Streptavidin gekoppelt an ein Enzym enthält, wobei das Enzym, z. B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, ein Substrat umsetzt, das ei- nen Farbstoff erzeugt oder zu Chemielumineszenz führt. Mögliche Enzyme für diesen Ver- wendungszweck sind Hydrolasen, Lyasen, Oxido-Reduktasen, Transferasen, Isomerasen und Ligasen. Weitere Beispiele sind Peroxidasen, Glukoseoxidasen, Phosphatasen, Esterasen, und Glykosidasen. Derartige Verfahren sind dem Fachmann an sich bekannt (Wetmur JG. Crit Rev Biochem Mol Biol 1991 ; (3-4) : 227-59 ; Temsamani J. et al. Mol Biotechnol 1996 Jun ; 5 (3) : 223-32). Bei manchen Methoden, bei denen Enzyme als Konjugatspartner fungieren, müssen farbändernde Substanzen anwesend sein (Tijssen, P. Practice and Theory of Enzyme I munoassays in laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds. R. H.

Burton and P. H. van Knippenberg (1998).

Ein weiteres bevorzugtes Konjugat umfaßt ein Enzym, welches an einen Antikörper gekop- pelt wird (Williams, J. Immunol. Methods, 79,261 (1984). Weiterhin ist üblich die Markie- rung der nachzuweisenden Nukleinsäure mit einem Gold Streptavidin Konjugat, wobei dann ein Biotin-markiertes Zielnukleotid nachgewiesen werden kann. Vorstellbar sind jedoch auch Bindungspartner, die kovalente Bindungen miteinander eingehen, wie z. B. Sulfhydryl- reaktive Gruppen wie Maleimide und Haloacetyl-Derivate und Amin-reaktive Gruppen wie Isothiocyanate, Succinimidylester und Sulfonylhalide.

Im Falle der Markierung mit Konjugaten, kann das detektierbare Konjugat auf eine Zone des Trockenschnelltestes aufgetragen werden, die von der nachzuweisenden Nukleinsäure passiert wird, wobei in diese nachzuweisende Nukleinsäure der Konjugatspartner eingebracht wurde.

Werden die nachzuweisenden Nukleinsäuren markiert, dann sind die Sonden in der Regel nicht markiert. Die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren erfolgt somit im wesent- lichen nach im Stand der Technik beschriebenen Methoden (siehe auch US 6,037, 127).

Das Einbringen der Markierung in die nachzuweisende Nukleinsäure kann durch chemische oder enzymatische Methoden erfolgen, oder durch direkte Inkorporation von markierten Ba- sen in die nachzuweisende Nukleinsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform werden nachzuweisende Sequenzen, die Markierungen inkorporiert haben, durch markierte Basen oder markierte Primer während der PCR hergestellt. Markierte Primer können hergestellt werden durch chemische Synthese z. B. mittels der Phosphoramidit-Methode durch die Sub- stitution von Basen des Primers durch markierte Phosphoramiditbasen während der Primer- Synthese. Alternativ dazu können Primer hergestellt werden mit modifizierten Basen, an wel- che nach der Primer-Synthese Markierungen chemisch gebunden werden.

Denkbar sind auch Verfahren ohne daß die zu detektierende Nukleinsäure amplifiziert oder mit einer Modifikation versehen wird. Beispielsweise können ribosomale RNS Spezies mit einer DNS-Sonde spezifisch hybridisieren und mit einem RNS/DNS-spezifischen Antikörper als RNS/DNS-Hybrid nachgewiesen werden.

Eine andere Möglichkeit ist das Einbringen von Markierungen mit Hilfe der T4 Polynucleoti- de-Kinase oder eines terminalen Transferase-Enzyms. Vorstellbar sind so das Einbringen von radioaktiven oder fluoreszierenden Markierungen (Sambrook et. al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2,9. 34-9.37 (1989) ; Cardullo et. al. PNAS, 85, 8790 ; Morrison, Anal. Biochem, 174,101 (1988).

Markierungen können in eines oder in beide Enden der Nukleinsäuresequenz der nachzuwei- senden Nukleinsäure eingebracht werden. Markierungen können auch innerhalb der Nuklein- säuresequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebracht werden. In eine nachzuweisen- de Nukleinsäure können mehrere Markierungen eingebracht werden.

Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß die Denaturierung gemäß Verfahrensschritt i) mit NaOH erfolgt und die Neutralisierung gemäß Verfahrensschritt i) mit einem Phosphatpuffer oder Tris-Puffer. Eine Denaturierung ist auch durch andere Maßnahmen zu erreichen wie bei- spielsweise Kochen bei einer Temperatur größer als 95°C, eventuell unter Zusatz mild dena- turierender Chemikalien. Eine Denaturierung der nachzuweisenden Nukleinsäure ist immer dann notwendig, wenn doppelsträngige Nukleinsäuren in der Probe vorliegen. Es ist weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, daß der Laufpuffer gemäß Verfahrensschritt ii) Phosphat-bzw.

TRIS-Puffer ist und als mild denaturierendes Agens eines oder mehrere der nachfolgend ge- nannten im Laufpuffer enthalten sind : Formamid, DMSO, Harnstoff. Zur Neutralisierung und als Laufpuffer können jedoch erfindungsgemäß alle unten aufgeführten Laufpuffer verwendet werden. Der Puffer, der zur Neutralisierung verwendet wird, kann identisch sein zum Lauf- puffer.

Puffer und Lösungsmittel, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kön- nen, sind bekannt und Beispiele sind beschrieben in US 4,740, 468 und US 6,037, 127. Der pH für den Laufpuffer befindet sich normalerweise im Bereich von 4-11, bevorzugt im Bereich 5- 11 und am meisten bevorzugt im Bereich von 6-9. Der pH wird so gewählt, daß ein erhebli- ches Maß an Bindungsaffinität zwischen allen Bindungspartnern inklusive der hybridisieren- den Nukleinsäuren erhalten bleibt und auch ein optimales Signal vom Signal-produzierenden System erhalten werden kann. Typischerweise verwendete Puffer enthalten Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und ähnliches. Normalerweise spielt die Wahl des geeigneten Puffers keine kritische Rolle für das erfindungsgemäße Verfahren. Für spezielle Tests können jedoch einige Puffer mehr geeignet sein als andere. Herkömmliche Hybridisierungsverfahren werden mit erwärmten Lösungen in Hybridisierungsöfen oder Wasserbädern durchgeführt. Dies er- folgt typischerweise bei 30° bis 70°C, bevorzugt bei 50°C. Für ein Nukleinsäurenachweissy- stem im Trockenschnelltestformat muß bei Raumtemperatur gearbeitet werden. Um gute Sen- sitivitäten zu erzielen, ist es daher notwendig, die oben erwähnten mild denaturierenden Agenzien dem Laufpuffer hinzuzufügen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann natürlich bei allen Temperaturen zwischen 4°C und 50°C durchgeführt werden. Am zweckmäßigsten und daher bevorzugt ist jedoch die Raumtemperatur.

Der Begriff Hybridisierung bezieht sich auf die Bildung von Duplexstrukturen durch zwei einzelsträngige Nukleinsäuren aufgrund von komplementärer Basenpaarung. Hybridisierung kann zwischen komplementären Nukleinsäuresträngen oder zwischen Nukleinsäuresträngen erfolgen, welche kleinere Regionen an Fehlpaarung aufweisen. Die Stabilität des Nukleinsäu- ren-Duplexes wird gemessen durch die Schmelztemperatur Tm. Die Schmelztemperatur Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und pH), bei welcher 50% der Basenpaare dis- soziiert sind.

Bedingungen, bei denen lediglich vollständig komplementäre Nukleinsäuren hybridisieren, werden als stringente Hybridisierungsbedingungen bezeichnet. Stringente Hybridisierungsbe- dingungen sind dem Fachmann bekannt (z. B. Sambrook et al., 1085, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Im allgemeinen, werden stringente Bedingungen so ausgewählt, daß die Schmelztemperatur 5°C niedriger ist als die Tm für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und pH.

Wenn die Hybridisierung unter weniger stringenten Bedingungen durchgeführt wird, dann werden Sequenz-Fehlpaarungen toleriert. Das Ausmaß an Sequenz-Fehlpaarungen kann durch Veränderung der Hybridisierungsbedingungen kontrolliert werden.

Die Durchführung der Hybridisierung unter stringenten Bedingungen ist besonders wichtig für das erfindungsgemäße Verfahren. Stringent im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeu- tet, daß das Detektionsverfahren eine eindeutige Unterscheidung zwischen einer positiven Reaktion und einer negativen Reaktion im Reaktionsfeld des Streifens zuläßt. Dies kann ins- besondere durch folgende Maßnahmen erzielt werden : Struktur der Sonde : Durch die Länge der zur Zielsequenz komplementären Struktur der Son- de ; bevorzugt sind 15 bis 20mere.

Laufpuffer : Durch den Salzgehalt wird die Stringenz beeinflußt. Die Ionenstärke liegt bevor- zugt zwischen 100-400 mM, insbesondere bevorzugt um 250 mM.

Weiterhin kann durch die oben erwähnten mild denaturierenden Substanzen im Laufpuffer (DMSO, Formamid, Harnstoff) die Stringenz individuell eingestellt und optimiert werden.

Die Stringenz wird auch durch den pH-Wert des Laufpuffers beeinflußt. Alle der oben ge- nannten Maßnahmen sind letztlich Maßnahmen, die Einfluß auf Wasserstoffbrückenbindun- gen haben.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde eine Nuklein- säure mit einer spezifischen Sequenz ist, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingun- gen an die nachzuweisende Nukleinsäure hybridisiert. Spezifische Sequenz bedeutet, daß eine definierte Nukleinsäurestruktur von vielen anderen Strukturen unterschieden werden kann.

Dies kann zur Differenzierung von Mikroorganismen und Viren aber auch zu Unterscheidung von Nukleinsäurepolymorphismen bei genetischen oder epidemiologischen Fragestellungen sein.

Die nachzuweisende Nukleinsäure kann isoliert werden aus einer Vielzahl von Organismen wie bakteriellen und viralen Pathogenen. Die nachzuweisende Nukleinsäure kann auch Ge- genstand eines diagnostischen Nachweises für eine genetisch bedingte Krankheit sein. Die nachzuweisende Nukleinsäure kann jeder vorstellbaren Quelle entstammen, wenn die Detek- tion der Nukleinsäure oder Teile davon nachgewiesen, differenziert oder charakterisiert wer- den sollen. Meistens wird die nachzuweisende Nukleinsäure nicht direkt nachgewiesen, son- dern muß vorher amplifiziert werden. (Für die Darstellung von möglichen Amplifikations- methoden siehe auch US 6,037, 127. ) Die im folgenden beschriebene Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens soll die Erfindung näher erläutern. In dieser Ausführungsform ist die nachzuweisende Nukleinsäure ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis assoziierten Bakteriums oder komplementär zu diesem. In dieser Ausführungsform ist die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde eine Nu- kleinsäure mit einer speziesspezifischen Sequenz ist, welche unter stringenten Hybridisie- rungsbedingungen an die nachzuweisende Nukleinsäure hybridisiert. Bevorzugt ist die se- quenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus einer der folgenden Sequenzen bezie- hungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist : SEQ ID No. : 1-29, beziehungsweise ist ein Fragment davon. (siehe auch Abbildung 6 und 7) Dem Fachmann ist bewußt, daß ausgehend von der Lehre der vorliegenden Erfindung auch Sonden entworfen werden können, die geringfügig von den erfindungsgemäßen Sonden ab- weichen, aber dennoch funktionieren. So sind auch Sonden denkbar, die gegenüber den erfin- dungsgemäßen Sonden mit den Sequenzen SEQ ID No. 1-29 am 5'-und/oder 3'-Ende Ver- längerungen oder Verkürzungen um wenigstens ein, zwei oder drei Nukleotide aufweisen.

Ebenso ist denkbar, daß einzelne oder wenige Nukleotide einer Sonde durch andere Nukleoti- de austauschbar sind, solange die Spezifität der Sonde nicht zu stark verändert wird und der Schmelzpunkt der Sonde nicht zu stark verändert wird. Das schließt ein, daß bei Abwandlung die Schmelztemperatur der abgewandelten Sonde nicht zu stark von der Schmelztemperatur der ursprünglichen Sonde abweicht. Die Schmelztemperatur wird dabei nach der G (=4°C) + C (=2°C) Regel ermittelt. Dem Fachmann ist klar, daß neben den üblichen Nukleotiden A, G, C, T auch modifizierte Nukleotide wie Inosin usw. zur Anwendung kommen können. Die Lehre der vorliegenden Erfindung ermöglicht solche Modifikationen, ausgehend vom Gegen- stand der Ansprüche.

Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure oder einen Teil davon enthält, mit einer oder mehreren Sonden hybridisiert.

Prinzipiell ist möglich, das durch Hybridisierung mit einer einzelnen spezifischen Sonde die nachzuweisende Nukleinsäure und damit beispielsweise die Bakterienspezies zu bestimmen.

Es ist aber auch möglich, die Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure oder einen Teil davon enthält, mit mehr als einer Sonde zu hybridisieren. Dadurch wird die Aussagekraft des Verfahrens erhöht. Man erhält dann ein genaues Profil und kann die nach- zuweisende Nukleinsäure und damit beispielsweise die Bakterienspezies mit hoher Sicherheit bestimmen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren eine Vorrichtung zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens in Form eines Trockenschnelltestes enthaltend ein chromatographisches Material umfassend - eine Probenaufnahmezone, - eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nu- kleinsäuresonden immobilisiert sind und - eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifischen Nukleinsäuresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind.

Die bevorzugten Ausführungsformen der Vorrichtung entsprechen im wesentlichen denen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Bevorzugt erfolgt die Immobilisierung der sequenzspezifische Nukleinsäuresonden an die Membran über einen Polymerlinker erfolgt, der mit einem Verankerungsmolekül verbunden ist. Die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül, beträgt mehr als 30 nm beträgt. Bevorzugt beträgt die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymer- linkers mit Verankerungsmolekül, mehr als 40 nm. Insbesondere ist bevorzugt, daß der Linker Polythymidin ist.

Des weiteren ist bevorzugt, daß das Verankerungsmolekül Psoralen ist.

Bevorzugt ist das chromatographische Material der erfindungsgemäßen Vorrichtung Nitro- zellulose. Es ist weiterhin bevorzugt, daß das chromatographische Material eine Porengröße von 4 um und größer aufweist.

In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die sequenz- spezifische Nukleinsäuresonde eine Nukleinsäure, welche unter stringenten Hybridisierungs- bedingungen an ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis assoziierten Bakteriums oder an die dazu komplementäre Sequenz hybridisiert. In dieser Ausführungsform ist insbe- sondere bevorzugt, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus einer der folgenden Sequenzen beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist : SEQ ID No. : 1-29 beziehungsweise Fragmente davon enthält.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren die Verwendung der erfindungsge- mäßen Vorrichtung zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Nu- kleinsäuren, insbesondere zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Parodontitis assoziierten Bakterien.

Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung des erfindungsge- mäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Nachweis von Amplifikati- onsprodukten aus Amplifikationsverfahren wie der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und der Nukleinsäurestrang basierende Amplifikation (NASBA). Es wird darauf hingewiesen, daß die Amplifikationsprodukte auch durch andere Nukleinsäureamplifikationstechniken entstan- den sein können wie z. B. durch die Transcriptase vermittelte Amplifikation (TMA), Reverse Transcriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR), Q-beta Replicase Amplifikation (ß-Q- Replicase) und die Einzelstrangverdrängungs Amplification (SDA).

Abbildunssbeschreibung Abbildung 1 Abbildung eines Teststreifens geeignet für den erfindungsgemäßen Trockenschnelltest Abbildung 2 : Trockenschnelltest (A) positiv für Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis und Bacteroides forsythus, sowie Trockenschnelltest (B) positiv filr Actinobacillus actinomycetemcomitans. 150 ul Testansatz wurden auf das Auftragskissen des Tests getropft und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Als Sonden für (A) wurden (von oben nach unten) eine Laufkontrolle (Biotin-BSA) und die Sonden für Actinobacillus actinomycetemcomitans : 5'-PsoC6-T85-SEQ ID No. : 16, Porphyromonas gingivalis : 5'-PsoC6-T85-SEQ ID No. : 21 und Bacteroides forsythus : 5'PsoC6-T84-SEQ ID No. : 23 auf der Nitrozellulosemembran immobilisiert. Das heißt, daß alle Sonden jeweils 5Psoralen markiert sind und einen Polythymidinlinker von 85 Thymidinen aufweisen.

In (A) ist eine für alle drei Sonden positive Probe gezeigt, während in (B) nur ein Amplifikat des Actinobacillus actinomycetemcomitans spezifisch detektiert wurde. Die Amplifikation wurde mit einem speziesspezifischen Primerpaar durchgeführt (Primerpaar 5'-Biotin-SEQ ID No. : 14 ; 5'-Biotin-SEQ ID No. 4).

In Abbildung 2 verwendete Sonden : SEQ ID No. : 16 : 5'PsoC6-T85-ccgaagaagaactcag (A. actinomycetemconzitans) SEQ ID No. : 21 : 5'PsoC6-T85-catacacttgtattattgc (Po7phyromonas gingivalis) SEQ ID No. : 23 : 5'PsoC6-T85-aacaggggttccgca (Bacteroides forsythus) In Abbildung 2 verwendete Primer : SEQ ID No. : 14 : 5'-Biotin-ggattggggtttagcccc SEQ ID No. 4. : 5'-Biotin-ggataagggttgcgctcgtt Abbildung 3 : Einfluß der Länge des Linkerarms auf die Sensitivität. Variation der Sonde SEQ ID No. : 16 im Polythymidinlinker : (A) ohne Linker, (B) 20 Thymidinresten und (C) 100 Thymidinresten.

Als Amplifikat diente Actinobacillus actinomycetemcofnitans (Primerpaar 5'-Biotin-SEQ ID No. : 14 ; 5'-Biotin-SEQ ID No. 4).

Abbildung 4 : Einfluß der Psoralenmarkierung auf die Sensitivität. In (A) wurde die Sonde SEQ ID No. 16 mit Polythymidinlinker von 85 Thymidinresten ohne Psoralenmarkierung und in (B) mit Psoralenmarkierung immobilisiert. Amplifiziert wurde jeweils Actinobacillus actinomycetem- comitans (Primerpaar 5'-Biotin-SEQ ID No. : 14 ; 5'-Biotin-SEQ ID No. 4).

Abbildung 5 : Einfluß mild denaturierender Verbindungen auf die Sensitivität. Denaturiertes Actinobacillus actinomycetemcomitans-Amplifikat (Primerpaar 5'-Biotin-SEQ ID No. : 14 ; 5'-Biotin-SEQ ID No. 4) wurde mit Hybridisierungspuffer (A) ohne DMSO, (B) 10 % DMSO, 20 % DMSO und 30 % DMSO auf den Trockenschnelltest aufgetragen. (Sonde SEQ ID No. 16, psoralenmar- kiert und mit dem Polymidinlinker mit 85 Polymidinresten).

Abbildung 6 und Abbildung 7 Sequenzen SEQ ID No. 1-29, Nukleinsäuresonden für den Nachweis Parodontitis assoziierter Bakterien Beispiel 1 Nachweis Parodontitis assoziierter Bakterien mit Hilfe des erfindungsgemäßen Trocken- schnelltestes Dazu werden die Sonden SEQ ID No. 1-29 (die Sonden sind am 5'-Ende mit Psoralen modi- fiziert) auf eine Nitrozellulosemembran aufgebracht und durch UV-Bestrahlung gebunden.

Der Aufbau des Schnelltestes ist in Abbildung 1 dargestellt.

DNS-Isolierung : Dazu wurde von Festmedien mit einer sterilen Impföse bäkterielles Material entnommen und in 300110mM Tris/HCl pH 7,5 suspendiert. Aus Flüssigkulturen wurde lml entnommen, 5min bei 13. 000rpm in einer Tischzentrifuge zentrifugiert, der Überstand ver- worfen und in 300111 10mM Tris/HCl pH 7,5 resuspendiert. Die so erhaltenen Zellsuspensio- nen wurden 15min bei 95°C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) in- kubiert, 15min in einem Ultraschallbad (Bandelin electronic, Berlin, Deutschland) beschallt und 10min bei 13. 000rpm in einer Tischzentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) zen- trifugiert. Vom Überstand wurden jeweils 5ll1 in die Amplifikationsreaktion eingesetzt.

Amplifikation : Alle Primer wurden kommerziell synthetisiert (Interactiva, Ulm, Deutschland). Der PCR- Ansatz enthielt 1 x Taq-Puffer (Qiagen, Hilden, Deutschland), je lM Primer, 200uM dNTP (Roche, Mannheim, Deutschland) und 1U Hotstar Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland). Die PCR-Amplifikation wurde auf einem Thermocycler PE 9600 (ABI, Wei- terstadt, Deutschland) mit 15min 95°C, 10 Zyklen mit 30sek 95°C und 2min 60°C und mit 20 Zyklen lOsek 95°C, 50sek 55°C und 30sek 70°C durchgeführt.

DNS-Amplifikat wurde mit einem ethidiumbromidgefärbtem Agarosegel nachgewiesen.

Auf eine Nitrozellulosemembran AE 99 (Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland) wurden in Form von Linien durch einen Probenautomat 3"Freemode" (CAMAG, Berlin, Deutsch- land) 5'-Psoralenmarkierte Oligonukleotidsonden (Aal, Pg2, Bf) gelöst in 3 x SSC ! (10 x SSC-Lösung 1,5M NaCl, 0, 15M Trinatriumcitrat) aufgetragen. Als Färbekontrolle wurde eine Linie Biotin-BSA (SIGMA, München, Germany) lmg/ml aufgesprüht. Die Oligonukleotide wurden auf der Membran, nachdem sie vollständig getrocknet waren, in einem UV- Crosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) bei 1200 Joule/cm2 fixiert. Die beschichtete Membran wurde auf einen Vinylrücken geklebt und mit einem Probenkissen (Grad 903 Papier, Schleicher & Schüll, vorbehandelt mit 0, O1M Natriumtetraborat, 1% Triton X-100, pH 7,4) und einem Zugkissen (Grad 470 Papier, Schleicher & Schüll) versehen. Die geschnittenen Streifen wurden in ein Kunststoffgehäuse eingepackt.

Für die Detektion wurden mit Streptavidin konjugierte Goldpartikel 20nm (British Biocell, Cardiff, Großbritannien) OD524,4, 0 benützt. 3) J. l dieser Goldpartikelsuspension wurden mit 201l1 biotiniliertem Amplifikat vermischt 5min inkubiert. Die Denaturierung des Amplifikats wurde durch Zugabe einer NaOH-Lösung (Endkonzentration 200 mM) erreicht. Nach fünf- minütiger Inkubation wurde die Lösung in 1501l1 Laufpuffer bestehend aus 250 mM Phos- phatpuffer, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1% Tween 20 und 20% DMSO (SIGMA, München, Germany) neutralisiert und komplett auf die Auftragszone gegeben. Nach ca. 5 min können die entwickelten Zonen abgelesen werden.

Beispiel 2 : Einfluß der Länge des Linkerarms auf die Sensitivität Um eine größere Sensitivität zur Verfügung zu haben, wurde die Detektion für die nachfol- genden Experimente ohne konjugierte Partikel, sondern durch eine Alkalische Phosphatase katalysierte Färbung mit NBT/BCIP durchgeführt. Dazu wurde der Streifen, nachdem die Zielnukleinsäure im Trockenschnelltestverfahren hybridisiert hatte, aus dem Gehäuse ge- nommen und einmal in 1 x SSC für 1 min gewaschen. Durch Inkubation in 5g/1 Blockingrea- genz (Roche, Mannheim, Deutschland) in Maleinsäurepuffer pH 7,5 (8,26 g NaCl und 10,06 g Maleinsäure in 1 1 Wasser) mit Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat (1 : 5000 Ver- dünnung, Dianova, Hamburg, Deutschland) für 15 min. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer (3 x SSC, 0,1% Tween 20) konnten die hybridisierte DNS durch Inkubation in Substratpuffer (274mM Tris/Cl pH 7,5, 68,6 mM Na3Citrat, 200mM NaCl, 27,4 mM MgCl2 x 6 H20) mit NBT (75 mg/ml Nitroblautetrazoliumsalz in 70% Dimethylformamid) und BCIP (50 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indonylphosphat-toluidiniumsalz in 100% Dimethylforma- mid) gefärbt werden.

Auf den Streifen wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben die Sonde SEQ ID No. 16 ohne Polythymidinlinker, die gleiche Sonde mit Polythymidinlinker aus 20 Thymidinresten und mit 100 Thymidinresten hybridisiert und mit NBT/BCIP entwickelt. Als Amplifikat diente Ac- tinobacillus actinomycetemcomitans (Primerpaar 5'-Biotin-SEQ ID No. : 14 ; 5'-Biotin-SEQ ID No. 4). Es ist eine deutliche Sensitivitätsabstufung korrelierend mit der Länge des Linkers zu sehen (siehe Abbildung 3). Die Sonde deren Linker 100 Thymidinresten lang ist, zeigt die höchste Sensitivität.

Beispiel 3 : Einfluß der Psoralenmarkierung auf die Sensitivität Auf den Streifen wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben die Sonde SEQ ID No. 16 mit Po- lythymidinlinker aus 100 Thymidinresten mit und ohne 5'-Psoralenmarkierung hybridisiert und mit NBT/BCIP entwickelt. Als Amplifikat diente Actinobacillus actinomycetemcomitans (Primerpaar 5'-Biotin-SEQ ID No. : 14 ; 5'-Biotin-SEQ ID No. 4). Es ist eine deutliche Sensiti- vitätsabstufung korrelierend mit dem Vorhandensein der Psoralenmarkierung zu sehen. (Abb.

4). Psoralenmarkierte Sonden sind sensitiver.

Beispiel 4 Einfluß mild denaturierender Verbindungen auf die Sensitivität : Auf den Streifen wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben die Sonde SEQ ID No. 16 mit Po- lythymidinlinker aus 100 Thymidinresten und mit 5'-Psoralenmarkierung hybridisiert und mit NBT/BCIP entwickelt. Denaturiertes Actinobacillus actinomycetenacomitans-Amplifikat (Primerpaar 5'-Biotin-SEQ ID No. : 14 ; 5-Biotin-SEQ ID No. 4) wurde mit Hybridisierungs- puffer (A) ohne DMSO, (B) 10 % DMSO, 20 % DMSO und 30 % DMSO auf den Trocken- schnelltest aufgetragen. Das heißt, der Laufpuffer enthält steigende Konzentration von DMSO von 0,10, 20 und 30%. Der Test wird sensitiver bei DMSO Konzentrationen von mehr als 10%. (Abb. 5)