METODOLOGIA DE MARCAÇÃO DE NEURÓNIOS E SUAS APLICAÇÕES

Domínio da Invenção

A presente invenção enquadra-se no domínio das Tecnologias na área das Ciências da Saúde, mais precisamente, na área das Neurociências .

Antecedentes da invenção

O fenómeno único da neurogénese adulta engloba a formação e incorporação de novos neurónios em circuitos pré-existentes no cérebro adulto, constituindo assim o caso mais interessante de neuroplasticidade no cérebro. A neurogénese adulta ocorre maioritariamente em duas regiões do cérebro, as quais dão origem a diferentes tipos de neurónios: a zona subgranular (SGZ) do girus denteado (DG) onde são formados neurónios glutamatérgicos e a zona subependimal (SEZ) onde são formados diferentes classes de interneurónios GABAérgicos do bolbo olfactivo (OB) . Atualmente, os investigadores estudam todos os componentes deste processo neurogénico e tentam revelar a sua função, tendo a vantagem do uso de variadas técnicas disponíveis para medir a neurogénese adulta. Notavelmente, este processo neuroplástico é disfuncional em várias doenças.

Várias estratégias têm sido desenvolvidas para estudar a neurogénese adulta. Como pré-requisito para estudar a actividade de células estaminais in vivo, é necessário identificar as células proliferativas e marcar estavelmente a sua descendência. Em roedores, existem modelos animais transgénicos , marcação com retrovírus e imunohistoquímica com bromodeoxyuridine (BrdU) , os quais fornecem estratégias fortes para estudar a formação e o destino dos novos neurónios no cérebro adulto. Contudo, a maioria destas técnicas não são aplicáveis a humanos, devido a serem técnicas muito invasivas .

A marcação das células com BrdU é atualmente um dos métodos prevalentes para estudar a proliferação e neurogénese in vivo. Quando o BrdU é injetado sistemicamente , este é incorporado, como um análogo de timidina, no DNA de todas as células que estão a sintetizar DNA, permitindo assim a sua deteção imunohistológica em células pós-mitóticas durante o restante período de vida das células. Esta técnica é essencial para a identificação da origem das células neuronais formadas de novo na SGZ e SEZ adultas. Estudos adicionais com múltiplas marcações, usando imunohistoquímica para BrdU e microscopia confocal, revelaram que os novos neurónios formados no cérebro adulto expressam uma sequência de marcadores que reflectem o seu estado de maturação. A identificação do estado de maturação destes novos neurónios pode ser realizada através de múltiplas marcações usando BrdU e marcadores neuronais. Outros métodos alternativos foram desenvolvidos para medir a proliferação in vivo através de marcadores mitóticos, como o PCNA e Ki67, que são bons marcadores para células que estão em ciclo celular. Contudo, estes marcadores não são adequados para detetar a descendência neuronal das células que estão a proliferar, pois quando as células expressam marcadores neuronais maduros, estas já saíram do ciclo celular. Desta forma, outros métodos são necessários para detetar a neurogénese adulta e para confirmar inequivocamente a existência de neurogénese e validar a marcação com BrdU. Adicionalmente, a técnica usada com BrdU não demonstrou ser útil para estudar a conetividade e a morfologia dos novos neurónios formados no cérebro adulto, como por exemplo a arborização dendritica e a forma das espinhas. Assim, surgiu uma outra técnica de marcação das células com retrovirus, a qual se tornou o método mais usado frequentemente para demonstrar a ocorrência de neurogénese adulta. Os vetores virais conseguem-se integrar no genoma das células durante a sua divisão, resultando na marcação permanente das células proliferativas e na sua descendência. Devido a esta característica, este método foi demonstrado ser útil também para estudar o desenvolvimento morfológico e fisiológico dos neurónios formados de novo durante todos o processo neurogénico, ao contrário do BrdU. De fato, a deteção de novos neurónios usando vetores retrovirais fornece muitas outras vantagens comparativamente à marcação com BrdU. Por exemplo, a marcação com retrovirus permite a distinção entre a divisão celular e reparação de DNA, pois a integração estável do genoma retroviral no DNA cromossomal pode apenas ocorrer depois da quebra da membrana nuclear. Além disso, o método da presente invenção permite o estudo de toda a descendência de uma única célula independentemente do número de divisões celulares, ao contrário do BrdU que é diluído durante divisões celulares sucessivas. Uma vez que a barreira hemato-encefálica é um obstáculo à entrada dos retrovirus, estes têm que ser injetados diretamente na região de interesse através de cirurgias estereotáxicas , causando lesões no cérebro devido ao trato da cânula e possíveis reacções inflamatórias locais. Estas possíveis lesões e inflamações podem induzir alterações na neurogénese, levando assim a ter muitos cuidados quando se usa este método para estudar a atividade das células estaminais no cérebro intacto. Notavelmente, já foi observado no sistema nervoso central o silenciamento da expressão do gene retroviral o que pode levar o gene repórter a não ser expresso continuamente em todas as células. Devido a este possível silenciamento dos vetores retrovirais em células estaminais, não podemos ter a certeza se toda a descendência das células estaminais é marcada. Adicionalmente, ainda não se sabe se os retrovírus quando integrados em células adultas progenitoras podem ser regulados por mecanismos epigenéticos , levando a conclusões erradas sobre o que realmente acontece durante a neurogénese adulta. Não obstante, atualmente a marcação com retrovírus é ainda considerada o método mais consistente usado para estudar a neurogénese adulta no cérebro. Contudo, considerando as várias desvantagens deste método mencionadas anteriormente, é necessário ser cauteloso na interpretação dos resultados em relação à neurogénese no cérebro intacto e ainda mais importante no cérebro "doente". Daí a necessidade de encontrar novos métodos mais consistentes para estudar com maior precisão este processo tão importante que ocorre no nosso cérebro adulto.

Notavelmente, a proliferação de células estaminais, a neurogénese e a sobrevivência de novos neurónios pode ser regulada por condições fisiológicas e patológicas. De fato, estudos anteriores propuseram que desequilíbrios na neurogénese adulta no hipocampo podem estar na base da fisiopatologia da depressão e na ação de antidepressivos, dando assim origem à "hipótese neurogénica" da depressão. Alterações na estrutura neuronal no hipocampo e no córtex pré-frontal são reconhecidas como sendo chave na fisiopatologia da depressão. De notar que há uma contribuição da plasticidade sináptica e conetividade neuronal para o desenvolvimento e recuperação de comportamentos depressivos. De realçar o fato de as conexões sinápticas serem restabelecidas através da administração de antidepressivos , como por exemplo a fluoxetina e imipramina, facilitando a recuperação dos circuitos neuronais.

Na maioria destes estudos, a avaliação da arborização dendritica e a forma das espinhas foi realizada através de análises morfométricas tridimensionais de impregnação de Golgi em neurónios usando reconstruções computadorizadas no hipocampo e no córtex. Contudo, esta técnica permite o estudo de neurónios na região de interesse sem ser possível a distinção entre neurónios pré-existentes e neurónios formados de novo, dos quais só os novos neurónios foram afetados pela doença ou pelo tratamento. Assim, torna-se extremamente necessário encontrar um método alternativo que permita estudar a morfologia e conetividade dos novos neurónios especificamente. Uma boa alternativa seria usar marcação com retrovírus para marcar as células formados de novo e ao mesmo tempo estudar a estrutura celular, incluindo os processos dendríticos e axonais. Contudo, devido às várias desvantagens mencionadas acima, os retrovirus trazem muitas precauções na interpretação dos resultados especialmente no caso de patologias. Além disso, este é um método que exige uma cirurgia e por isso é invasivo tornando impossível usá-lo em humanos. Desta forma, é útil ter uma técnica que permita simultaneamente marcar os novos neurónios e estudar a sua morfologia, evitando problemas como lesões e reacções inflamatórias na região cerebral de interesse. Neste sentido, o método inovador e não-invasivo da presente invenção, permite a realização destes objetivos com sucesso através de um método que combina marcação com BrdU imunohistoquimica com impregnação de Golgi-Cox em neurónios.

Sumário da invenção

A metodologia de marcação de neurónios descrita na presente invenção combina a imuno-histoquímica de bromodioxiuridina (BrdU) com a técnica de impregnação de Golgi-Cox. Com este método simples e não invasivo, é possível:

• determinar a estrutura tridimensional da arborização dendrítica e a forma das espinhas dos novos neurónios que são formados num momento específico, na estrutura hipocampal de animais adultos, em condições fisiológicas e patológicas, como é o caso da depressão ;

• estudar com elevada precisão e de uma forma não invasiva o processo neurogénico no cérebro adulto.

A presente invenção descreve uma metodologia de marcação de neurónios que compreende simultaneamente:

• técnica de impregnação de Golgi-Cox;

• técnica de imunohistoquímica para bromodeoxyuridine (BrdU) . Numa realização preferencial da presente invenção a metologia de marcação de neurónios é caracterizada por compreender os seguintes passos:

a) estabelecer a impregnação de Golgi-Cox em amostras de neurónios;

b) estabelecer a imunohistoquímica com BrdU nas amostras previamente impregnadas com Golgi-Cox;

c) análise das amostras.

Numa realização mais preferencial da presente invenção o passo a) referido anteriormente compreende os seguintes passos :

i) colocar a amostra em solução de Golgi-Cox e manter esta no escuro durante pelo menos 15 dias ;

ii) colocar a amostra numa solução de sacarose a 30%, previamente refrescada;

iii) manter a amostra em refrigeração à temperatura de 4°C no escuro durante 2 a 5 dias ;

iv) mergulhar a amostra em água destilada durante 15 minutos, e posteriormente em hidróxido de amónio durante 5 minutos, no escuro ;

v) lavar as amostras com água destilada e mergulhar as amostras em solução de fixação Kodak ;

vi) lavar as amostras com água destilada e mergulhar as amostras em solução tampão fosfato-salino. Numa realização ainda mais preferencial da presente invenção no passo ii) do passo a) referido anteriormente a solução ser refrescada até à temperatura de 4°C.

Numa realização ainda mais de preferência da presente invenção no passo v) do passo a) as amostras estarem mergulhadas em solução de fixação durante pelo menos 20 minutos .

Numa outra realização preferencial da presente invenção o passo b) referido anteriormente compreende os seguintes passos :

i) colocar as amostras em solução tampão citrato ;

ii) aquecer as amostras durante 5 minutos; iii) arrefecer as amostras até à temperatura ambiente ;

iv) mergulhar as amostras em solução tampão Tris três vezes;

v) incubar as amostras com anticorpo primário para BrdU;

vi) remover a solução de anticorpo primário e mergulhar as amostras em TBS 3 vezes, 10 minutos cada lavagem;

vii) incubar as amostras com anticorpo secundário durante 2 horas à temperatura ambiente; viii) remover o anticorpo secundário e mergulhar as amostras em TBS 3 vezes,;

ix) incubar as amostras em DAPI na concentração de l g/ml em solução de TBS durante 10 minutos à temperatura ambiente e de seguida foram mergulhar as amostras em TBS 3 vezes, 3 minutos cada lavagem . Numa realização ainda mais preferencial da presente invenção no passo i) do passo b) referido anteriormente a solução tampão ter concentração de 10 nM e pH 6.

Numa realização ainda mais de preferência da presente invenção o passo ii) do passo b) ocorrer a uma potência entre 750 e 900 watts.

Numa realização ainda mais preferencial da presente invenção no passo iv) do passo b) as amostras permanecerem mergulhadas em solução tampão TRIS durante 10 minutos cada vez .

Numa realização ainda mais de preferência da presente invenção no passo v) do passo b) as amostras serem incubadas durante uma noite a 4°C.

Numa realização ainda mais preferencial da presente invenção no passo b) o anticorpo primário para BrdU ser usado na diluição de 1:50.

Numa realização ainda mais de preferência da presente invenção no passo viii) do passo b) as amostras permanecerem mergulhadas em TBS 10 minutos cada lavagem.

Numa outra realização preferencial da presente invenção o anticorpo secundário ser usado na diluição 1:1000. A presente invenção descreve ainda a aplicação da metodologia descrita na análise da estrutura tridimensional da arborização dendritica de neurónios e da forma das espinhas .

Numa realização preferencial da utilização desta metodologia esta invenção é aplicada em condições fisiológicas ou patológicas onde a neurogénese e a plasticidade sináptica possam estar afectadas.

Descrição Geral

A observação da estrutura dendritica neuronal em combinação com a determinação do fenótipo neuronal especifico é atualmente um grande desafio. Na presente invenção foi desenvolvido um método inovador que combina imunohistoquimica para bromodioxyuridine (BrdU) com a técnica de impregnação de Golgi-Cox em neurónios. Com esta técnica simples e não invasiva, consegue-se determinar a estrutura tridimensional da arborização dendritica de neurónios e a forma das espinhas especificamente em neurónios formados de novo no hipocampo de animais adultos em condições fisiológicas e patológicas, como por exemplo a depressão .

Para o desenvolvimento e implementação deste método, foram necessários vários passos experimentais, que englobam:

- estabelecer a impregnação de Golgi-Cox em neurónios em cortes de cérebro de ratos em condições fisiológicas e patológicas; - estabelecer a imunohistoquímica com BrdU nos mesmos cortes do cérebro em que se fez inicialmente a impregnação com Golgi;

- fazer análises por microscopia confocal e análises estereológicas para comprovar a marcação combinada de BrdU com impregnação de Golgi-Cox.

Os passos detalhados da implementação da metodologia da presente invenção são:

1- Impregnação de Golgi-Cox em neurónios

Ratos são anestesiados com pentobarbital sódico (Eutasil, 60mg/Kg i.p. por rato com peso entre 300-500 gramas; Ceva Saúde Animal, Portugal) e perfundidos com salino a 0,9% imediatamente após 4 semanas de injecção de BrdU (5 injeções i.p em 5 dias consecutivos, 100mg/kg) . Todos os cérebros /amostras foram removidos, colocados em solução de Golgi-Cox e mantidos no escuro durante 15 dias. De seguida, os cérebros foram transferidos para uma solução de sacarose a 30% (previamente refrescada no frigorifico) e mantidos no frigorifico durante 2 a 5 dias no escuro, até afundarem. Os cérebros são seccionados usando um vibrótomo (Microm HM 650V) depois de serem secos em papel e fixados na plataforma do vibrótomo usando cianoacrilato (secções foram cortadas com a espessura de 200μπ\) . As secções são transferidas para uma placa de 24-poços múltiplos (Nunc) preenchida com água destilada, durante 15 minutos e de seguida são mergulhadas em hidróxido de amónio (Sigma Aldrich) durante 5 minutos, no escuro. De seguida, as secções são lavadas duas vezes com água destilada, 10 minutos cada lavagem, e mergulhadas em solução de fixação Kodak (Rapid fixer; Sigma Aldrich) durante 20 minutos. Procede-se a mais 2 lavagens com água destilada, 10 minutos cada lavagem, e de seguida as secções são mergulhadas em tampão fosfato-salino (PBS IX) , mantendo-as sempre frescas no frigorifico à temperatura de 4°C.

2- Imunohistoquímica com BrdU

Imediatamente após terminar o procedimento para marcação com Golgi-Cox, as secções /amostras são transferidas para placas de 6-poços múltiplos (máximo 10 secções por poço) preenchidas com tampão citrato (ΙΟηΜ; pH=6 ) . De seguida, coloca-se a tampa nas placas e aquece-se as secções durante 5 minutos no microondas a uma potência média (entre 750 e 900 Watts) . As placas de poços múltiplos são de seguida retiradas do microondas e colocadas à temperatura ambiente para arrefecimento das secções durante 15 minutos. As secções são mergulhadas em solução tampão Tris (TBS) três vezes, durante 10 minutos cada, e de seguida são incubadas com anticorpo primário para BrdU (rat anti-mouse da Novocastra) na diluição de 1:50 em 0,5% Triton®-X 100 e 10% solução de soro normal de cabrito (NGS) durante uma noite a 4°C (500μ1 de solução por poço) . No dia seguinte, a solução de anticorpo primário é removida e as secções são mergulhadas em TBS 3 vezes, 10 minutos cada lavagem. As secções são depois incubadas com anticorpo secundário (anti-mouse Alexa Fluor 488 ou Alexa Fluor 546 da Invitrogen) na diluição de 1:1000 em 0,5% Triton®-X 100 e 10% NGS durante 2 horas à temperatura ambiente. O anticorpo secundário é depois removido e as secções são mergulhadas em TBS 3 vezes, 10 minutos cada lavagem. Finalmente, as secções são incubadas em DAPI na concentração de l g/ml em solução de TBS durante 10 minutos à temperatura ambiente e de seguida são mergulhadas em TBS 3 vezes, 3 minutos cada lavagem. As secções são depois montadas em slides superfrost (SuperFrost Ultra Plus da Menzel-Gláser ; 3 secções por slide) usando meio de montagem Vectashield (Vector Labs). Os slides são colocados deitados a secar durante pelo menos 48 horas num local escuro e fresco (4°C) .

3- Análises de microscopia confocal

Depois dos slides com as secções estarem completamente secos, tiram-se imagens dos neurónios marcados duplamente para Golgi-Cox e BrdU localizados no girus denteado do hipocampo, usando um microscópio confocal Olympus FV1000 (comprimento de onda da emissão a 488 ou 594 e campo claro) a magnificação elevada (40x) . As secções são oticamente seccionadas usando intervalos de 1-2μπι e as células são rodadas em planos ortogonais para confirmar a marcação dupla .

4- Análises esterologicas

A arborização dendritica e as espinhas são analisadas no girus denteado do hipocampo. Para cada neurónio selecionado que apresentava co-localização de Golgi-Cox e BrdU, todos os ramos da árvore dendritica são reconstruídos a uma magnificação de x600 (lente com óleo) usando um microscópio motorizado (Axioplan 2; Carl Zeiss) e software da Neurolucida (Microbrightfield) com o módulo de extensão AutoNeuron. As análises tridimensionais dos neurónios reconstruídos são elaboradas usando software do NeuroExplorer (Microbrightfield) . Breve descrição das figuras

Para uma mais fácil compreensão da invenção juntam-se em anexo as figuras, as quais, representam realizações preferenciais do invento que, contudo, não pretendem, limitar o objeto da presente invenção.

Figura 1. Análises tridimensionais dos neurónios duplamente marcados com BrdU e Golgi-Cox

Análises morfométricas tridimensionais de um neurónio com impregnação de Golgi-Cox e com marcação para BrdU (marcado com ponto cinzento claro) e Dapi (marcação de todos os núcleos) (A) usando reconstruções computadorizadas. As reconstruções neuronais foram elaboradas usando um microscópio motorizado e software da Neurolucida com o módulo de extensão automático AutoNeuron diretamente da imagem de confocal (cor cinzenta em B e C) e usando reconstruções manuais (cor branca em D) . As cores distintas em C descrevem ramos dendriticos diferentes e as setas pretas em B e D apontam as diferenças entre as reconstruções automática e manual. A imagem E apresenta um segmento neuronal com diferentes tipos de espinhas. Barra de escala: 50μπ\

Figura 2. Imagens de confocal e análises morfométricas tridimensionais de neurónios duplamente marcados com BrdU e Golgi-Cox

(A, B, C) Imagens de confocal de três neurónios duplamente marcados com BrdU (marcados com pontos cinza claro) e Golgi-Cox (marcação a preto) . O BrdU foi administrado durante cinco dias consecutivos a ratos Wistar com quatro meses não-stressados e injetados com solução salino durante duas semanas (Control) (A) ou expostos a stress crónico imprevisível (uCMS) e injectados com solução salino (B) ou methyazoxymethanol -MAM (uCMS+MAM) (C) nas duas últimas semanas do protocolo de stress. Análises de imunohistoquímica foram elaboradas 4 semanas depois das injeções. Os núcleos (marcados com pontos cinzento escuro) foram marcados com Dapi (D, E, F) . Análises das reconstruções morfométr icas neuronais tridimensionais de neurónios duplamente marcados com BrdU e Golgi-Cox demonstradas em A (D) , em B (E) e em C (F) . (G) Gráfico demonstrando o comprimento total das dendrites de neurónios do girus denteado formados de novo em diferentes grupos experimentais (ratos control e expostos a uCMS não tratados (-MAM) e tratados com MAM ( +MAM) ) . (H) Gráfico demonstrando a percentagem dos diferentes tipos de espinhas (finas/thin, cogumelo/mushroom, amplas/wide e ramifiçadas /ramified) presentes em novos neurónios do girus denteado de diferentes grupos experimentais (ratos controlo e expostos a uCMS não tratados (-MAM) e tratados com MAM (+MAM) ) . Os resultados estão representados com média±se.m. Asterisco representa a comparação entre o controlo e todos os outros grupos experimentais; *P<0.05 e **P<0.01. Barra de escala: 50μπ\.

Figura 3. Exposição a stress crónico causa alterações neuromorfológicas a longo-termo em neurónios formados de novo no hipocampo de ratos adultos

(a) Alterações estruturais induzidas por exposição a stress crónico (CMS) em neurónios pré-existentes são revertidas a longo-termo e não estão associadas com deficiências comportamentais. (b e c) Exposição a CMS não provoca alterações na arborização dendrítica (b) nem na densidade de espinhas (c) dos neurónios formados de novo no hipocampo. (d) Os novos neurónios dos ratos previamente expostos a CMS apresentam um aumento na percentagem de espinhas finas e estas alterações são atenuadas com o tratamento dos antidepressivos fluoxetina e imipramina .

De realçar que os neurónios pré-existentes em a foram analisados apenas para marcação com Golgi e os novos neurónios em b foram marcados com Golgi e BrdU simultaneamente (técnica de Immuno-golgi ) . Esta nova técnica permitiu assim analisar os neurónios formados de novo no hipocampo, verificando alterações morfológicas a nível das espinhas que ocorrem especificamente nestes neurónios e não em neurónios pré-existentes . Esta nova tecnologia permitiu assim pela primeira vez distinguir entre neurónios pré-existentes e novos neurónios e verificar alterações específicas destes últimos.

* Demonstra o efeito do CMS e da inibição da neurogénese através da administração com MAM; # Demonstra o efeito dos antidepressivos . *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; n=10 por grupo .

Descrição detalhada da invenção

Para estudar a atividade de células estaminais in vivo é necessário identificar as células proliferativas e também marcar a sua descendência para permitir a análise de todos os componentes do processo de neurogénese adulta. Foi desenvolvido um método inovador que permite com sucesso a realização destes objetivos através da combinação de imunohistoquímica com bromodioxyuridine (BrdU) e impregnação em neurónios com Golgi-Cox (Fig. 1) . Com este método inovador consegue-se marcar especificamente os neurónios formados de novo usando a marcação com BrdU e estudar a estrutura desses mesmos neurónios, incluindo a arborização dendrítica e a forma das espinhas, através da marcação simultânea com Golgi-Cox. Para validar este método, foram analisados neurónios que apresentam co- localização de BrdU com Golgi-Cox usando microscopia confocal (Figs. 1 e 2) e elaboradas análises morfométricas tridimensionais desses mesmos neurónios usando reconstruções computadorizadas (Fig. 1 e 2) . Todos os ramos da árvore dendrítica dos neurónios selecionados foram reconstruídos usando um microscópio motorizado e software da Neurolucida com o módulo de extensão automático AutoNeuron (Fig. 1B, C) e usando reconstruções manuais sem o módulo AutoNeuron (Fig. 1D) . Como é demonstrado nas imagens, não foram encontradas diferenças entre as reconstruções manuais e as automáticas usando o AutoNeuron, apresentando assim diferentes estratégias possíveis para estudar a estrutura destes neurónios. Análises tridimensionais dos neurónios reconstruídos foram elaboradas usando software do NeuroExplorer

(Microbrightfield) . Este método também permite estudar a forma dos neurónios e os tipos de espinhas (Fig. 1E) , permitindo assim a avaliação da conetividade neuronal e da plasticidade neuronal.

Para validar este método, foi estudada a estrutura de neurónios formados de novo no girus denteado (DG) de ratos controlo (Figs. 2) e comparada com os neurónios do DG de ratos que apresentavam sintomas depressivos após exposição dos mesmos a stress crónico imprevisível (uCMS) e/ou após administração de methyazoxymethanol (MAM) , um agente alquilante que termina a proliferação celular. Está bem estabelecido na literatura que a proliferação e neurogénese podem ser reguladas por condições patológicas. De fato, estudos anteriores, demonstraram que alterações na neurogénese adulta no hipocampo podem estar envolvidas na fisiopatologia da depressão e na ação de antidepressivos . Adicionalmente, o comportamento depressivo observado em ratos expostos a CMS foi associado a uma diminuição da proliferação e a atrofia dendritica e perda sináptica no hipocampo destes animais. Notavelmente, estas conexões sinápticas e a plasticidade sináptica é restabelecida através da administração de antidepressivos, facilitando a reconstituição dos circuitos neuronais. De realçar que na maioria destes estudos, a análise da arborização dendritica e forma das espinhas dos neurónios foi elaborada através de impregnação destes neurónios com Golgi-Cox no hipocampo, sem ser possível a distinção entre os neurónios pré- existentes que não foram afetados pela doença e os neurónios formados de novo que foram afetados pela doença ou pelo tratamento. Esta distinção é de extrema importância para conseguir analisar convincentemente o efeito da doença e tratamento nos neurónios do cérebro. Isto até agora não foi possível, pois não existia nenhum método que permitisse analisar especificamente os novos neurónios afetados pela doença e tratamento. Com o método inovador da presente invenção, consegue-se marcar os neurónios que se formaram durante o período de exposição ao CMS usando imunohistoquímica para BrdU e estudar simultaneamente a estrutura desses neurónios, incluindo os processos dendríticos através da marcação com Golgi-Cox.

Assim, consegue-se comparar especificamente a morfologia dos novos neurónios em indivíduos sujeitos a CMS, alguns dos quais também foram tratados com MAM (Fig. 2B e C) com os novos neurónios da amostra controlo (Fig. 2A) . É demonstrado que os novos neurónios de indivíduos expostos a CMS sem administração de MAM são capazes de recuperar morfologicamente (Fig. 2B, E, G e H) e são comparáveis aos novos neurónios da amostra de controlo não tratados (Fig. IA, D, G e H) . Estes resultados, também demonstram pela primeira vez que os novos neurónios do DG de indivíduos expostos a CMS e injectados com MAM estão severamente comprometidos e não conseguem recuperar em termos de arborização dendrítica e forma das espinhas, mesmo 1 mês após a exposição a stress (Fig. 1C, F, G e H) .

Sabendo que a neuroplasticidade, ou a sua falha, é crucial em vários processos neuropatológicos , este método torna-se bastante relevante, pois compara a estrutura neuronal dos neurónios formados de novo com os neurónios pré-existentes . Até agora, a análise da estrutura dendrítica nos novos neurónios só era possível através da marcação com retrovírus . Contudo, este método tem várias desvantagens, comparativamente ao nosso método, como por exemplo ser um método invasivo causando lesões e reacções inflamatórias locais que o tornam menos apropriado para uso em estudos in vivo. Estas lesões ou inflamações podem causar per se alterações na neurogénese podendo levar a conclusões erradas relativamente a este processo no contexto neuropatológico . Adicionalmente, o método de marcação com retrovírus só permite estudar a região onde o vírus foi injetado e não permite uma resolução temporal precisa da proliferação nem uma comparação da morfologia neuronal entre células proliferativas e não proliferativas . Todas estas desvantagens são ultrapassadas com o método da presente invenção. De realçar ainda que técnicas histopatológicas padrão usadas para marcar neurónios não marcam as dendrites e as espinhas e podem assim perder informação sobre ramos dendriticos aberrantes e perda de sinapses em processos neurodegenerativos . Pelo contrário, a impregnação com Golgi-Cox é um método simples e validado que fornece informação detalhada sobre a morfologia neuronal dos neurónios, permitindo assim a deteção de danificações subtis ou degeneração dos neurónios. Como foi demonstrado na presente invenção, se a impregnação com Golgi-Cox for combinada com marcação para BrdU, este método irá adicionalmente permitir distinguir se as alterações sinápticas são especificas de determinadas populações neuronais (por exemplo, neste estudo, se os neurónios pré- existentes são afetados de forma diferente dos novos neurónios) . Obviamente, este método terá uma aplicabilidade muito mais ampla, pois a combinação de outros marcadores e Golgi-Cox irá permitir análises da estrutura neuronal dendritica com a sua caracterização fenotipica num espectro largo de condições experimentais. Muito importante ainda, é o fato de este método poder ser aplicado a humanos, visto não ser um método invasivo, ou contrário dos métodos existentes mais utilizados atualmente, nomeadamente as injeções de retrovirus .

Em síntese, este método inovador e não-invasivo será útil para estudar a estrutura neuronal fina em neurónios caraterizados fenotipicamente tanto em condições fisiológicas como em condições patológicas. A metodologia da presente invenção é útil para as condições patológicas onde a neurogénese e a plasticidade sináptica pode estar afetada, como por exemplo na depressão, doença de Alzheimer e esquizofrenia.

Referências

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As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais da presente invenção.