Procédé de fabrication d'un réseau de capillaires d'une puce

La présente invention concerne un procédé de fabrication d'un réseau de capillaires d'une puce ou d'une bio-puce. L'invention concerne également une puce comprenant un réseau de capillaires dans lesquels sont fixées des molécules chimiques ou biologiques organisées en matrice de sondes, et une puce comprenant un réseau de capillaires d'électrophorèse et/ou de chromatographie.

Dans la présente demande, les termes puce et bio-puce ont le même sens et désignent un composant comprenant un réseau de capillaires qui peut être utilisé dans de nombreux domaines tels que la microfluidique, l'électrophorèse capillaire, la chromatographie, l'électrochromatographie, etc., et pour des applications variées telles que l'analyse biologique, médicale, pharmaceutique, agroalimentaire, environnementale, etc.

Dans le cadre de l'analyse d'un mélange de cibles moléculaires polynucléotidiques, une puce ou une bio-puce comprend un réseau de capillaires et une matrice de sondes moléculaires organisées en spots et fixées dans les capillaires, ces sondes moléculaires étant de types différents et possédant chacune une séquence nucléotidique susceptible de se lier spécifiquement par hybridation moléculaire à un unique type de cible moléculaire du mélange lorsque ce dernier est amené au contact des sondes moléculaires.

Les cibles moléculaires du mélange qui circulent dans les capillaires de la puce, par exemple par simple diffusion du mélange, viennent en contact avec les sondes moléculaires et se lient spécifiquement à elles pour former des complexes sonde-cible qui sont détectés et/ou quantifiés par exemple par mesure de la fluorescence émise par des marqueurs fluorescents préalablement accrochés sur les cibles moléculaires. La circulation des cibles moléculaires dans les capillaires peut alternativement résulter de l'application d'un champ électrique dans les

capillaires par l'intermédiaire d'électrodes greffées ou déposées en couche mince sur la puce. Dans le cas où chaque sonde moléculaire est associée à une paire d'électrodes, la détection et/ou la quantification des complexes sonde-cible peut être obtenue par mesure de l'impédance entre chaque paire d'électrodes.

Il est connu de former un réseau de capillaires d'une puce dans une plaque en matériau plastique par usinage au laser, cette technique consistant à focaliser et déplacer un faisceau laser sur une surface de la plaque pour creuser les capillaires par ablation du matériau plastique de la plaque. Cependant, cette technique est complexe et très coûteuse à mettre en oeuvre et doit être réalisée avant le greffage ou le dépôt des électrodes et la fixation des sondes moléculaires sur la plaque, pour éviter de les abîmer ou de les détruire. De plus, l'usinage par laser de la plaque peut provoquer la formation de défauts tels que des bourrelets le long des bords longitudinaux extérieurs des capillaires.

Un réseau de capillaires d'une puce peut également être formé dans une plaque d'un matériau approprié, tel que de la silice, par dépôt d'un agent chimique corrosif, tel qu'un acide ou une base, sur une surface de la plaque pour creuser par attaque chimique la plaque de façon à former les capillaires. Ces agents chimiques sont toutefois incompatibles avec du matériel biologique et doivent donc être appliqués sur une plaque exempte de sondes moléculaires pour ne pas risquer de les détruire. Une solution à ce problème consisterait à recouvrir d'un masque de protection les sondes moléculaires fixées sur la plaque. Cependant, cette technique est peu efficace et est très coûteuse à mettre en œuvre. D'autre part, la formation d'un réseau de capillaires par attaque chimique ne permet pas d'avoir des capillaires avec des dimensions précises et uniformes et limite donc les applications des réseaux de capillaires obtenus par cette technique.

De manière générale, les procédés de fabrication connus ne permettent pas ou permettent très difficilement de fabriquer des réseaux complexes de capillaires pouvant accueillir un grand nombre de molécules

chimiques ou biologiques différentes, par exemple plusieurs milliers de molécules.

L'invention a notamment pour but d'apporter une solution, simple, efficace et économique à ces problèmes. Elle propose à cet effet un procédé de fabrication d'un réseau de capillaires d'une puce, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a) déposer au moins une couche d'un matériau de construction fusible ou d'un matériau de construction polymérisable, sur une plaque de support destinée à former les fonds des capillaires, b) focaliser et déplacer un faisceau laser sur des zones prédéterminées de la ou de chaque couche de matériau de construction pour entraîner respectivement la fusion ou la polymérisation du matériau dans ces zones de façon à former les parois latérales des capillaires, et c) fixer une plaque de fermeture sur les parois latérales des capillaires, après leur durcissement, cette plaque de fermeture formant les plafonds des capillaires.

Le procédé peut en outre consister, avant l'étape a) et/ou c), à fixer des molécules chimiques ou biologiques sur la plaque de support et/ou sur la plaque de fermeture, au niveau du fond et/ou du plafond d'au moins un des capillaires, et éventuellement à recouvrir ces molécules d'une couche d'un matériau de protection soluble.

Le procédé selon l'invention est plus simple à mettre en œuvre que les techniques actuellement utilisées et permet de fabriquer un réseau de capillaires d'une puce ou d'une bio-puce dans lequel les capillaires ne présentent pas de défauts et ont des dimensions précises et uniformes. Le procédé selon l'invention permet de fabriquer des réseaux de capillaires complexes pouvant accueillir un grand nombre de molécules chimiques ou biologiques fixées dans les capillaires (par exemple plusieurs milliers de sondes moléculaires différentes), la complexité du réseau de capillaires dépendant de l'application souhaitée.

Le réseau de capillaires obtenu par le procédé selon l'invention est formé entre une plaque inférieure dite de support formant les fonds des capillaires et une plaque supérieure dite de fermeture formant les plafonds des capillaires. Les parois latérales des capillaires sont formées d'une ou de plusieurs couches d'un matériau de construction fondu ou polymérisé sur la plaque de support au moyen d'un faisceau laser.

Dans la présente demande, l'expression paroi ou paroi latérale qualifie une cloison qui sépare le milieu contenu dans chaque capillaire, du milieu des autres capillaires et le cas échéant des autres éléments de la puce. En particulier, ladite paroi peut par exemple séparer deux capillaires adjacents, ou séparer un capillaire d'un bord de la puce. Les parois latérales qui délimitent un capillaire peuvent en outre être confondues avec ou séparées des parois latérales de capillaires adjacents.

Le matériau de construction utilisé dans le procédé selon l'invention doit s'entendre comme tout type de matériau qui peut être fondu ou alternativement tout type de matériau qui peut être polymérisé, au moyen d'un faisceau laser.

Dans le cas d'un matériau de construction fusible, le faisceau laser est utilisé pour chauffer le matériau et apporter l'énergie nécessaire à sa fusion. L'énergie nécessaire à la fusion du matériau de construction dépend de la température de fusion de ce matériau. Le matériau de construction fusible est préférentiellement choisi parmi des matériaux ayant une température de fusion relativement basse (et par exemple comprise entre 150 et 300 ⁰ C environ) pour limiter la consommation énergétique du laser et pour éviter d'abîmer par conduction thermique la plaque de support et/ou les éventuelles molécules fixées sur cette plaque. Dans le cas où la plaque de support résiste à de très fortes températures et est exempte de matériels biologiques, le matériau de construction peut avoir une température de fusion allant jusqu'à 1000 ⁰ C, voire plus.

En variante, le matériau de construction fusible est préchauffé à une température inférieure à sa température de fusion et le faisceau laser est utilisé pour apporter uniquement l'énergie nécessaire à sa fusion.

Dans la présente demande, le terme fusible qualifiera donc un composé qui peut être fondu par exposition à un faisceau laser.

La fusion du matériau de construction à l'aide d'un faisceau laser présente de nombreux avantages par rapport à la fusion de ce matériau en le disposant dans une enceinte chauffée telle qu'une étuve. Le recours au faisceau laser permet en effet de provoquer plus rapidement et plus précisément la fusion du matériau de construction grâce à la concentration d'une grande quantité d'énergie en un faisceau de faible section.

Dans le cas d'un matériau de construction polymérisable, le faisceau laser est utilisé pour amorcer ou initier la polymérisation du matériau. Le matériau de construction comprend dans ce cas des monomères d'au moins un type et des amorceurs photochimiques destinés à se décomposer et à amorcer la polymérisation du matériau lorsqu'ils sont exposés à un faisceau laser d'une longueur d'onde déterminée. Les amorceurs photochimiques peuvent par exemple se décomposer en radicaux libres par exposition à un faisceau laser et engendrer une polymérisation radicalaire du matériau de construction.

Dans la présente demande, le terme polymérisable qualifiera donc un composé dont la polymérisation peut être amorcée ou initiée par exposition à un faisceau laser.

La polymérisation du matériau de construction par amorçage au moyen d'un faisceau laser présente de nombreux avantages par rapport à la polymérisation par amorçage au moyen d'une autre source lumineuse, telle qu'une lampe quelconque par exemple. Le recours au faisceau laser permet en effet d'augmenter la profondeur de polymérisation dans la couche de matériau, d'augmenter le degré de polymérisation et de réduire le temps de polymérisation du matériau. D'autre part, il ne nécessite pas l'utilisation d'un masque opaque destiné à être posé sur la couche de

matériau et à laisser passer le rayonnement lumineux de la lampe aux endroits où la polymérisation doit avoir lieu. Par ailleurs, ce type de masque qui est long et coûteux à réaliser peut être posé seulement sur un matériau de construction sous forme de film et ne peut être utilisé sur un matériau de construction sous forme de gel ou de poudre.

De manière générale, le procédé selon l'invention consiste à former les parois latérales des capillaires du réseau au moyen d'un matériau de construction et de l'énergie apportée par un faisceau laser, cette énergie étant utilisé soit pour entraîner la fusion du matériau de construction si celui-ci est fusible, soit pour initier la polymérisation du matériau de construction si celui-ci est polymérisable.

L'étape a) du procédé selon l'invention consiste à déposer au moins une couche de matériau de construction sur la plaque de support.

On entend par couche de matériau une quantité de matériau suffisante pour recouvrir tout ou partie de la surface de la plaque de support formant les fonds des capillaires. Cette surface de la plaque de support peut donc être recouverte en totalité d'une couche de matériau de construction ou de deux ou plusieurs couches coplanaires, indépendantes ou non, de ce matériau. Dans un premier exemple de réalisation, la plaque de support est recouverte entièrement d'une couche de matériau de construction dans lequel seront formées les parois latérales des capillaires.

Dans un second exemple de réalisation, la plaque de support est recouverte de deux couches indépendantes coplanaires de matériau de construction, les parois latérales d'au moins un capillaire étant formées dans chacune des couches de matériau.

Dans un troisième exemple de réalisation, la plaque de support est recouverte de deux couches de matériau qui se rejoignent et en particulier se juxtaposent en au moins une région du support, les parois latérales d'au moins un capillaire étant formées dans chacune des couches de matériau et étant reliées, dans les régions précitées, aux parois latérales d'au moins

un capillaire formé dans l'autre couche de matériau, de façon à former une liaison fluidique entre ces capillaires.

L'étape b) du procédé selon l'invention consiste à focaliser et déplacer un faisceau laser sur des zones prédéterminées de la ou de chaque couche de matériau de construction de façon à former les parois latérales des capillaires par polymérisation ou par fusion du matériau dans ces zones.

Chacune de ces zones peut correspondre à tout ou partie d'une couche de matériau de construction. A titre d'exemple, lorsqu'une couche de matériau de construction recouvre entièrement une surface de la plaque de support, le faisceau laser peut être focalisé et déplacé sur des zones de cette couche bordant uniquement l'emplacement des futurs capillaires, ou sur des zones de la couche situées entre les emplacements des futurs capillaires, et entre ces emplacements et les bords de la plaque de support.

Dans le cas où deux ou plusieurs couches sont déposées sur une surface de la plaque de support, le faisceau laser peut également être focalisé et déplacé sur des zones de ces couches bordant uniquement l'emplacement des futurs capillaires ou sur des zones plus étendues. Si des couches de matériau sont déposées sur la plaque de support en dehors des emplacements des futurs capillaires, le faisceau laser peut être focalisé et déplacé sur l'intégralité de ces couches de matériau.

Le déplacement du faisceau laser peut par exemple être assuré au moyen de miroirs à commande galvanométrique ou piézo-électrique. Le laser utilisé est par exemple du type à impulsions et la dimension du point d'impact du faisceau laser a typiquement un diamètre inférieur à 50μm, et par exemple compris entre 20 et 30μm environ.

L'étape c) du procédé selon l'invention consiste à fixer la plaque de fermeture sur les parois latérales des capillaires, après leur durcissement. Le durcissement des parois latérales des capillaires doit s'entendre comme la fin de la polymérisation du matériau de construction polymérisé

ou le refroidissement jusqu'à température ambiante par exemple du matériau de construction fondu.

Les plaques de fermeture et de support peuvent être d'un même type ou de types différents. Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre, avant l'étape c), l'étape consistant à répéter une ou plusieurs fois les étapes a) et b) jusqu'à ce que les parois latérales des capillaires aient une hauteur prédéterminée.

La ou chaque couche de matériau de construction déposée à l'étape a) a une épaisseur comprise entre 1 et 2000μm environ et les capillaires ont typiquement une hauteur comprise entre 1 et 2000μm environ. La formation des parois des capillaires peut donc nécessiter le dépôt d'une ou de plusieurs couches de matériau de construction (une ou plusieurs étapes a)), chaque couche de matériau inférieure étant exposée au faisceau laser avant le dépôt d'une couche de matériau supérieure (c'est-à-dire, chaque étape a) est directement suivie d'une étape b)).

Le procédé selon l'invention peut comprendre également une étape consistant à retirer le matériau de construction non fondu ou non polymérisé, cette étape étant réalisée avant l'étape c) ou après chaque étape b, c'est-à-dire juste avant la fixation de la plaque de fermeture sur les parois des capillaires, ou après qu'une couche de matériau de construction ait été déposée sur la plaque de support et que des zones de cette couche aient été exposées au faisceau laser, et avant qu'une couche additionnelle soit superposée sur cette couche. Le retrait du matériau de construction non fondu ou non polymérisé peut être assuré par trempage de la plaque de support dans un bain approprié destiné à dissoudre ce matériau, par ablation laser, par prélèvement mécanique, par balayage au moyen d'un liquide ou d'un gaz sous pression pulvérisé sur la plaque de support, etc. Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre une étape consistant à fixer des molécules chimiques ou biologiques sur la plaque de

support, ces molécules pouvant être fixées dans les capillaires, avant l'étape c), ou au niveau des fonds des futurs capillaires, avant l'étape a).

La fixation, par exemple par couplage, de molécules chimiques ou biologiques sur la plaque de support est réalisée à l'aide de n'importe quelle méthode appropriée, et par exemple par polymérisation, électropolymérisation, ou synthèse in situ, par dépôt mécanique au moyen d'un système robotisé équipé par exemple d'aiguilles et/ou de pipettes du type piézo-électrique, etc.

D'une manière générale, tous les types de couplage, tels que les liaisons chimiques et les interactions fortes utilisées dans des colonnes de chromatographie peuvent éventuellement convenir. La fixation des molécules sur la plaque de support devra cependant être suffisamment forte pour résister aux différents traitements appliqués et aux éventuels champs électriques utilisés pour Ie déplacement d'autres molécules dans les capillaires, telles que des cibles moléculaires.

Les molécules chimiques ou biologiques sont par exemple choisies parmi des acides nucléiques notamment des molécules d'ADN (Acide DésoxyriboNucléique), d'ARN (Acide RiboNucléique), ou de PNA (Peptide Nucleic Acid), ou des composés mixtes ADN / PNA ou ARN / PNA, éventuellement marqués, des composés polypeptidiques, des ligands chimiques ou biologiques, des anticorps ou des fragments d'anticorps, etc.

Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre, après la fixation de molécules chimiques ou biologiques sur la plaque de support, et avant l'étape c), l'étape consistant à fixer des molécules chimiques ou biologiques sur la plaque de fermeture, au niveau des plafonds des futurs capillaires.

Les molécules fixées sur la plaque de support sont indépendantes des molécules fixées sur la plaque de fermeture mais peuvent toutefois interagir avec elles. En variante, des molécules peuvent être fixées sur la plaque de support par une de leurs extrémités, l'autre de leurs extrémités pouvant se

fixer sur ou du moins interagir avec la plaque de fermeture, une fois que celle-ci est fixée sur les parois latérales des capillaires.

Dans une autre variante, les molécules chimiques ou biologiques sont fixées uniquement sur la plaque de fermeture. Les molécules sont préférentiellement organisées en spots et sont régulièrement réparties les unes par rapport aux autres de manière à former une matrice de spots. Cette matrice est formée de p lignes de n spots ou de n colonnes de p spots, chaque ligne de spots étant située dans un capillaire du réseau et le nombre de lignes de spots correspondant au nombre de capillaires (ou chaque colonne de spots étant située dans un capillaire du réseau et le nombre de colonnes de spots correspondant au nombre de capillaires).

Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre, avant l'étape c), une étape consistant à remplir au moins un des capillaires d'une substance monolithique poreuse formant une phase stationnaire afin de former un capillaire de chromatographie.

Tout type de substance monolithique poreuse adaptée à la chromatographie peut convenir, le ou chaque capillaire de chromatographie pouvant être rempli par cette substance par polymérisation in situ ou par d'autres techniques appropriées.

Le procédé selon l'invention peut consister à l'étape c) à fixer de manière amovible, par exemple au moyen d'un film adhésif ou jointif (tel que du polydiméthyl siloxane - PDMS), la plaque de fermeture sur les parois latérales des capillaires, pour permettre l'ouverture et la fermeture à volonté du réseau de capillaires.

Selon un exemple particulier de réalisation de l'invention, le procédé consiste, à l'étape a), à déposer au moins une couche d'un matériau de construction polymérisable sous forme de gel ou de film sur la plaque de support, et à l'étape b), à focaliser et déplacer un faisceau laser sur des zones prédéterminées de la ou de chaque couche de matériau de

construction pour entraîner la polymérisation du matériau dans ces zones, de façon à former les parois latérales des capillaires.

Ce procédé peut en outre consister, avant l'étape a) et/ou c), à fixer des molécules chimiques ou biologiques sur la plaque de support et/ou sur Ia plaque de fermeture, au niveau du fond et/ou du plafond d'au moins un des capillaires, et éventuellement à recouvrir ces molécules d'une couche d'un matériau de protection soluble.

La ou chaque couche de matériau de construction sous forme de gel ou de film est déposée sur la plaque de support par n'importe quelle technique appropriée et par exemple par un système robotisé.

La polymérisation de ce type de matériau permet d'obtenir des parois de capillaires imperméables, étanches et lisses.

Les films photo-imageables tels que ceux commercialisés par la société DuPont sous l'appellation VACREL® ou RISTON® sont particulièrement adaptés à la fabrication d'un réseau de capillaires par le procédé selon l'invention. La polymérisation de ce type de film est amorcée par exposition à un rayonnement visible. Le procédé selon l'invention consiste donc à utiliser, à l'étape b), un laser émettant un faisceau de lumière visible (longueur d'onde de l'ordre de 532nm environ). Après la fin de la polymérisation du matériau de construction et le durcissement des parois latérales des capillaires, le matériau de construction non polymérisé peut être retiré de la plaque de support. Dans le cas où la plaque de support est recouverte entièrement d'une couche de matériau de construction, le retrait du matériau de construction non polymérisé de la plaque de support est nécessaire pour faire apparaître les capillaires.

Les étapes a) et b) peuvent être répétées une ou plusieurs fois si nécessaire avant la fixation de la plaque de fermeture sur les parois latérales des capillaires, prévue à l'étape c). Le procédé selon l'invention peut comprendre également une étape consistant à retirer le matériau de construction non fondu ou non

polymérisé, cette étape étant réalisée avant l'étape c) ou après chaque étape b.

Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre, avant l'étape c), une étape consistant à remplir au moins un des capillaires d'une substance monolithique poreuse formant une phase stationnaire afin de former un capillaire de chromatographie.

Le procédé selon l'invention peut consister, à l'étape c), à fixer de manière amovible, par exemple au moyen d'un film adhésif ou jointif, la plaque de fermeture sur les parois latérales des capillaires, pour permettre l'ouverture et la fermeture à volonté du réseau de capillaires.

Le procédé selon l'invention peut consister, à l'étape c), à : Ci) recouvrir les parois latérales des capillaires d'un film de matière à faible température de fusion, après leur durcissement, C ₅ ) poser la plaque de fermeture sur le film de matière, et c ₆ ) focaliser et déplacer un faisceau laser au niveau des parois latérales des capillaires pour entraîner la fusion du film au niveau de ces parois de façon à fixer par collage la plaque de fermeture sur les parois latérales des capillaires.

Le film de matière, qui est par exemple un film de paraffine ou d'un copolymère EVA (Ethylène - Acétate de vinyle) de 1 à 2μm environ d'épaisseur, est fondu localement par exposition à un faisceau laser et permet de fixer par collage la plaque de fermeture sur les parois latérales des capillaires. Le collage de la plaque de fermeture au moyen d'un film de matière fusible est avantageux par rapport à l'utilisation d'une colle liquide ou sous forme de gel car cette dernière a tendance à pénétrer dans les capillaires et à les boucher.

Avantageusement, ce procédé consiste à fixer de manière amovible la plaque de fermeture sur les parois latérales des capillaires pour permettre l'ouverture et la fermeture à volonté du réseau de capillaires. La plaque de fermeture peut être détachée manuellement ou par un outil approprié du réseau de capillaires et être à nouveau fixée sur les parois

latérales des capillaires par fusion d'un autre film de matière fusible déposé sur les parois des capillaires ou du film de matière préalablement utilisé, à condition que celui-ci puisse être fondu plusieurs fois sans se dégrader.

Le laser utilisé pour amener l'énergie nécessaire à la fusion du film de matière peut être du même type ou d'un type différent de celui utilisé pour provoquer la polymérisation du matériau de construction (qui peut lui- même être sous forme de film).

Le film de matière a une faible température de fusion c'est à dire une température de fusion suffisamment faible pour ne pas dégrader par conduction thermique les parois latérales des capillaires. La température de fusion d'un film de copolymère EVA (Ethylène - Acétate de vinyle) est de 176°C environ.

Le faisceau laser est focalisé et déplacé au niveau des parois des capillaires et passe à travers la plaque de fermeture qui est choisie pour être transparente à la longueur d'onde de ce faisceau laser.

La fusion du film de matière peut se faire par points ou en continu le long des parois des capillaires, le laser utilisé pour entraîner la fusion du film de matière étant par exemple du type à impulsions.

Dans le cas où le film de matière recouvre également les capillaires et les obture, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre, après l'étape Ci) précitée, l'étape consistant à :

C ₂ ) focaliser et déplacer un faisceau laser le long des capillaires pour rouvrir les capillaires par suppression du film de matière au niveau des plafonds des capillaires. Cette étape peut par exemple être nécessaire pour éviter toute interaction entre le film de matière et les molécules chimiques ou biologiques fixées dans les capillaires sur la plaque de support, et/ou d'autres molécules circulant dans les capillaires. Elle peut également être nécessaire pour éviter que le film de matière recouvre des électrodes de plaque de fermeture et perturbe l'application d'un champ électrique dans le réseau de capillaires.

Les capillaires qui ont été recouverts et obturés par le film de matière fusible doivent également être rouverts pour pouvoir fixer des molécules chimiques ou biologiques dans les capillaires, comme décrit précédemment. Le laser utilisé pour supprimer le film de matière peut être du même type que celui utilisé pour entraîner la fusion de ce film, le faisceau laser étant alors focalisé au milieu de chaque capillaire et déplacé le long de ce capillaire pour entraîner la fusion du film de matière et la rétractation du film fondu sur les bords longitudinaux extérieurs des capillaires. La suppression du film de matière peut alternativement être provoquée par ablation laser c'est à dire par sublimation du film de matière au moyen d'un laser approprié.

Le procédé selon l'invention peut également comprendre, après l'étape c-i) ou l'étape C ₂ ) et avant l'étape C ₅ ), les étapes consistant à : C ₃ ) fixer des molécules chimiques et/ou biologiques sur la plaque de support, dans les capillaires, et

C ₄ ) recouvrir ces molécules d'une couche d'un matériau de protection soluble.

Le matériau de protection est destiné à recouvrir les molécules dans les capillaires et à les protéger contre toute agression physique, chimique ou thermique et notamment contre le rayonnement et la chaleur provoqués par la focalisation du faisceau laser au niveau des parois latérales des capillaires pour la fixation par collage de la plaque de fermeture sur les parois des capillaires. Les capillaires peuvent être entièrement ou partiellement remplis de ce matériau de protection.

Dans la présente demande, on entend par soluble un composé qui peut être dissous dans un solvant, ce solvant étant compatible avec l'utilisation du matériel biologique ou chimique des molécules contenues dans les capillaires. Une fois la plaque de fermeture fixée sur les parois des capillaires, le matériau de protection pourra être utilisé comme milieu de diffusion de

molécules dans les capillaires, et/ou être retiré des capillaires par dissolution dans un solvant approprié injecté dans les capillaires par des canaux ou des pores formés dans la plaque de support et/ou la plaque de fermeture, et évacué du réseau de capillaires par ces mêmes canaux ou pores.

Les canaux ou pores formés dans la plaque de support et/ou la plaque de fermeture peuvent déboucher directement dans les capillaires ou dans des réservoirs reliés aux capillaires.

A titre d'exemple, un gel de polyacrylamide ou d'agarose peut être utilisé comme matériau de protection et être conservé dans les capillaires après leur fermeture car ce type de gel est particulièrement adapté à la régulation et au contrôle de la diffusion de molécules dans les capillaires lors de leur migration par simple diffusion ou par application d'un champ électrique dans le cas d'une électrophorèse. En variante ou en caractéristique additionnelle, les molécules chimiques ou biologiques fixées sur la plaque de support sont protégées au moyen d'un masque de photolithographie posé sur la plaque de fermeture, entre les étapes C ₅ ) et C ₆ ) précités, ce masque ayant la forme du réseau de capillaires et étant destiné à former un écran opaque au faisceau laser utilisé pour entraîner la fusion du film de matière à travers la plaque de fermeture. Ce masque peut être réalisé directement sur la plaque de fermeture par fusion au moyen d'un faisceau laser d'une poudre appropriée, telle qu'une poudre noire de toner d'imprimante, comme précédemment décrit. La poudre non fondue peut ensuite être retirée de la plaque de fermeture à l'aide d'un jet d'air comprimé.

Selon un autre exemple particulier de réalisation de l'invention, le procédé selon l'invention consiste, à l'étape a), à déposer au moins une couche d'un matériau de construction fusible, sous forme de poudre, sur la plaque de support, et à l'étape b), à focaliser et déplacer un faisceau laser sur des zones prédéterminées de la ou de chaque couche de matériau de

construction pour entraîner la fusion du matériau dans ces zones de façon à former les parois latérales des capillaires.

La ou chaque couche de matériau de construction sous forme pulvérulente est déposée sur la plaque de support par n'importe quelle technique appropriée et par exemple par un système robotisé.

En variante, la poudre de matériau de construction est chargée électrostatiquement et la plaque de support comporte des électrodes au niveau des emplacements des parois latérales des futurs capillaires qui sont destinées à former un champ électrostatique de charge opposée à celle de la poudre pour la maintenir sur la plaque de support. L'étape a) consiste alors à déposer une couche de poudre sur une surface de la plaque de support, dans son intégralité, puis à retirer par simple balayage, au moyen d'un jet d'air comprimé par exemple, la poudre qui n'est pas retenue sur la plaque de support par interaction électrostatique. Lorsque la poudre de matériau de construction est chargée électrostatiquement, elle peut également être déposée sur la plaque de support au niveau des emplacements des parois latérales des capillaires par l'intermédiaire d'un tambour ou d'un élément plan photoconducteur. La surface à traiter de cet élément est balayée par un faisceau laser destiné à former des charges électrostatiques aux emplacements des parois latérales des futurs capillaires. Une couche de poudre de charge opposée à celle de la surface traitée de l'élément est déposée sur cette surface et est retenue sur celle-ci aux endroits où des charges électrostatiques ont été formées. Cette couche de poudre est ensuite appliquée sur la plaque de support et transférée sur celle-ci par formation d'un champ électrostatique sur la plaque de support comme décrit ci-dessus.

Le matériau de construction fusible peut être organique, métallique, ou peut être un matériau plastique ou céramique. La taille des grains de la poudre de matériau de construction est relativement homogène et est préférentiellement comprise entre 0,1 et 20μm environ et par exemple entre

0,5 et 10μm environ. La fusion d'une telle poudre permet d'obtenir des parois de capillaires imperméables, étanches et relativement lisses.

La longueur d'onde du laser est choisie pour l'accorder sur la bande d'absorption du matériau de construction et est par exemple située dans l'Infra-Rouge (IR : 0,75 à 300μm), le visible (400 à 800nm) ou l'Ultra-Violet (UV : 190 à 400nm).

On peut par exemple utiliser comme matériau organique fusible : un sucre en poudre (le laser étant utilisé pour entraîner la fusion et/ou la carbonisation du sucre) ; comme matériau plastique fusible : une poudre de polyméthylméthacrylate, de polychlorure de vinyle, de polyéthylène, d'un polyuréthane, d'un copolymère EVA (Ethylène - Acétate de vinyle), d'un copolymère ABS (Acrylonitrile - Butadiène - Styrène), etc ; et comme matériau céramique fusible : une poudre d'alumine.

Le procédé selon l'invention permet également de réaliser les parois latérales des capillaires du réseau en métal. La formation des parois latérales des capillaires par fusion d'une feuille de métal au moyen d'un laser nécessite une grande quantité d'énergie et génère des températures importantes susceptibles de dégrader par conduction thermique la plaque de support sur laquelle est déposée la feuille métallique, et également d'éventuelles électrodes greffées ou déposées sur cette plaque. Au contraire, la fusion par laser d'une poudre métallique, telle qu'une poudre d'un alliage de titane, ne nécessite pas un apport énergétique trop important par le laser et présente moins de risque de dégradation de la plaque de support ou de ses électrodes. Dans le cas où les parois des capillaires sont formées par fusion d'une poudre métallique sur une plaque de support comportant des électrodes, le procédé peut comprendre une étape supplémentaire consistant à recouvrir la plaque de support (voire également la plaque de fermeture si celle-ci comprend également des électrodes) d'un film d'un matériau électriquement isolant destiné à isoler électriquement les électrodes des parois des capillaires. Ce film est par exemple à base d'un

copolymère EVA et/ou d'un polyimide tel que le Kapton® qui peut être supprimé au niveau des fonds et des plafonds des capillaires comme précédemment décrit pour la suppression du film de matière. Il est par ailleurs nécessaire que ce film supporte sans se dégrader la température de fusion de la poudre de matériau de construction qui sera déposée sur lui à l'étape a).

Les étapes a) et b) peuvent être répétées une ou plusieurs fois si nécessaire avant la fixation de la plaque de fermeture sur les parois latérales des capillaires, prévue à l'étape c). Le procédé selon l'invention peut comprendre également une étape consistant à retirer le matériau de construction non fondu ou non polymérisé, cette étape étant réalisée avant l'étape c) ou après chaque étape b.

Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre, avant l'étape c), une étape consistant à remplir au moins un des capillaires d'une substance monolithique poreuse formant une phase stationnaire afin de former un capillaire de chromatographie.

Le procédé selon l'invention peut consister, à l'étape c), à fixer de manière amovible, par exemple au moyen d'un film adhésif ou jointif, la plaque de fermeture sur les parois latérales des capillaires, pour permettre l'ouverture et la fermeture à volonté du réseau de capillaires.

Le procédé selon l'invention comprend avantageusement une étape additionnelle consistant à préchauffer le matériau de construction fusible avant son dépôt sur la plaque de support ou avant son exposition au faisceau laser, de façon à limiter la consommation énergétique du laser et à diminuer le risque de dégradation thermique de la plaque de support.

A titre d'exemple, une poudre de polyéthylène dont la taille des grains est comprise entre 1 et 10μm (et est par exemple de 3μm environ) a une température de fusion de 490 ⁰ C environ et est préchauffée à une température de 190 ⁰ C avant d'être déposée sur la plaque de support et fondue par laser, le laser étant utilisé pour élever la température de la

poudre de 300 ⁰ C, c'est-à-dire de 190 ⁰ C jusqu'à sa température de fusion (490 ⁰ C).

Après le durcissement des parois latérales des capillaires, le matériau de construction non fondu peut être retiré de la plaque de support. Dans le cas où la plaque de support est recouverte entièrement d'une couche de matériau de construction, le retrait du matériau de construction non fondu de la plaque de support est nécessaire pour faire apparaître les capillaires.

Les étapes a) et b) peuvent être répétées une ou plusieurs fois si nécessaire, avant la fixation de la plaque de fermeture sur les parois latérales des capillaires.

Ce procédé peut comprendre en outre, avant l'étape c), les étapes consistant à fixer des molécules chimiques et/ou biologiques sur la plaque de support et/ou sur la plaque de fermeture, dans les capillaires, puis à recouvrir ces molécules d'une couche d'un matériau de protection soluble. La description faite ci-dessus et dans les exemples, de l'étape d'utilisation d'un matériau de protection est applicable à l'identique dans le présent mode de réalisation de l'invention.

Comme précédemment décrit, le matériau de protection est destiné à recouvrir les molécules et à les protéger notamment contre le rayonnement et la chaleur provoqués par la focalisation du faisceau laser au niveau des capillaires pour le collage de la plaque de fermeture sur les parois des capillaires. Le matériau de protection peut être un gel de poiyacrylamide ou d'agarose. Il peut également être un sucre ou de l'EDTA, sous forme de poudre ou de gel.

Le procédé peut comprendre en outre, avant l'étape a), les étapes consistant à fixer des molécules chimiques ou biologiques sur la plaque de support, au niveau des fonds des futurs capillaires, puis à recouvrir ces molécules d'une couche d'un matériau de protection soluble. A la différence de certains autres exemples de réalisation précédemment décrits, lorsque les molécules sont fixées sur la plaque de

support avant la formation des parois des capillaires, elles doivent être protégées pour éviter leur dégradation notamment pendant les étapes de dépôt et de fusion du matériau de construction sur la plaque de support.

Pour cela, les molécules peuvent être recouvertes d'une couche de matériau de protection soluble. Le dépôt de ce matériau de protection peut être fait au moyen d'un moule ou d'un masque de forme prédéterminée permettant l'accès aux molécules, préalablement positionné sur la plaque de support. Le masque ou le moule est réalisé dans un matériau approprié et par exemple en un plastique quelconque tel qu'un polyimide (Kapton®, etc.).

Dans le cas de l'utilisation d'un masque, celui-ci est positionné sur la plaque de support et comprend des interstices ou des lumières dans des zones correspondants aux endroits de la plaque de support où une couche de matériau de protection doit être déposée, c'est-à-dire les endroits de la plaque où des molécules sont fixées. Une couche de matériau de protection est alors déposée sur ce masque et une partie de cette couche passe à travers les lumières ou les interstices du masque et vient recouvrir les molécules fixées sur la plaque de support. Le masque peut ensuite être retiré. Le masque peut également être posé et fixé à demeure sur la plaque de support, l'étape a) consistant alors à déposer au moins une couche de matériau de construction sur le masque. Ce masque peut être formé d'une plaque de Kapton® qui est recouverte sur au moins une de ses faces d'une couche d'un copolymère EVA pour sa fixation par collage au moyen d'un laser sur la paque de support, comme précédemment décrit. Les lumières ou les interstices du masque peuvent être préalablement réalisés par découpe laser et peuvent former un réseau de capillaires indépendant destiné à être relié de manière fluidique au réseau de capillaires formé par fusion ou polymérisation du matériau de construction déposé sur le masque, comme cela sera décrit plus en détail dans ce qui suit.

Dans le cas de l'utilisation d'un moule, celui-ci comprend une surface plane destinée à être mise en contact avec la surface de la plaque de support sur laquelle sont fixées des molécules, et comprenant des rainures ou des évidements dans des zones correspondant aux endroits de la plaque de support où une couche de matériau de protection doit être déposée. Les rainures ou les évidements du moule sont remplis de matériau de protection puis la surface du moule présentant ces évidements est mise en contact avec la surface de la plaque de support sur laquelle sont fixées les molécules, pour recouvrir les molécules d'une couche de matériau de protection. Le moule peut ensuite être retiré de la plaque de support.

Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre une étape consistant à retirer par ablation laser ou par toute autre technique appropriée le surplus de matériau de protection qui ne recouvre pas des molécules chimiques ou biologiques.

Le surplus de matériau de protection s'entend comme une quantité de matériau qui ne recouvre pas des molécules chimiques ou biologiques et qui n'est donc pas nécessaire, ou qui est susceptible de gêner ou d'empêcher la formation des parois latérales des capillaires. La longueur d'onde du faisceau laser est déterminée pour ablater le matériau de protection sans risque de dégradation de la plaque de support, ni d'éventuelles électrodes de la plaque.

Cette étape peut suivre l'étape précitée de dépôt d'une couche de matériau de protection à l'aide d'un moule ou d'un masque approprié, ou une autre étape de dépôt d'une couche de matériau de protection par exemple à l'aide d'un système robotisé.

Lorsque le matériau de protection est fusible, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre une étape consistant à focaliser et déplacer un faisceau laser sur tout ou partie de la couche de matériau de protection pour entraîner sa fusion. La fusion puis le durcissement par

refroidissement du matériau de protection permet de protéger de manière stable et efficace les molécules fixées sur la plaque de support.

Le surplus de ce matériau fondu peut éventuellement être retiré par ablation laser, comme précédemment décrit. Dans le cas où l'indice de réfraction et la couleur du matériau de protection fusible sont proches de ceux de la plaque de support, le matériau de protection peut être mélangé à un colorant pour décaler son absorption lumineuse vers une longueur d'onde prédéterminée et ainsi éviter à la plaque de support d'absorber une partie de la lumière émise par le laser.

De préférence, le matériau de protection est dans ce cas sous forme de poudre ou de gel et est par exemple un sucre ou de l'EDTA (acide éthylènediaminotétraacétique), qui sont très hydrophiles et compatibles avec du matériel biologique ou chimique. La taille des grains de la poudre de matériau de protection ne doit pas nécessairement être homogène et est par exemple comprise entre 1 et 10μm environ.

En variante, le matériau de protection est polymérisabie et un faisceau laser est focalisé et déplacé sur tout ou partie de la couche de matériau de protection pour entraîner sa polymérisation. La polymérisation du matériau de protection peut également être provoquée par application d'un champ électrique par l'intermédiaire d'électrodes présentes dans la plaque de support. Le matériau de protection peut dans ce cas être à base de pyrole.

Dans encore une autre variante, le procédé consiste à dissoudre le matériau de protection dans un solvant approprié qui est ensuite déposé sur la plaque de support au niveau des molécules. Une étape supplémentaire d'évaporation naturelle ou forcée du solvant assure le séchage et le durcissement du matériau de protection.

L'avantage d'un matériau de protection qui a durci par refroidissement, par polymérisation ou par évaporation est qu'il peut être

utilisé comme moule pour le dépôt du matériau de construction prévu à l'étape a).

Le procédé selon l'invention peut consister, à l'étape c), à : c-i ) déposer une autre couche de matériau de construction fusible sur les parois des capillaires, après leur durcissement,

C ₂ ) poser la plaque de fermeture sur cette couche, et

C ₃ ) focaliser et déplacer un faisceau laser au niveau des parois latérales des capillaires pour entraîner la fusion de la couche au niveau de ces parois de façon à fixer par collage la plaque de fermeture sur les parois latérales des capillaires.

L'épaisseur de la couche de matériau de construction déposée sur les parois des capillaires est par exemple comprise entre 1 et 2μm environ. Une fois la plaque de fermeture fixée sur les parois des capillaires, le matériau de protection pourra être conservé dans les capillaires, comme décrit précédemment, et/ou être retiré des capillaires par dissolution de la couche de matériau de protection dans un solvant approprié, par exemple de l'eau, injecté dans les capillaires à travers des canaux ou des pores formés dans la plaque de support et/ou la plaque de fermeture, et évacué des capillaires par ces canaux ou ces pores. La plaque de fermeture peut éventuellement être fixée de manière amovible sur les parois latérales des capillaires, comme décrit ci-dessus.

La présente invention concerne également une puce comprenant un réseau de capillaires, caractérisée en ce qu'elle comprend une plaque de support et une plaque de fermeture sensiblement parallèles entre elles et entre lesquelles s'étendent les parois latérales des capillaires formées par fusion ou polymérisation d'un matériau de construction au moyen d'un laser, la plaque de fermeture étant fixée sur les parois latérales des capillaires par l'intermédiaire d'une couche d'adhésion.

Cette couche d'adhésion peut être formée par un film adhésif ou jointif, ou par fusion ou polymérisation au moyen d'un laser d'un matériau

sous forme de film ou de poudre. Avantageusement, la plaque de fermeture est fixée de manière amovible sur les parois latérales des capillaires.

Les plaques de support et de fermeture de la puce sont préférentiellement réalisées dans des matériaux compatibles avec du matériel biologique ou chimique et comprennent par exemple une lame de verre, de quartz, de plastique ou de tout autre matériau approprié.

Le matériau de la plaque de fermeture peut par ailleurs être choisi pour être transparent à au moins une longueur d'onde du faisceau laser qui est utilisé pour entraîner la fusion ou la polymérisation du matériau destiné à former la couche d'adhésion.

Ces plaques peuvent comprendre des électrodes, par exemple gravées ou déposées en couche mince sur la lame, et séparées les unes des autres par des éléments diélectriques, par exemple en silice (Siθ ₂ ). La gravure d'électrodes sur une lame consiste par exemple à déposer une feuille métallique sur la lame et à réaliser une gravure du type lithographique, photolithographique, ou par ablation laser de cette feuille.

Les électrodes de la puce permettent d'appliquer un champ électrique dans le réseau de capillaires et de faire migrer par électrophorèse des molécules chargées d'un point à un autre du réseau. Elles peuvent également servir à confiner des molécules dans une région du réseau de capillaires, à mesurer des variations d'impédance, etc.

Les électrodes sont par exemple réalisées en or ou dans un alliage d'oxyde d'étain ou de zinc tel que : ITO (Indium Tin Oxyde), ATO (Antimony Tin Oxyde), FTO (Fluorine Tin Oxyde), ZnO (Zinc Oxyde). Chacune des plaques, parmi les plaques de support et de fermeture, peut être recouverte d'un film d'un matériau électriquement isolant destiné à isoler électriquement les électrodes des parois des capillaires qui peuvent être métalliques.

Dans le cadre de l'analyse d'un mélange de cibles moléculaires par exemple, au moins une des plaques peut être recouverte d'un film facilitant la fixation par dépôt mécanique ou par polymérisation in situ de molécules

chimiques ou biologiques, telles que des sondes moléculaires destinées à s'hybrider avec les cibles moléculaires et à former des complexes sonde- cible lorsque le mélange est amené au contact des sondes. Ce film peut également recouvrir les électrodes précitées afin d'éliminer les risques de réaction d'oxydo-réduction aux électrodes.

Des molécules chimiques ou biologiques peuvent être fixées dans au moins un des capillaires, sur la plaque de support et/ou sur la plaque de fermeture.

A titre d'exemple, la ou chacune des plaques de la puce peut être recouverte d'un film de polyimide facilitant la fixation de molécules biologiques ou chimiques.

Au moins une des plaques peut comprendre une pluralité de molécules chimiques ou biologiques organisées en spots et régulièrement réparties les unes par rapport aux autres pour former une matrice de spots. Les capillaires de la puce ont typiquement une hauteur et une largeur comprises entre 1 et 2000μm environ. Dans un exemple particulier de réalisation, les capillaires sont à section carrée et ont une hauteur et une largeur de 100μm environ.

La réseau de capillaires de la puce peut être relié à au moins un réservoir dont les parois latérales s'étendent entre les plaques de support et de fermeture de la puce. Les parois latérales du ou de chaque réservoir peuvent être formées par le procédé selon l'invention.

Dans un exemple de réalisation, les capillaires s'étendent sensiblement parallèlement les uns par rapport aux autres et sont reliés à chacune de leurs extrémités à un réservoir. Ces réservoirs peuvent par exemple être reliés à des moyens d'injection et d'évacuation d'un mélange de cible moléculaires dans le réseau de capillaires.

Le réseau de capillaires de la puce peut par exemple comprendre au moins un capillaire de chromatographie rempli d'une substance monolithique poreuse formant une phase stationnaire, et au moins un

capillaire d'électrophorèse relié sensiblement perpendiculairement au capillaire de chromatographie.

La réseau de capillaires de la puce est préférentiellement relié à au moins une chambre d'analyse par effet LIBS (Laser Induced Breackdown Spectroscopy) dont les parois latérales s'étendent entre les plaques de support et de fermeture de la puce. Les parois latérales du ou de chaque chambre d'analyse peuvent être formées par le procédé selon l'invention.

L'analyse par effet LIBS est une technique d'analyse par spectroscopie d'émission optique sur plasma produit par laser et consiste à focaliser un faisceau laser, par exemple du type à impulsions, sur une surface d'un échantillon à analyser de manière à produire un plasma constitué des éléments particuliers de l'échantillon. Ce plasma émet un rayonnement lumineux et l'analyse des raies atomiques et ioniques de ce rayonnement permet de connaître les concentrations respectives des différents éléments constitutifs de l'échantillon.

La présente invention concerne enfin un dispositif d'analyse par effet LIBS comprenant une puce telle que décrite ci-dessus, des moyens d'émission d'un faisceau laser sur une surface de l'échantillon contenu dans une chambre d'analyse de la puce à travers une paroi transparente de celle-ci, pour provoquer la formation et l'expansion d'un plasma dans la chambre, et des moyens de détection et d'analyse spectrométrique de la lumière émise par le plasma à travers la paroi transparente de la chambre, cette paroi transparente étant par exemple une lentille en quartz.

Le dispositif selon l'invention comprend préférentiellement des moyens d'injection d'un gaz dans la chambre, ce gaz étant avantageusement de l'argon ou de l'azote ce qui permet en outre d'augmenter le signal d'émission optique du plasma.

L'invention sera mieux comprise et d'autres détails, caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif en référence aux dessins annexés dans lesquels :

- la figure 1 est une vue schématique en perspective éclatée de la puce selon l'invention ;

- la figure 2 est une vue en coupe selon la ligne H-Il de la figure 1 ;

- les figures 3 à 10 sont des vues schématiques en perspective illustrant des étapes d'un exemple de réalisation du procédé selon l'invention de fabrication d'un réseau de capillaires d'une puce ;

- les figures 11 à 17 sont des vues schématiques en perspective illustrant des étapes d'une variante de réalisation du procédé selon l'invention ;

- la figure 18 représente très schématiquement un mode de réalisation d'un réseau de capillaires de chromatographie et d'électrophorèse d'une puce ;

- la figure 19 est une vue à plus grande échelle d'une partie de la figure 18.

La puce 10 selon l'invention représentée schématiquement en figures 1 et 2 a une forme parallélépipédique et comprend un réseau de capillaires 12 formé entre une plaque inférieure 14 dite de support et une plaque supérieure 16 dite de fermeture formant respectivement les fonds et les plafonds des capillaires 12. Les plaques 14 et 16 s'étendent sensiblement parallèlement l'une par rapport à l'autre.

Les capillaires 12 sont séparés les uns des autres et sont séparés des bords de la puce 10 par des parois 18 qui s'étendent sensiblement perpendiculairement aux plaques 14 et 16 et qui sont formées directement sur la plaque de support 14 par polymérisation ou par fusion provoquée par laser d'au moins une couche d'un matériau de construction déposée sur la plaque 14, comme cela sera décrit plus en détail dans ce qui suit.

La formation des parois latérales 18 des capillaires par fusion ou polymérisation du matériau de construction directement sur la plaque de support 14 permet de fixer par simple adhérence ou ancrage les parois 18 des capillaires sur la plaque 14, après leur durcissement.

La plaque de fermeture 16 est quant à elle fixée sur les parois 18 des capillaires par l'intermédiaire d'une couche d'adhésion 20 qui est formée par un film adhésif ou jointif, ou à partir d'un matériau sous forme de poudre ou de film qui est fondu ou polymérisé par laser de façon à faire

adhérer la plaque de fermeture 16 sur les parois 18 des capillaires.

Dans l'exemple représenté, les capillaires 12 sont au nombre de quatre et s'étendent sensiblement parallèlement entre eux entre deux réservoirs cylindriques 22 formés entre les plaques 14 et 16, la plaque 14 formant les fonds des réservoirs et la plaque 16 formant les plafonds des réservoirs. Les parois latérales 18 des réservoirs 22 sont formées de la même manière et en même temps que les parois latérales 18 des capillaires 12, comme cela sera décrit également plus en détail dans ce qui suit. Les réservoirs 22 sont par exemple reliés à des moyens d'alimentation ou d'injection d'un mélange de cibles moléculaires dans le réseau de capillaires et à des moyens de détection par exemple par spectrométrie de masse.

Les plaques de support 14 et de fermeture 16 sont réalisées dans des matériaux compatibles avec du matériel chimique ou biologique et comprennent chacune une lame 24 en matériau diélectrique tel que du verre, du quartz, de la silice, un plastique, etc., sur la surface venant en contact (direct ou indirect) des capillaires de laquelle sont gravées ou déposées en couche mince par une technique appropriée des électrodes 26, 28, 30.

Ces électrodes 26, 28, 30 peuvent par exemple servir à appliquer un champ électrique dans les capillaires 12 du réseau de façon à faire migrer par électrophorèse des molécules chargées d'un point à un autre du réseau, à confiner des molécules dans une région du réseau de capillaires, à mesurer des variations d'impédance, etc.

Ces électrodes sont par exemple réalisées en or ou dans un alliage d'oxyde d'étain ou de zinc tel que : ITO (Indium Tin Oxyde), ATO (Antimony Tin Oxyde), FTO (Fluorine Tin Oxyde), ZnO (Zinc Oxyde), et sont séparées les unes des autres par des éléments diélectriques (non représentés) par exemple en silice.

Dans l'exemple représenté, chaque plaque 14, 16 comprend quatre électrodes rectilignes parallèles 26 gravées ou déposées sur une partie médiane de la plaque 14, 16, ces électrodes 26 étant destinées à s'étendre sensiblement perpendiculairement aux capillaires 12 de la puce. Chaque plaque 14, 16 comprend également deux paires d'électrodes 28, 30 gravées ou déposées sur des parties d'extrémités de la plaque 14, 16, chacune de ces paires d'électrodes comportant une électrode circulaire 28 destinée à être située sensiblement au centre du fond ou du plafond d'un réservoir 22, et une électrode courbe 30 située entre l'électrode circulaire 28 et les électrodes rectilignes 26 et destinée à s'étendre autour d'une partie du réservoir.

Les électrodes 26, 28, 30 sont reliées au niveau d'un bord de la plaque 14 ou 16 à des moyens appropriés tels que des moyens de génération d'un courant électrique, des moyens de mesure d'impédance, etc.

Chaque plaque 14, 16 comprend également un film 32 facilitant la fixation par dépôt mécanique ou par polymérisation in situ de molécules chimiques ou biologiques 34 dans les capillaires de la plaque, ce film recouvrant les électrodes 26, 28, 30 et étant destiné à former les fonds ou les plafonds des capillaires 12 et des réservoirs 22.

Les molécules 34 peuvent être fixées dans les capillaires sur l'une ou l'autre des plaques 14, 16, voire les deux. La fixation des molécules chimiques ou biologiques dans les capillaires peut être effectuée selon le cas au niveau des électrodes 26 ou entre celles-ci. Les plaques 14, 16 ont typiquement une épaisseur de lOOOμm environ, et les parois des capillaires 12 et des réservoirs 22 ont par exemple une épaisseur comprise entre 1 et 2000μm environ, et par exemple de 100μm environ. Les capillaires sont à section carrée ou rectangulaire. On a représenté aux figures 3 à 10 des étapes d'un premier exemple de réalisation du procédé selon l'invention de fabrication d'un réseau de

capillaires d'une puce, ce procédé consistant notamment à former les parois latérales des capillaires 12 et des réservoirs 22 de la puce par polymérisation d'au moins une couche d'un matériau de construction se présentant sous forme de gel ou de film déposé sur une plaque de support 14.

Dans la première étape du procédé représentée en figure 4, un film photo-imageable 50 du type VACREL® ou RISTON® de 75 à 150μm environ d'épaisseur est déposée sur une surface de la plaque de support 14 par une technique appropriée et par exemple manuellement ou par un système robotisé, le film recouvrant la totalité de cette surface.

La seconde étape du procédé selon l'invention consiste à focaliser et déplacer un faisceau laser 52 sur des zones prédéterminées 54 du film 50 pour entraîner la polymérisation du film dans ces zones de façon à former les parois latérales des capillaires 12 et des réservoirs 22. Le faisceau laser 52 est émis par un générateur laser (non représenté) sur une longueur d'onde de 532nm environ (visible) et est par exemple du type à impulsions, avec une fréquence de répétition de 10 à 5OkHz environ et une puissance de 1 à 10Watts environ. La dimension du point d'impact du faisceau laser sur le film 50 est typiquement de l'ordre de 20 à 30μm en diamètre.

Le faisceau laser 52 est déplacé sur les zones 54 du film 50 au moyen de miroirs à commande galvanométrique ou piézo-électrique, ces zones étant schématiquement représentées en figure 4 par les parties du film qui sont situées en dehors des lignes en traits pointillés et des parties hachurées.

Après le durcissement des parois 18 des capillaires et des réservoirs, le procédé consiste dans une troisième étape à tremper la plaque de support dans un bain contenant de la soude à 0,1 mol. L ^"1 de façon à dissoudre le matériau du film 50 non polymérisé et à faire apparaître les capillaires 12 et les réservoirs 22 (figure 5). Les capillaires et les réservoirs sont formés aux endroits du film 50 qui n'ont pas été exposés

au faisceau laser 52 c'est-à-dire les endroits correspondants aux lignes en traits pointillés et aux parties hachurées de la figure 4.

Dans une autre étape du procédé selon l'invention, les parois 18 sont recouvertes d'une couche d'adhésion 55 à faible température de fusion formée par un film de paraffine ou un film d'un copolymère EVA

(Ethylène - Acétate de Vinyle) dont l'épaisseur est comprise entre 1 et 2μm environ (figure 6).

Un faisceau laser 56 est focalisé et déplacé sur le film de EVA le long des capillaires 12 et au niveau des réservoirs 22 pour supprimer le film de EVA au niveau des plafonds des capillaires et des réservoirs, c'est-à- dire au niveau des lignes en traits pointillés et des parties hachurées de la figure 6.

Le faisceau laser 56 est émis par un générateur laser à émission puisée, sur une longueur d'onde de 532 nm (vert), avec une fréquence de répétition de 1 OkHz environ et avec une puissance de 1Watt environ pour entraîner la fusion du film de EVA. Ce faisceau laser est focalisé au milieu des capillaires et déplacé le long de ces capillaires pour entraîner la fusion du film et la rétractation du film fondu sur les bords longitudinaux extérieurs des capillaires 12 (figure 7). La température de fusion du film de EVA est de l'ordre de 176°C.

Le faisceau laser 56 peut également être émis sur une longueur d'onde de 1064nm pour entraîner l'ablation du film de paraffine ou du film de EVA, c'est à dire pour entraîner la sublimation de ce film.

Dans l'étape suivante illustrée en figure 8, des molécules chimiques ou biologiques 58 organisées en spots sont fixées dans les capillaires sur la plaque de support, au niveau des électrodes 26. Chaque capillaire du réseau comprend une ligne de quatre spots régulièrement répartis, les spots d'un capillaires étant alignés avec les spots des autres capillaires pour former une matrice de quatre lignes de quatre spots. Les molécules sont ensuite recouvertes d'un gel 60 de polyacrylamide, d'agarose ou d'EDTA (figure 9) afin de les protéger durant

la dernière étape du procédé consistant à poser la plaque de fermeture 16 sur le film de paraffine 55 puis à focaliser et déplacer un faisceau laser 62 au niveau des parois 18 des capillaires et des réservoirs, à travers la plaque de fermeture 16, pour entraîner la fusion du film au niveau de ces parois de façon à fixer par collage la plaque de fermeture sur les parois 18 (figure 10).

Le faisceau laser 62 est également émis par un générateur laser sur une longueur d'onde de 532 nm (vert), et est focalisé et déplacé au niveau des parois 18 des capillaires et des réservoirs, c'est-à-dire en dehors des lignes en traits pointillés et des parties hachurées de la figure 10.

Le gel de polyacrylamide ou d'agarose est avantageusement conservé dans les capillaires 12 et dans les réservoirs 22 pour former un milieu de diffusion d'autres molécules telles que des cibles moléculaires lors de leur migration par simple diffusion ou par application d'un champ électrique dans le cas d'une électrophorèse.

Le gel, par exemple de I ¹ EDTA ₁ peut également être retiré du réseau de capillaires par circulation d'un solvant tel que de l'eau dans les capillaires, ce solvant étant destiné à dissoudre le gel puis à être retiré des capillaires. Ce solvant peut être injecté et évacué des capillaires par l'intermédiaire de canaux (non représentés) formés dans au moins une des plaques 14, 16, ces canaux débouchant à une de leurs extrémités dans les capillaires ou les réservoirs et étant reliés à l'autre de leurs extrémités à des moyens appropriés d'injection et d'évacuation du solvant.

On a représenté aux figures 11 à 17 des étapes d'un second exemple de réalisation du procédé selon l'invention, ce procédé consistant entre autre à former les parois latérales des capillaires 12 et des réservoirs 22 d'une puce par fusion d'au moins une couche d'un matériau de construction sous forme pulvérulente sur une plaque de support 14.

Dans la première étape du procédé représentée en figure 12, des molécules chimiques ou biologiques 70 organisées en spots sont fixées sur

une surface de la plaque de support 14 au niveau des électrodes 26 et de l'emplacement des futurs capillaires 12.

Ces molécules sont recouvertes d'une couche 72 de poudre d'EDTA (figure 13) afin de les protéger durant la formation des parois des capillaires et des réservoirs.

L'EDTA peut être préalablement dissous dans de l'eau pour former un gel qui est déposé sur les molécules au niveau des fonds des futurs capillaires par une technique appropriée. La plaque de support est alors placée dans une étuve pour entraîner l'évaporation de l'eau et le séchage et le durcissement de l'EDTA. L'eau peut également s'évaporer naturellement.

En variante et comme représenté, la poudre d'EDTA a été déposée sur une surface de la plaque 14 au niveau des fonds des futurs capillaires et des futurs réservoirs au moyen d'un masque 74 de forme appropriée préalablement positionné sur cette surface.

L'étape suivante du procédé consiste à focaliser et déplacer un faisceau laser 76 sur la couche 72 pour entraîner la fusion de l'EDTA de façon à former une couche relativement rigide et compacte, après durcissement (figure 13). Le faisceau laser 76 est émis par un générateur laser sur une longueur d'onde de 532 ou 1064nm environ avec une puissance de 5Watts environ.

Une couche 78 de poudre de polyméthylméthacrylate (PMMA) ou de polychlorure de vinyle surchloré (CPVC) de 100 à 200μm environ d'épaisseur est ensuite déposée sur les parties de la surface de la plaque 14 qui ne sont pas recouvertes d'EDTA fondu. Cette étape peut être réalisée avec l'aide d'un masque 79 de forme approprié préalablement positionné sur la couche d'EDTA fondu (figure 14).

Un faisceau laser 80 est alors focalisé et déplacé sur l'intégralité de la couche 78 pour entraîner la fusion de la poudre de PMMA ou de CPVC de façon à former les parois latérales 18 des capillaires 12 et des réservoirs

22 (figure 15). Le faisceau laser 80 est émis par un générateur laser sur

une longueur d'onde de 1064nm environ (IR) avec une puissance comprise entre 20 et 200Watts environ.

Le procédé consiste ensuite à répéter les étapes des figures 14 et

15, c'est-à-dire à déposer une couche supplémentaire 78' de poudre de PMMA ou de CPVC de 100 à 200μm environ d'épaisseur sur la couche 78, après son durcissement, et à nouveau à focaliser et déplacer un faisceau laser 80' sur l'intégralité de cette couche supplémentaire 78' pour entraîner sa fusion de façon à achever la formation des parois 18.

Dans une autre étape du procédé selon l'invention, les parois 18 sont recouvertes d'une couche d'adhésion 84 à faible température de fusion qui est ici formée par une autre couche de poudre de PMMA ou de

CPVC de 1 à 3μm environ d'épaisseur. Cette étape peut également être réalisée avec l'aide du masque 79 précité (figure 16).

La dernière étape du procédé consiste à poser la plaque de fermeture 16 sur cette couche 84 puis à focaliser et déplacer un faisceau laser 86 au niveau des parois 18 des capillaires et des réservoirs, à travers la plaque de fermeture 16, pour entraîner la fusion de la poudre de PMMA ou de CPVC au niveau de ces parois de façon à fixer par collage la plaque

16 sur les parois 18 (figure 17). Le faisceau laser 86 est également émis par un générateur laser sur une longueur d'onde de 1064 nm (UV), et est déplacé des les zones situées en dehors des lignes en traits pointillés et des parties hachurées de la figure 17.

L'EDTA fondu est retiré du réseau de capillaires par circulation d'un solvant tel que de l'eau dans les capillaires. Comme décrit précédemment, le solvant peut être injecté dans les capillaires par l'intermédiaire de pores formés dans au moins une des plaques 14, 16 et débouchant dans au moins un des réservoirs.

Dans une variante de réalisation non représentée, le procédé selon l'invention consiste à former les parois 18 des capillaires 12 et des réservoirs 22 par fusion d'au moins une couche d'un matériau de

construction sous forme pulvérulente sur une plaque de support 14, avant de fixer des molécules chimiques ou biologiques sur cette plaque.

Dans une première étape de ce procédé, une couche de poudre de

PMMA ou de CPVC de 300μm environ d'épaisseur est déposée sur la totalité de la surface de la plaque 14 (comme cela est illustré en figure 4) puis un faisceau laser est focalisé et déplacé sur les zones précitées de cette couche.

La poudre qui n'a pas été fondue est ensuite retirée de la plaque 14 par exemple par circulation d'un liquide, tel que de l'eau, sur la plaque de support ou par balayage par projection d'un gaz sous pression, tels que de l'air, sur la plaque de support.

Dans l'étape suivante, et comme illustré en figure 8, des molécules chimiques ou biologiques organisées en spots sont fixées dans les capillaires sur la plaque de support. Ces molécules sont ensuite recouvertes d'une couche d'un gel d'EDTA afin de les protéger durant la dernière étape du procédé consistant à fixer la plaque de fermeture 16 sur les parois des capillaires et des réservoirs.

Pour cela, une couche d'adhésion formée par un film de EVA de 1 à 3μm environ d'épaisseur est déposée sur les parois des capillaires et des réservoirs.

La plaque 16 est ensuite posée sur le film et un faisceau laser est focalisé et déplacé au niveau des parois des capillaires et des réservoirs, à travers la plaque 16, pour entraîner la fusion du film de EVA au niveau de ces parois de façon à fixer par collage la plaque de fermeture sur les parois

18.

Le faisceau laser est pour cela émis par un générateur laser sur une longueur d'onde de 532 ou 1064nm environ avec une puissance comprise entre 1 et 50Watts environ.

Dans la dernière étape du procédé, le gel d'EDTA est retiré par circulation d'un solvant dans le réseau de capillaires, comme précédemment décrit.

Dans une autre variante de réalisation du procédé selon l'invention, Ie masque 74 précité qui est utilisé pour déposer la poudre d'EDTA sur les molécules 70 est fixé à demeure sur la plaque de support 14 et les lumières ou les interstices de ce masque à travers lesquels est déposée la poudre d'EDTA forment un second réseau de capillaires et/ou de réservoirs destiné à être mis en communication fluidique avec le réseau de capillaires fabriqué par fusion ou polymérisation du matériau de construction par laser.

Le masque peut être formé d'une structure en sandwich comprenant une plaque de Kapton® intercalée entre deux films d'un copolymère EVA ou de PDMS (polydiméthyl siloxane), l'épaisseur totale de cette structure étant par exemple comprise entre 10 et 2000μm environ et l'épaisseur de chaque film de EVA ou de PDMS étant par exemple de 1 à 2μm environ.

Les capillaires et/ou les réservoirs du second réseau sont formés dans la structure par découpe laser (c'est-à-dire par ablation des matériaux de la structure), ce réseau pouvant être formé sur Ia totalité ou seulement une partie de l'épaisseur de la structure. A titre d'exemple et lorsque le second réseau a une forme similaire à celle du réseau formé par fusion ou polymérisation par laser d'un matériau de construction, les réservoirs 22 et les parties médianes des capillaires 12 sont formés sur toute l'épaisseur de la structure et les extrémités des capillaires qui les relient aux réservoirs sont formées sur une profondeur de Ia structure représentant environ 95% de l'épaisseur de la plaque de Kapton®, de sorte que les parois latérales des capillaires qui s'étendent entre deux capillaires adjacents soient reliées au reste de la structure par l'épaisseur restante (environ 5%) de la plaque de Kapton®.

Les capillaires et les réservoirs peuvent éventuellement être formés par découpe laser d'une plaque de Kapton® qui est par la suite recouverte d'un film de EVA ou de PDMS sur chacune de ses faces.

Dans l'étape suivante, la structure est disposée sur la plaque de support de sorte que la faible épaisseur de la plaque de Kapton® (5%) soit située du côté de la plaque de support. La structure est ensuite fixée à la plaque de support en focalisant et en déplaçant un faisceau laser sur le film de EVA, à travers la plaque de support, pour entraîner sa fusion. Dans le cas où la plaque de Kapton® est recouverte d'un film de PDMS, la plaque de Kapton® est appliquée à pression sur la plaque de support pour assurer leur fixation.

Si nécessaire, le procédé consiste ensuite à percer par ablation laser au moins un orifice dans le film de EVA ou de PDMS situé su côté opposé à la plaque de support pour former une voie de communication fluidique entre le second réseau et le réseau de capillaires (par exemple au niveau des réservoirs) qui est formé par dépôt et fusion ou polymérisation d'une couche de matériau de construction déposée sur ce film. En variante, le réseau de capillaires formé par le masque a une forme différente de celle du réseau formé par fusion ou polymérisation par laser.

Dans les exemples précités, la plaque de fermeture peut également être fixée de manière amovible sur les parois latérales des capillaires au moyen d'un film adhésif ou jointif, tel que par exemple un film de PDMS, inséré entre la plaque de fermeture et les parois latérales du réseau. Une pression est appliquée sur la plaque de fermeture et permet de serrer le film entre la plaque et les parois latérales et de les fixer l'une contre l'autre par simple adhérence ou par ancrage mécanique du film dans les aspérités des parois latérales et de la plaque de fermeture.

On a représenté très schématiquement en figure 18 un mode de réalisation d'un réseau de capillaires d'une puce, ce réseau de capillaires comprenant un capillaire de chromatographie 90, un capillaire d'électrophorèse 92 et des chambres 94 d'analyse spectrométrique par effet LIBS (Laser Induced Breackdown Spectroscopy), les parois latérales

des capillaires et des chambres étant formées entre des plaques de support et de fermeture par le procédé selon l'invention.

Le capillaire de chromatographie 90 est rempli d'une substance monolithique poreuse formant une phase stationnaire et est relié à une de ses extrémités à des moyens d'alimentation en phase mobile et à des moyens d'injection d'au moins un échantillon, et à l'autre de ses extrémités à une chambre d'analyse 94 par effet LIBS. Ce capillaire permet de façon connue de fractionner les composants d'un échantillon et de les détecter et de les quantifier les uns après les autres dans la chambre d'analyse en fonction de leur temps d'élution.

Dans l'exemple représenté, le capillaire d'électrophorèse 92 a une forme sensiblement en S et comprend une partie médiane reliée perpendiculairement au capillaire de chromatographie 90, les parties d'extrémités du capillaire d'électrophorèse 92 étant reliées à une anode et à une cathode respectivement pour l'application d'un champ électrique dans ce capillaire. Le capillaire d'électrophorèse 92 est également relié à ses extrémités à des chambres d'analyse 94 par effet LIBS.

Les fractions éluées de l'échantillon injecté dans le capillaire de chromatographie 90 vont être orientées vers l'une ou l'autre des chambres d'analyse 94 du capillaire d'électrophorèse 92 en fonction de la présence de molécules chargées positivement ou négativement dans ces fractions. Les fractions contenant une majorité de molécules chargées négativement vont être orientées vers la chambre d'analyse 94 de la partie d'extrémité du capillaire 92 reliée à l'anode (+), et les fractions contenant une majorité de molécules chargées positivement vont être orientées vers la chambres d'analyse 94 de la partie d'extrémité du capillaire 92 reliée à la cathode (-). En l'absence de molécules chargées dans les fractions, celles-ci continueront à être éluées dans le capillaire de chromatographie 90 et seront détectées et quantifiées dans la chambre d'analyse 94 de ce capillaire.

On a représenté schématiquement en figure 19 une chambre d'analyse 94 par effet LIBS, cette chambre étant montée à une extrémité sur un tronçon ouvert du capillaire d'électrophorèse 92 (ou du capillaire de chromatographie 90) et comportant à son extrémité opposée une lentille en quartz 106 à travers laquelle un faisceau laser 98 est focalisé sur une surface du milieu de migration des fractions du capillaire, à travers l'ouverture de ce dernier. La lentille peut également être réalisée dans un matériau plastique transparent à Ia longueur d'onde du faisceau laser et par exemple aux rayons UV. Lorsqu'une fraction de l'échantillon passe devant la lentille 106 de la chambre et qu'un faisceau laser 98 est focalisé à travers cette lentille sur la surface du milieu de migration, il se produit un plasma 100 dans la chambre qui est constitué des éléments particuliers de cette fraction. Ce plasma émet un rayonnement lumineux qui est détecté et analysé par des moyens 104 appropriés de façon à déterminer les concentrations respectives des différents éléments constitutifs de la fraction de l'échantillon. A titre d'exemple, dans le cas d'un échantillon comprenant des acides nucléiques, les moyens 104 sont destinés à déterminer la concentration en Phosphore des fractions de l'échantillon. La chambre d'analyse est également reliée à des moyens 102 d'injection d'un gaz tel que de l'argon ou de l'azote dans la chambre pour éviter que le milieu de migration ne pénètre dans la chambre à travers l'ouverture du tronçon du capillaire.

En variante, le tronçon ouvert du capillaire 90 ou 92 est rempli d'une substance monolithique poreuse, tel qu'un métal ou un minéral poreux, de manière à réduire le volume occupé par le milieu de migration dans le tronçon du capillaire et à augmenter les concentrations des molécules des fractions dans ce tronçon afin qu'elles soient plus facilement détectables et analysables. La chambre d'analyse 94 peut en outre comporter une paire d'électrodes reliées à une source de courant et disposées de manière

appropriée dans la chambre de manière à appliquer un champ électrique dans le tronçon du capillaire, de préférence perpendiculaire à la direction de migration des fractions dans le capillaire, pour amener les molécules chargées de ces fractions sur la surface du milieu de migration sur laquelle le faisceau laser est focalisé. Ceci permet d'augmenter la quantité de molécules exposées au faisceau laser émis à travers la lentille et donc d'améliorer l'analyse de l'échantillon.

La focalisation du faisceau laser sur la surface du milieu de migration permet également d'accélérer la migration des fractions dans le capillaire par un effet de pompage thermique.