DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention concerne un procédé d'induction et de production de peridia de truffe ainsi que l'utilisation desdits peridia.

ARRIERE -PLAN TECHNOLOGIQUE

La truffe est particulièrement réputée pour ses qualités organoleptiques. La truffe est une fructification d'un champignon ectomycorhizien dont le mycéllium est en symbiose avec les racines d'arbres et arbustes. Les truffes appartiennent à la division des Ascomycota. Elles dériveraient des pezizes par fermeture progressive de la coupe originelle (apothécie) et complication de l'hyménium. Les truffes font parties intégrante de la famille des Tuberaceae et du genre Tuber. Une grande partie de son cycle n'est pas connue, en particulier sa reproduction sexuée. La production truffière dépend d'un délicat équilibre entre d'une part les conditions physiso-chimiques du sol, la présence de bactéries accompagnatrices de la mycorhysation, la compétition avec d'autres champignons édaphiques et le développement radiculaire de certains végétaux ligneux d'autre part. Ce que nous appelons la truffe est en réalité le fruit du champignon (ascocarpe). La truffe est un champignon hypogé qui fructifie dans le sol. D'avril à juin, il naît sous la forme d'une coupe dont les bords vont peu à peu se rejoindre et former le peridium. Avec les chaleurs et les pluies de fin d'été, la fructification se développe avant d'atteindre sa pleine maturité en septembre.

Parmi les 60 espèces existantes, seulement quelques-unes sont prisées pour leurs arômes et leurs goûts, parmi elles le Tuber melanosporum (truffe noire du Périgord), Tuber magnatum (truffe blanche d'Alba), Tuber aestivum (truffe Mayenque ou truffe blanche d'été), Tuber brumale (truffe musquée), Tuber uncinatum (truffe de Bourgogne ou truffe de Champagne), Tuber mesentericum (truffe de Lorraine), Tuber indicum (communément appelée truffe de chine), Tuber macrosporum, Tuber oligospermum et Tuber asa.

La production mondiale ne cesse de baisser : environ 1000 tonnes par an au début du siècle mais uniquement 80 à 150 tonnes par an de nos jours. Depuis plus de 50 ans, l'homme plante des arbres dont les racines sont infectées par la truffe. Moins de 5% des arbres produisent des truffes, et ceci généralement après 5-10 ans, car on comprend encore très peu la biologie du champignon. A ce jour, ni les avancées scientifiques, avec la mise au point d'une mycorhization efficace des plants, ni les techniques de trufficulture moderne et tous les efforts remarquables engagés par les trufficulteurs, n'ont pu véritablement redresser la chute d'une production fortement déficitaire.

Par conséquent, il apparaît nécessaire de disposer d'un nouveau procédé permettant de produire en condition contrôlées, du peridia de truffe en continu.

DESCRIPTION DETAILLEE

La Demanderesse de la présente invention propose donc un nouveau procédé d'induction et de production de peridia de truffe, capable de produire en continu des peridia de truffe. Ce nouveau procédé permet de pallier les aléas de production de la truffe dus notamment aux conditions climatiques et/ou aux conditions de sol. Un objet de l'invention est donc un procédé d'induction et de production de peridia de truffe comprenant les étapes suivantes :

a. une étape de préparation d'un extrait par extraction par un solvant à partir d'un broyât de plant truffier,

b. optionnellement, une étape de lavage à l'acétate d'éthyle,

c. une étape de solubilisation de l'extrait obtenu à l'étape a) ou à l'étape b) d. une étape de mise en culture de mycélium de truffe en présence de l'extrait soluble obtenu à l'étape c),

e. une étape d'induction de la formation des peridia,

f. une étape de multiplication des peridia sur un milieu nutritif, et

g. la récolte des peridia formés.

Au sens de la présente invention, on entend par « peridium » ou « peridia », l'enveloppe externe de la truffe, dépourvue de la gleba.

Au sens de la présente invention, on entend par « plant truffier », un arbre ou un arbuste susceptible de former une association ectomycorhizienne avec un champignon du genre Tuber. Dans un mode de réalisation selon l'invention, le procédé d'induction et de production de peridia de truffe peut être mis en œuvre in vitro, c'est-à-dire mis en œuvre en conditions aseptiques et contrôlées ou peut être mis en œuvre dans un bioréacteur ou un fermenteur. Dans un mode de réalisation selon l'invention, l'extrait de l'étape a) est obtenu en mélangeant la poudre de plant truffier à un solvant, ledit solvant pouvant être un solvant organique, un solvant aqueux ou un mélange de solvant, avantageusement un mélange cétone/eau ou un mélange éthanol/eau. Avantageusement, le solvant peut être un mélange acétone/eau, un mélange méthanol/eau, un mélange éthanol/eau ou de l'eau. Avantageusement, le solvant utilisé est un mélange acétone/eau. De manière encore plus avantageuse, le solvant utilisé est un mélange éthanol/eau. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le solvant est un mélange acétone/eau 95/5 (v/v), avantageusement 90/10 (v/v), avantageusement 80/20 (v/v), avantageusement 70/30 (v/v). Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le solvant est un mélange éthanol/eau 95/5 (v/v), avantageusement 90/10 (v/v), avantageusement 80/20 (v/v), avantageusement 70/30 (v/v).

Dans un mode de réalisation avantageux, l'étape d'extraction est réalisée à une température allant de 20°C à 80°C, avantageusement à une température comprise entre 30°C et 75°C, avantageusement entre 40°C et 70°C, avantageusement entre 50°C et 70°C. Dans un mode de réalisation encore plus avantageux, l'étape d'extraction est réalisée à une température de 60°C. Dans un mode de réalisation avantageux, l'étape d'extraction est réalisée sous agitation. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le rendement d'extraction de l'étape a) est supérieur à 5%, avantageusement supérieur à 6%, avantageusement supérieur à 7%. Dans un mode de réalisation encore plus avantageux, lorsque l'extraction est réalisée à l'aide d'un mélange acétone/eau 70/30, le rendement de l'étape a) est supérieur à 7%, de préférence supérieur à 7,1 %.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé selon l'invention peut comprendre de manière optionnelle, une étape de lavage à l'acétate d'éthyle entre l'étape a) d'extraction de l'extrait à partir du broyât de plant truffier et l'étape c) de solubilisation de l'extrait. Dans un mode de réalisation particulier, le lavage à l'acétate d'éthyle est réalisé avec de l'acétate d'éthyle pur.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé selon l'invention comprend une étape d'évaporation du solvant préalablement à l'étape b) de lavage à l'acétate d'éthyle. Avantageusement, l'étape d'évaporation du solvant peut être réalisée notamment en utilisant un évaporateur rotatif. Avantageusement, le solvant est éliminé par évaporation sous pression réduite à 50° C. L'extrait ainsi obtenu à l'étape a) est un extrait sec.

Dans un mode de réalisation selon l'invention, l'extrait ainsi obtenu à l'étape a) ou à l'étape b) comprend entre 15 et 25% de phénols totaux, dont 4 à 10% de tannins, le pourcentage étant exprimé en gramme pour 100 g de pyrogallol.

Dans un mode de réalisation selon l'invention, la truffe est choisie parmi le groupe : Tuber melanosporum (communément appelée truffe noire du Périgord), Tuber magnatum (communément appelée truffe blanche d'Alba), Tuber brumale (communément appelée truffe musquée), Tuber aestivum (communément appelée truffe Mayenque ou truffe blanche d'été), Tuber uncinatum (communément appelée truffe de Bourgogne ou truffe de Champagne), Tuber mesentericum (communément appelée truffe de Lorraine), Tuber indicum (communément appelée truffe de chine), Tuber macrosporum, Tuber oligospermum et Tuber asa. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux selon l'invention, la truffe est Tuber melanosporum.

Dans un mode de réalisation selon l'invention, l'extrait est obtenu à partir d'un broyât de plant truffier. Avantageusement, le broyât de plant truffier est obtenu en réduisant en poudre les racines ou l'écorce dudit plant truffier. Dans un mode de réalisation selon l'invention, le plant truffier appartient à la famille des Fagaceae. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le plant truffier appartient au genre Castanea, Fagus ou Quercus. De manière encore plus avantageuse, le plant truffier appartient au genre Quercus pubescens.

Dans un mode de réalisation selon l'invention, l'étape c) de solubilisation est mise en œuvre dans un mélange eau ou eau/solvant organique. Au sens de la présente invention, on entend par « extrait soluble », l'extrait tel que défini précédemment mis en solution dans de l'eau ou un mélange eau/solvant organique. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le solvant organique utilisé est le diméthylsulfoxyde (DMSO, C2H6OS). Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le solvant polaire est un mélange eau/DMSO 30/70 (v/v), avantageusement 40/60 (v/v), avantageusement 50/50 (v/v). Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'extrait soluble a la même composition que l'extrait obtenu à l'étape a) ou à l'étape b). Dans un mode de réalisation selon l'invention, l'étape d) est réalisée par mise en culture de mycélium truffier avec l'extrait soluble obtenu à l'étape c) sur un milieu nutritif. Le milieu nutritif utilisé lors de l'étape d) peut être choisi parmi le groupe comprenant :

un milieu nutritif constitué de malt distasique et d'agar,

- un milieu nutritif constitué d'extrait de malt, d'extrait de levures, de glucose et d'agar, un milieu nutritif constitué d'extrait de malt, d'extrait de levures et d'agar, un milieu nutritif constitué d'extrait de malt, d'extrait de levures, de chlorure de sodium et d'agar,

un milieu nutritif de Czapek, ledit milieu de Czapek étant constitué de nitrate de sodium, chlorure de potassium, glycérophosphate de magnésium, sulfate ferreux, sulfate de potassium, saccharose et agar,

un milieu nutritif de Czapek complété avec des extraits de levures,

un milieu nutritif constitué de sels minéraux, d'extrait de levures, de glycérol et d'agar, la liste n'étant pas limitative.

Avantageusement, le milieu nutritif utilisé lors de l'étape d) est constitué de malt distasique et d'agar.

Avantageusement, le milieu nutritif est constitué de malt distasique à une concentration comprise entre 0,5 et 3% (m/v) et d'agar à une concentration comprise entre 0,5 et 3,5% (m/v). Avantageusement, le milieu nutritif est constitué de malt distasique à une concentration comprise entre 0,5 et 2,5% (m/v) et d'agar à une concentration comprise entre 0,5 et 3% (m/v). Avantageusement, le milieu nutritif est constitué de malt distasique à une concentration comprise entre 0,5 et 2 % (m/v) et d'agar à une concentration comprise entre 0,5 et 2,5% (m/v). De manière plus avantageuse, le milieu nutritif est constitué de malt distasique à une concentration comprise entre 0,5 et 1 ,5% (m/v) et d'agar à une concentration comprise entre 0,5 et 2% (m/v). De manière encore plus avantageuse, le milieu nutritif est constitué de malt distasique à 1 % (m/v) et d'agar à 1 ,5% (m/v).

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait soluble est déposé dans un puit préalablement creusé dans le milieu nutritif à mi-distance entre le centre et le bord de la boite de pétri contenant le milieu nutritif. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'extrait soluble est présent en une quantité comprise entre 1 et 15 mg par boite de pétri, avantageusement en une quantité comprise entre 1 et 10 mg par boite de pétri, avantageusement en une quantité comprise entre 2 et 9 mg par boite de pétri. De manière plus avantageuse, l'extrait soluble est présent en une quantité comprise entre 2 et 8 mg par boite de pétri. De manière encore plus avantageuse, l'extrait soluble est présent en une quantité de 8 mg par boite de pétri. Dans un mode de réalisation selon l'invention, l'étape e) d'induction de la formation des peridia est réalisée par mise à l'étuve des boites de pétri contenant un milieu nutritif et contenant le mycélium truffier et l'extrait soluble, à une température comprise entre 15°C et 35°C, avantageusement entre 20°C et 30°C, avantageusement à 25°C.

Le milieu nutritif utilisé lors de l'étape e) peut être choisi parmi le groupe comprenant : un milieu nutritif constitué de malt distasique et d'agar,

un milieu nutritif constitué d'extrait de malt, d'extrait de levures, de glucose et d'agar, un milieu nutritif constitué d'extrait de malt, d'extrait de levures et d'agar, un milieu nutritif constitué d'extrait de malt, d'extrait de levures, de chlorure de sodium et d'agar,

un milieu nutritif de Czapek, ledit milieu de Czapek étant constitué de nitrate de sodium, chlorure de potassium, glycérophosphate de magnésium, sulfate ferreux, sulfate de potassium, saccharose et agar,

un milieu nutritif de Czapek complété avec des extraits de levures,

- un milieu nutritif constitué de sels minéraux, d'extrait de levures, de glycérol et d'agar, la liste n'étant pas limitative.

Avantageusement, le milieu nutritif utilisé lors de l'étape e) est constitué de malt distasique et d'agar.

Avantageusement, le milieu nutritif est constitué de malt distasique à une concentration comprise entre 0,5 et 3% (m/v) et d'agar à une concentration comprise entre 0,5 et 3,5% (m/v). Avantageusement, le milieu nutritif est constitué de malt distasique à une concentration comprise entre 0,5 et 2,5% (m/v) et d'agar à une concentration comprise entre 0,5 et 3% (m/v). Avantageusement, le milieu nutritif est constitué de malt distasique à une concentration comprise entre 0,5 et 2 % (m/v) et d'agar à une concentration comprise entre 0,5 et 2,5% (m/v). De manière plus avantageuse, le milieu nutritif est constitué de malt distasique à une concentration comprise entre 0,5 et 1 ,5% (m/v) et d'agar à une concentration comprise entre 0,5 et 2% (m/v). De manière encore plus avantageuse, le milieu nutritif est constitué de malt distasique à 1 % (m/v) et d'agar à 1 ,5% (m/v).

Dès l'apparition des fructifications, celles-ci sont repiquées dans de nouvelles boites de pétri, afin de permettre leur multiplication.

Dans un mode de réalisation selon l'invention, la multiplication des peridia de l'étape f) est réalisée sur milieu nutritif.

Le milieu nutritif utilisé lors de l'étape f) peut être choisi parmi le groupe comprenant : un milieu nutritif constitué de malt distasique et d'agar, un milieu nutritif constitué d'extrait de malt, d'extrait de levures, de glucose et d'agar, un milieu nutritif constitué d'extrait de malt, d'extrait de levures et d'agar, un milieu nutritif constitué d'extrait de malt, d'extrait de levures, de chlorure de sodium et d'agar,

- un milieu nutritif de Czapek, ledit milieu de Czapek étant constitué de nitrate de sodium, chlorure de potassium, glycérophosphate de magnésium, sulfate ferreux, sulfate de potassium, saccharose et agar,

un milieu nutritif de Czapek complété avec des extraits de levures,

un milieu nutritif constitué de sels minéraux, d'extrait de levures, de glycérol et d'agar, la liste n'étant pas limitative.

Avantageusement, le milieu nutritif utilisé lors de l'étape f) est constitué de malt distasique et d'agar. Avantageusement, le milieu nutritif est constitué de malt distasique à une concentration comprise entre 0,5 et 3% (m/v) et d'agar à une concentration comprise entre 0,5 et 3,5% (m/v). Avantageusement, le milieu nutritif est constitué de malt distasique à une concentration comprise entre 0,5 et 2,5% (m/v) et d'agar à une concentration comprise entre 0,5 et 3% (m/v). Avantageusement, le milieu nutritif est constitué de malt distasique à une concentration comprise entre 0,5 et 2 % (m/v) et d'agar à une concentration comprise entre 0,5 et 2,5% (m/v). De manière plus avantageuse, le milieu nutritif est constitué de malt distasique à une concentration comprise entre 0,5 et 1 ,5% (m/v) et d'agar à une concentration comprise entre 0,5 et 2% (m/v). De manière encore plus avantageuse, le milieu nutritif est constitué de malt distasique à 1 % (m/v) et d'agar à 1 ,5% (m/v).

Dans un mode de réalisation selon l'invention, le procédé comprend en outre une étape d'aromatisation. L'étape d'aromatisation selon l'invention comprend l'utilisation d'au moins un précurseur d'arôme pour induire la production de composés volatils de l'arôme naturel des corps fructifères de truffes à partir de peridia en culture. Avantageusement, ledit précurseur d'arôme est sélectionné parmi les acides aminés naturels ou synthétiques de la L-méthionine, la leucine, l'isoleucine, la valine, la phénylalanine et/ou leurs mélanges, leurs précurseurs et/ou leurs produits de dégradations. Avantageusement, ledit précurseur d'arôme est additionné au milieu de culture dudit peridium truffier en large excès, avantageusement à une concentration supérieure ou égale à 10 mM. Avantageusement, ledit précurseur d'arôme additionné au milieu de culture dudit peridium truffier est présent à une concentration comprise entre 10 et 1000 mM, avantageusement entre 10 et 500 mM, et plus avantageusement de 50 à 500 mM ou aux concentrations spécifiques pour chaque acide aminé. En particulier, dans le cas où de la L-méthionine ou de la valine sont additionnées au milieu de culture desdits peridia truffier, la concentration utilisée est préférablement supérieure ou égale à 50 mM. Dans le cas où de la leucine ou de l'isoleucine sont additionnées au milieu de culture desdits peridia truffier, la concentration utilisée est préférablement supérieure ou égale à 100 mM. Dans le cas où de la phénylalanine ou l'acide 2-oxo-4-méthylthiobutyrique, produit de dégradation de la L-méthionine, sont additionnés au milieu de culture desdits peridia truffier, la concentration utilisée est préférablement supérieure ou égale à 10 mM.

De manière encore plus avantageuse, les acides aminés sont sélectionnés parmi la L- méthionine, l'isoleucine leurs précurseurs, leurs produits de dégradations et/ou leurs mélanges. L'aromatisation des peridia peut également être réalisée selon la méthode décrite dans la demande de brevet EP 2 448 430.

De manière avantageuse, l'étape d'aromatisation selon l'invention peut être réalisée soit en enrichissant directement le milieu de nutritif utilisé lors de l'étape d) de mise en culture de mycélium de truffe avec l'extrait soluble avec au moins un précurseur d'arôme, soit en enrichissant directement le milieu de nutritif utilisé lors de l'étape e) d'induction de la formation de péridia avec au moins un précurseur d'arôme, soit en enrichissant directement le milieu de nutritif utilisé lors de l'étape f) de multiplication des péridia avec l'extrait soluble avec au moins un précurseur d'arôme, soit en aromatisant directement les péridia obtenu à l'étape g). Avantageusement, l'étape d'aromatisation est réalisée après l'étape g) de récolte des peridia formés.

Dans un mode de réalisation selon l'invention, le procédé de production et d'induction de peridia de truffe selon l'invention comprenant les étapes suivantes :

a. une étape de préparation d'un extrait par extraction utilisant un mélange acétone/eau à partir d'une poudre de racines de Quercus pubescens,

b. une étape de lavage à l'acétate d'éthyle,

c. une étape de solubilisation de l'extrait obtenu à l'étape b) dans un mélange eau/DMSO,

d. une étape de mise en culture de mycélium de truffe avec 2 à 8 mg d'extrait soluble obtenu à l'étape c) dans une boite de pétri contenant un milieu nutritif constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5%, ledit milieu nutritif étant préalablement aromatisé, e. une étape d'induction de la formation des peridia sur le milieu nutritif de l'étape d),

f. une étape de multiplication des peridia sur un milieu nutritif frais constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5%, g. la récolte des peridia formés.

Dans un autre mode de réalisation selon l'invention, le procédé de production et d'induction de peridia de truffe selon l'invention comprenant les étapes suivantes :

a. une étape de préparation d'un extrait par extraction utilisant un mélange acétone/eau à partir d'une poudre de racines de Quercus pubescens,

b. une étape de lavage à l'acétate d'éthyle,

c. une étape de solubilisation de l'extrait obtenu à l'étape b) dans un mélange eau/DMSO,

d. une étape de mise en culture de mycélium de truffe avec 2 à 8 mg d'extrait soluble obtenu à l'étape c) dans une boite de pétri contenant un milieu nutritif constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5%,

e. une étape d'induction de la formation des peridia sur le milieu nutritif de l'étape d), ledit milieu nutritif étant préalablement aromatisé,

f. une étape de multiplication des peridia sur un milieu nutritif frais constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5%,

g. la récolte des peridia formés.

Dans un autre mode de réalisation selon l'invention, le procédé de production et d'induction de peridia de truffe selon l'invention comprenant les étapes suivantes :

a. une étape de préparation d'un extrait par extraction utilisant un mélange acétone/eau à partir d'une poudre de racines de Quercus pubescens,

b. une étape de lavage à l'acétate d'éthyle,

c. une étape de solubilisation de l'extrait obtenu à l'étape b) dans un mélange eau/DMSO,

d. une étape de mise en culture de mycélium de truffe avec 2 à 8 mg d'extrait soluble obtenu à l'étape c) dans une boite de pétri contenant un milieu nutritif constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5%,

e. une étape d'induction de la formation des peridia sur le milieu nutritif de l'étape d),

f. une étape de multiplication des peridia sur un milieu nutritif frais constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5%, ledit milieu nutritif étant préalablement aromatisé, g. la récolte des peridia formés. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé de production et d'induction de peridia de truffe selon l'invention comprenant les étapes suivantes : a. une étape de préparation d'un extrait par extraction utilisant un mélange acétone/eau à partir d'une poudre de racines de Quercus pubescens,

b. une étape de lavage à l'acétate d'éthyle,

c. une étape de solubilisation de l'extrait obtenu à l'étape b) dans un mélange eau/DMSO,

d. une étape de mise en culture de mycélium de truffe avec 2 à 8 mg d'extrait soluble obtenu à l'étape c) dans une boite de pétri contenant un milieu nutritif constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5%,

e. une étape d'induction de la formation des peridia sur le milieu nutritif de l'étape d),

f. une étape de multiplication des peridia sur un milieu nutritif frais constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5%,

g. la récolte des peridia formés, et

h. une étape d'aromatisation des peridia récoltés.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé selon l'invention peut en outre comprendre après l'étape g) de récolte des péridia ou entre l'étape g) de récolte des peridia et l'étape h) d'aromatisation des peridia récoltés, une étape de repiquage des péridia obtenus à l'étape g). Cette étape de repiquage permet d'obtenir de nouveaux peridia tout en s'affranchissant des étapes a) à f) du procédé selon l'invention, ce qui permet un gain de temps et une augmentation de la production des peridia. Avantageusement, les péridia obtenus à l'étape g) sont mis en culture avec du mycélium de truffe dans une boite de pétri contenant un milieu nutritif constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5%. Avantageusement, l'étape de repiquage est suivie d'une étape d'induction de la formation des peridia, avantageusement dans les mêmes conditions que celles appliquées à l'étape e) du procédé selon l'invention, suivie d'une étape de multiplication des peridia sur un milieu nutritif, avantageusement dans les mêmes conditions que celles appliquées à l'étape f) du procédé selon l'invention, et de la récolte des peridia formés, avantageusement dans les mêmes conditions que celles appliquées à l'étape g) du procédé selon l'invention.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé de production et d'induction de peridia de truffe selon l'invention peut comprendre les étapes suivantes : a. une étape de préparation d'un extrait par extraction par un solvant à partir d'un broyât de plant truffier,

b. optionnellement, une étape de lavage à l'acétate d'éthyle,

c. une étape de solubilisation de l'extrait obtenu à l'étape a) ou à l'étape b) d. une étape de mise en culture de mycélium de truffe en présence de l'extrait soluble obtenu à l'étape c),

e. une étape d'induction de la formation des peridia,

f. une étape de multiplication des peridia sur un milieu nutritif, et

g. la récolte des peridia formés.

g1 . une étape de repiquage des peridia récoltés à l'étape g),

g2. une étape d'induction de la formation des peridia,

g3. une étape de multiplication des peridia sur un milieu nutritif, et, g4. la récolte des peridia formés.

h. optionnellement, une étape d'aromatisation des peridia récoltés.

Avantageusement, les étapes g1 , g2, g3 et g4 peuvent être reproduites autant de fois qu'il est possible de repiquer les peridia nouvellement formés. Avantageusement, le procédé de production et d'induction de peridia de truffe selon l'invention comprenant les étapes suivantes :

a. une étape de préparation d'un extrait par extraction utilisant un mélange acétone/eau à partir d'une poudre de racines de Quercus pubescens,

b. optionnellement, une étape de lavage à l'acétate d'éthyle,

c. une étape de solubilisation de l'extrait obtenu à l'étape b) dans un mélange eau/DMSO,

d. une étape de mise en culture de mycélium de truffe avec 2 à 8 mg d'extrait soluble obtenu à l'étape c) dans une boite de pétri comprenant un milieu nutritif constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5%,

e. une étape d'induction de la formation des peridia sur le milieu nutritif de l'étape d),

f. une étape de multiplication des peridia sur un milieu nutritif frais constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5%,

g. la récolte des peridia formés,

g1 . une étape de repiquage des peridia récoltés à l'étape g) dans une boite de pétri comprenant un milieu nutritif constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5% et comprenant du mycélium de truffe,

g2. une étape d'induction de la formation des peridia sur le milieu nutritif de l'étape g1 ),

g3. une étape de multiplication des peridia sur un milieu nutritif frais constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5%, g4. la récolte des peridia formés,

h. optionnellement, une étape d'aromatisation des peridia récoltés.

De manière encore plus avantageuse, le procédé de production et d'induction de peridia de truffe selon l'invention comprenant les étapes suivantes :

a. une étape de préparation d'un extrait par extraction utilisant un mélange acétone/eau à partir d'une poudre de racines de Quercus pubescens,

b. une étape de lavage à l'acétate d'éthyle,

c. une étape de solubilisation de l'extrait obtenu à l'étape b) dans un mélange eau/DMSO,

d. une étape de mise en culture de mycélium de truffe avec 2 à 8 mg d'extrait soluble obtenu à l'étape c) dans une boite de pétri comprenant un milieu nutritif constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5%,

e. une étape d'induction de la formation des peridia sur le milieu nutritif de l'étape d),

f. une étape de multiplication des peridia sur un milieu nutritif frais constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5%,

g. la récolte des peridia formés,

g1 . une étape de repiquage des peridia récoltés à l'étape g) dans une boite de pétri comprenant un milieu nutritif constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5% et comprenant du mycélium de truffe,

g2. une étape d'induction de la formation des peridia sur le milieu nutritif de l'étape g1 ),

g3. une étape de multiplication des peridia sur un milieu nutritif frais constitué de malt distasique à 1 % et d'agar à 1 ,5%,

g4. la récolte des peridia formés,

h. une étape d'aromatisation des peridia récoltés.

Un autre objet de l'invention concerne les peridia de truffe obtenu par le procédé d'induction et de production tel que décrit précédemment.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de peridia de truffe pour la fabrication d'un produit aromatique à odeur et à goût naturel de truffe. Par « produit aromatique à odeur et à goût naturel de truffe», on entend un produit artificiel, ne faisant pas appel au produit naturel lui-même, de façon à écarter toutes les contraintes associées à l'utilisation de ce produit naturel, mais ayant une fidélité remarquable dans la reproduction des caractéristiques organoleptiques de l'arôme de truffe fraîche. Avantageusement, le produit aromatique à odeur et à goût naturel de truffe selon l'invention peut être utilisé dans l'industrie agroalimentaire, l'industrie cosmétique, la parfumerie ou l'industrie des arômes.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de peridium de truffe pour la préparation d'un produit alimentaire, d'un complément alimentaire, d'un aliment nutraceutique ou d'un produit cosmétique. Dans un mode de réalisation avantageux, le peridium de truffe peut être sous forme déshydratée ou non déshydratée, sous forme d'extrait ou de broyât.

Dans un mode de réalisation avantageux, les peridia de truffe peuvent être utilisés en entiers, sous forme de brisures ou sous forme de poudres comme produit alimentaire ou dans un produit alimentaire déjà existant. Avantageusement, les peridia de truffe quel que soit sa forme d'utilisation (brisures, poudre ou entier) peuvent être sous forme déshydratée ou non déshydratée, sous forme d'extrait ou de broyât.

Dans un mode de réalisation avantageux, le produit alimentaire peut être des brisures de peridia de truffe, une poudre de peridia de truffe ou le peridia de truffe entier.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, les peridia de truffe peuvent être utilisés dans un produit alimentaire déjà existant tel que :

un corps gras, par exemple une huile, avantageusement une huile végétale, du beurre, de la margarine, du saindoux, de la crème fraîche,

un produit laitier, par exemple le lait, les fromages, le fromage blanc, les yaourts, les crèmes,

un condiment, par exemple la moutarde, une sauce,

un vinaigre, une préparation culinaire, un biscuit, ou tout autre produit alimentaire susceptible de contenir de la truffe. Dans un autre mode de réalisation avantageux, les peridia de truffe peuvent être utilisés en entiers, sous forme de brisures, ou sous forme de poudres pour la fabrication d'un produit cosmétique. Avantageusement, les peridia de truffe quel que soit sa forme d'utilisation (brisures, poudre ou entier) peuvent être sous forme déshydratée ou non déshydratée, sous forme d'extrait ou de broyât.

Avantageusement, les peridia de truffe peuvent être ajoutés directement dans la composition de tout produit cosmétique, conférant ainsi au produit cosmétique des effets lissants et blanchissants lorsqu'il est appliqué sur la peau, un effet liftant, un effet antirepousse des poils et/ou cheveux, ainsi que des propriétés de lutte contre le vieillissement cutanée et en particulier un effet anti-âge et/ou un effet antirides. FIGURES

Figure 1 : La figure 1 représente un mycélium en croissance sur une boite de pétri comprenant un milieu nutritif à base de malt diastasique à 1 % et d'agar à 1 ,5 %.

EXEMPLES

Exemple 1 : Procédé d'induction et de production in-vitro de peridium de truffe

A/ Préparation de l'extrait

15 g de poudre de racines de chêne {Quercus pubescens) est déposée dans 150 ml d'un mélange eau/acétone (30/70) (v/v), préalablement chauffé à 60°C. L'extraction est réalisée sous agitation à 60°C. Après 30 minutes d'extraction, le mélange est filtré à chaud sur Buchner. Le filtrat contenant les composés actifs est séparé de la poudre de plante. L'acétone contenue dans le filtrat est éliminée par évaporation sous pression réduite à 50°C. Les composés actifs contenus dans le filtrat sont ensuite séparés par partage liquide- liquide. Dans une ampoule à décanter, on ajoute à la phase aqueuse 90ml d'acétate d'éthyle (3x). Les phases organique et aqueuse sont récupérées et évaporées sous pression réduite à 50°C. Les composés d'intérêt sont retrouvés dans la phase aqueuse. La masse d'extrait obtenu est d'environ 660 mg. Le rendement d'extraction est d'environ 4,5%. L'extrait est ensuite solubilisé dans un mélange eau/DMSO (50/50) (v/v) pour obtenir l'extrait soluble. B/ Culture de mycélium de Tuber melanosporum

Une pastille de mycélium de Tuber melanosporum est déposée au milieu d'une boite de pétri contenant un milieu nutritif à base de malt diastasique à 1 % et d'agar à 1 ,5 %. La boite de pétri est mise à l'étuve à 25°C sous atmosphère non contrôlée. La souche est repiquée deux à trois fois successivement sur du milieu de culture frais, afin d'obtenir un mycélium apte à la production de peridia.

C/ Production des peridia

Une pastille de mycélium de Tuber melanosporum est déposée au centre d'une boite de pétri. 100μί d'extrait soluble est déposé dans un puit préalablement creusé à mi-distance entre le centre et le bord de la boîte. La boite est mise à l'étuve à 25°C. Dès leur apparition, les fructifications sont repiquées dans de nouvelles boites de pétri, afin de les faire se multiplier. Le nombre et la taille des peridia vont en augmentant au cours du temps. Au bout de 2 à 3 semaines, la production de peridia est de 2 à 3 grammes par boîte de pétri.