一种提高桑黄总三萜类化合物产量的方法 技术领域

本发明涉及一种提高桑黄总三萜类化合物产量 的液体发酵方法，属于生物发酵工程技术 领域。

背景技术

桑黄 CPhellinus igniarius) 为担子菌亚门 Basidiomycotina 层菌纲 Hymenomycetes 多 孔菌目 Polyporales、 锈革孑 L菌禾斗 H we"oc z。 "c"e、 针层孔菌属 (Phellinus 真菌， 是一种 珍贵的大型药用真菌。 传统中医认为桑黄性甘、 味苦， 用于治疗血崩、 带下、 闭经、 脾虚泄 泻等。 现代药理学研究表明， 桑黄具有抗肿瘤、 增强免疫力、 抗肝纤维化等功效。 据报道， 桑黄是目前抗肿瘤能力最高的药用真菌。 早在 1968年， 日本学者 Tetsuro lkekawa等用桑黄 的水提取物进行细胞试验，结果发现其对小鼠 S180的抑制率为 96.7 %，而对正常细胞无毒， 同时研究发现桑黄主要活性成分为多糖组分、 三萜类化合物和黄酮类物质， 其中所含三萜 类涵盖了不下百余种的化合物成分， 其中以四环三萜类化合物为主。近来研究表明 桑黄 中的三萜类物质具有迅速提高免疫力的作用， 表现在促进淋巴细胞增殖， 提高巨噬细胞、 NK细胞、 T细胞的吞噬能力和杀伤力， 并直接和间接毒杀肿瘤细胞， 同时能够激活化疗药 物难以杀死的休眠期肿瘤细胞， 进行单独和联合毒杀。 由于桑黄三萜类化合物对休眠期细胞 的独特作用， 以及对恶性肿瘤复发转移的有效遏止， 弥补了传统肿瘤治疗（手术、 放疗、 化 疗）的不足， 成为肿瘤免疫治疗中的重要成分。 但是桑黄的总三萜类化合物产量较低一直是 限制其应用的影响因素， 由于受生理状态的特殊性、 复杂性以及外部环境的制约， 特别是生 成可应用的子实体需要多年， 加之近几年人们对野生桑黄的大量采集， 天然的桑黄资源已经 非常稀少， 同时桑黄的人工栽培也极其困难， 培养条件苛刻， 且生长周期长达 3〜4年。 因 此，仅是通过利用釆集或人工栽培子实体从中 提取总三萜类化合物的生产方式很难满足日益 膨胀的市场需要。 液体发酵法生产桑黄的有效成分有生产周期短 、 节省劳动力、 受外部环境 影响小等优点， 是一种相对低成本、 高效的生产方法， 但其中总三萜类成分的分泌产量仍然 较低。

目前，国内外学者对桑黄总三萜类化合物的发 酵研究相对较少，主要集中在培养基组成、 溶氧、 _P H值及产物提取分离等工艺层面上， 对桑黄总三萜类化合物的发酵水平提高有限， 还远不能满足现代工业化发酵生产的需要。

近年来， 在植物细胞壁中发现一类被称为扩张蛋白的蛋 白新家族。 自 McQueen-Mason 等首先从黄瓜下胚轴伸长区分离纯化出扩张蛋 白以来， 相继从燕麦胚芽鞘细胞壁、栝楼根尖 细胞壁、 番茄、 烟草、 拟南芥、 水稻、 棉纤维、 玉米、 大豆等细胞壁中也发现了扩张蛋白的 存在， 被认为其普遍存在于各种双子叶和单子叶植物 的细胞壁中， 促进其细胞生理生长， 影 响营养生长、 形态发生、 授粉受精、 果实软化等。 通过重组细胞壁实验研究证实了该蛋白与 以前发现的所有细胞壁蛋白不同， 它具有诱导热钝化的离体细胞壁恢复伸展的功 能， 被推测 能够打断细胞壁多聚物之间的氢键进而诱导酸 依赖的细胞壁延展和压力松弛等生理活动，在 植物生长过程中可能是生理调控和细胞壁松弛 延伸的主要调控因子。但是， 关于扩张蛋白的 作用机制目前仍多是猜测和推断， 国内外均未有明确的验证定论和机制阐明。 因此， 对扩张 确认本 蛋白的各种应用的研究报道很少， 将扩张蛋白应用于桑黄的液体发酵生产， 用以提高桑黄三 萜类化合物等次生代谢产物的产量的研究国内 外均尚未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用扩 张蛋白提高桑黄总三萜类化合物产量的液 体发酵方法。

本发明的技术方案如下：

一种提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵 方法， 包括如下步骤：

( 1 ) 将桑黄菌种接种到平板培养基上， 进行活化培养， 然后取菌块接种于液体发酵培 养基中进行发酵培养， 液体发酵培养条件为： 温度 22〜27 °C， 摇床培养 2〜3天， 摇床转速 100〜180 r/min， 得初发酵液；

(2) 向步骤 （1 ) 制得的初发酵液中加入扩张蛋白溶液， 使扩张蛋白的浓度为 0.2〜1.5 mg/ml, 然后在温度 22〜27 °C、 摇床转速 100〜180 r/min的条件下， 继续培养 3〜5天， 分 离， 得到桑黄菌丝体和发酵液；

(3 ) 从步骤 （2) 制得的发酵液中提取桑黄胞外总三萜类化合物 ， 从步骤 （2) 制得的 桑黄菌丝体中提取桑黄胞内总三萜类化合物， 混合桑黄胞外总三萜类化合物和胞内总三萜类 化合物， 即得桑黄总三萜类化合物。

根据本发明优选的，所述步骤（1 )中的平板培养基为 PDA平板培养基；每升组分如下： 马铃薯 200 g、 葡萄糖 20 g， 琼脂 15g， 蒸馏水定容至 1000 mL。

根据本发明优选的， 所述步骤 （1 ) 中的活化培养条件为： 温度 22~27 V , 时间 4〜5 天。

根据本发明优选的， 所述步骤 （1 ) 中的液体发酵培养基为 PD液体发酵培养基， PD液 体发酵培养基每升组分如下：

马铃薯 200 g、 葡萄糖 20 g, 蒸馏水定容至 1000 mL。

根据本发明优选的， 所述步骤（2) 中， 扩张蛋白的浓度为 0.3〜1.0 mg/ml _; 进一步优选 0.35-0.8 mg/mlo 最优选的， 所述步骤 （2) 中， 扩张蛋白的浓度为 0.4 mg/ml。

所述步骤 （2) 中的扩张蛋白溶液可参照现有技术制备， 如采用 McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J， Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall ext ension in plants. Plant Cell, 1992, 4: 1425-1433中的记载的方法制备；也可以按照如下 方法制备扩张蛋白溶液：

将大豆或黄瓜种子经 0.05〜0.15 wt% HgCl ₂ 消毒 4〜6 min,流水冲洗 5〜7 h，然后， 25〜 28 °C暗培养 4〜6天； 剪取幼苗下胚轴顶端 3〜4 cm， 置 -20 °C预冷 0.5 h, 加预冷至 4 °C的 匀桨缓冲液， 匀浆后， 用孔径 70 μιη的尼龙网过滤， 滤渣经匀浆缓冲液洗涤， 然后将滤渣加 入匀浆缓冲液中， 室温静置 l〜3 h， 得静置液； 向静置液中加入提取液， 4 °C下提取 44〜50 h， 过滤， 按 0.3〜0.5 g/mL的添加量向滤液中缓慢添加 （NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , 添加 （N ) ₂ S0 ₄ 过 程中不断搅拌， 防止 （N ) ₂ S0 ₄ 局部过饱和， 然后静置 45〜50 h， 4 °C条件下 25000 g离 心 5〜10 min,沉淀用酸性缓冲液复溶， 4 °C下分子量 3000 Da的透析袋透析，透析液经 20000 g离心 10 min， 取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。

上述扩张蛋白溶液制备方法中， 所述匀浆缓冲液组分为： 25 mmol/L HEPES (4-羟乙基 哌嗪乙磺酸）， 1.5 mmol/L Na ₂ S ₂ 0 ₅ ， 2 mmol/ L EDTA, 0.1 wt% Triton X- 100， pH 7.0； 所述 提取液组分为： 15 mmol/ L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸， 1.0 mmol/ L EDTA, 1.5 mmol/ L Na ₂ S ₂ 0 ₅ ,

0.5 mol/L NaCl, pH 6.0； 所述酸性缓冲液配制是： 将 2.05 g醋酸钠溶于水中， 用冰醋酸调节 pH至 4.0， 水定容至 1 L。

根据本发明优选的，步骤（2 )中所述的分离是在 15000 r/min条件下离心分离 5〜10 min。 根据本发明优选的， 步骤 （3 ) 中从发酵液中提取桑黄胞外总三萜类化合物的 方法， 步 骤如下：

向步骤 （2 ) 制得的发酵液中加入 3〜5倍体积的体积百分数为 95 %的乙醇溶液， 去除 沉淀（沉淀为多糖和其它大分子物质)，取上� �液，经 70°C浓缩蒸馏去除乙醇，然后加入 2〜 3倍体积的乙酸乙酯萃取， 再经过 70°C浓缩蒸馏去除乙酸乙酯， 得到桑黄胞外总三萜类化合 物。

根据本发明优选的， 所述步骤（3 ) 中提取桑黄胞内总三萜类化合物的方法， 步骤如下- 将步骤 （2 ) 制得的桑黄菌丝体 65 Ό烘干， 研成粉末， 按每克桑黄菌丝体粉末加 15〜 40 mL甲醇的量加入甲醇， 在室温条件下， 通过频率 40 KHz, 功率 200 W的超声提取 5〜7 h， 过滤， 取上清液， 制得浸提液； 滤渣重复超声提取、 过滤操作， 合并浸提液， 经 65 °C浓 缩蒸馏去除甲醇， 得到桑黄胞内总三萜类化合物。

本发明同已有技术相比有如下积极效果：

7、 本发明将扩张蛋白应用于桑黄总三萜类化合物 的液体发酵中， 桑黄胞外总三萜类化 合物和桑黄胞内总三萜类化合物产量分别高达 到 952.12 mg/L和 475.51 mg/L,相比现有技术 提高了 2.52倍和 2.19倍， 极大的提高了桑黄总三萜类化合物的产量， 具有良好的工业化应 用前景。

2 , 本发明利用天然桑黄菌种作为生产原料， 环保无毒， 原材料成本低廉， 所采用的桑 黄液体发酵工艺和提取方法简单， 重复性好； 此外， 本发明所述的发酵过程可控， 不受外部 环境条件限制， 适于工业化生产和应用。

3、 本发明所述扩张蛋白可从大多数双子叶和单子 叶植物及真菌等不同物种中提取， 来 源广泛， 成本较低， 制备方法也相对简单， 可规模提取生产， 对桑黄总三萜类化合物的发酵 生产具有很好的促进和提升效果。

附图说明

图 1 是不同浓度的扩张蛋白溶液对桑黄胞外总三萜 类化合物和桑黄胞内总三萜类化合 物产量的影响曲线；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细说明， 但本发明所保护范围不限于此。

原料及培养基

实施例中所述的发酵用桑黄 PheUinus igniar ^ 菌种， 购自中国普通微生物菌种保藏 管理中心， 菌种保藏号为 CGMCC No. 51328。

香草醛、 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、 EDTA (乙二胺四乙酸）、 牛血清白蛋白、 Triton X-100 均购自生工生物工程（上海）有限公司公司； 熊果酸标准溶液购自济南盛伟生物科技有限公 司； 其他试剂均为普通市售产品。

实施例中所述的扩张蛋白溶液的制备步骤如下 ：

将大豆（Glycine max L. Merr. CV. M40; 购自济南伟丽种业有限公司）或黄瓜（Cucumis sativus L. CV. Jinnian No. 6; 购自济南伟丽种业有限公司） 种子经 0.1wt% HgCl ₂ 消毒 5 min, 流水冲洗 6 h ， 然后， 栽入湿蛭石中， 27 °C暗培养 5 d。 剪取幼苗下胚轴顶端 3〜4 cm, 即 生长区约 100 g，置 -20 °C冰箱预冷 0.5 h，加预冷至 4 °C的匀浆缓冲液，高速匀浆后，用 70 μπι 尼龙网过滤， 滤渣经匀浆缓冲液洗涤， 然后将滤渣加入匀浆缓冲液中， 室温静置 2 h， 得静 置液； 向静置液中加入提取液， 4 °C下提取 48 h， 过滤， 滤液按 0.4 g/ mL的添加量向滤液中 缓慢添加 （NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , 添加 （NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 过程中不断搅拌， 防止 （N ) ₂ S0 ₄ 局部过饱和， 然后静置 48 h， 4 °C条件下 25000 g离心 lO min, 沉淀用酸性缓冲液复溶， 4 °C条件下用截 留分子量为 3000 Da的聚偏氟乙烯 （PVDF) 透析袋 （购自北京博润莱特科技有限公司） 透 析， 透析液经 20000 g离心 10 min， 取上清液即为制备的扩张蛋白溶液， 置 4 °C下保存。 其 他未描述歩骤可参照 McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall ext ension in plants. Plant Cell, 1992, 4: 1425-1433中的描述进行。

上述匀桨缓冲液组分为： 25 mmol/L HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸）， 1.5 mmol/L Na ₂ S ₂ 0 ₅ , 2 mmol/L EDTA， 0.1 wt % Triton X- 100, pH 7.0；

上述提取液组分为： 15 mmol/L HEPES, 1.0 mmol/L EDTA, 1.5 mmol/L Na ₂ S ₂ 0 ₅ ， 0.5 mol/L NaCl, pH 6.0；

所述酸性缓冲液每升按如下方法配制：

将 2.05 g醋酸钠溶于水中， 用冰醋酸调节 pH至 4.0， 水定容至 1 L。

扩张蛋白溶液浓度的测定方法釆用考马斯亮蓝 法检测， 具体可参照 （《精编蛋白质科学 实验指南》， ISBN: 703018086, 出版日期 1900-1-1 ) 中记载的考马斯亮蓝法进行操作， 以 牛血清白蛋白作标准曲线， 经检测上述扩张蛋白溶液中扩张蛋白浓度为 0.27 g/ml。

实施例中所述 PDA平板培养基，每升组份如下： 马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g，琼脂 15 g， 蒸馏水定容至 1000 mL。

实施例中所述 PD液体发酵培养基， 每升组份如下： 马铃薯 200 g、 葡萄糖 20 g， 蒸馏 水定容至 1000 mL。

实施例 1

一种利用扩张蛋白提高桑黄总三萜类化合物产 量的液体发酵方法， 包括如下步骤-

( 1 ) 将桑黄菌种接种到 PDA平板培养基上， 进行活化培养， 培养温度 25 V , 培养时 间 5天， 然后取直径 0.3 cm的菌块 6块， 接种于含有 PD液体发酵培养基的三角瓶中 （每 500 mL三角瓶装 PD液体发酵培养基 150 mL) 进行发酵培养， 液体发酵培养条件为： 温度 25 °C , 摇床培养 2天， 摇床转速 150 r/min, 得初发酵液；

(2 ) 向步骤 （1 ) 制得的初发酵液中加入扩张蛋白溶液， 使扩张蛋白的终浓度为 0.2 mg/mL, 然后在温度 25 °C、 摇床转速 150 r/min的条件下， 继续培养 5天， 15000 r/min条件 下离心分离 10 min， 得到桑黄菌丝体和发酵液；

( 3 )从步骤（2)制得的发酵液中提取桑黄胞外总三 萜类化合物， 从桑黄菌丝体中提取 桑黄胞内总三萜类化合物， 混合桑黄胞外总三萜类化合物和桑黄胞内总三 萜类化合物，得桑 黄总三萜类化合物；

上述提取桑黄胞外总三萜类化合物的步骤如下 ：

向步骤 （2) 制得的发酵液中加入 4倍体积的体积百分数为 95 %的乙醇溶液， 经 15000 r/min离心 5〜10 min去除沉淀， 取上清液， 经 70 Ό浓缩蒸馏去除乙醇， 然后加入 3倍体积 的乙酸乙酯萃取， 再经过 70 °C浓缩蒸馏去除乙酸乙酯， 得到桑黄胞外总三萜类化合物； 上述提取桑黄胞内总三萜类化合物的步骤如下 - 将步骤 （2) 制得的桑黄菌丝体烘干， 研成粉末， 按每克桑黄菌丝体粉末加 15〜40 mL 甲醇的量加入甲醇， 在室温条件下， 通过频率 40 KHz, 功率 200 W的超声提取 5 h， 过滤， 取上清， 得浸提液， 封口置 4 °C下冷藏； 滤渣重复超声提取、 过滤操作 3次， 合并浸提液； 然后， 经 65 Ό浓缩蒸馏去除甲醇， 得到桑黄胞内总三萜类化合物。

桑黄总三萜类化合物含量的测定

桑黄胞外总三萜类化合物待测样品的制备： 取由 100 mL发酵液制得的桑黄胞外总三萜 类化合物， 加甲醇定容至 2 mL， 制得桑黄胞外总三萜类化合物待测样品；

桑黄胞内总三萜类化合物待测样品的制备： 将由干重 1.0 g的菌丝体中提取出的桑黄胞 内总三萜类化合物， 加甲醇定容至 2 mL, 制得桑黄胞内总三萜类化合物待测样品；

采用本领域常规的紫外比色法测定 （参照 皮文霞， 蔡宝昌， 郭胜伟等. 分光光度法测 定山茱萸制剂中总三萜酸的含量 [ J]. 南京中医药大学学报 . 2003， 19( 2): 99-100. 和 王文祥， 顾振论. 比色法测定山楂总三萜酸的含量. 中国野生植物资源 [ J] . 2001, 20( 5): 47-48.等文献 报道)：

( 1 ) 标准曲线的建立

分别取熊果酸标准溶液 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6 mL于试管中， 再加香草醛 0.2 mL, 高氯酸 0.5 mL, 混勾后于 60 °C水浴中保温 30 min, 取出后置 4 °C冷水中 10 min, 再加入冰 醋酸 5 mL， 于 550 nm处测定吸光值， 以熊果酸的微克数为横坐标， 吸光度为纵坐标， 建立 标准曲线。

(2) 桑黄胞外总三萜类化合物产量的检测

加桑黄胞外总三萜类化合物待测样品 0.1 mL于试管中， 再加香草醛 0.2 mL， 高氯酸 0.5 mL, 混匀后于 60 °C水浴中保温 30 min, 取出后置 4 'C冷水中 10 min, 再加入冰醋酸 5 mL， 于 550 nm处测定吸光值， 经检测， 吸光值为 0.293, 通过标准曲线计算， 0.1 mL桑黄胞外总 三萜类化合物待测样品中含有 2.1151 mg桑黄胞外总三萜类化合物。

2.1151 mgX (2 mL/0.1 mL) /100=0.42302 mg, 即每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜 类化合物 423.02 μ _β ， 因此， 每升发酵液中含有 423.02 mg桑黄胞外总三萜类化合物。 如图 1 所示。

( 3 ) 桑黄胞内总三萜类化合物产量的检测

加桑黄胞内总三萜类化合物待测样品 0.1 mL于试管中， 再加香草醛 0.2 mL， 高氯酸 0.5 mL, 混匀后于 60 °C水浴中保温 30 min, 取出后置 4 °C冷水中 10 min, 再加入冰醋酸 5 mL, 于 550 nm处测定吸光值， 经检测， 吸光值为 0.122， 通过标准曲线计算， O.lmL桑黄胞内总 三萜类化合物待测样品中含有 470.6 μg桑黄胞内总三萜类化合物。

470.6 μ _§ Χ (2 mL/0.1 mL) =9412 μ _β ， 即每克菌丝体 （干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 9.41 mg， 因此， 对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 142.21 mg桑黄胞内总三萜类 化合物。 结果如图 1所示。

因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 423.02 mg +142.21 mg =565.23 mg。 实施例 2 如实施例 1 所述的液体发酵方法， 不同之处在于， 步骤 （2) 中扩张蛋白的浓度为 0.4 mg/mL;

经检测计算， 每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物 952.12 ^g, 即每升发酵液 中含有 952.12 mg桑黄胞外总三萜类化合物； 每克菌丝体（干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 17.26 mg, 即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 333.47 mg桑黄胞内总三萜类化合 物。 结果如图 1所示。

因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 952.12 mg +333.47 mg =1285.59 mg。 实施例 3

如实施例 1 所述的液体发酵方法， 不同之处在于， 步骤 （2 ) 中扩张蛋白的浓度为 0.6 mg/mL;

经检测计算， 每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物 829.51 μ _§ , 即每升发酵液 中含有 829.51 mg桑黄胞外总三萜类化合物； 每克菌丝体（干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 15.31 mg, 即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 340.77 mg桑黄胞内总三萜类化合 物。 结果如图 1所示。

因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 829.51 mg +340.77 mg =1170.28 mg。 实施例 4

如实施例 1 所述的液体发酵方法， 不同之处在于， 步骤 （2) 中扩张蛋白的浓度为 0.8 mg/mL;

经检测计算， 每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物 785.76 μg, 即每升发酵液 中含有 785.76 mg桑黄胞外总三萜类化合物； 每克菌丝体（干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 16.34 mg, 即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 449.51 mg桑黄胞内总三萜类化合 物。 结果如图 1所示。

因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 785.76 mg +449.51 mg =1235.27 mg。 实施例 5

如实施例 1 所述的液体发酵方法， 不同之处在于， 步骤 （2) 中扩张蛋白的浓度为 1.0 mg/mL;

经检测计算， 每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物 838.63 μ _Ε , 即每升发酵液 中含有 838.63 mg桑黄胞外总三萜类化合物； 每克菌丝体（干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 12.07 mg， 即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 337.82 mg桑黄胞内总三萜类化合 物。 结果如图 1所示。

因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 838.63 mg +337.82 mg =l 176.45 mg。 实施例 6

如实施例 1 所述的液体发酵方法， 不同之处在于， 步骤 （2) 中扩张蛋白的浓度为 1.2 mg/mL;

经检测计算， 每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物 882.37 μ _§ , 即每升发酵液 中含有 882.37 mg桑黄胞外总三萜类化合物； 每克菌丝体（干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 13.25 mg, 即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 335.03 mg桑黄胞内总三萜类化合 物。 结果如图 1所示。

因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 882.37 mg +335.03 mg =1217.4 mg。 如实施例 1 所述的液体发酵方法， 不同之处在于， 步骤 （2) 中扩张蛋白的浓度为 1.5 mg/mL;

经检测计算， 每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物 713.11 μg, 即每升发酵液 中含有 713.11 mg桑黄胞外总三萜类化合物； 每克菌丝体 （干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 15.94 mg， 即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 414.72 mg桑黄胞内总三萜类化合 物。 结果如图 1所示。

因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 713.11 mg +414.72 mg =1127.83 mg。 对比例 1

如实施例 1所述的液体发酵方法， 不同之处在于， 步骤 （2) 中用不含扩张蛋白的酸性 缓冲液替代实施例加入的扩张蛋白溶液；

经检测计算， 每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物 270.15 μg, 即每升发酵液 中含有 270.15 mg桑黄胞外总三萜类化合物； 每克菌丝体（干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 9.76 mg, 即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 149.03 mg桑黄胞内总三萜类化合 物。 结果如图 1所示。

因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 270.15 mg +149.03 mg =419.18 mg。 分析

根据以上实施例 1〜7及对比例 1可表明： 扩张蛋白对桑黄胞外总三萜类化合物、 桑黄 胞内总三萜类化合物的产量具有明显促进作用 ， 分别在发酵液中扩张蛋白的浓度为 0.4 mg/mL和 0.8 mg/mL时，桑黄胞外总三萜类化合物和桑黄胞内� ��三萜类化合物产量分别达到 最高产量 952.12 mg/L和 475.51 mg/L。 相比对比例 1分别提高了 2.52倍和 2.19倍。

本发明扩张蛋白还可从其它双子叶和单子叶植 物及真菌等物种（如： 燕麦胚芽、栝楼根 尖、 番茄、 烟草、 拟南芥、 水稻、 棉纤维、 玉米等） 的细胞壁中提取， 桑黄菌种也可采用其 它普通栽培品种。