Verfahren zur Erweiterung des dynamischen Erfassungsbereichs bei Mikroarrays

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikroarrays, bei denen die verschiedenen Sondenmoleküle jeweils mehrmals und in unterschiedlichen Konzentrationen auf einem Träger aufgetragen sind. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein verbessertes Verfahren zum Nachweis bestimmter Zielkomponenten in einer Probe.

Aufgrund der immer größer werdenden Menge an Daten über biologische Systeme, insbesondere zelluläre Systeme, sehen sich Wissenschaftler vermehrt dem Problem gegen¬ über, mit den jeweils durchzuführenden Untersuchungen möglichst viele der bekannten Parameter, wie beispielsweise die Transkription von Nukleinsäuren oder die Translation in Proteine, zu untersuchen.

Herkömmliche (molekular-)biologische Methoden beinhalteten normalerweise Experimente, bei denen auf eine bestimmte biologische Zielkomponente, abgestellt wurde, wie beispiels¬ weise ein Gen oder die davon abgeleitete mRNA, oder ein Protein, was eine Evaluierung von Abläufen in der Zelle, insbesondere unter Beteiligung mehrerer biologischer Zielkom¬ ponenten nur unter erschwerten Bedingungen erlaubt.

In den letzten Jahren wurden sogenannte Mikroarrays entwickelt, mit deren Hilfe eine Vielzahl biologischer Zielmoleküle gleichzeitig untersucht werden kann. Derartige Mikro- arrays enthalten im Wesentlichen einen Träger, wie ein Glas- oder Silikon-Plättchen oder eine Membran, auf dem auf vorbestimmten Stellen in einer bestimmten Anordnung, einem sogenannten Array, biologische Komponenten bekannter Zusammensetzung, wie beispiels¬ weise Nukleinsäuren oder Proteine, die sogenannten Sonden(moleküle), aufgetragen werden. Die Größe dieser Stellen beträgt normalerweise etwa 20 μm so dass ein Träger eine Vielzahl derartiger Stellen enthalten kann. Die Mikroarrays ermöglichen eine schnelle und kostengünstige Untersuchung beispielsweise der Genexpression und/oder genetischer Änderungen in einer Probe.

Sind die Sonden Nukleinsäuren, so werden geeignete Nukleotide bekannter Basenabfolge in einer Länge von etwa 20 bis 2000 Basen in einer vorbestimmten Anordnung auf dem Träger immobilisiert (gespottet). Anschließend wird die zu untersuchende Probe mit dem Träger unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine Hybridisierung komplementärer Stränge er¬ laubt. Nicht-komplementäre Stränge, die keine Hybridisierung mit den Sonden auf dem Träger eingehen, werden entfernt. Die Bereiche auf dem Microarray, welche Nukleotid- Doppelstränge enthalten, werden ermittelt und ermöglichen einen Rückschluss auf die Sequenz in der Ausgangsprobe.

Vergleichbares gilt für Proteine als Sonden. Dazu werden geeignete Proteine, wie beispiels¬ weise Peptide oder Antikörper auf dem Träger immobilisiert (gespottet) und anschließend wird der Träger mit der zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht. Biologische Kompo- nenten, die an die Sonden gebunden haben, werden nachfolgend gemäß herkömmlicher Verfahren detektiert.

Derartige "Screening-Verfahren", bei denen in einem einzigen Ansatz eine Vielzahl von unterschiedlichen Sonden gleichzeitig mit einer zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht werden, sind auch dazu geeignet die Menge der von der Sonde eingefangenen biologischen Komponente in der Probe zu bestimmen.

Sind die Zielkomponenten in der biologischen Probe in einer ausreichenden Menge vorhanden, so kann der Assay in der Regel direkt durchgeführt werden.

Es ergeben sich jedoch bei der Durchführung Probleme, wenn die Probe einerseits eine grosse Menge sowie auch eine kleine Menge an Zielkomponenten enthält, da das Signal, das beim Nachweisverfahren der eingefangenen Zielmoleküle erzeugt wird, technisch bedingt nicht linear zur Anzahl der Moleküle ist, sondern sigmoid. Ist in der Probe eine große Menge an Zielmolekülen enthalten, so kann die Bestimmung aufgrund eines Sättigungseffekts des Signals bei der Detektion nicht quantitativ durchgeführt werden. In diesem Fall muss der Assay mit einem Weniger an Probenmaterial wiederholt werden, was teilweise aufgrund der Verfügbarkeit der Probe selbst schwierig oder sogar unmöglich ist.

Andererseits kann auch dann, wenn die Zielkomponenten in der Probe in einer sehr geringen Konzentration vorliegten, das Signal nicht auswertbar sein, da zu schwach. Eine Möglichkeit dies zu umgehen besteht darin, die Zielmoleküle in der Probe vor Inkontaktbringen mit dem Mikroarray zu amplifizieren, beispielsweise bei einer Nukleinsäure mittels einer PCR- Reaktion. Nachteilig hier wiederum ist, dass eine Amplifϊzierung in der Probe fehlerbehaftet sein kann, während eine vorherige Aufreinigung, beispielsweise Entfernung von Protein¬ material, selbst Fehler einbringen kann. Eine andere bekannte Möglichkeit bei Vorliegen von geringen Mengen an Zielkomponente(n) besteht in der Amplifizierung des Signals selbst.

Beide Vorgehensweisen der Amplifizierung bergen jedoch das Risiko, erneut bei der Bestim¬ mung in einen Sättigungsbereich der Detektierung zu gelangen.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin ein verbessertes Mittel zur Verfügung zu stellen, mit dem der Erfassungsbereich von Zielkomponenten bei Verwendung eines Mikroarrays erweitert werden kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Bereitstellung eines Mikroarrays, der eine Vielzahl auf einem Träger in einer bestimmten Anordnung immobiliert vorliegende Sondenmoleküle aufweist, wobei eine Spezies eines Sondenmoleküls mindestens dreifach auf dem Träger vorhanden ist, und für eine Spezies an Sondenmolekül in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen. In den Figuren,

Fig. 1 zeigt einen Graph, der die Signalstärke für Fluoreszenzproben in Abhängigkeit von der Konzentration zeigt.

Fig. 2 zeigt schematisch einen Mikroarray mit 3 Sonden, die in unterschiedlicher Kon¬ zentration aufgetragen wurden.

Bei den Untersuchungen, die zu der vorliegenden Erfindung gefuhrt haben hat sich gezeigt, dass durch Bereitstellen von mindestens 3 Sonden gleicher Spezifität auf dem Array, die in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen, der dynamische Bereich der Detektion, bei dem eine quantitative Erfassung der Zielkomponenten möglich ist, erweitern kann, so dass auch Proben, die eine große Menge an Zielkomponenten, wie auch Proben, die eine geringe Menge an Zielkomponenten enthalten, mit einem Assay zuverlässig quantitativ erfasst werden können.

Der hier eingesetzte Träger kann jeder im Handel erhältliche und für den Zweck der Bindung von Zielmolekülen an Sondenmoleküle gebräuchliche Träger sein, einschließlich Membranen, Metallträgern, Kunststoffmaterialien, Kügelchen oder Glas. Zum Aufbringen von Sondenmolekülen auf den Träger kann weiter jedes im Stand der Technik bekannte Ver¬ fahren eingesetzt werden, das zeitweilig oder dauerhaft eine Immobilisierung, ein Fixieren oder ein Anhaften des Sondenmoleküls an einer Stelle oder in einem Bereich des Trägers bewirkt, beispielsweise unter Ausbildung kovalenter, ionischer, metallorganischer Bindungen, von Bindungen auf Basis von van-der-Waals-Kräften oder von Enzym-Substrat- Wechselwirkungen oder von sog. "Affinitäts-Bindungen". Natürlich können zwischen dem Träger und dem auf dem Träger aufgebrachten Sondenmolekül beliebige Spacer-Moleküle, beispielsweise Spacer auf Polymer-Basis, angeordnet werden. Darüber hinaus eignen sich für die Durchführung der vorliegenden Erfindung auch Träger auf der Basis selbst¬ organisierender ("self-assembling") Schicht-Systeme. Das Auftragen kann gegenwärtig auch unter Verwendung automatisierter Verfahren erreicht werden. Die Sondenmoleküle auf dem Array sind gewöhnlich Nukleotide mit unterschiedlicher Sequenz, können jedoch auch ein Bindungspartner in einem System sein, beispielsweise Antigen-Antikörper.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist der Mikroarray die gleichen Sonden¬ moleküle, d.h. Sondenmoleküle mit gleicher Spezifität, in einer Anzahl von 3 bis 10, mehr bevorzugt 3 bis 7, noch mehr bevorzugt 3 bis 5, gespottet auf dem Träger auf. Die Konzentrationsunterschiede zwischen den einzelnen aufgetragenen Sonden an den jeweiligen Stellen kann je nach der Anzahl der die gleichen Sonden enthaltenden Stellen (Spots) variieren, beispielsweise um den Faktor, 1, 10 oder 100. Vorzugsweise sollte die Stelle mit der höchsten Konzentration mindestens eine doppelt so hohe Konzentration aufweisen, wie die Stelle mit der geringsten Konzentration an dem gleichen Sondenmolekül. So kann beispielsweise im Fall der Verwendung von 10 Sondenmolekülen gleicher Spezifität (d.h. 10 Spots auf die die gleichen Sondenmoleküle immobilisiert wurden) auf dem Array, auf dem sich Sondenmoleküle gleicher Spezifität befinden, ein Konzentrationsgefälle von jeweils 10 % vorliegen, wobei die Stelle mit der höchsten Konzentration als 100 % gesetzt wird. Bei dem aufgrund räumlicher Anordnung auf dem Array bevorzugten Einsatz von drei Stellen der gleichen Sondenmolekülen ist ein Konzentrationsgefälle von 100%, 75 % und 50 %.

Als Nachweisverfahren können im Allgemeinen jede gegenwärtig gebräuchliche Verfahren eingesetzt werden, beispielsweise Färbeverfahren mit Silber, Fluoreszenz oder enzymatischer Reaktionen, beispielsweise mit Meerrettich-Peroxidase.

Bei dem Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen kann der dynamische Bereich zusätzlich noch dadurch erweitert werden, dass die Anregungsintensität abgestuft eingesetzt wird. Wird beispielsweise bei einer Messung festgestellt, dass bereits eine Sättigung erreicht ist, bzw. der lineare Bereich verlassen wurde, dann kann durch Reduktion der Anregungsintensität der Messbereich wieder in den linearen Bereich zurückgeführt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft zudem ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Zielmolekülen in einer Probe, welches beinhaltet, Inkontaktbringen einer Probe mit einem Mikroarray, der auf vorbestimmten Stellen bestimmte Sondenmoleküle aufweist unter Bedingungen, dass eine Bindung der Zielmoleküle an die Sondenmoleküle ermöglicht wird. Jede Spezies eines Sondenmoleküls ist auf dem Träger mindestens drei mal an unterschiedlichen Stellen vorhanden und in unterschiedlichen Konzentrationen.

Der Nachweis der an den Träger gebundenen Zielmoleküle bzw. deren Menge kann gemäß herkömmlicher Verfahren erfolgen, wie Färbeverfahren mit Silber oder Fluoreszenz¬ farbstoffen oder Farbbildung durch enzymatische Reaktionen, wie unter Zuhilfenahme von Meerrettich-Peroxidase. Die so erhaltene Färbung wird dann durch im Handel erhältliche Hard- und Software-Produkte quantitativ ausgewertet.

Beispiel

Ein DNA-Mikroarray wurde mit drei verschiedenen Sonden A, B und C hergestellt. Mit jeder Sonde wurden jeweils drei Spots erzeugt. Die drei Spots jeder Sonde unterschieden sich in der Konzentration. Der erste Spot der Sonde A wurde mit einer definierten Konzentration gespottet, und als 100 % festgelegt. Für die weiteren Spots wurde die die Sonden enthaltende Lösung derart verdünnt, dass die ursprüngliche Konzentration auf 70 % bzw. 50 % absank.

Für die Sonden B und C wurde analog verfahren.

Somit werden im Beispiel 9 Spots erhalten:

Der so erhaltene Mikroarray wurde mit einer Lösung, die die komplementären Stränge der aufgebrachten Sonden B und C enthielt unter Standardbedingungen hybridisiert, wobei für die Sonde C die 11A fache Menge eingesetzt wurde.

Die hybridisierten Moleküle wurden mit dem bekannten Verfahren der Silberfarbung nachgewiesen. Die Signale sollten proportional zur Menge an hybridisierter DNA sein. Das in Fig. 2 dargestellte Ergebnis wurde dabei erhalten, woraus ersichtlich ist, dass die unterschiedlichen Konzentrationen an DNA in den Spots den dynamischen Bereich erheblich erweitert werden.