DOMAINE TECHNIQUE

L’invention a trait à un procédé de production in vitro de neurones de mammifères. Plus particulièrement, le procédé selon l’invention permet de produire des neurones exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau (2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R). L’invention trouve des applications en lien avec les maladies neurodégénératives, notamment dans le domaine du diagnostic et de la thérapie cellulaire, ainsi que pour l’identification et le développement de nouveaux traitements thérapeutiques.

ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE

Tau est une protéine multifonctionnelle, identifiée à l'origine comme une protéine cytoplasmique associée aux microtubules. Six isoformes de Tau sont exprimées dans le cerveau humain adulte, résultant de l'épissage alternatif du gène MAPT. L'épissage de Tau est régulé au cours du développement de telle sorte que seule l’isoforme la plus courte de Tau est exprimée dans le cerveau fœtal, contrairement au cerveau adulte qui exprime les 6 isoformes.

L'accumulation de dépôts intracellulaires pathologiques de la protéine Tau est la marque de nombreuses maladies neurodégénératives appelées tauopathies (Sergeant et al., 2008). Il est important de noter que la composition protéique (identité des isoformes de Tau présentes), la morphologie et la distribution anatomique des dépôts intracellulaires de Tau permettent de distinguer les différentes tauopathies. Dans la maladie d'Alzheimer (MA), les 6 isoformes Tau sont anormalement phosphorylées et agrégées. Dans la maladie de Pick, les isoformes de Tau 3R prédominent, tandis que des formes agrégées de Tau 4R prévalent dans la dégénérescence corticobasale et la paralysie supranucléaire progressive. D’autre part, plus de 50 mutations délétères ont été identifiées au sein du gèn QMAPT chez des patients atteints de démence lobaire frontotemporale liés au chromosome 17 (FTDP-17). Les mutations identifiées conduisent soit à une capacité réduite des protéines Tau à interagir avec les microtubules ou d'autres partenaires, soit à une surproduction d'isoformes 4R, ce qui entraîne un changement dans le rapport entre les isoformes 3R et 4R dans la cellule.

Au cours de la dernière décennie, la technologie des cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) a ouvert de nouvelles perspectives dans la modélisation des maladies humaines. Plusieurs groupes ont déjà démontré que les neurones dérivés d'iPSC peuvent être un outil précieux pour étudier les tauopathies. Cependant, l'immaturité relative des neurones issus d'iPSC constitue un défi majeur pour la récapitulation in vitro de la pathologie Tau. De nombreuses études ont montré que les neurones corticaux dérivés d'iPSC de type « sauvage » expriment principalement l'isoforme Tau embryonnaire 0N3R (Biswas et al, 2016 ; Hallmann et al, 2017 ; Imamura et al, 2016 ; Iovino et al, 2015 ; Sato et al, 2018 ; Silva et al, 2016 ; Verheyen et al, 2018, 2015). Même si la plupart de ces études ont décrit une transition de isoforme 0N3R unique vers la production mixte d’isoformes Tau 3R et 4R au cours de la procédure de différenciation, l'isoforme Tau 0N3R reste largement majoritaire. L'allongement du temps de culture jusqu'à 365 jours a permis la détection des isoformes protéiques 0N3R, 0N4R, 1N3R et 1N4R de Tau dans les neurones dérivés d'iPSC (Lovino et al., 2015 ; Sposito et al., 2015), mais toujours avec une prédominance du 0N3R. La présence d'isoformes de Tau adultes a également été décrite au niveau ARN dans les neurones corticaux dérivés d'iPSC (Ehrlich et al., 2015). Cependant, les isoformes protéiques correspondantes n'ont pas pu être détectées. Seule l'isoforme fœtale Tau 0N3R était présente dans ces neurones corticaux dérivés d'iPSC.

Il existe donc un besoin en modèle de neurones adultes, c’est-à-dire exprimant les 6 isoformes de la protéine T, afin de pouvoir étudier les tauopathies, notamment les tauopathies liées à Tau 4R.

RESUME DE L’INVENTION

En travaillant sur la différenciation des neurones et l’expression des différentes isoformes de la protéine Tau chez l’adulte, les inventeurs ont découvert qu’il est possible de produire in vitro des neurones exprimant les 6 isoformes en cultivant des cellules souches dans des microcompartiments cellulaires creux à base d’alginate, permettant une culture en 3D, dans un milieu de culture permettant la différenciation neuronale. Avantageusement, cette étape est conduite au sein d’un bioréacteur dans lequel les microcompartiments sont maintenus en suspension dans ledit milieu de différenciation neuronale. Les inventeurs ont également mis en évidence qu’en utilisant un milieu de différenciation neuronale particulier comprenant du chlorure de sodium, un sel inorganique neuroactif, de la glycine, de la L-alanine et de la L- serine, il est possible d’obtenir des cellules neuronales post-mitotiques comprenant les 6 isoformes de la protéine Tau dans des temps relativement courts, compris entre 5 et 50 semaines. Les inventeurs ont ainsi mis au point des procédés de culture permettant d’obtenir de tels neurones après seulement quelques semaines.

L’invention a donc pour objet un procédé de production in vitro de neurones de mammifère exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau (2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R), comprenant une étape de différentiation neuronale, selon laquelle on cultive des microcompartiments cellulaires comprenant chacun une capsule creuse en hydrogel entourant des cellules neuronales post-mitotiques et une matrice extracellulaire, ladite étape de différentiation neuronale étant réalisée dans un bioréacteur, les microcompartiments cellulaires étant maintenus en suspension dans une enceinte dudit bioréacteur contenant un milieu de différenciation neuronale pendant une période comprise entre 5 semaines et 100 semaines. L’invention a également pour objet un procédé de production in vitro de neurones de mammifère exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau (2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R), comprenant une étape de de différentiation neuronale selon laquelle on cultive pendant une période comprise entre 5 semaines et 100 semaines, préférentiellement entre 5 et 50 semaines, plus préférentiellement entre 10 et 50 semaines, encore plus préférentiellement entre 25 et 50 semaines, entre 25 et 40 semaines, entre 25 et 35 semaines, entre 25 et 30 semaines, entre 20 et 50 semaines, entre 20 et 40 semaines, entre 20 et 35 semaines, entre 20 et 30 semaines, ou entre 20 et 25 semaines, des microcompartiments cellulaires comprenant chacun une capsule creuse en hydrogel entourant des cellules neuronales post-mitotiques et une matrice extracellulaire dans un milieu de différenciation neuronale comprenant au moins un sel inorganique neuroactif, de la glycine, de la L-alanine et de la L-serine. Lesdits composés sont chacun présents à une concentration qui maintient la survie et la fonctionnalité neurale d'une cellule neuronale.

L’invention a également pour objet des cellules neuronales post-mitotiques non naturelles, susceptibles d’être obtenues par le procédé selon l’invention, dans lesquelles les 6 isoformes de la protéine Tau sont exprimées.

Par cellules neuronales post-mitotiques non naturelles, on entend des cellules obtenues par culture in vitro dans des conditions contrôlées de cellules aptes à se différencier en cellules neuronales, telles que des cellules pluripotentes, par opposition à des cellules obtenues par prélèvement sur un sujet humain tel qu’un sujet humain adulte. Ainsi, l’invention a pour objet des cellules neuronales post-mitotiques issues de culture cellulaire, susceptibles d’être obtenues par le procédé selon l’invention, dans lesquelles les 6 isoformes de la protéine Tau 2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R et 0N3R sont exprimées.

Avantageusement, de telles cellules neuronales post-mitotiques présentent un ratio d’expression des isoformes de 3R et 4R compris entre 1/3 et 3, plus préférentiellement compris entre ½ et 2, encore plus préférentiellement compris entre ¾ et 4/3, idéalement à 10% d’un ratio équimolaire. Les isoformes 2N, IN et ON représentent avantageusement, respectivement, plus de 3%, plus de 17% et moins de 90% des isoformes totales, préférentiellement respectivement plus de 5%, plus de 26% et moins de 50%, encore plus préférentiellement respectivement plus de 8%, plus de 45% et moins de 45%, idéalement respectivement 9%, 54%, and 37%.

DESCRIPTION DES DESSINS

[Fig 1] montre une caractérisation moléculaire des iPSC, des NSC et des neurones dérivés d’iPSC. Analyse par RT -PCR à 15, 20 et 25 semaines (15s, 20s, 25s), des iPSCs (A), NSCs (B) et neurones différenciés à différents points de différenciation (C-F), en utilisant le marqueur de pluripotence POU5F1 (A), le marqueur des NSC OTX-1 (B), deux marqueurs spécifiques des neurones de la couche supérieure du cortex : CALB1 (C) et RELN (D), GF AP comme marqueur d'astrocyte (E) et le marqueur spécifique des oligodendrocytes CLDN11 (F). Les cellules ont été différenciées pendant 15, 20 ou 25 semaines (w), en milieu DMEM/F12 - Neurobasal (D/N) ou BrainPhys.

[Fig 2] montre la détection des 6 isoformes adultes d'ARNm de MAPT dans des extraits de cerveau. (A) Représentation schématique des différentes isoformes de MAPT analysées. Les tailles attendues pour chaque produit de PCR ont été calculées en fonction de l'emplacement des amorces couvrant les exons 1 et 11. (B) Chaque pic correspond à une isoforme MAPT différente. L'axe Y affiche la fluorescence en unités arbitraires et l'axe X indique la taille en pb.

[Fig 3] montre l’expression des isoformes d'ARNm et de protéines MAPT adultes dans les neurones dérivés d'iPSC (A) Représentation de l'expression relative des 6 isoformes de MAPT dans les neurones induits à partir d’iPSC après 15, 20 et 25 semaines de maturation par analyse RT-qPCR. Les cellules ont été différenciées pendant 15, 20 ou 25 semaines (s), en milieu DMEM/F12 - Neurobasal (D/N) ou BrainPhys. (B) L'analyse par Western Blot de protéines extraites de capsules neuronales de 25 semaines maintenues en BrainPhys. Le traitement avec la Lambda phosphatase révèle la présence de 4 isoformes de Tau, correspondant à 1N4R, 1N3R, 0N4R et 0N3R. Les isoformes 2N ne sont pas détectables.

[Fig 4] représente la quantification de l'expression relative des 6 isoformes adultes d'ARNm de MAPT Les isoformes d'ARNm de MAPT ont été quantifiées soit individuellement (A), soit regroupées en fonction de l'inclusion de l'exon 10 (B), soit de l’inclusion des exons 2 et 3 (C). (A) Les données représentent l'écart type moyen (SD) d'au moins deux expériences indépendantes.

[Fig 5] montre la détection et quantification des isoformes adultes d'ARNm d MAPT. Analyses spécifiques de la proportion relative des isoformes ON, IN et 2N (A), ou des isoformes 3R et 4R (B) dans les NSC ou dans les neurones dérivés des iPSC par RT-qPCR. Les cellules neuronales ont été différenciées pendant 15, 20 ou 25 semaines (w), en milieu DMEM/F12 - Neurobasal (D/N) ou BrainPhys. Pour chaque analyse (A, B), une représentation schématique des différentes isoformes d'ARNm de MAPT analysées, la taille attendue du produit de PCR calculée en fonction de l'emplacement des amorces et un électrophérogramme représentatif sont présentés. L'axe Y affiche la fluorescence en unités arbitraires et l'axe X indique la taille en pb. (C) Les valeurs quantitatives sont indiquées dans les tableaux. Les données représentent l'écart type moyen (SD) d'au moins deux expériences indépendantes.

[Fig 6] montre la détection et quantification des isoformes adultes d'ARNm de MAPT après exclusion des transcrits 0N3R. Analyses spécifiques des transcrits 1N3R, 1N4R, 2N3R et 2N4R (A) ou des isoformes 4R-Tau (B) dans des extraits de cerveau ou dans des capsules neuronales de 25 semaines maintenues en BrainPhys par RT-qPCR. (A) L'utilisation des amorces ex2 et exl 1 a permis d'amplifier uniquement les isoformes IN et 2N. (B) L'utilisation des amorces exl et exlO a permis l'amplification spécifique des isoformes 4R. Pour chaque analyse (A, B), une représentation schématique des différentes isoformes de MAPT analysées et la taille attendue du produit de PCR calculée en fonction de l'emplacement des amorces sont présentées. Les valeurs quantitatives correspondantes sont indiquées dans les tableaux de gauche (A : amplification ex2/exl l, B : amplification exl/exlO). Les tableaux de droite (A, B : exl/exl l) présentent les données obtenues lorsque les 6 isoformes d'ARNm de MAPT ont été simultanément amplifiées à l'aide de l'exl-exl 1 (Fig. 4A) et l'expression relative des isoformes 1N3R, 1N4R, 2N3R et 2N4R calculée sans inclure les isoformes ON (A) ou l'expression relative des isoformes 0N4R, 1N4R et 2N4R calculée sans inclure les isoformes 3R (B).

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

La présente invention concerne un procédé de culture et de production de cellules neuronales post-mitotiques exprimant les 6 isoformes 2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R de la protéine Tau. Ce profil d’expression est caractéristique des neurones adultes, et ne se retrouve pas notamment au niveau embryonnaire. Jusqu’à présent, les procédés de production in vitro de cellules neuronales n’avaient pas abouti à la production de cellules neuronales exprimant ces 6 isoformes. Les inventeurs ont eu le mérite de découvrir et montrer qu’il est possible de produire in vitro de tels neurones, à haut débit et dans des délais raisonnables (de l’ordre de quelques dizaines de semaines), en combinant une culture de cellules en 3D à un milieu de différenciation.

L’utilisation de microcompartiments cellulaires comprenant une enveloppe externe creuse d’hydrogel encapsulant les cellules et de la matrice extracellulaire est particulièrement avantageuse et permet, dans le cadre de la présente invention, de favoriser la différentiation cellulaire et la maturation des neurones jusqu’au stade post-mitotique caractéristique des neurones adultes.

Microcompartiment cellulaire

Le procédé selon l’invention met en œuvre des microcompartiments cellulaires renfermant des cellules. Chaque microcompartiment cellulaire comprend une capsule creuse en hydrogel réticulé, dans laquelle sont logées des cellules, noyées dans une matrice extracellulaire.

Dans un mode de réalisation, la capsule d’hydrogel renferme un unique ensemble de cellules. Par unique, on entend que la capsule ne contient qu’un groupe de cellules, qui peut être plus ou moins cohésif. Notamment, un ensemble de cellules unique s’entend d’une structure cellulaire tridimensionnelle dans laquelle chaque cellule dudit ensemble est en contact physique avec au moins une autre cellule dudit ensemble.

Avantageusement, les cellules sont autoorganisées en un ensemble de cellules positionnées de manière particulière les unes par rapport aux autres pour créer des interactions et communications cellulaires et former une microstructure tridimensionnelle d’intérêt. Chaque microcompartiment comprend ainsi une couche externe d’hydrogel, ou capsule d’hydrogel, renfermant un ensemble de cellules autoorganisées. Les cellules peuvent se multiplier, s’organiser et/ou se différencier au sein de la capsule d’hydrogel.

Dans le contexte de l’invention, « la couche externe d’hydrogel », ou « coque d’hydrogel », désigne une structure tridimensionnelle formée à partir d’une matrice de chaînes de polymères gonflée par un liquide, et préférentiellement de l’eau. Une telle couche externe d’hydrogel est obtenue par réticulation d’une solution d’hydrogel. Avantageusement, le ou les polymères de la solution d’hydrogel sont des polymères réticulables lorsque soumis à un stimulus, tel qu’une température, un pH, des ions, etc. Avantageusement, la solution d’hydrogel utilisée est biocompatible, en ce sens qu’elle n’est pas toxique pour les cellules. La couche d’hydrogel permet avantageusement la diffusion de gaz dissous (et notamment d’oxygène et/ou de dioxyde de carbone), de nutriments, et de déchets métaboliques pour permettre la survie, la prolifération, la différenciation, la maturation des cellules et/ou la production de molécules ou d’assemblages moléculaires d’intérêt et/ou la récapitulation de comportements cellulaires d’intérêt. Les polymères de la solution d’hydrogel peuvent être d’origine naturelle ou synthétique. Par exemple, la solution d’hydrogel contient un ou plusieurs polymères parmi les polymères à base de sulfonate, tel que le polystyrène sulfonate de sodium, les polymères à base d’acrylate, tel que le polyacrylate de sodium, le polyéthylène glycol diacrylate, le composé gélatine méthacrylate, les polysaccharides, et notamment les polysaccharides d’origine bactérienne, telle que la gomme gellane, ou d’origine végétale, telles que la pectine ou l’alginate. Dans un mode de réalisation, la solution d’hydrogel comprend au moins de l’alginate. Préférentiellement, la solution d’hydrogel ne comprend que de l’alginate. Dans le contexte de l’invention, on entend par « alginate » des polysaccharides linéaires formés à partir de b-D- mannuronate (M) et a-L-guluronate (G), des sels et dérivés de ceux-ci. Avantageusement, G alginate est un alginate de sodium, composé à plus de 80% de G et moins de 20% de M, avec une masse moléculaire moyenne de 100 à 400 kDa (par exemple : PRONOVA® SLG100) et une concentration totale comprise entre 0.5% et 5% en masse volumique (poids/volume).

Préférentiellement le microcompartiment cellulaire est clos. C’est la couche externe en hydrogel qui confère sa taille et sa forme au microcompartiment cellulaire. Le microcompartiment peut avoir n’importe quelle forme compatible avec l’encapsulation de cellules. Préférentiellement, la couche de matrice extracellulaire forme un gel. La couche de matrice extracellulaire comprend un mélange de protéines et de composés extracellulaires nécessaires à la culture cellulaire, par exemple de cellules pluripotentes. Préférentiellement, la matrice extracellulaire comprend des protéines structurelles, telles que de la laminine 521, 511 ou 421, de rentactine, de la vitronectine, des laminines, du collagène, ainsi que des facteurs de croissance, tels que du TGF-béta et/ou de l’EGF. Dans un mode de réalisation, la couche de matrice extracellulaire consiste en, ou contient du Matrigel® et/ou de la Geltrex®.

Selon l’invention, le microcompartiment peut contenir, à la place de la matrice extracellulaire, un substitut de matrice extra-cellulaire. Un substitut de matrice extracellulaire s’entend d’un composé capable de favoriser l’attachement et/ou la survie des cellules en interagissant avec les protéines de membrane et/ou les voies de transduction du signal extracellulaire. Par exemple, un tel substitut comprend les polymères biologiques et leurs fragments notamment les protéines (laminines, vitronectines, fibronectines et collagènes), les glycosaminoglycanes non sulfatés (acide hyaluronique) ou sulfatés (chondroïtine sulfate, dermatane sulfate, kératane sulfate, héparane sulfate), et polymères synthétiques contenant des motifs issus des polymères biologiques ou reproduisant leurs propriétés (motif RGD) et les petites molécules mimant l’attachement à un substrat (inhibiteurs de Rho-A kinase tel que Y-27632 ou thiazovivin).

Toute méthode de production de microcompartiments cellulaires contenant à l’intérieur d’une capsule d’hydrogel de la matrice extracellulaire et des cellules peut être utilisée pour la mise en œuvre du procédé de préparation selon l’invention. Notamment, il est possible de préparer des microcompartiments en adaptant la méthode et le dispositif microfluidique décrits dans Alessandri et al., 2016 (« A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and différentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC) », Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604).

Avantageusement, les dimensions du microcompartiment cellulaire sont contrôlées. Dans un mode de réalisation, le microcompartiment cellulaire selon l’invention a une forme sphérique. Préférentiellement, le diamètre d’un tel microcompartiment est compris entre 10 pm et 1 mm, plus préférentiellement entre 75 et 750 pm, plus préférentiellement compris entre 100 et 500 pm, encore plus préférentiellement entre 150 et 300 pm, +/- 10%. Dans un autre mode de réalisation, le microcompartiment cellulaire selon l’invention a une forme allongée. Notamment, le microcompartiment peut avoir une forme ovoïde ou tubulaire. Avantageusement, la plus petite dimension d’un tel microcompartiment ovoïde ou tubulaire est comprise entre 10 pm et 1 mm, plus préférentiellement entre 75 et 750 pm, plus préférentiellement compris entre 100 et 500 pm, encore plus préférentiellement entre 150 et 300 pm, +/- 10%. Par « plus petite dimension », on entend le double de la distance minimale entre un point situé sur la surface externe de la couche en hydrogel et le centre du microcompartiment.

Dans un mode de réalisation particulier, l’épaisseur de la couche externe en hydrogel représente 5 à 40% du rayon du microcompartiment. L’épaisseur de la couche de matrice extracellulaire représente 5 à 80 % du rayon du microcompartiment et est avantageusement accrochée sur la face interne de la coque en hydrogel. Cette couche de matrice peut combler l’espace entre les cellules et la coque en hydrogel. Dans le contexte de l’invention, « l’épaisseur » d’une couche est la dimension de ladite couche s’étendant radial ement par rapport au centre du microcompartiment.

Milieu de différenciation neuronale

Selon l’invention, des cellules neuronales post-mitotiques exprimant les 6 isoformes sont obtenues dans un délai de production relativement court, et notamment inférieur à 100 semaines, et plus préférentiellement inférieur à 50 semaines. Pour cela, les microcompartiments sont maintenus dans un milieu de différenciation neuronal.

De tels milieux sont connus de l’homme de l’art. Il est notamment possible d’utiliser du milieu dit N2B27 (500 ML DMEM/F12, 500mL Neurobasal, 5mL N2 medium complément, 10 mL B27 medium complément). Avantageusement, un tel milieu est complémenté dans une première phase (10 à 15 premiers jours, phase d’induction neurale) par des molécules bloquant les voies de signalisation liées à BMP2 (telles que le LDN-193189 ou la protéine Noggin) et la voie de signalisation TGF-beta (telles que le SB-431542), et/ou dans une seconde phase optionnelle par des molécules activant les voies de signalisation liées à EGF-1 et FGF-2 (phase d’amplification de cellules souches neurales), et/ou complémenté dans une phase de différenciation terminale par des molécules activant les voies de signalisation neurotrophiques (par exemple la voie de transduction BDNF) et des molécules bloquant les voies de transduction du signal Notch (par exemple le compound E ou un autre inhibiteur de gamma-secretase)

Dans un mode de réalisation particulier, les microcompartiments cellulaires, contenant des cellules souches, éventuellement déjà différentiées en cellules neuronales post-mitotiques, sont mis en culture dans un milieu de différenciation neuronale particulier, comprenant au moins un sel inorganique neuroactif, de la glycine, de la L-alanine et de la L-serine lesdits composés étant chacun présents à une concentration qui maintient la survie et la fonctionnalité neurale d'une cellule neuronale. L’homme du métier est à même d’adapter les concentrations pour maintenir la survie et la fonctionnalité desdites cellules.

Dans le contexte de l’invention, on entend par composé « neuroactif » un composé, tel qu’un sel inorganique, qui affecte de manière significative l’activité neurale d’une cellule (par exemple une activité électrophysiologique). Une telle activité neurale peut être sensiblement identique à ractivité neurale d’une cellule neuronale sauvage dans son milieu naturel (in vivo).

Dans un mode de réalisation, le au moins un sel inorganique neuroactif est choisi dans le groupe constitué par le chlorure de sodium (NaCl), le chlorure de potassium (KC1), le chlorure de calcium (CaC12), le sulfate de magnésium (MgS04), le chlorure de magnésium (MgCL2), le nitrate ferrique (FeN03), le sulfate de zinc (ZnS04), le sulfate cuivrique (CuS04), le sulfate ferrique (FeS04) et des combinaisons de ceux-ci. Dans un mode de réalisation, le milieu de différenciation neuronale comprend du chlorure de sodium et au moins un autre sel inorganique neuroactif.

Dans certains modes de réalisation, la concentration en chlorure de sodium est comprise entre 20 et 200 mM, préférentiellement entre 70 et 150 mM, notamment à 120 mM +/- 10%.

La concentration en les autres sels inorganiques neuroactifs est préférentiellement comprise entre 0,000001 et 10 mM, 0,000005 et 8 mM, 0,00001 et 6 mM, 0,00005 et 4 mM, 0,00005 et 2 mM, 0,0001 et 1 mM, 0,0005 et 0.5 mM, 0,001 et 0,05 mM, 0,01 et 0,05 mM.

La concentration en glycine comme la concentration en L-alanine sont avantageusement comprises entre 0,0001 et 0,05 mM. La concentration en L-serine est avantageusement comprise entre 0,001 et 0,03 mM.

Dans un mode de réalisation, le milieu de culture comprend en outre de l'acide L-aspartique, préférentiellement à une concentration comprise entre 0,00001 et 0,003 mM, et/ou de l'acide L-glutamique, préférentiellement à une concentration comprise entre 0,00001 et 0,02 mM, et/ou un agent de modulation du pH, tel qu’un sel inorganique.

Par exemple, l’agent de modulation est un sel inorganique choisi parmi le phosphate de sodium dibasique, le phosphate de sodium monobasique et des combinaisons de ceux-ci, ledit agent étant avantageusement à une concentration comprise entre 0,001 et 1 mM. Alternativement, l’agent de modulation est le bicarbonate de sodium, avantageusement à une concentration comprise entre 1 et 35 mM.

De manière alternative ou complémentaire, le milieu de culture peut comprendre au moins un des composés suivants : un ou plusieurs acides aminés, chaque acide aminé étant avantageusement à une concentration comprise entre 0,001 et 1 mM; une ou plusieurs vitamines, chaque vitamine étant avantageusement à une concentration comprise entre 0,00001 et 1 mM; un agent supplémentaire choisi dans le groupe consistant en une protéine, un facteur neurotrophique, un stéroïde, une hormone, un acide gras, un lipide, une vitamine, un sulfate minéral, un composé chimique organique, un monosaccharide, un nucléotide et des combinaisons de ceux-ci; un substrat énergétique, tel que le sucre, le pyruvate de sodium et des combinaisons ceux-ci, préférentiellement à une concentration comprise entre 0,1 et 5 mM; et un agent photosensible, notamment la riboflavine (B2) à une concentration comprise entre 0,0001 et 0,0006 mM; et/ou l'HEPES à une concentration comprise entre 1 et 10 mM.

Par exemple, le ou les acides aminés sont alors avantageusement choisi parmi la L-alanyl-L- glutamine, le chlorhydrate de L-arginine, la L-asparagine-H20, le chlorhydrate de cysteine- H20, la L- Cystine 2HC1, le chlorhydrate de L-histidine-H20, la L-isoleucine, la L-leucine, le chlorhydrate de L-lysine, la L-methionine, la L-phenylalanine, la L-proline, la L-threonine, le L tryptophane, le dihydrate de sel disodique de L-tyrosine, la L- Valine et des combinaisons de ceux-ci.

Par exemple, la ou les vitamines sont choisies dans le groupe constitue par le chlorure de choline, le pantothenate de D-calcium (B5), l'acide folique (B9), le i-Inositol, la niacinamide (B3), le chlorhydrate de pyridoxine, le chlorhydrate de thiamine, la vitamine B 12 (cyanocobalamine), la riboflavine (B2) et des combinaisons de ceux-ci.

Dans un mode de réalisation, le milieu de culture ne comprend pas de sérum. De manière alternative ou complémentaire, l'osmolarité du milieu est comprise entre 280 et 330 Osm/mL.

Des exemples de composition de milieu de différenciation neuronale pouvant être utilisés pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention sont décrits dans la demande WO2014/172580. Le milieu BrainPhys™ Neuronal Medium commercialisé par la société STEMCELL Technologies est particulièrement adapté pour être utilisé comme milieu de différenciation neuronale dans le procédé de l’invention.

Etapes de culture

Selon l’invention, les microcompartiments sont mis en culture dans le milieu de différenciation cellulaire pendant une période comprise entre 5 semaines et 100 semaines. De manière avantageuse, l’étape de culture dans le milieu de différenciation est conduite pendant une période comprise entre 5 et 50 semaines, préférentiellement entre 10 et 50 semaines, entre 20 et 50 semaines, entre 25 et 50 semaines, entre 20 et 40 semaines entre 25 et 40 semaines, entre 20 et 30 semaines, entre 25 et 30 semaines, plus préférentiellement entre 20 et 25 semaines, encore plus préférentiellement pendant environ 24 semaines, 25 semaines, 26 semaines, 27 semaines, 28 semaines, 29 semaines, 30 semaines, notamment pendant 25 semaines +/- 1 semaine. En effet, les inventeurs ont découvert qu’ après ces laps de temps, tout ou partie des microcompartiments contient des neurones exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau (2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R).

Selon G invention, les microcompartiments comprenant les cellules neuronales post-mitotiques peuvent être obtenus lors d’une étape de préculture de microcompartiments cellulaires comprenant chacun une capsule creuse en hydrogel entourant un unique amas de cellules souches et de la matrice extracellulaire dans un milieu de culture apte à induire la différenciation cellulaire au sein desdits microcompartiments cellulaires. Les cellules étant avantageusement organisées en cyste à l’intérieure des capsules d’hydrogel à l’issu de ladite étape de préculture.

Dans le contexte de l’invention, on désigne par cyste au moins une couche de cellules pluripotentes organisées autour d’une lumière centrale. Selon l’invention, un tel microcompartiment comprend donc successivement, autour d’une lumière centrale, ladite couche de cellules pluripotentes, une couche de matrice extracellulaire, ou d’un substitut de matrice extra-cellulaire, et la couche externe en hydrogel. La lumière est générée, au moment de la formation du cyste, par les cellules qui se multiplient et se développent en couches sur la couche de matrice extracellulaire. Avantageusement, la lumière contient un liquide et plus particulièrement du milieu de culture.

Les cellules souches utilisées pour la préparation des microcompartiments sont avantageusement des cellules souches pluripotentes de mammifère, humain ou non humain. Une cellule souche pluripotente, ou cellule pluripotente, s’entend d’une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans l’organisme d’origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Notamment, les cellules souches sont choisies parmi les cellules souches pluripotentes induites (IPS), les cellules souches embryonnaires (ES), les cellules transdifférenciées et des mélanges de ceux-ci. Les cellules transdifférenciées s’entendent de cellules pour lesquelles une différenciation en cellules d’intérêt est obtenue sans passer par une étape de pluripotence. Les cellules passent de leur état initial (par exemple fibroblaste ou cellule mononucléée sanguine périphérique) à un état terminal de neurone mâture en forçant l’expression d’un ensemble de gènes de l’état terminal sans jamais transitionner par le phénotype pluripotent.

Un procédé de préparation de cystes est décrit dans la demande WO2018/096277, ainsi que des milieux de culture favorables à l’organisation des cellules en cystes au sein des microcompartiments.

Dans un autre mode de réalisation, des progéniteurs neuraux sont encapsulés dans une coque en hydrogel, lesdits progéniteurs étant avantageusement aptes à d’organiser sous forme de cystes. D’une manière générale, une fois que les microcompartiments cellulaires renferment majoritairement des cellules neuronales post-mitotiques, lesdits compartiments sont placés dans le milieu de différenciation neuronal. Par « majoritairement », on entend que le microcompartiment comprend plus de 50% en nombre de cellules neuronales post-mitotiques, préférentiellement, plus de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%.

Avantageusement, l’étape de différenciation neuronale est conduite dans un bioréacteur, les microcompartiments cellulaires étant maintenus en suspension dans une enceinte dudit bioréacteur contenant le milieu de différenciation.

Les cellules étant protégées des contraintes pouvant exister au sein du réacteur par la coque d’hydrogel, le flux au travers du bioréacteur peut être aussi fort que la coque d’hydrogel peut le soutenir. En outre, la coque d’hydrogel des microcompartiments cellulaires préserve les cellules des contraintes mécaniques liées aux collisions et prévient les fusions des éléments multicellulaires (agrégats, micro-carriers). Les microcompartiments sont en suspension dans le bioréacteur, ce qui permet un accès au milieu de culture et une diffusion dans les microcompartiments homogènes, ainsi qu’une bonne convection.

L’utilisation de microcompartiments cellulaires permet de cultiver les cellules dans n’importe quel type de bioréacteur, muni d’une enceinte close, et notamment dans un bioréacteur en mode d’alimentation par « batch », en mode d’alimentation par « fed batch » ou en mode d’alimentation continu (perfusion). L’utilisation de ces microcompartiments est particulièrement avantageuse dans le cas de culture en mode d’alimentation continu. En effet, les cellules étant protégées par la coque d’hydrogel, il est possible de les soumettre à des flux continus, sans risque de les fragiliser.

Dans un mode de réalisation, le bioréacteur comprend une enceinte pouvant être fermée hermétiquement. Cela permet de contrôler l’atmosphère à l’intérieur du bioréacteur, et par exemple de cultiver les microcompartiments sous atmosphère inerte.

Le bioréacteur peut comporter une enceinte ayant un volume compris entre 1 mL et 10 000L, préférentiellement entre 5 mL et 10.000 L, entre 10 mL et 10.000 L, entre 100 mL et 10.000 L, entre 200 mL et 10.000 L, entre 500 mL et 10.000 L. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 1 mL. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 10 mL. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 100 mL. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 500 mL. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 1 L. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 10 L. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume de 100 L, ou plus. L’homme du métier saura adapter le nombre de microcompartiments et le volume du bioréacteur en fonction des besoins.

Préférentiellement, l’étape de différenciation neurale est conduite dans des conditions stériles afin d’éviter toute contamination par des microorganismes. Par exemple, l’enceinte du bioréacteur est close de manière à empêcher les contaminations, mais permet les échanges gazeux avec l’extérieur.

D’une manière générale, l’utilisation d’une enceinte close permet un contrôle fin de l’environnement de culture, sans risque de perturbation par l’environnement extérieur. Il est par ailleurs aisé d’obtenir des produits stériles. Cela permet également un meilleur rendement volumétrique.

A l’issu de l’étape de différenciation neuronale il est possible de récupérer tout ou partie des microcompartiments cellulaires, afin de récupérer des neurones post-mitotiques exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau contenus dans lesdits microcompartiments. Les cellules peuvent être récupérées aisément, par simple hydrolyse et/ou dissolution de la couche externe en hydrogel.

Cellules neuronales et applications

Le procédé selon l’invention permet d’obtenir des cellules neuronales post-mitotiques dans lesquelles les 6 isoformes 2N4R, 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R de la protéine Tau sont exprimées.

Avantageusement, les 6 isoformes sont des proportions sensiblement identiques aux proportions présentent dans des cellules neuronales adultes sauvages.

Dans un mode de réalisation, les cellules neuronales post-mitotiques récupérées dans les microcompartiments cellulaires à l’issue de l’étape de différenciation présentent un ratio d’expression des isoformes 3R et 4R compris entre 1/3 et 3, plus préférentiellement compris entre ½ et 2, encore plus préférentiellement compris entre ¾ et 4/3, idéalement à 10% d’un ratio équimolaire. Les isoformes 2N, IN et ON représentent avantageusement, respectivement, plus de 3%, plus de 17% et moins de 90% des isoformes totales, préférentiellement respectivement plus de 5%, plus de 26% et moins de 50%, encore plus préférentiellement respectivement plus de 8%, plus de 45% et moins de 45%, idéalement respectivement 9%, 54%, and 37%.

Dans un mode de réalisation, les cellules neuronales post-mitotiques récupérées dans les microcompartiments cellulaires à l’issue de l’étape de différenciation comprennent les 6 isoformes dans les proportions ci-dessous rapport au nombre total des 6 isoformes : entre 0,1 et 0,9 % de Tisoforme 2N4R, notamment 0,16% ou 0,9%, entre 0,5 et 1% de Tisoforme 2N3R, notamment 0,69% ou 1%, entre 2 et 18% de Tisoforme 1N4R, notamment 2,19% ou 17,6%, entre 8 et 23% de Tisoforme 0N4R, notamment 9,4% ou 22,4%, entre 8 et 23% de Tisoforme 1N3R, notamment 9,4% ou 27,5%, et entre 30 et 80% de Tisoforme 0N3R, notamment 78,16% ou 30,6%.

De telles cellules neuronales post-mitotiques peuvent être utilisées aussi bien à des fins de recherche que de diagnostic ou de traitement. Ces cellules, présentant un profil d’expression de la protéine Tau sensiblement identique à celui des cellules neuronales adultes sauvages, sont particulièrement adaptées pour le criblage de molécules thérapeutiques ciblant des maladies neurodégénératives et/ou modifiant la physiopathologie des neurones, notamment chez l’humain.

Exemples

Matériel et méthodes

1. Lignée iPSC et encapsulation La lignée BC-1 (WT XY, passages 15-25, MTI-Globalstem, Gaithersburg, MD) a été maintenue en absence de cellules nourricières. Les plaques de culture ont été recouvertes d'une matrice Matrigel pendant 2 heures à 37°C (Corning, NY, 1/100, dilué dans un milieu DMEM). Les colonies BC-1 ont été dissociées en utilisant du ReLeSR (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) puis cultivées dans du mTESRl (technologies STEMCELL) complémenté avec 1% de pénicilline/streptomycine (Invitrogen, Caribstad, CA ). Les cultures ont été nourries quotidiennement et passées tous les 5 à 7 jours.

La procédure d'encapsulation utilisée est celle décrite dans Alessandri et al, 2016.

2. Production de neurones corticaux matures

L'induction neurale a été réalisée dans un mélange 1 :1 de DMEM/F12 et de Neurobasal complémenté avec B27 et N2 (Thermo Fischer Scientific Inc., Waltham, MA), ImM LDN- 193189 (Sigma Aldrich, St-Louis, MO, ) et IOmM SB431542 (Tocris Biosciences, Bristol, UK). Le milieu a été changé tous les jours pendant 8 jours. Ensuite, la différenciation des cellules souches neurales a été réalisée en utilisant le mélange DMEM/F12:Neurobasal (1 : 1) complémenté avec B27 et N2, ou le milieu BrainPhys™ complémenté avec N2-A et SMI (STEMCELL Technologies). Les deux milieux ont été supplémentés par 10 ng/mL de BDNF et GDNF (Cell Guidance Systems Ltd., Cambridge, Royaume-Uni), 10 nM de Compound E (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) et 10 nM de trichostatine A (Abcam). La moitié du milieu a été changée tous les jours jusqu'à la période de maturation spécifiée.

3. Extraction d'ARN

Les microcompartiments (sphères) sédimentés ont été rincés une fois en PBS IX (Thermo Fischer Scientific Inc.) puis incubés avec du Gentle Cell Dissociation Reagent (STEMCELL Technologies) pendant 5 minutes pour désintégrer la capsule d'alginate. Après deux lavages PBS IX, l'ARN total des cellules a été extrait à l'aide du kit Nucleospin RNA XS (Macherey- Nagel GmbH and Co KG, Düren, Allemagne). Des expériences de validation ont été effectuées sur l'ARN total extrait de cortex cérébral humain adulte normal (BioChain Institute Inc., Newark, CA).

4. Analyse de la maturation neuronale par RT -PCR

Un total de 250 ng d'ARN a été retro-transcrit à l'aide du kit de transcription inverse RETROscript (Thermo Fischer Scientific Inc.) avec des amorces oligo(dT), conformément aux instructions du fabricant pour la procédure RT -PCR en deux étapes. Les réactions de PCR ont été réalisées en utilisant 1 pL d'ADNc et les amorces appropriées (figure 7). Les produits PCR ont été séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 1,5 %.

5. Analyse des isoformes MAPT adultes par RT -PCR fluorescente

La rétrotranscription a été effectuée sur 70 ng d'ARN, à l'aide du kit d'ADNc Verso (Thermo Fischer Scientific Inc.) et des amorces oligo(dT). Les amorces utilisées dans cette étude sont énumérées dans le tableau 1 ci-dessous. La proportion relative des isoformes d MAPT a ensuite été analysée par PCR fluorescente, à l'aide d'une amorce sens non marquée et d'une amorce anti-sens marquée 6-FAM. Les produits de PCR ont été analysés sur un séquenceur automatique Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems), et les électrophérogrammes analysés avec le logiciel GeneMapper Software 5.

[Table 1]

6. Extraction et déphosphorylation des protéines

Les sphères ont été rincées dans du PBS IX (Thermo Fischer Scientific Inc.) puis incubées avec le Gentle Cell Dissociation Reagent (STEMCELL Technologies) pendant 5 minutes pour désintégrer la capsule d'alginate. Après deux lavages en PBS IX, les sphères ont été homogénéisées dans un tampon Pierce® RIPA (Thermo Fisher Scientific Inc.) additionnés d’un cocktail d'inhibiteurs de protéase (Sigma-Aldrich), en utilisant le TissueLyserLT (Qiagen,

Hilden, Allemagne) (agitation rapide (50 Hz, 2 min), microtubes de 1,5 ml contenant deux billes en acier inox de 2 mm). Les échantillons ont ensuite été centrifugés et les lysats collectés. Après

30 min sur glace et centrifugation (11 300 X g, 20 min, 4°C), le surnageant contenant les protéines solubles a été recueilli. Trente pg de protéines totales ont ensuite été traitées avec 80 unités de protéine phosphatase lambda (New England Biolabs, Ipswich, MA) pendant 3 h à

37°C dans un volume final de 50pL. 7. Western Blotting

Les protéines ont été analysées grâce à la technique de Western blot comme décrit précédemment (Pons et al., 2017). Brièvement, les protéines des échantillons déphosphorylés ont été séparées par électrophorèse sur gel SDS-PAGE 10%, en parallèle de lpL d’un échantillon de référence contenant les 6 isoformes protéiques de Tau produites in vitro (Sigma Aldrich), puis transférées sur une membrane de nitrocellulose. Les membranes ont été incubées avec l'anticorps primaire : Polyclonal Anti-human Tau (Dako Denmark A/S, Glostrup, Danemark) (1 :50 000) puis révélées à l'aide de réactifs chemiluminescents (ECL Clarity, Bio- Rad Laboratories).

Résultats

1. Développement de neurones corticaux et des lignages gliaux sur matrigel à partir d'iPSC dans des capsules d'alginate

Dans cette étude, des iPSC provenant de donneurs sains ont été utilisés. Après dissociation, les cellules iPSCs ont été encapsulées à l'intérieur de capsules d'alginate tapissées de Matrigel comme décrit précédemment pour les cellules souches neurales (NSC) dans Alessandri et al, 2016. Les capsules ont d'abord été maintenues dans un milieu mTESR pour permettre aux colonies d'émerger à l'intérieur des capsules. Ensuite, l'induction neurale des iPSCs a été réalisée par la double inhibition de SMAD jusqu'à ce que les NSCs atteignent 100% de confluence dans les capsules (Feyeux et al., 2012). L'efficacité de l'induction neurale a été confirmée par l'évaluation de l'expression des ARNm POU5F1 et OTX-1 par RT -PCR. Comme attendu, le gène de pluripotence POU5F1 était fortement exprimé dans les iPSC et presque non détecté dans les NSC (Fig. 1 A). D'autre part, le marqueur OTX-1 des NSCs était spécifiquement surexprimé dans les NSCs par rapport aux iPSCs non induits (Fig. IB). Une fois que les NSCs ont atteint la confluence, ils ont ensuite été différenciés en neurones corticaux. Deux milieux de culture cellulaire ont été testés : un milieu couramment utilisé (DMEM/F12 - Neurobasal 1 : 1, D/N) ainsi que le milieu BrainPhys™ qui a été conçu pour favoriser la maturation et la fonction synaptique des neurones dérivés d'iPSC (Bardy et al., 2015). Parce que des études antérieures ont montré que la neurogenèse corticale à partir d'iPSC suit le même ordre temporel in vitro que le développement cortical des mammifères et s'étend au moins jusqu'au jour 90 en culture (Espuny-Camacho et al., 2013 ; Kirwan et al., 2015 ; Shi et al., 2012), il a été arbitrairement décidé de caractériser l'identité des neurones corticaux humains dérivés des iPSC dans la procédure expérimentale après 15, 20 ou 25 semaines de culture. L'expression de CALB1 (Calbindin 1) et RELN (Reelin), deux marqueurs spécifiques des neurones corticaux de la couche supérieure, a été évaluée. Les neurones corticaux de la couche supérieure sont générés aux derniers stades de la neurogenèse corticale. CALB 1 est exprimé dans les couches corticales II et III du cortex cérébral humain et RELN dans la couche corticale I. Comme le montrent les figures IC et 1D, l'expression des ARNm CALB 1 et RELN a été détectée dans les neurones dérivés d’iPSC dès 15 semaines de culture quel que soit le milieu utilisé. L'expression des deux gènes a été maintenue jusqu'à 25 semaines. Comme attendu, CALB1 et RELN n'ont pas été détectés à un niveau significatif dans les iPSC et les NSC.

La présence d'astrocytes et d'oligodendrocytes myélinisants dans les cultures a également été étudiée, en évaluant respectivement l'expression des ARNm GF AP (Glial fibrillary acidic protein) et CLDN11 (Claudinl l). L'expression de GF AP a été détectée dès 15 semaines de culture dans les deux conditions expérimentales (Fig. 1E). Par contre, si l'expression de CLDN11 a été facilement détectée dans des capsules cultivées dans le milieu BrainPhys™ dès la 15ème semaine de culture, son expression est demeurée absente dans celles cultivés dans le milieu standard, même au bout de 25 semaines de différenciation (Fig. 1F). Encore une fois, comme attendu, aucun de ces gènes n’est exprimé aux stades iPSC et NSC. Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que les neurones issus d'iPSC à l'intérieur des capsules d'alginate tapissées de Matrigel ont pu se différencier en neurones corticaux, y compris les neurones corticaux de la couche supérieure qui sont générés aux derniers stades de la neurogenèse corticale. Il est important de noter la présence d'oligodendrocytes spécifiquement dans les cultures maintenues en BrainPhys™, soulignant que le milieu neuronal BrainPhys™ a amélioré la maturation neuronale par rapport au milieu D/N couramment utilisé.

2. Développement d'une méthode quantitative pour mesurer les 6 isoformes d’ARNm adultes de MAPT : validation dans le cortex cérébral humain

Actuellement, les analyses de l'expression des isoformes d’ARNm de MAPT adultes sont principalement basées sur la seule quantification de l'inclusion de l'exon 10, pour déterminer le rapport 3R/4R, ou l'inclusion des exons 2 et 3, pour évaluer la proportion des isoformes ON, IN ou 2N. Dans la présente étude, une méthode permettant l'analyse simultanée des 6 isoformes ARNm de MAPT adultes individuellement dans une seule réaction PCR pour examiner leur proportion relative pendant la maturation neuronale a été mise au point. A cette fin, un nouveau test a été mis au point, basé sur l'amplification des transcrits MAPT à l'aide d'amorces marquées par fluorescence. Un ensemble d'amorces couvrant les exons 1 et 11 (Fig. 2A), qui devrait permettre l'amplification des 6 isoformes MAPT, a été identifié. Pour valider ce test, des expériences de RT -PCR sur des ARNm extraits de cortex cérébral humain adulte ont été réalisées. L'analyse des électrophérogrammes correspondant aux produits amplifiés par PCR a révélé un profil en 6 pics correspondant aux tailles attendues pour les 6 isoformes d’ARNm adultes de MAPT (Fig. 2B). La proportion relative des différentes isoformes a ensuite été calculée à partir de la hauteur du pic. Les isoformes 0N3R et 1N3R étaient les plus exprimées (30,6 et 27,5 %), suivies des isoformes 0N4R et 1N4R (22,4 et 17,6 %), tandis que les isoformes 2N3R et 2N4R ne représentaient que 1 et 0,9 % de toutes les isoformes.

Ces données ont également permis de déterminer la proportion relative des isoformes ON (53 %), IN (45,1 %) et 2N (1,9 %) et des isoformes 3R (59,1 %) et 4R (40,9 %). Il est important de noter que des données quantitatives similaires ont été obtenues lors de l'analyse indépendante de l'inclusion des exons 2/3 et de l'inclusion de l'exon 10 (Fig. 5 A, B) : les isoformes ON et IN se sont avérées les plus exprimées (52,9% et 45% respectivement), alors que les isoformes 2N ne représentaient que 2 %. En ce qui concerne l'épissage de l'exon 10, la quantification relative des pics indique que le rapport est légèrement en faveur des isoformes 3R, avec 59,9% de 3R- Tau contre 40,1% de 4R-Tau. Ces données sont parfaitement cohérentes avec les études publiées précédemment et valident donc ce nouvel essai.

3. Le BrainPhys™ favorise l'expression des 6 isoformes ARNm adultes de MAPT dans les neurones issus d'iPSC et cultivés à l'intérieur de capsules d'alginate tapissées de Matrigel

Après avoir validé l’essai sur des extraits de cerveau adulte, la méthode a été utilisée pour évaluer l'expression des isoformes adultes MAPT dans des cultures neuronales dérivées d’iPSC maintenues en D/N ou dans un milieu BrainPhys™, sur une période de maturation de 25 semaines. Conformément aux études antérieures, l'analyse des NSCs a révélé un pic unique, correspondant à la taille prévue de l'isoforme 0N3R de MAPT (Fig. 3 A et Fig. 4A). Dès 15 semaines de maturation, des isoformes contenant l'exon 2 (les isoformes 1N3R et 1N4R) et l'exon 10 (les isoformes 0N4R et 1N4R) ont été détectées. Il est intéressant de noter que les cultures maintenues en BrainPhys™ présentaient des niveaux d'expression plus élevés des isoformes 1N3R, 0N4R et 1N4R que les cultures D/N. Après 20 semaines de maturation, une augmentation significative de la quantité de ces espèces a été observée, avec l'apparition de faibles niveaux d'expression de l'isoforme 2N3R dans les deux conditions expérimentales. Au dernier point de l’étude (25 semaines), les niveaux d'expression de ces isoformes ARNm de MAPT adultes ont continué à augmenter. Plus important encore, l'isoforme 2N4R était maintenant détectable dans les cultures maintenues en BrainPhys™. L'analyse quantitative des proportions relatives des isoformes ARNm de MAPT dans des cultures maintenues par BrainPhys™ pendant 25 semaines a révélé que les isoformes 0N4R et 1N3R représentaient chacune 9,4 % de toutes les isoformes présentes, tandis que l'isoforme 1N4R représentait 2,19 %. Les isoformes 2N3R et 2N4R correspondaient respectivement à 0,69 % et 0,16 %. Les isoformes 4R-Tau constituaient donc 11,75 % des transcrits MAPT (Fig. 4B), tandis que les isoformes IN et 2N représentaient respectivement 11,63 % et 0,85 % (Fig. 4C). Comme pour les extraits de cerveau, ces résultats ont été validés par des évaluations indépendantes de l'épissage de l'exon 10 ou des exons 2/3 (Fig. 5C).

La procédure expérimentale a permis le développement de neurones exprimant les 6 transcrits d'ARNm de MAPT adultes, mais l'isoforme 0N3R est restée principalement exprimée après 25 semaines de maturation (-78%). Afin d'exclure que les isoformes 0N3R puissent "piéger" les amorces et donc diminuer l'efficacité de la PCR par rapport aux transcrits moins bien exprimés, l'expression des isoformes de MAPT a été analysée indépendamment des transcrits 0N3R. Pour ce faire, deux jeux d'amorces (Fig. 6) ont été réalisés : la première couvrant les exons 2 et 11 pour analyser précisément les transcriptions 1N3R, 1N4R, 2N3R et 2N4R, et la seconde couvrant les exons 1 et 10 pour amplifier spécifiquement les isoformes 4R-Tau. L'analyse d'extraits cérébraux ainsi que des cultures maintenues en BrainPhys™ pendant 25 semaines ont confirmé les proportions relatives des différentes isoformes MAPT, validant ainsi le test.

Dans l'ensemble, ces résultats ont montré que les neurones maintenus en BrainPhys™ exprimaient les 6 transcrits MAPT adultes après 25 semaines de maturation, incluant les isoformes 2N3R et 2N4R. Il est important de noter que lorsque les cultures dérivées d'iPSC ont été conservées dans le milieu D/N, seules 5 isoformes été exprimées. L'isoforme 2N4R était indétectable. De plus, à chaque point d’étude, les niveaux d'ARNm pour chaque isoforme étaient systématiquement inférieurs à ceux observés avec le milieu BrainPhys™. Ces données sont parfaitement cohérentes avec le rôle bénéfique du milieu BrainPhys™ sur l'état de maturation des neurones. Fait intéressant, conformément à ce qui a été démontré lors du développement du cerveau humain (Hefti et al., 2018), un changement dans l'expression des exon 2 et exon 10 a d'abord été détecté. L’inclusion de l'exon 3 est plus tardive.

Afin de valider l'efficacité de la traduction des transcrits MAPT adultes dans le modèle expérimental, la production d'isoformes protéiques Tau a ensuite été évaluée par Western Blot dans des sphères maintenues en BrainPhys™ pendant 25 semaines. Les protéines ont été déphosphorylées ou non à l'aide de lambda phosphatase et séparées par éléctrophorèse à côté d'une échelle de protéines Tau recombinante contenant les 6 isoformes. Comme le montre la figure 3B, les protéines Tau migrent sous formes de multiples bandes entre 40 et 60 kDa, en raison (i) de la présence d’isoformes multiples et (ii) de l’état de phosphorylation des protéines. Le traitement à la phosphatase a entraîné un déplacement des protéines Tau vers des poids moléculaires plus faibles. En accord avec l'analyse en ARNm, il a été constaté que l'isoforme 0N3R-Tau était majoritairement détectée dans les capsules de 25 semaines. Cependant, des quantités significatives d'isoformes 0N4R, 1N3R et 1N4R ont également été détectées. En revanche, nous n'avons pas pu observer les isoformes 2N de Tau. Ces isoformes représentant moins de 1 % de toutes les espèces de Tau présentes en ARNm, il est possible que leurs concentrations soient inférieures à la limite de détection dans l’analyse.

CONCLUSIONS

Ces résultats montrent que les neurones dérivés d'iPSC, cultivés à l'intérieur de capsules d'alginate revêtues de Matrigel présentaient des spécifications de cultures de cellules corticales matures. Plus important encore, à l'aide d'un nouveau test qui permet l'analyse qualitative et quantitative de toutes les isoformes d'ARNm MAPT adultes individuellement, il a été démontré que les neurones maintenus en BrainPhys™ exprimaient les 6 transcrits d'ARNm MAPT adultes après 25 semaines de maturation, rendant ce modèle très approprié pour la modélisation des pathologies Tau et à des fins thérapeutiques.