PLANTAS.

Campo de la técnica

La presente invención está relacionada con el campo de la biotecnología agropecuaria, específicamente con la estimulación de la defensa natural y la inducción de resistencia a enfermedades en plantas, para prevenir o combatir las enfermedades causadas por agentes patógenos.

Estado de la técnica anterior

Muchos han sido los estudios realizados, desde el punto de vista morfológico, fisiológico, bioquímico y molecular, de las interacciones planta - patógeno en las últimas décadas. Sin embargo, los resultados alcanzados hasta la fecha no satisfacen las necesidades y el conocimiento de los principales grupos de investigación en el mundo, además de no poder contar con altos rendimientos a través de una protección eficiente y estable de las cosechas. A pesar de las innumerables medidas tomadas a escala mundial, para una protección integral en los cultivos, cada año se registran grandes pérdidas de las cosechas, producto de enfermedades, específicamente en situaciones donde no ocurren epifitias, en las cuales estas pérdidas podrían alcanzar hasta el 80 % de la producción (Gao et al. (2000) Nature Biotechnol. 18: 1307-1310).

Las plantas y los patógenos han coevolucionado durante millones de años. En el transcurso de esta interacción han surgido estrategias que les permiten a las plantas reconocer potencialmente al patógeno que las está invadiendo y desencadenar una defensa exitosa. De la misma manera, los patógenos han ido desarrollando los mecanismos que les posibilitan evadir y/o suprimir las respuestas defensivas de la planta. La influencia de esta presión selectiva sobre las plantas, ha conllevado al perfeccionamiento de sus mecanismos de defensa. Como consecuencia de esto, el éxito del patógeno para causar una enfermedad, lejos de constituir la regla, es una excepción (Staskawicz (2001 ) Plant Physiology 125: 73-76).

La percepción de elicitores específicos y generales por las plantas no solo permite el reconocimiento de los patógenos, sino que posibilita la transducción de señales para la activación de los mecanismos de respuesta. Entre las diferentes vías de señalización activadas se encuentran las mediadas por intermediarios como el oxígeno reactivo, el ácido salicílico, el etileno y el ácido jasmónico. El entrecruzamiento entre las vías de señalización de estas fitohormonas brinda un potencial regulatorio que permite la activación de una combinación óptima de respuestas en dependencia del patógeno específico que esté atacando. También es activada la expresión de genes relacionados con la patogenicidad (PR) y la síntesis de compuestos antimicrobianos que son generalmente fitoalexinas, defensinas, compuestos fenólicos y flavonoides producidos para atacar directamente al patógeno (Baker et al. (1997) Science 276: 726 - 733).

Existen otros tipos de mecanismos de respuestas que operan en las plantas, cuyos efectos perduran por un espacio de tiempo relativamente prolongado, después de la infección. Estos se denominan: respuesta localizada adquirida y respuesta sistémica adquirida. La respuesta localizada adquirida se observa en un anillo de células, de 5-10 mm de espesor, alrededor de las lesiones provocadas por la respuesta hipersensible. Esta zona se caracteriza por una gran acumulación de proteínas relacionadas con la patogénesis, fundamentalmente básicas (Fritig et al. (1998) Current Opinión of Immunology 10: 16-22) y la estimulación de enzimas como las metiltransferasas (Legrand et al. (1978) Planta 144: 101 -108), de la vía del fenilpropanoide, que interviene en la producción de antibióticos como la escopoletina, lo cual no provee un ambiente adecuado a los patógenos, impidiendo su diseminación por toda la planta. La respuesta sistémica adquirida, le brinda a la planta un mayor nivel de resistencia contra una infección subsecuente del mismo patógeno. Se desarrolla no solo en los tejidos infectados, sino en todo el organismo. Se caracteriza por la acumulación de proteínas PR, sobre todo ácidas, que son las relacionadas con el mecanismo de señalización del ácido salicílico (Cordelier et al. (2003) Plant Molecular Biology 51 : 109- 1 18).

Las plantas poseen la capacidad de sintetizar una gran variedad de esferoides que funcionan como hormonas. Sin embargo, no fue hasta 1979 que la presencia de las hormonas esferoides se confirmó en las plantas. En ese año, científicos norteamericanos publicaron datos sobre un nuevo brasinosteroide llamado lactona, que fue aislado del polen de Brassica napus L. (Grove et al. (1979) Nature 281 : 216- 217). Los brasinosteroides han sido reconocidos como una nueva clase de fitohormonas que desempeñan un papel importante en la regulación del crecimiento (Azpiroz et al. (1998) Plant Cell 10: 219-230). Las sustancias naturales pueden ser adecuadas para una amplia aplicación en la protección de plantas y la promoción de rendimiento en la agricultura. Desde el inicio, lo s brasinosteroides se consideraron compu estos prometedores para su aplicación en la agricultura, sin afectación del medio ambiente, debido a que mostraron diversos tipos de actividad reguladora en el crecimiento y el desarrollo de las plantas, y a su valor económico como agente promotor del rendimiento (Khripach et al. (2000) Ann. Botany 86: 441 -447). Una característica importante es la capacidad de los brasinosteroides para actuar en concentraciones extremadamente bajas. Una confirmación indirecta de este fenómeno es la baja concentración de brasinosteroides en las plantas. Una cantidad típica para la aplicación en la agricultura es de entre 5 y 50 mg por hectárea, en el cultivo de plantas (Khripach et al. (2000) Ann. Botany 86: 441 -447).

Un brasinosteroide indujo resistencia a patógenos bacterianos y fúngicos en tabaco y arroz. La resistencia a la enfermedad inducida por este brasinosteroide no fue correlacionada con una mayor acumulación de ácido salicílico o el aumento de la expresión de genes asociados con la resistencia sistémica adquirida (Nakashita et al. (2003) Plant Journal 33: 887-898).

La enfermedad "Huanglongbing" (HLB), producida por la bacteria Candidatus 'Liberibacter asiaticus', es la más destructiva de los cítricos en todo el mundo, por la severidad de los síntomas, la rapidez con que se dispersa y porque afecta a todas las especies comerciales de cítricos. Es una enfermedad que aún no tiene cura (Gottwald (2010) Annu. Rev. Phytopathol. 48: 6.1-6.21 ). La enfermedad fue detectada por primera vez en Asia, a finales del siglo XIX, luego se reportó su presencia en África del Sur a principios del siglo XX, lo que propició que a través de los años se diseminara en ambos continentes (Gottwald (2010) Annu. Rev. Phytopathol. 48: 6.1-6.21 ). En la actualidad se reconocen tres variantes de esta enfermedad (asiática, africana y americana). El organismo causal es una bacteria Gram negativa "fastidiosa", la c ual no es posible obtener en cultivos puros en medios artificiales. Este organismo se restringe al floema de las Rutáceas, aunque tiene la capacidad de multiplicarse en la hemolinfa y las glándulas salivares de los psílidos vectores (psila asiática de los cítricos - Diaphorina citri). Dentro de los insectos, penetra la pared intestinal hasta llegar a las glándulas salivares, vía hemolinfa, en un período de 1 a 3 semanas según la virulencia de la cepa.

Los síntomas varían con la variedad y la edad de la planta afectada, ya que estos se observan claramente en árboles jóvenes y vigorosos, mientras que en los afectados después de su desarrollo, los síntomas son menos marcados. En las hojas formadas, los tejidos a lo largo del nervio central y las venas secundarias se tornan amarillos y la clorosis se difunde sobre las nervaduras laterales hasta que la hoja se cae (da Graca (1991 ) Annu. Rev. Phytopathol. 29: 109-36). Las hojas jóvenes afectadas permanecen de tamaño pequeño, ocurriendo el proceso de forma más severa. Las plantas muestran una considerable defoliación con muerte apical a los pocos años de ocurrida la infección, generalizándose también el moteado y el amarillamiento. Se desarrollan brotes múltiples con hojas pequeñas, pálidas y moteadas. Durante la infección existe un pobre cuajado de frutos; caída prematura de estos y los que se mantienen en el árbol son pequeños y asimétricos, tomando la coloración correcta la parte expuesta al sol, mientras que la otra parte toma una coloración verde-olivo intenso (Bové J (2006) Plant Pathol. 88: 7-37). Los frutos poseen una baja cantidad de jugo, además de poca concentración de sólidos solubles y azúcares, por lo que son muy ácidos y no pueden ser utilizados en la industria (Gottwald (2010) Annu. Rev. Phytopathol. 48: 6.1-6.21 ).

El impacto económico por la presencia del HLB en los países productores de cítricos se ha incrementado año por año, debido a las pérdidas por la disminución de los rendimientos y la calidad de los frutos. Se estima que las pérdidas son aproximadamente de un 30-100%. Hasta este momento, no existe en el mundo una región donde el HLB esté controlado adecuadamente y la enfermedad no exista, lo cual contribuye a incrementar su severidad e incidencia (Gottwald (2010) Annu. Rev. Phytopathol. 48: 6.1-6.21 ).

Recientemente, se ha evaluado el empleo de la resistencia sistémica adquirida, mediante el uso de compuestos como el ácido salicílico y el fosfito combinado con micronutrientes, para mantener árboles infectados con HLB en un estado productivo. Sin embargo, en algunos casos, no hubo una diferencia significativa entre los árboles con HLB tratados y no tratados, en relación con la disminución del HLB, la caída del fruto, el rendimiento y la calidad (Gottwald (2010) Annu. Rev. Phytopathol. 48: 6.1-6.21 ).

Por tanto, un importante problema que persiste en la agricultura es el control de las enfermedades de plantas, las cuales limitan la producción agrícola cada año en el mundo. Explicación de la invención

Esta invención contribuye a resolver el problema antes mencionado, al proporcionar un método eficaz para la estimulación de la defensa natural y la inducción de resistencia a enfermedades en las plantas, mediante la aplicación de un compuesto que activa, simultáneamente, genes relacionados con la ruta del ácido salicílico, ácido jasmónico/etileno y la respuesta de hipersensibilidad en las mismas.

La inducción de resistencia a enfermedades constituye un método de mucha importancia e interés en la actualidad, el cual permite la utilización de mecanismos bioquímicos y moleculares ya existentes en la planta, para su empleo en el control de enfermedades. La defensa de las plantas a las enfermedades comprende una serie de eventos relacionados con el reconocimiento, señalización y respuesta definidos como inmunidad innata de las plantas. Esta inmunidad innata puede ser activada por una serie de factores, los cuales contribuyen de una forma decisiva al control de las enfermedades. Dentro de los mecanismos de defensa que son activados por la planta está la síntesis de compuestos antimicrobianos como fitoalexinas, defensinas y proteínas relacionadas con la patogénesis entre otras. Estas respuestas son mediadas por la activación de genes relacionados con el ácido salicílico, ácido jasmónico/etileno y de la respuesta de hipersensibilidad.

En la presente invención se logra, por primera vez, la activación simultánea de las enzimas quitinasa, beta 1 , 3 glucanasa, glutatión peroxidasa, fenilalanina amonio Nasa, superóxido dismutasa y aleño óxido sintetasa, las cuales forman parte de las rutas de señalización del ácido salicílico, el ácido jasmónico/etileno y la respuesta de hipersensibilidad. Esta activación se correlaciona con la protección frente a bacterias, oomicetos y hongos.

Adicionalmente, se demuestra la activación simultánea de un grupo de nuevos genes, pertenecientes a las rutas del ácido salicílico, del ácido jasmónico/etileno y la respuesta de hipersensibilidad, cuya activación se correlaciona con la protección frente a bacterias, oomicetos y hongos. Dichos genes se identificaron y caracterizaron por la técnica de análisis seriado de expresión de genes (del inglés Serial Analysis Gene Expression, abreviado SuperSAGE). Resulta sorprendente, a la luz del estado de la técnica anterior a esta invención, que la activación de genes pertenecientes a las rutas del ácido salicílico, del ácido jasmónico/etileno y la respuesta de hipersensibilidad sea simultánea, en respuesta a la aplicación de un compuesto natural. En el contexto de la invención dicho compuesto puede ser una fitohormona, un ácido nucleico, un lípido o un péptido, entre otros compuestos.

En una materialización de la invención, la estimulación de la defensa natural y la inducción de resistencia a enfermedades en las plantas, mediante activación simultánea de genes relacionados con el ácido salicílico, ácido jasmónico/etileno y de la respuesta de hipersensibilidad, se produce tras la aplicación de una fitohormona a dichas plantas. En una realización particular, la fitohormona es un brasinosteroide natural o un análogo de brasinosteroide. En el contexto de esta invención se considera un compuesto análogo de brasinosteroide aquel que se sintetiza a partir de cambios en la estructura de los anillos de un brasinosteroide natural para aumentar su actividad.

El método revelado en esta invención permite el tratamiento preventivo y curativo de enfermedades de plantas producidas por bacterias, oomicetos y hongos, a través de la activación simultánea de genes relacionados con la ruta del ácido salicílico, el ácido jasmónico/etileno y la respuesta de hipersensibilidad. En una materialización de la invención la enfermedad que se trata o se previene es el "Huanglongbing" (HLB), producida por la bacteria Candidatus 'Liberibacter asiaticus' en cítricos. En otra materialización de la invención la enfermedad que se trata o se previene es la causada por Alternaría solani en el cultivo del tomate, o la causada por Phytophthora parasítica en los cultivos de tabaco.

La presente invención también revela, por primera vez, la frecuencia de aplicación de los brasinosteroides naturales (y sus análogos) efectiva para que permita el control de las enfermedades de las plantas. En una realización de la invención, la aplicación del brasinosteroide natural o un análogo, en un rango de concentración de entre 0,01 - 20 μΜ, permite la reducción drástica de los agentes causales de las enfermedades de origen bacteriano y fúngico, a través de la disminución del número de copias de la bacteria, oomiceto u hongo, a partir de los tratamientos en plantas enfermas. El método propuesto en la presente invención puede ser usado para prevenir la infección en plantas sanas mediante la aplicación periódica del brasinosteroide natural y su análogo. En una realización particular de la invención, la aplicación del brasinosteroide a la planta se produce con una frecuencia al menos mensual. En otra realización, la aplicación del brasinosteroide a las plantas enfermas se produce con una frecuencia al menos quincenal. El rango de concentraciones en que se aplica el brasinosteroide, tanto natural como análogo, varía en dependencia del cultivo a proteger o tratar, y también en dependencia de la tecnología de aplicación. Como es conocido para los versados en este campo de la técnica, las concentraciones efectivas del compuesto pueden disminuir considerablemente cuando se emplea un método de aplicación en bajo volumen (en inglés Low Volume Application) o ultra-bajo volumen (en inglés Ultra-Low Volume Application).

En una materialización de la invención, el método para la estimulación de la defensa natural y la inducción de resistencia a enfermedades en plantas comprende la aplicación del brasinosteroide o análogos en combinación con un plaguicida.

Es también objeto de la presente invención una composición para la estimulación de la defensa natural y la inducción de resistencia a enfermedades en las plantas que comprende un compuesto que activa simultáneamente genes relacionados con la ruta del ácido salicílico, del ácido jasmónico/etileno y la respuesta de hipersensibilidad, y donde dicho compuesto es una fitohormona.

En una realización preferida, dicha composición comprende un brasinosteroide natural o un análogo de brasinosteroide. En una realización particular de la invención, los brasinosteroides naturales y los análogos se obtienen por síntesis química. A los fines de la invención, los brasinosteroides se pueden formular a través de una suspensión, solución, emulsión, polvo, gránulo, emulsionable concentrado, aerosol, gránulo impregnado, adyuvante, pasta o a través de encapsulaciones.

En una materialización de la invención, en la composición preventiva o curativa de las enfermedades de las plantas, el brasinosteroide natural o el análogo de brasinosteroide se encuentra en un rango entre 0,01 - 20 μΜ, o su equivalente para aplicación en bajo volumen o ultra-bajo volumen.

Otro objeto de la presente invención es el uso de un brasinosteroide para preparar una composición para la estimulación de la defensa natural y la inducción de resistencia a enfermedades en las plantas, donde la composición se aplica de forma periódica. En una realización de la invención las enfermedades de la planta que pueden ser prevenidas o tratadas mediante este nuevo uso de los brasinoseroides son causadas por una bacteria, oomiceto o un hongo.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la prevención o el tratamiento de la enfermedad Huanglongbing (HLB) en los cítricos donde se aplica a la planta un brasinosteroide de forma periódica, al menos una vez al mes. En dicho método el brasinosteroide puede ser un compuesto natural o un análogo de brasinosteroide.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Expresión relativa de genes relacionados con las respuestas de defensa a las enfermedades, en plantas de cítricos tratadas con el análogo de brasinosteroide (25R)-3-hidroxi-C-homo-11-oxa-5-espirostan-12-ona. Se muestra la expresión relativa de los genes que codifican para: quitinasa (A), beta-1 ,3-glucanasa (B), glutatión peroxidada (C), fenilalanina amonio-liasa (D), superóxido dismutasa (E), aleño oxido sintetasa (F). Las barras en las curvas representan la desviación estándar de la media de 10 plantas, por cada tiempo evaluado. Los genes evaluados están relacionados con la resistencia de las plantas a través del ácido salicílico, del ácido jasmónico/etileno y la respuesta de hipersensibilidad.

Figura 2. Expresión relativa de nuevos genes, identificados por la técnica de SuperSAGE, activados por los tratamientos con un análogo de brasinosteroide. Las barras en las curvas representan la desviación estándar de la media de 10 hojas por planta, por cada tiempo evaluado. Los genes fueron agrupados en las siguientes categorías: genes relacionados con la respuesta defensiva de las plantas contra patógenos en general (A); genes relacionados con la respuesta defensiva de las plantas contra bacterias (B); factores transcripcionales relacionados con la defensa de las plantas a las enfermedades (C); señalizadores de respuesta defensiva (D) y genes relacionados con la síntesis de fitoalexinas (E).

Figura 3. Efecto de un análogo de brasinosteroide sobre la reducción del HLB en plantas de cítricos en fomento (A) y adultas (B), medido como copias de la bacteria causante del HLB por reacción, determinado mediante reacción en cadena de la polimerasa (del inglés Polymerase Chain Reaction, abreviado PCR). Las barras en las curvas representan la desviación estándar de la media de 10 hojas por cada tiempo evaluado.

Figura 4. Microscopía electrónica de hojas de plantas con HLB, tratadas (A) y no tratadas (B) con un análogo de brasinosteroide. Se realizaron 20 microfotografías electrónicas por cada muestra analizada a diferentes magnificaciones. Se estudiaron un total de 10 rejillas por muestras. Cada rejilla de cobre tiene 400 huecos para su visualización. Figura 5. Evaluación del efecto de un brasinosteroide natural y un análogo sobre la reducción del HLB en plantas de cítrico, medido como copias de la bacteria causante del HLB por reacción de PCR.

Figura 6. Efecto de la frecuencia de aplicación del análogo de brasinosteroide (25R)-3-hidroxi-C-homo-1 1-oxa-5-espirostan-12-ona en la reducción del HLB, medido como copias de la bacteria causante del HLB por reacción de PCR. Las barras en las curvas representan la desviación estándar de la media de 10 hojas por planta, por cada tiempo evaluado.

Figura 7. Efecto protector del análogo de brasinosteroide (25R)-3-hidroxi-C-homo- 11-oxa-5-espirostan-12-ona sobre el HLB de los cítricos, medido como copias de la bacteria causante del HLB por reacción de PCR. Las aplicaciones del producto se realizaron una vez al mes. Las barras en las curvas representan la desviación estándar de la media de 10 hojas por planta, por cada tiempo evaluado.

Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización

Ejemplo 1. Activación simultánea de genes relacionados con la resistencia natural de las plantas a las enfermedades, después del tratamiento con un análogo de brasinosteroide.

El ácido ribonucleico (ARN) total se extrajo a partir de hojas de 5 plantas de cítrico (Citrus sinensis) tratadas con el análogo de brasinosteroide (25R)-3-hidroxi-C-homo- 1 1-oxa-5-espirostan-12-ona (Iglesias et al. (1998) Synthetic Communications 28: 75- 81). Las hojas fueron recolectadas a las 0, 1 , 5, 10, 24 y 48 horas después de la aplicación de dicho compuesto, a 20 μΜ, por aspersión. Para ello se empleó el kit Rneasy (Qiagen, Valencia, CA), según las instrucciones del fabricante. Los ácidos dexosirribonucleicos complementarios (ADNc) se sintetizaron mediante el empleo del cebador oligo-dT y el kit de transcripción reversa SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA), según las instrucciones del fabricante. El PCR cuantitativo en tiempo real, se realizó utilizando un equipo Gene 3000 PCR (Corbett, Australia) y el kit QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen). Todas las secuencias de oligonucleótidos para genes relacionados con la defensa a enfermedades en plantas de cítricos empleados en este estudio se muestran en la Tabla 1. Las condiciones de la reacción de PCR en tiempo real fueron las siguientes: un paso inicial de desnaturalización a 95 °C por 15 min., seguido por una desnaturalización a 95°C por 15 segundos, un paso de alineamiento por 30 segundos a 60 °C y un paso de extensión por 30 segundos a 72 °C, durante 40 ciclos. El análisis se realizó mediante el programa Rotor-Gene 3000 (Corbett, Australia), y se emplearon cinco réplicas para cada muestra. Los experimentos se repitieron dos veces.

Tabla 1. Lista de oligonucleótidos utilizados en este estudio.

Genes de Citrus sinensis analizados Oligonucleótidos

quitinasa 5'-TCTTCGACGGCATAAAGAATCA-3'

5'-CCAAATTGAGGATAAGCCTTGG-3' beta-1 ,3-glucanasa 5'-TCGTTGGTGACCGTCAAATATC-3'

5'-TTTCTCCAACGCAGCGTAAGTA-3' fenilalanina amonio-liasa 5'-AACGGGTTGCCTTCAAATCTTA-3'

5'-ACATGATTGGTGACAGGATTGG-3' superóxido dismutasa 5'-CAGTTGCAGTTCTTGGTGGAAC-3'

5'-AGACCAGAGAGGCTTCCTGAAA-3' aleño óxido sintetasa 5'-CCACACTTGGCTCGGATGC-3'

5'-CGTGCGGAGCAATGGTTC-3'

glutation peroxidasa 5'-GAATGTTGTTGAGCGTTATGCC-3'

5'-AGCTGATCATGCAAGTTGTAGCA-3'

En la Figura 1 se puede apreciar como todos los genes analizados fueron activados después del tratamiento de las plantas de cítrico con el análogo de brasinosteroide. El gen aleño óxido sintetasa tuvo el mayor nivel de expresión a las 24 horas, mientras que el resto de los genes tuvieron su mayor expresión a las 5 horas de aplicado el análogo. Este grupo de genes tienen un importante papel en la defensa de las plantas frente a patógenos.

Ejemplo 2. Identificación de nuevos genes relacionados con la respuesta de defensa natural en plantas tratadas con un análogo de brasinosteroide.

El ARN total se extrajo a partir de hojas de 5 plantas de cítrico (Citrus sinensis) tratadas con el análogo de brasinosteroide (25R)-3-hidroxi-C-homo-1 1-oxa-5- espirostan-12-ona. Las hojas fueron recolectadas a las 1 , 5, 10, 24 y 48 horas después de la aplicación del compuesto, por aspersión, a una concentración de 20 μΜ. Para ello se empleó el kit Rneasy (Qiagen, Valencia, CA), según las instrucciones del fabricante. Los ADNc se sintetizaron mediante el empleo del cebador oligo-dT con biotina y el kit de transcripción reversa SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA), según las instrucciones del fabricante. Como control, se utilizaron muestras de 5 plantas de cítrico tratadas con agua y recolectadas durante los tiempos mencionados anteriormente. La identificación y caracterización de nuevos genes se realizó mediante la construcción de dos librerías de ADNc, por la técnica de SuperSAGE (M atsumura et al. (2003) PNAS 100: 15718-15723). La librería control fue la mezcla de hojas de plantas tratadas con agua en los diferentes tiempos y la muestra blanco fue la mezcla de las hojas de plantas de cítrico tratadas con el análogo en los diferentes tiempos. Se aislaron, secuenciaron y analizaron los nuevos genes activados por la aplicación del análogo de brasinosteroide que han sido relacionados con la respuesta de la planta hacia el HLB. En la Figura 2 se pueden apreciar los nuevos genes activados por el análogo, los que están relacionados con el mecanismo natural de defensa de las plantas frente a las enfermedades. Al analizar el patrón de genes activados por este análogo de brasinosteroide se encontró que activa simultáneamente genes relacionados con la respuesta de hipersensibilidad, la ruta del ácido salicílico y del ácido jasmónico/etileno. Este patrón de activación simultánea no había sido descrito hasta la presente invención.

Ejemplo 3. Evaluación del efecto de la aplicación de un análogo de brasinosteroide sobre el control del HLB de los cítricos en plantas en fomento y adultas.

a) Evaluación del efecto en plantas de cítrico en fomento.

El experimento fue desarrollado en condiciones de casas verdes. Las plantas (Citrus sinensis) con síntomas del HLB fueron colocadas en bolsas plásticas negras con un régimen de riego adecuado. Los niveles de la bacteria Candidatus 'Liberibacter asiaticus', en las plantas con síntomas de HLB, fueron determinados por PCR en tiempo real, a través de la cuantificación absoluta de la bacteria (copias de la bacteria por reacción) en las hojas, según la curva patrón, y amplificando el ácido desoxirribonucleico (ADN) ribosomal 16S de la bacteria. La cuantificación de la bacteria se realizó cada mes, durante 6 meses. La última evaluación se desarrolló tomando todas las hojas de la planta y realizando una mezcla antes del aislamiento del ADN. La concentración del análogo de brasinosteroide (25R)-3-hidroxi-C-homo- 1 1-oxa-5-espirostan-12-ona fue de 20 μΜ, y se aplicó mediante aspersión, cada 15 días. El ADN fue extraído de las hojas, según el protocolo de aislamiento de ADN de Promega. El PCR cuantitativo en tiempo real, se realizó utilizando un equipo Gene 3000 PCR (Corbett, Australia) y el kit QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen). Los oligonucleótidos utilizados en la cuantificación de la bacteria fueron los siguientes: CTAATCCCCAAAAGCCATCTC y CTTCAGGCAAAACCAACTCC. L as condiciones de la reacción de PCR en tiempo real fueron las siguientes: un paso inicial de desnaturalización a 95 °C por 15 min., seguido por una desnaturalización a 95°C por 15 segundos, un paso de alineamiento por 30 segundos a 60 °C, y un paso de extensión por 30 segundos a 72 °C, durante 40 ciclos. El análisis se realizó mediante el programa Rotor-Gene 3000 (Corbett, Australia), y se emplearon cinco réplicas para cada muestra. Los experimentos se repitieron dos veces. Como controles, se utilizaron plantas de cítrico enfermas, a las cuales no se les aplicó el brasinosteroide. Como se puede observar en la Figura 3A, se produjo una reducción significativa de los niveles de la bacteria a partir del segundo mes, alcanzando niveles no detectables a partir del mes 4, lo que se mantuvo hasta la última evaluación, que se realizó al final del experimento. Es importante destacar que este comportamiento se observó en todas las plantas que fueron tratadas con este análogo de brasinosteroide.

b) Evaluación del efecto en plantas de cítrico adultas.

El experimento fue desarrollado en condiciones naturales. Los niveles de la bacteria Candidatus 'Liberibacter asiaticus' en 30 plantas con síntomas de HLB fueron determinados por PCR en tiempo real, a través de la cuantificación absoluta de la bacteria (copias de la bacteria por reacción) en las hojas, según la curva patrón y amplificando el ADN ribosomal 16S de la bacteria. La cuantificación de la bacteria se realizó cada mes, durante un año. La última evaluación se desarrolló tomando todas las hojas de la planta y realizando una mezcla antes del aislamiento del ADN. La concentración del análogo de brasinosteroide (25R)-3-hidroxi-C-homo-1 1 -oxa-5- espirostan-12-ona fue de 20 μΜ, y se aplicó mediante aspersión, cada 15 días. El ADN fue extraído de las hojas según el protocolo de aislamiento de DNA de Promega. El PCR cuantitativo en tiempo real, se realizó como se describe en el Ejemplo 3a. Como controles se utilizaron plantas de cítrico enfermas, a las cuales no se les aplicó e I brasinosteroide. Como se puede observar la Figura 3B, se produjo una reducción significativa de los niveles de la bacteria a partir del mes 3, alcanzando niveles no detectables a partir del mes 8, comportamiento que se mantuvo hasta la última evaluación, que se realizó al final del experimento. Todas las plantas que fueron tratadas con este análogo de brasinosteroide redujeron los niveles de la bacteria. c) Microscopía electrónica de plantas de cítrico tratadas.

El objetivo de este experimento fue el diagnóstico de la bacteria Candidatus 'Liberibacter asiaticus', a través de un estudio ultraestructural por microscopía electrónica de transmisión, en plantas de cítrico (Citrus sinensis) con HLB tratadas con el mismo análogo de brasinosteroide. Se tomaron muestras de hojas de cítrico con presencia de HLB (Candidatus 'Liberibacter asiaticus'), tratadas durante un año. Como control, se tomaron muestras de hojas de cítrico con la presencia de HLB (Candidatus 'Liberibacter asiaticus') sin aplicación del producto. Las diferentes muestras se fijaron en glutaraldehído al 5%, durante una noche, al vacío a 4°C, y se post-fijaron al 1 % en tetróxido dé osmio, por 12 horas a 4°C. Posteriormente, se lavaron en buffer cacodilato pH 7,4 y se deshidrataron en concentraciones crecientes de acetona (20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100%), durante 15 minutos cada vez, a 4°C y durante 1 hora al 100%, a temperatura ambiente. La inclusión fue realizada con baja viscosidad. Las secciones ultrafinas fueron realizadas con un ultramicrótomo (NOVA, LKB), con un grosor de 40-50 nm, se colocaron sobre rejillas de cobre de 400 orificios. Después de realizados los cortes ultrafinos y colocados los mismos en las rejillas, se contrastaron con acetato de uranilo saturado y citrato de plomo, y se examinaron con un microscopio JEOL JEM 2000 EX (JEOL). Se realizaron 20 microfotografías electrónicas por cada muestra analizada, a diferentes magnificaciones. Se estudiaron un total de 10 rejillas por muestra. Cada rejilla de cobre tiene 400 huecos para su visualización. En las muestras de hojas de cítricos tratados no se observa la presencia de la bacteria (Figura 4A). Mientras, se observan en las hojas de cítricos no tratados (control) la presencia de la bacteria Candidatus 'Liberibacter asiaticus' longitudinal y transversal a nivel ultraestructural (Figura 4B).

Ejemplo 4. Evaluación de diferentes concentraciones del análogo de brasinosteroide (25R)-3-hidroxi-C-homo-11-oxa-5-espirostan-12-ona en el control del HLB de los cítricos.

El objetivo de este experimento fue evaluar la concentración mínima necesaria del análogo de brasinosteroide (25R)-3-hidroxi-C-homo-1 1 -oxa-5-espirostan-12-ona para el control del HLB de los cítricos. Se utilizaron 5 plantas de cítrico (Citrus sinensis) en fomento, con HLB, por cada concentración del análogo. Las concentraciones del análogo de brasinosteroide evaluadas fueron 0.001 , 0.01 , 0.1 , 1 , 5, 10, 20, 40, 60 μΜ, y se aplicaron mediante aspersión, cada 15 días, por 6 meses. La evaluación fue realizada a los 6 meses del tratamiento. Los niveles de la bacteria Candidatus 'Liberibacter asiaticus' fueron determinados como se describe en el Ejemplo 3a. Como se observa en la Tabla 2, a partir de la concentración de 0.01 y hasta 60 μΜ del análogo de brasinosteroide los niveles de la bacteria fueron reducidos drásticamente.

Tabla 2. Efecto del análogo de brasinosteroide (25R)-3-hidroxi-C-homo-1 1-oxa-5- espirostan-12-ona, aplicado en diferentes concentraciones, sobre la bacteria.

Concentraciones del análogo Concentración absoluta de la bacteria de brasinosteroide (μΜ) después de 6 meses de tratamiento

(Copias de la bacteria por reacción)

0 2788

0.001 522

0.01 29

1 1

5 0

10 0

20 0

40 0

60 0

Ejemplo 5. Evaluación del efecto de la aplicación de un brasinosteroide natural y un análogo de brasinosteroide en el control del HLB de los cítricos.

Con el objetivo de evaluar el efecto del brasinosteroide natural brasinolida (Khripach et al. (2000) Ann. Botany 86: 441-447) y del análogo de brasinosteroide (25R)-3- hidroxi-C-homo-1 1-oxa-5-espirostan-12-ona en el control del HLB, en un mismo experimento, se utilizaron 10 plantas de cítrico con HLB por cada tratamiento. Ambos compuestos fueron aplicados por aspersión, a una concentración de 1 μΜ, cada 15 días, durante 6 meses. Los niveles de la bacteria Candidatus 'Liberibacter asiaticus' fueron determinados según el Ejemplo 3a. La Figura 5 muestra como tanto el compuesto natural como el análogo tuvieron un efecto positivo, al lograr una reducción significativa de los niveles de la bacteria durante todo el período de evaluación.

Ejemplo 6. Evaluación del efecto de la frecuencia de aplicación de un análogo de brasinosteroide sobre el control del HLB de los cítricos.

El objetivo de este experimento fue determinar la influencia de la frecuencia de aplicación, por aspersión, del análogo de brasinosteroide (25R)-3-hidroxi-C-homo- 1 1-oxa-5-espirostan-12-ona en el control del HLB en plantas de cítrico enfermas. Fueron utilizadas 5 plantas por tratamiento, y las frecuencias de aplicación fueron 1 , 2 y 4 veces por mes. La concentración del análogo utilizada fue de 1 μΜ y las determinaciones del nivel de la bacteria se realizaron todos los meses hasta el sexto mes. Los niveles de la bacteria Candidatus 'Liberibacter asiaticus' fueron determinados como se describe en el Ejemplo 3a. Como se aprecia en la Figura 6, todas las variantes analizadas redujeron la bacteria. La aplicación del compuesto con frecuencia quincenal y semanal redujo significativamente los niveles de la bacteria, de forma más temprana, en comparación con una sola aplicación al mes. Ejemplo 7. Evaluación del efecto preventivo de un análogo de brasinosteroide sobre el HLB de los cítricos.

Este experimento fue desarrollado para determinar el efecto preventivo de la aplicación del análogo (25R)-3-hidroxi-C-homo-1 1 -oxa-5-espirostan-12-ona, dos veces al mes, a una concentración de 1 μΜ, sobre plantas de cítrico sin HLB, en un área con plantas de cítrico con HLB y altos niveles de poblaciones del insecto vector (psila asiática de los cítricos - Diaphorina citrí). Se emplearon 10 hojas de plantas de cítricos sin HLB, a las cuales se les aplicó por aspersión el análogo, y 10 hojas de plantas de cítrico sin HLB, a las cuales no se le aplicó el producto. Los niveles de la bacteria Candidatus 'Liberibacter asiaticus' fueron determinados como se describe en el Ejemplo 3a. Como se puede apreciar en la Figura 7, la aplicación del análogo en plantas de cítrico sin HLB permitió la protección de las mismas contra la infección por la bacteria a través del vector, mientras que las plantas a las cuales no se les aplicó el análogo, a medida que pasaron los meses, fueron incrementando los niveles de la bacteria y los síntomas del HLB. Este fue otro resultado sorprendente e inesperado, y que permite el empleo de este método para la protección de los cítricos contra esta importante enfermedad. Ejemplo 8. Evaluación del efecto de la aplicación de un brasinosteroide natural y un análogo sobre el control de otras enfermedades de plantas.

Con el objetivo de evaluar el efecto del brasinosteroide natural brasinolida y del análogo de brasinosteroide (25R)-3-hidroxi-C-homo-1 1-oxa-5-espirostan-12-ona, sobre el control de otras enfermedades de plantas, se realizaron experimentos con plantas de tabaco y tomate inoculadas con Phytophthora parasítica y Alternaría solani, respectivamente. Tanto el brasinosteroide natural como el análogo fueron aplicados por aspersión, a una concentración de 1 μΜ, cada 15 días durante 3 meses. El porcentaje de mortalidad fue determinado a los 3 meses. La Tabla 3 muestra como ambos brasinosteroides tuvieron un efecto marcado en la reducción de la incidencia de las enfermedades producidas por estos patógenos. Se utilizaron 100 plantas por cada uno de los tratamientos. Como grupo control se tomaron plantas que no se trataron con ningún compuesto.

Tabla 3. Efecto de la aplicación de un brasinosteroide natural y un análogo en el control de enfermedades producidas por oomicetos y hongos.

Los valores en la tabla representan el porcentaje de mortalidad de las plantas, debido a las enfermedades producidas por estos patógenos.