Die Bestimmung des Blutgerinnungsstatus kann indirekt durch Ermittlung der Prothrombinkonzentration in menschlichen Kör- perflüssigkeiten erfolgen. Bei Prothrombin handelt es sich um ein Protein, welches vorwiegend im Plasma des menschlichen Bluts vorkommt. Dieses Protein ist durch eine Vitamin-K abhä- nige y-Carboxylase modifizierbar. Prothrombin ist mitverant- wortlich für die Blutgerinnung. Es wandelt Fibrinogen in Fi- brin um.

Die durch Prothrombin induzierte Umwandlung des Fibrinogens erfolgt nur dann, wenn Prothrombin in natürlicher carboxy- lierter Form vorliegt. Die Carboxylierung erfolgt in der Le- ber durch eine Carboxylase unter Bindung des Co-Faktors Vit- amin K. Die Aktivität der Carboxylase ist von der Konzentra- tion an Vitamin K abhängig. Bei reduzierter Aktivität der Carboxylase entsteht eine abnormale nicht carboxylierte Form des Prothrombins, welche nicht gerinnungsaktiv ist.

Beim gesunden Menschen liegt das Prothrombin in natürlicher, d. h. carboxylierter, Form vor. Die Carboxylierung wird durch Vitamin-K als Co-Faktor bewirkt. Bei kranken Menschen, insbe- sondere bei Menschen mit Leberschäden, oder bei Zugabe von Antikoagulantien, kommt Prothrombin auch in der abnormalen Form vor.

Das carboxylierte Prothrombin bewirkt eine Gerinnung nur dann, wenn zuvor Ca2+-Ionen gebunden werden. Nur dann ist das carboxylierte Prothrombin in der Lage, an die Membranen der

Blutplättchen zu binden und eine Gerinnung zu bewirken. Nur die carboxylierte Form des Prothrombins kann Calcium binden.

Somit läßt der Gehalt an carboxyliertem Prothrombin auf den Blutgerinnungsstatus schließen.

Aus der US 4,769,320 ist ein Verfahren bekannt, bei dem die Ermittlung des Gehalts an carboxyliertem Prothrombin unter Verwendung von Antikörpern mittels Immunoassay erfolgt. Die Antikörper sind spezifisch für carboxyliertes Prothrombin in Gegenwart von Calcium. Sie binden nicht an decarboxyliertes Prothrombin. Es wird ein Kit zur Bestimmung des Pegels von carboxyliertem Prothrombin in einer Plasmaprobe beschrieben, der einen solchen Antikörper enthält.

Aus der US 5,252,712 ist ein monoklonaler Antikörper bekannt, der spezifisch für nicht-carboxyliertes Prothrombin ist. Un- ter Verwendung dieses Antikörpers läßt sich mittels Immunoas- say die Konzentration an nicht-carboxyliertem Prothrombin er- mitteln. Auch damit ist eine Aussage über den Blutgerinnungs- status möglich.

In der US 4,780,410 ist ein Sandwich-Immunoassay-Verfahren zur Quantifizierung von einem decarboxylierten Prothrombin offenbart. Bei dem Verfahren wird ein gegen decarboxyliertes Prothrombin gerichteter immobilisierter monoklonaler Antikör- per verwendet. Daran bindendes decarboxyliertes Prothrombin wird mittels eines zweiten gegen Prothrombin gerichteten An- tikörpers detektiert. Es wird auch ein Kit zur Durchführung des Verfahrens beschrieben.

Aus Kornberg A. et al., Circulation 88 (1993), Seiten 454- 460 ist es bekannt, die Konzentration von carboxyliertem Pro- thrombin in einer Probe mittels eines Kompetitors zu bestim-

men. Dabei konkurriert Peroxidase-markiertes Prothrombin als Kompetitor mit dem Prothrombin in der Probe um die Bindung an einem immobilisierten Anti-Prothrombin-Antikörper. Das an dem Anti-Prothrombin-Antikörper gebundene Peroxidase-markierte Prothrombin ist mittels einer Enzymreaktion nachweisbar. Die Größe des dabei entstehenden Signals ist umgekehrt proportio- nal zur Prothrombin-Konzentration in der Probe.

Aus der JP 05 284 994 A sind drei monoklonale Antikörper be- kannt. Ein erster bindet spezifisch an humanes decarboxylier- tes Prothrombin, ein zweiter spezifisch an humanes Prothrom- bin, humanes Thrombin und humanes decarboxyliertes Prothrom- bin und ein dritter spezifisch an humanes decarboxyliertes Prothrombin und humanes Prothrombin.

Aus von Kries, R. et al., Thrombosis and Haemostasis 68 (1992), Seiten 383-387 ist es bekannt, decarboxyliertes Prothrombin im Blut mittels eines ELISAs mit einem monoklona- len Antikörper zu bestimmen.

Nach dem Stand der Technik tritt das Problem auf, daß das zu analysierende Probenmaterial nicht immer unmittelbar nach der Entnahme der Probe analysiert wird. Durch die Versendung des Probenmaterials vergehen mitunter 1 bis 2 Tage. Die meisten der an der Blutgerinnung beteiligten Faktoren sind hoch emp- findlich und schnell inaktiv. Während dieser Zeit wird u. a. sowohl carboxyliertes als auch nicht-carboxyliertes Prothrom- bin in der Probe abgebaut. Eine Verfälschung der Ergebnisse des Blutgerinnungsstatus ist die Folge.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere die Genauig- keit der Ermittlung des Blutgerinnungsstatus mittels der Be-

stimmung des Prothrombingehalts erhöht werden. Ferner soll ein Kit bereitgestellt werden, der eine genauere Ermittlung des Blutgerinnungsstatus ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 11 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 10 und 12 bis 20.

Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur indirekten Bestimmung des Blutgerinnungsstatus mit folgenden Schritten vorgesehen : a) Entnahme von Körperflüssigkeit, die ein durch eine Vit- amin-K abhängige y-Carboxylase modifizierbares Protein enthält, b) Ermittlung von mindestens zwei Konzentrationen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus einer ersten Konzentration an carboxyliertem Protein, einer zweiten Konzentration an decarboxyliertem Protein und einer Gesamtkonzentration an carboxyliertem und decarboxyliertem Protein, wobei die erste Konzentration unter Verwendung eines ersten Anti- körpers, die zweite Konzentration unter Verwendung eines zweiten Antikörpers und die dritte Konzentration unter Verwendung eines dritten Antikörpers ermittelt wird, c) Bildung eines ersten Quotienten aus erster und zweiter Konzentration oder Bildung eines zweiten Quotienten aus dritter und erster Konzentration

oder Bildung eines dritten Quotienten aus dritter und zweiter Konzentration, wobei eine zur Bildung des ersten, zweiten oder dritten Quotienten erforderliche und bei Schritt lit. b) nicht ermittelte Konzentration gemäß folgender Beziehung : C3-C2 = Cl errechnet wird und d) Korrelation des ersten, zweiten oder dritten Quotienten mit dem Blutgerinnungsstatus.

Unter einem durch eine Vitamin-K abhängige 7-Carboxylase mo- difizierbaren Protein wird ein Protein verstanden, das in Ab- hängigkeit des Blutgerinnungsstatus anteilig sowohl in ca- boxylierter als auch in decarboxylierter Form vorliegen kann.

Das Protein kann ein leicht von einem Patienten gewinnbares Protein, z. B. ein Protein aus dem Speichel, sein. Das Protein kann ein Protein sein, das derselben prozentualen Hypomodifi- kation unterliegt wie Prothrombin. Ein Antikörper im Sinne der Erfindung kann ein Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein sonstiger Stoff mit Bindungsspezifität für die car- boxylierte Form, die decarboxylierte Form oder beiden Formen des Proteins sein.

Mit den erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, auf der Basis des Gehalts an modifizierbarem Protein den Blutgerin- nungsstatus genau zu ermitteln. Durch die Betrachtung sowohl des Gehalts an carboxyliertem Protein als auch des Gehalts an decarboxyliertem Protein und das Inbeziehungsetzen der beiden vorgenannten Proteingehalte werden Fehler bei der Bestimmung des Blutgerinnungsstatus minimiert.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird beim Schritt lit. b) zusätzlich mindestens ein erster Kompetitor zur Ermittlung der ersten Konzentration, ein zweiter Kompetitor zur Ermitt- lung der zweiten Konzentration oder ein dritter Kompetitor zur Ermittlung der dritten Konzentration verwendet. Bei dem Kompetitor handelt es sich um einen Stoff, der mit dem car- boxylierten Protein, dem decarboxylierten Protein oder dem carboxylierten und dem decarboxylierten Protein um die Bin- dung an einem der Antikörper konkurriert. Der Kompetitor kann das carboxylierte oder decarboxylierte Protein sein, wobei es mit einer Markierungssubstanz versehen ist. Anstatt des voll- ständigen Proteins kann auch ein Fragment dieses Proteins als Kompetitor verwendet werden.

Vorzugsweise ist mindestens einer der Antikörper oder minde- stens einer der Kompetitoren mit einer Markierungssubstanz, insbesondere einem Enzym, einem Fluoreszenz-Farbstoff, einem Quencher, einem Goldpartikel, einem Latexpartikel, Biotin, Streptavidin oder Avidin, konjugiert. Als Enzym kann jedes Enzym verwendet werden, das mittels einer enzymatischen Reak- tion nachgewiesen werden kann. Die Markierung des Antikörpers mit einem Goldpartikel erlaubt den Nachweis des gebundenen Antikörpers mittels eines Plasmonresonanz-Verfahrens.

Anstatt der Ermittlung der mindestens zwei Konzentrationen gemäß Schritt lit. b) kann auch ein dazu korrelierendes Mischsignal unter Verwendung von zwei Antikörpern, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus dem ersten, dem zweiten und dem dritten Antikörper, und gegebenenfalls mindestens einem der Kompetitoren erzeugt und ermittelt und direkt mit dem Blutgerinnungsstatus korreliert werden. Das Mischsignal ent- steht durch das Zusammenwirken unterschiedlicher Einzelsigna- le. Es entspricht dem ersten, zweiten oder dritten Quotien- ten. Die Bildung dieser Quotienten gemäß Schritt lit. c) ent- fällt. Das Verfahren ist dadurch schneller und einfacher aus- führbar. Das Mischsignal kann eine, insbesondere durch Fluo- reszenzfarbstoffe erzeugte, Mischfarbe, ein durch den För- ster-Effekt hervorgerufenes Fluoreszenzsignal oder eine durch den Quencher bedingte Verminderung eines Fluoreszenzsignals sein. Die Mischfarbe kann auch durch zwei Enzyme erzeugt wer- den, die jeweils eine spezifische Farbreaktion katalysieren.

Bei dem Förster-Effekt findet ein strahlungsloser Energie- transfer von einem angeregten ersten Fluorophor auf ein un- mittelbar benachbartes zweites Fluorophor statt. Dadurch geht das erste Fluorophor in den Grundzustand über, während das zweite Fluorophor angeregt wird und fluoresziert. Bei dem er- findungsgemäßen Verfahren können z. B. die ersten und zweiten Antikörper mit Fluorophoren konjugiert sein, die den Förster- Effekt ermöglichen. Die Bindung der ersten Antikörper in un- mittelbarer Nachbarschaft zu den zweiten Antikörpern kann mittels eines durch den Förster-Effekt hervorgerufenen Fluo- reszenzsignals festgestellt werden. Bei einem strahlungslosen Energietransfer vom Fluorophor auf den Quencher findet eine Löschung der Fluoreszenz statt. Das insgesamt meßbare Fluo- reszenzsignal wird dadurch vermindert.

Bei der Körperflüssigkeit kann es sich zweckmäßigerweise um Plasma, Blut, Speichel, Urin oder dgl. handeln. Geeignet sind grundsätzlich alle Körperflüssigkeiten, in der das modifi- zierbare Protein in einem Gehalt enthalten ist, der eine Mes- sung ermöglicht.

Nach einem Ausgestaltungsmerkmal der Erfindung erfolgt die Ermittlung der ersten, zweiten und/oder dritten Konzentration oder des Mischsignals mittels eines immunologischen Verfah- rens. Dabei kann bei dem immunologischen Verfahren mindestens einer der Antikörper auf einem Träger, insbesondere einem Kunststoff, einem Magnetpartikel, einem Latexpartikel, einem Goldpartikel, einem Teststreifen oder einer Membran, immobi- lisiert sein. Der Kunststoff kann in Form eines Teströhr- chens, eines Teststreifens, eines Kunststoffpartikels oder einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte vorliegen.

Die erste, zweite und/oder dritte Konzentration und/oder das Mischsignal kann mittels einer Farbreaktion oder Fluoreszenz- detektion ermittelt werden. Damit ist eine besonders schnelle und einfache Ermittlung des Blutgerinnungsstatus möglich.

Bei dem durch eine Vitamin-K abhängige y-Carboxylase modifi- zierbaren Protein handelt es sich vorzugsweise um einen der in der decarboxylierten Form als"Proteins Induced by Vitamin K Antagonism or Absence" (PIVKA-Faktoren) bezeichneten Gerin- nungsfaktoren Prothrombin, Faktor VII, Faktor IX oder Faktor X, um Nephrocalcin oder um Osteocalcin. Es ist auch möglich, zur Bestimmung des Blutgerinnungsstatus andere Proteine zu benutzen, die von einer Vitamin-K abhängigen Carboxylase car- boxyliert werden und ebenfalls mittels oral verabreichbarer Anticoagulantien beeinflußbar sind. Nephrocalcin ist z. B. im Urin nachweisbar. Es muß bei Benutzung dieses Proteins kein

Blut entnommen werden. Das bedeutet für Patienten, deren Blutgerinnungsstatus laufend überwacht werden muß, eine er- hebliche Erleichterung.

Es ist ferner ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, wobei mindestens zwei Antikörper ent- halten sind, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus einem ersten Antikörper zur immunologischen Bestimmung einer ersten Konzentration der carboxylierten Form des Proteins, einem zweiten Antikörper zur immunologischen Bestimmung einer zwei- ten Konzentration der decarboxylierten Form des Proteins und einem dritten Antikörper zur immunologischen Bestimmung einer Gesamtkonzentration an carboxyliertem und decarboxyliertem Protein.

Es kann sich beim ersten, zweiten und dritten Antikörper um nach dem Stand der Technik bekannte Antikörper handeln. Sol- che Antikörper sind z. B. aus der US 5,252,712 und US 4,769,320 bekannt, deren Inhalt hiermit in die Beschreibung einbezogen wird.

In dem Kit kann zusätzlich mindestens ein erster Kompetitor zur Ermittlung der ersten Konzentration, ein zweiter Kompeti- tor zur Ermittlung der zweiten Konzentration oder ein dritter Kompetitor zur Ermittlung der dritten Konzentration enthalten sein. Mindestens einer der in dem Kit enthaltenen Antikörper oder Kompetitoren kann mit einer Markierungssubstanz, insbe- sondere einem Enzym, einem Fluoreszenz-Farbstoff, einem Quen- cher, einem Goldpartikel, einem Latexpartikel, Biotin, Strep- tavidin oder Avidin, konjugiert sein.

Vorzugsweise sind der erste und der zweite Antikörper auf ei- nem Träger immobilisiert. Der Träger kann ein Kunststoff, ein

Magnetpartikel, ein Latexpartikel, ein Goldpartikel, ein Teststreifen oder eine Membran sein. Ist der Träger ein Test- streifen, können der erste und der zweite Antikörper jeweils auf einem separaten Feld des Teststreifens aufgenommen sein.

Vorzugsweise ist in dem Kit ein mit einer Markierungssub- stanz, insbesondere einem Enzym, einem Fluoreszenz-Farbstoff, einem Quencher, einem Goldpartikel, einem Latexpartikel, Bio- tin, Streptavidin oder Avidin, konjugierter dritter Antikör- per enthalten. Das ermöglicht eine besonders einfache Ermitt- lung des jeweiligen Gehalts z. B. mittels einer Farbreaktion auf dem Teststreifen.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist der dritte Antikörper auf dem oder einem weiteren Träger, insbesondere einem Kunststoff, einem Magnetpartikel, einem Latexpartikel, einem Goldpartikel, einem Teststreifen oder einer Membran, immobilisiert. Ist der Träger der oder ein weiterer Test- streifen, kann der dritte Antikörper auf einem Feld des Test- streifens aufgenommen sein. Bevorzugt sind in dem Kit mit je- weils einer Markierungssubstanz, insbesondere einem Enzym, einem Fluoreszenz-Farbstoff oder einem Quencher, konjugierte erste und zweite Antikörper enthalten, wobei die Markierungs- substanzen so gewählt sind, daß sie gemeinsam ein Mischsi- gnal, insbesondere eine Mischfarbe, ein durch den Förster- Effekt hervorgerufenes Fluoreszenzsignal oder eine durch ei- nen Quencher bedingte Verminderung eines Fluoreszenzsignals, erzeugen können. Das Mischsignal entspricht dem ersten Quoti- enten.

Bei dem Protein handelt es sich vorzugsweise um Prothrombin, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Nephrocalcin oder Osteo- calcin.

Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand der Zeichnung erläutert : Es zeigen Fig. 1 die Korrelation des Blutgerinnungsstatus mit cPT/dcPT, Fig. 2 die Korrelation des Blutgerinnungsstatus mit dcPT/cPT und Fig. 3 die Korrelation des Blutgerinnungsstatus mit dcPT.

In Fig. 1 ist der Quotient aus den Konzentrationen von car- boxyliertem und decarboxyliertem Prothrombin über dem Blutge- rinnungsstatus INR aufgetragen. Die Konzentrationen sind hier als OD-Werte gemessen. Bei einem ermittelten Quotienten von 0,5 ergibt sich ein Blutgerinnungsstatus INR von 3,8.

In Fig. 2 ist der Quotient aus den Konzentrationen von decar- boxyliertem und carboxyliertem Prothrombin über dem Blutge- rinnungsstatus aufgetragen. Es ist ersichtlich, daß der Quo- tient hier besonders gut mit dem Blutgerinnungsstatus INR korreliert.

Fig. 3 zeigt die nach dem Stand der Technik bekannte Korrela- tion von dcPT mit dem Blutgerinnungsstatus INR. Diese verän- dert sich mit zunehmendem Alter der Proben.

Beispiel 1 : Für Serienmessungen besonders geeignet ist der sogenannte ELISA auf einer Mikrotiterplatte. a) Probenvorbereitung :

Die Kavitäten einer Mikrotiterplatte (Maxisorb, NUNC) werden über Nacht bei 4°C mit je 501 eines Antikörpers (lOg/ml in Carbonatpuffer) beschichtet. Die Kavitäten werden dreimal mit PBS gewaschen. Unspezifische Bindungsstellen werden eine Stunde bei Zimmertemperatur mit 5041 1% BSA in PBS pro Kavi- tät abgesättigt. Anschließend werden die Kavitäten dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen.

Anschließend werden die folgenden jeweils 1 : 50 in PBS/0,1% BSA verdünnten Proben aufgetragen (5041/Kavität) : Kalibrierplasmen, Normalplasma, Patientenplasma und Prothrombindefizientes Plasma (negative Kontrolle).

Die Mikrotiterplatte wird eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Anschließend werden die Kavitäten dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Es werden 501/Kavität Kanin- chen Anti-Gesamt-Prothrombin (10ßg/ml) zufügt. Dann wird die Mikrotiterplatte eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert.

Die Kavitäten werden anschließend dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Es werden 5041/Kavität Ziege-anti-Kaninchen- Antikörper, Biotin-konjugiert (Dianova, 1 : 20000 in PBS/0,1% BSA), zufügt. Die Mikrotiterplatte wird eine Stunde bei Zim- mertemperatur inkubiert. Anschließend werden die Kavitäten dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen.

Es werden 501/Kavität Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Ro- che Diagnostics, 1 : 1000 in Konjugatpuffer) zufügt. Die Mikro- titerplatte wird eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert.

Anschließend werden die Kavitäten dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen.

Zur Durchführung der Entwicklungsreaktion werden 50ß1/Kavität ABTS-Lösung (Roche Diagnostics, lmg/ml) zufügt. Die Mikroti- terplatte wird eine halbe bis eine Stunde bei Zimmertempera- tur inkubiert. Die Absorbtionswerte (OD-Werte) werden in ei- nem ELISA-Reader gemessen.

Es versteht sich, daß das Verfahren erheblich verkürzt werden kann, wenn bereits der zur Detektion gebundenen Prothrombins verwendete Anti-Prothrombin-Antikörper eine Markierungssub- stanz, wie Peroxidase oder ein anderes Enzym, aufweist. Eine weitere Verkürzung des Verfahrens kann durch Verwendung einer direkt detektierbaren Markierungssubstanz, wie einem Fluoro- phor, erreicht werden. Bei Verwendung einer solchen Markie- rungssubstanz ist keine Entwicklungsreaktion erforderlich. b) Auswertung : Es werden aa) die OD-Werte des Gesamt-Prothrombins (Kavitäten sind mit monoklonalen Anti-Gesamt-Prothrombin-Antikörpern beschich- tet), bb) die OD-Werte des decarboxylierten Prothrombins (Kavitä- ten sind mit monoklonalen Anti-Decarboxy-Prothrombin- Antikörpern beschichtet) und cc) die OD-Werte des carboxylierten Prothrombins (Differenz zwischen den OD-Werten des Gesamt-Prothrombins und den OD- Werten des decarboxylierten Prothrombins) bestimmt.

Dann werden Eichkurven aus den gemessenen OD-Werten (siehe Fig. 1-3 : Punkte A, B, C und D) der Kalibrierplasmen erstellt und der INR der Patientenplasmen berechnet.

Es versteht sich, daß der Gerinnungsstatus auch durch Ermitt- lung der entsprechenden Konzentrationen anderer durch eine Vitamin-K abhängige y-Carboxylase modifizierbarer Proteine als Prothrombin ermittelt werden kann. Solche Proteine sind z. B. Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Nephrocalcin oder Osteocalcin.

Beispiel 2 : Die Kavitäten einer Mikrotiterplatte (Maxisorb, NUNC) werden über Nacht bei 4°C mit je 50k1 eines gegen carboxyliertes und decarboxyliertes Prothrombin oder eines nur gegen decarboxy- liertes Prothrombin gerichteten Antikörpers (10ßg/ml in Car- bonatpuffer) beschichtet. Die Kavitäten werden dreimal mit PBS gewaschen. Unspezifische Bindungsstellen werden eine Stunde bei Zimmertemperatur mit 50ß1 1% BSA in PBS pro Kavi- tät abgesättigt. Anschließend werden die Kavitäten dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen.

Peroxidase-markiertes decarboxyliertes Prothrombin wird zu- sammen mit den folgenden jeweils 1 : 50 in PBS/0,1% BSA ver- dünnten Proben in einer Endkonzentrationen von 30 Fg/ml in die Antikörper-beschichteten Kavitäten der Mikrotiterplatte gegeben (5041/Kavitat) : Kalibrierplasmen, Normalplasma, Patientenplasma und Prothrombindefizientes Plasma (negative Kontrolle).

Die Mikrotiterplatte wird eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Anschließend werden die Kavitäten dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Es werden 5041/Kavität ABTS- Lösung (Roche Diagnostics, lmg/ml) zugefügt. Die Mikrotiter- platte wird eine halbe bis eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die OD-Werte in den Kavitäten der Mikrotiterplatte werden im ELISA-Reader gemessen. Je höher der OD-Wert in ei- ner Kavität ist, desto geringer ist die Konzentration des Prothrombins in der jeweiligen Probe. Die Prothrombinkonzen- tration im Patientenplasma wird aufgrund einer mittels der Kalibrierplasmen erstellten Eichkurve ermittelt. Mit dem An- tikörper gegen carboxyliertes und decarboxyliertes Prothrom- bin beschichtete Kavitäten werden zur Bestimmung der Gesamt- konzentration des carboxylierten und decarboxylierten Pro- thrombins verwendet. Kavitäten, die mit dem gegen decarboxy- liertes Prothrombin gerichteten Antikörper beschichtet sind, dienen zur Bestimmung der Konzentration an decarboxyliertem Prothrombin. Die ermittelte Gesamtkonzentrationen an carboxy- liertem und decarboxyliertem und die Konzentration an decar- boxyliertem Prothrombin werden zueinander ins Verhältnis ge- setzt. Aus dem resultierenden Quotienten kann anhand der Quo- tienten für die Kalibrierplasmen der Gerinnungsstatus ermit- telt werden.