CONSORCIO DE HONGOS RESISTENTES A TIOCARB (CARBAMATO) Y

BIFENTRINA (PIRETROIDE) Y SU USO EN

ABONOS LÍQUIDOS

A) DESCRIPCION

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Dado que el ESTADO DE LA TÉCNICA sobre la investigación científica y aplicación tecnológica enfocados a inducir el crecimiento, repoblación y desarrollo de un consorcio de microorganismos benéficos que toleren trazas químicas que quedan en los suelos y en los residuos orgánicos, y que además resistan a nuevas generaciones de sustancias que van desplazando cada vez más a los agroquímicos convencionales (y que son prohibidos en la agricultura) esta principalmente determinada por la PATENTE No. PA/2006/003777 , otorgada por el IMPI (27 de abril de 2017) donde se aislaron consorcios de microorganismos resistentes a compuestos organoclorados y organofosforados, en esta solicitud se ha desarrollado la ACTIVIDAD INVENTIVA de desarrollar, cultivar y seleccionar consorcios de hongos resistentes a compuestos químicos de nueva generación de plaguicidas y de biocontrol como lo son los compuestos piretroides y carbamatos que son en teoría de uso controlado por los efectos secundarios que provocan como contaminación de suelo, mantos acuíferos, y que afectan al crecimiento agrícola.

En la información presentada en este documento parte de la NOVEDAD consiste en el desarrollo de un consorcio con especies fúngicas específicas, adaptadas para que resistan, toleren y mineralicen la materia orgánica contaminada con carbamatos como el tiodicarb y piretroides como la bifentrina, compuestos que son utilizados actualmente en la industria agrícola, pecuaria y presentes en los residuos orgánicos. Con estos residuos orgánicos, que generalmente no son aprovechados y si generan contaminación como ejemplo, la equinaza, residuos lácteos, enzimas pancreáticas, carbohidratos, etc., se producen BioAbonos líquidos; este consorcio los enriquece y se obtiene un producto con una microcarga fúngica que al aplicarlos a los cultivos, solubilizan el fósforo presente en suelos como P ₂ 0 ₄ adicionándole un Oxígeno para convertirlo en P ₂ 0 ₅ asimilable por las plantas, contiene antagonistas de algunos patógenos, y repuebla el suelo con hongos benéficos. Es importante anotar que los microorganismos que conforman nuestros consorcios NO ESTÁN GENÉTICAMENTE MODIFICADOS ni son patógenos para los humanos, ni para animales, ni para las plantas .

Con la prohibición del uso de los compuestos órgano-clorados y órgano-fosforados como insecticidas en la segunda mitad del siglo XX, los compuestos carbamatos y piretroides se consolidan como una alternativa de uso. Los carbamatos son sustancias insecticidas conformadas por un átomo de N unido a un grupo lábil, el ácido carbámico; su característica principal es su alta toxicidad, su baja estabilidad química y su nula acumulación en tejidos; y los piretroides, son moléculas con actividad insecticida, permanecen más tiempo en el medio ambiente ya que la modificación química de su fórmula los hace más estables a la luz solar y al calor. Estos productos se usan en forma indiscriminada en la industria agrícola y pecuaria, generando residualidad.

Esta investigación se enmarca en los lineamientos del Programa 21 de Naciones Unidas (Capítulos 10, 11 ,12 y 14 respectivamente) , sobre la desertificación y la sequía; la agricultura y el desarrollo sostenible. Se estima que la degradación de la tierra a escala mundial se extiende a más de 2000 millones de hectáreas, poniendo en peligro los medios de subsistencia de más de 1000 millones de personas. Se calcula que aproximadamente las 2/5 partes de la superficie de la tierra son terrenos áridos, con un limitado suministro de agua dulce, y un alto porcentaje de éstas se encuentran degradadas. Aproximadamente el 65% de la tierra cultivable ya ha perdido alguna función biológica y/o física.

En Latinoamérica, el uso indiscriminado de agroquimicos utilizados en la agricultura durante décadas, ha dejado una residualidad, generando la contaminación de suelos, aguas superficiales y subterráneas. "Los plaguicidas están diseñados para matar, reducir o repeler los insectos , hierbas, roedores, hongos y otros organismos que puedan amenazar la salud pública y las economías de las naciones . Cuando estos productos químicos se manejan o depositan inadecuadamente pueden afectar la salud humana." "Los riesgos principales ligados a la salud humana de la exposición crónica a bajas dosis se relacionan con la aparición de cáncer, defectos de nacimiento, afecciones del sistema nervioso y del funcionamiento del sistema endocrino" . Aseveraciones tomadas de: Childhood Pesticides

Poisoning: Information for Advocacy and Action", UNEP

Chemicals, May 2004.

En el desarrollo de nuestra investigación científica, hemos encontrado suelos que presentan ausencia de micro carga por el excesivo uso de agroquímicos a los que han sido sometidos. Ejemplo: Cultivo de arroz en zonas de Ibagué (Colombia) . Cultivo de jitomate en Sinaloa (México. Cultivo de Soja en Provincia de Santa Fe (Argentina, entre otros casos.

La conciencia ambiental, el conocimiento ecológico, las actitudes y valores hacia el medio ambiente han ido ganando espacio en nuestras comunidades. El problema de los residuos sólidos municipales, domiciliarios, agrícolas y pecuarios continua aumentando y su producción es excesiva, la falta de separación en la fuente, la mala disposición, la falta de áreas para su manejo y la falta de tratamiento o aprovechamiento. Dentro de los problemas más relevantes que se causan esta la producción de gases contaminantes de la atmósfera, los lixiviados contaminantes de suelos, aguas subterráneas, aguas superficiales y además la generación de focos de enfermedades o vectores transmisores de ellas. Los residuos sólidos orgánicos actuales de cualquier fuente, son muy diferentes a los producidos hace 20 años debido a la acumulación de trazas químicas, esta toxicidad está directamente relacionada con la evolución de los plaguicidas, herbicidas y acaricidas entre otros.

Los Organismos Internacionales, como la FAO (Organización para la Agricultura y Alimentación) y la OMS (Organización Mundial de la Salud) , han establecido los niveles máximos admisibles respecto a la ingestión de plaguicidas, sin embargo las autoridades nacionales de cada país son las encargadas de establecer una legislación apropiada y vigilar cuidadosamente el uso de éstos y la cantidad de residuos mediante controles analíticos adecuados.

El presente es un desarrollo científico con hongos nitrificantes, solubilizadores de fósforo y antagonistas de patógenos del banco de cepas del laboratorio del Dr. Luis Orlando Castro, cabe mencionar que los microorganismos utilizados en estas investigaciones fueron inicialmente aislados por el grupo del Dr. Luis Orlando Castro conforme lo descrito en la patente 11851 de Colombia, dichas cepas se han trabajado desde 1984.

Las cepas de hongos se someten a varias etapas de estrés mediante cambios inducidos, adicionando trazas para lograr quimio resistencia al piretroide sintético bifentrina (2- metilbifenil-3-ilmetil (2 ) - (1RS, 3RS) -3- (2-eloro 3,3,3- trifluroprop-enil ) -2 , 2-dimetilciclopropanocarboxilato;

código alfanumérico CA DPR Chem Code 2300. CAS 82657-04-3. CIPAC 415. FMC 54800. PC Code 128825) y al carbamato tiodicarb (C10H18N4O4S3 ) .

Es importante indicar que los consorcios de microorganismos aqui descritos han sido depositados ante el INIFAP en el Centro Nacional de Recursos Genéticos (Se anexa la constancia de depósito) . Con la utilización de estos consorcios, en la producción de fertilizantes líquidos, estamos poniendo al servicio del agro un producto seguro y efectivo para el control de plagas, como una alternativa al uso de insecticidas y pesticidas de origen químico.

El siguiente protocolo de aislamiento de cepas resistentes y la conformación del consorcio microbiano indica que cada una de las cepas mencionadas fue evolucionada hacia una resistencia adquirida SIN LA MANIPULACION DEL GENOMA de cada organismo. Por otro lado cada cepa fue aislada y seleccionada independientemente mediante cultivos en etapas sucesivas con incrementos en la concentración de piretroides sintéticos como la bifentrina y carbamatos como el tiodicarb.

Los porcentajes de cada microorganismo perteneciente al consorcio oscilan entre 20-30% de UFC de cada una de las cepas. La variabilidad de la cantidad de cada cepa dependerá de las características del sustrato y cultivo al que se destinará el consorcio.

DESCRIPCION DEL PROCEDIMIENTO

Durante toda la investigación, con cada uno de las cepas de hongos y en cada una de las etapas se realizaron: a. Modificaciones al medio de cultivo de cada microorganismo. Coloraciones para determinar su tamaño, forma, morfología celular, tinción de Gram y cristal violeta para diferenciación y observación de hifas ó propágulos, micelio, pared interna y pared celular. b. Curvas de crecimiento y recuento de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) en los tiempos programados y determinados para esta investigación. c. Las cepas micológicas se sometieron a iluminación (luz) directa en cada una de las etapas; inicialmente tenue y a medida que iban transcurriendo las etapas se aumentó progresivamente la intensidad; buscando lograr la adaptación esperada.

d. Se adaptaron a partir del incremento de humedad y disminución de temperatura.

MATERIALES Y METODOS

Medios de Cultivo: Líquidos: Caldo nutritivo. Sólidos: Agar, gelatina o sílica gel, Agar nutritivo, extracto de carne, extracto de levadura, Caldo sabouraud, extracto de malta, sustrato de arroz, harinas de maíz y algunos minerales. Fuentes de Carbono: Orgánicas: Peptona y sacarosa (4-5%). Fuente de Nitrógeno: NH ₄ y nitritos.

Fuente de luz: Luz artificial (lámpara de baja y media intensidad) .

Otros elementos del cultivo: Agua, hidrógeno, oxigeno, nitrógeno, azufre, fósforo, potasio, magnesio, calcio, hierro y sodio.

Elementos trazas: Cobalto, zinc, potasio, magnesio, molibdeno, azufre, cobre, manganeso, carbamato (tiodicarb) y piretroide (bifentrina) .

Cepas de Hongos solubilizadores de fósforo y antagonistas de algunos patógenos: a) Paecilomyces sp.

b) Bauveria bassiana

c) Tríchoderma harzianum

d) Metharhízíum anisolapliae Preparación para desarrollo de etapas

1. Se realiza la esterilización del material de vidrio en autoclave .

2. Se prepara la cantidad requerida del medio de cultivo con 3% caldo-arroz (P/V) , y 9% de una solución de melaza y se esteriliza a 121°C por 15 minutos a 15 Ib de presión.

3. Se determina la dosis letal (DL) de aplicación a una hectárea tanto de tiodicarb como de bifentrina, Se preparan

10 cajas de Petri con 0.1 DL de tiodicarb o bifentrina. Las cajas se incuban inicialmente a temperatura de 25°C por 72 horas y con luz fría.

4. De la suspensión anterior de concentración conocida, ( 10 ⁷ ) se inocula el medio de cultivo con 1 mi, se realiza el ajuste de pH a 5.5 con una solución de ácido cítrico estéril al 10%.

5. Se agita a 110 rpm a 27 °C durante 7 días

6. Se monitorea el proceso controlando las variables sobre todo pH y concentración de biomasa, ajustando el pH a 5.5 durante todo el proceso.

7. Al cuarto día de proceso se controla la formación de espuma con aceite de soya al 1% y la velocidad de agitación. a. Las cajas Petri se colocan en la campana de flujo laminar junto con las muestras diluidas, para las siembra de microorganismos en las placas se toma una muestra de las cepas en un mi con la pipeta automatizada y se realizan diluciones 10 ^_1 y 10 ^~2 y cada dilución se homogeniza. b. Teniendo las cajas de Petri con el medio de cultivo estéril y enfriado, se homogeniza mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr la completa incorporación del inoculo en el medio, se deja reposar para que solidifique y se coloca parafilm a cada una de las cajas con agar para evitar contaminación durante el tiempo de incubación . c. Las cajas con tiodicarb o Biofentrina se llevan a la incubadora a temperatura de 25 °C por 72 horas con iluminación a partir de lámpara de luz fría. d. Las cajas inoculadas se incuban por 15 dias, se determina el efecto de las concentraciones de los productos sobre el crecimiento micelial radial, esporulación y germinación (12 horas de incubación) . e. El efecto residual del producto se evalúa a los 7 dias en medio agar malta, dextroxa y Agar PDA, enriquecido con minerales . f. Si no hay un crecimiento por encima del 10% se repite el procedimiento hasta obtener mortalidad menor de 90%. g. Se determina el diámetro de las colonias con regla graduada, los datos se registrarán descontándose el diámetro del disco sembrado, a partir del cual se determinará el efecto sobre el crecimiento micelial con relación al testigo (AM no envenenado) , a lo que se le denomina porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) . h. Diariamente se registra el avance pero a los 7 dias se analiza y si existe un cubrimiento aceptable, si aún no se tiene, se repite el procedimiento cuantas veces sea necesario, posteriormente, se preparará una suspensión de esporas por el método de barrido de la colonia, la suspensión obtenida se coloca en tubos de 160 x 20 mm, y se agrega 30 mL de agua destilada estéril. Posteriormente la suspensión obtenida se agita durante 30 segundos en agitador de tubos Vortex. La concentración de esporas se cuenta en Cámara de

Newbauer y finalmente el resultado se expresa como conidios por mirr ² . i. De las 10 cajas de Petri, de cada microorganismo, la que menor mortalidad nos arroje, es la que continúa para el siguiente ensayo. j. Realizamos nuevamente el ensayo con este porcentaje hasta tener un recubrimiento superior y asi sucesivamente, se va alternando la adición de tiodicarb y bifentrina con las DL en intervalos de 0.1 DL, todos estos experimentos han sido diseñados con las cepas experimentales y un testigo. k. Con los datos obtenidos del crecimiento micelial, germinación y esporulación se calcula el porcentaje de inhibición del crecimiento radial, los datos para su análisis son transformados a través de la expresión 2 are sen, y la esporulación mediante la expresión Logi ₀ (x+10). Se aplicará un análisis de varianza de clasificación doble y a posteriori se realiza la prueba de Tukey, al 5% de probabilidad.

REGISTROS

Durante todas las etapas se registraron las características de este procedimiento mediante los indicadores: a. Velocidad de crecimiento

b. Porcentaje de Inhibición medido en Número de UFC/ m c. Resistencia a envenenamiento en porcentaje

ETAPAS REALIZADAS EN CADA MICROORGANISMO

Para cada especie se realizaron etapas analizando los tiempos que requería para el cubrimiento total del campo. Una vez determinado este tiempo, se dejaron en reposo por un periodo de 10 días y posteriormente se someten al siguiente protocolo :

Paecilomyces sp.

Es un hongo entomopatógeno, tiene la habilidad de sobrevivir en materia orgánica en el suelo y siempre se encuentra presente en el campo principalmente en zonas húmedas, es de color vino. Los conidióforos son erectos, alcanzando entre

400 y 600 pm y se originan individualmente (raramente en grupos o sinemas) a partir del micelio horizontal. Las conidias son elipsoidales a fusiformes, con dimensiones de 2.5 a 3pm de largo y de 2.0 a 2.2pm de ancho.

REPRODUCCIÓN EN LABORATORIO Su crecimiento se hace inicialmente en sustrato de arroz con una humedad del 47% por un periodo de 7 dias a 28°C.

Se prepara el medio de cultivo en un matraz Erlenmeyer con agar papa dextrosa (PDA) . Se toma una muestra de las esporas del cepario fúngico del laboratorio.

Se siembra en cajas Petri estériles en agar papa dextrosa y extracto de malta, para mantener la colonia pura. Se deja solidificar de 2 a 3 minutos. Posteriormente se incuban a 24 °C +/- 1 por periodos de 12 horas intercalando luz/obscuridad por periodos de 15, 30 a 45 dias.

ETAPAS REALIZADAS EN EL LABORATORIO CON Paecilomyces sp.

Durante las etapas E-l y E-2 (Etapa 1 y Etapa 2 ) al medio de cultivo se le adiciona 0.1 DL de tiodicarb ( ⁽ ).0000175 gr) presentando mortalidades entre 60 a 62%. (En la etapa 2 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de cepas resistentes) . Las cepas resistentes son transferidas a medios de cultivo sólidos con 0.2 DL (0.000035 gr) de tiodicarb (E-3 y E-4, nuevamente en la E-4 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) presentando mortalidades entre 58 a 60%. Al finalizar la etapa E-4 se han seleccionado los organismos por 206 dias.

Las Etapas E-5 y E-6 se les someten a una primera adición de bifentrina el medio de cultivo se adiciona con 0.1 DL de bifentrina (0.00000006 gr) , presentando mortalidades entre 55 a 58% (de la misma manera que el caso anterior, la E-6 se utiliza para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes). Las Etapas E-7 y E-8 se aumenta al 0.2 DL de bifentrina (0.00000012 gr) presentando mortalidades entre 51 a 53%. Al finalizar la E-8 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) el proceso de adaptación llega a 384 dias.

En las Etapas E-9 y E-10 se agrega 0.3 DL (0.000053 gr) de tiodicarb, presentando mortalidades entre 50 a 48%. (Al igual que en las etapas anteriores la E-10 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-ll y

E-12 se les adiciona 0.4 DL de la dosis (0.000070 gr) de tiodicarb, presentando mortalidades de 47 a 48%. Al finalizar la etapa E-12 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 540 dias de proceso.

En las etapas E-13 y E-14 se adiciona 0.3 DL (0.00000018 gr) de bifentrina, presentando mortalidades entre 45 a 44%. En las etapas E-15 y E-16 se aumenta a 0.4 DL (0.00000024 gr) presentando mortalidades entre 42 a 44%. Al finalizar la etapa 16 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 687 dias de selección.

En las etapas E-17 y E-18 se agrega 0.5 DL (0.000087 gr) de tiodicarb, presentando mortalidades entre 40 a 42% (Al igual que en las etapas anteriores la E-18 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para la etapa E-19 y E-20 se les adiciona 0.6 DL (0.00011 gr) de tiodicarb, presentando mortalidades de 38 a 41%. Al finalizar la E-20 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se contabilizan 823 dias de selección.

Para las E-21 y E-22 se adiciona se agrega 0.5 DL (0.00000030 gr) de bifentrina, presentando mortalidades entre 33 a 36% (Al igual que en las etapas anteriores la E-22 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para las E-23 y E-24 se aumenta a 0.6 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidades entre 27 a 31%. Al finalizar la E-24 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 935 días de trabajo. En las etapas E-25 y E-26 se agrega 0.7 DL (0.00012 gr) de tiodicarb, presentando mortalidades entre 25 a 23% (Al igual que en las etapas anteriores la E-26 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En E-27 y E-28 se les adiciona 0.8 DL (0.00014 gr) de tiodicarb, presentando mortalidades de 18 al 21%. Al finalizar la E-28 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan los 1032 días de adaptación.

Para las E-29 y E-30 se adiciona el 0.7 DL de bifentrina (0.00000042 gr) presentando mortalidades entre 12 a 15% (Al igual que en las etapas anteriores la E-30 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las

E-31 y E-32 se aumenta al 0.8 DL de bifentrina (0.00000048 gr) presentando mortalidades entre 8 al0%. Al finalizar la E-32 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1112 dias de trabajo. En las etapas E-33 y E-34 el 0.9 DL (0.00016 gr) de tiodicarb, presentando mortalidades de 8% (Al igual que en las etapas anteriores la E-34 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-35 y E- 36 se les adiciona el 1 DL (0.00018 gr) de tiodicarb, presentando mortalidades de 5%. Al finalizar la E-36 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1177 dias de adaptación.

En las etapas E-37 y E-38 el 0.9 DL (0.00016 gr) de bifentrina, presentando mortalidades de 8% (Al igual que en las etapas anteriores la E-38 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-39 y E- 40 se les adiciona el 1 DL (0.00018 gr) de bifentrina, presentando mortalidades de 5%. Al finalizar la E-40 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1223 dias de adaptación.

Tabla No.l. Cuadro Comparativo Características Iniciales y Finales

Beauveria bassiana

Es un hongo ascomiceto mitospórico que crece en forma natural en los suelos, con micelio entomopatógeno eucarioto heterótrofo que posee células quitinizadas . Su poder entomopatógeno le hace capaz de parasitar a insectos. Su estructura está conformada por hifas septadas. Las conidias son elipsoidales a fusiformes, con dimensiones de 2.5 a 3pm de largo y de 2.0 a 2.5npm de ancho. Sus esporas son esféricas y levemente ovaladas de color blancuzco. En laboratorio crece en PDA aproximadamente en 7 días a 28 °C.

ETAPAS REALIZADAS EN EL LABORATORIO CON Beauveria bassiana

Se inician, manejando las condiciones de su hábitat natural: pH - 7.0 a 7.5, Humedad: 30 a 40% y vamos aumentando la humedad hasta un 70% y una Temperatura de 28 a 30 °C las cuales se mantienen durante todo el periodo de investigación. Estas condiciones son nuestro punto de partida para ir adaptando la cepa a tiodicarb (carbamato) y a bifentrina (piretroide) . Durante todas las etapas estamos utilizando lámpara de luz fría para ir adaptando al microorganismo a luz solar.

En la adaptación de este microorganismo se realizaron 56 etapas iniciando los procesos con el medio de cultivo convencional. Durante las etapas E-l y E-2 (Etapa 1 y Etapa 2) al medio de cultivo se le adiciona 0.1 DL de tiodicarb (0.0000175 gr) manteniendo una humedad del 32%, presentando mortalidad de 73% (En la etapa 2 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de cepas resistentes) . Las cepas resistentes son transferidas a medios de cultivo sólidos con 0.2 DL (0.000035 gr) de tiodicarb (E-3 y E-4, nuevamente en la E-4 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) presentando mortalidad de entre 73-70%. Al finalizar la etapa E-4 se han seleccionado los organismos por 281 dias de proceso selectivo .

Las Etapas E-5 y E-6 se les someten a una primera adición de bifentrina; el medio de cultivo se adiciona con 0.1 DL de bifentrina (0.00000006 gr) , presentando mortalidad de 71 a 70% (de la misma manera que el caso anterior, la E-6 se utiliza para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) . Las Etapas E-7 y E-8 se aumenta al 0.2 DL de bifentrina (0.00000012 gr) presentando mortalidad de 68 a 65%. Al finalizar la E-8 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) el proceso de adaptación llega a 547 dias.

En las Etapas E-9 y E-10 se agrega 0.3 DL (0.000053 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 66 a 65% (Al igual que en las etapas anteriores la E-10 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En las etapas E-ll y E-

12 se les adiciona 0.4 DL (0.000070 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 62 a 59%. Al finalizar la etapa E-12 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 796 dias de proceso de selección.

En las etapas E-13 y E-14 se adiciona 0.3 DL (0.00000018 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 57 a 55% (Al igual que en las etapas anteriores la E-14 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En las etapas E-15 y E-16 se aumenta a 0.4 DL (0.00000024 gr) presentando mortalidad de 53 a 50%. Al finalizar la etapa 16 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1036 dias de proceso de selección. En las etapas E-17 y E-18 se agrega 0.5 DL (0.000087 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 51 a 49% (Al igual que en las etapas anteriores la E-18 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para la etapa E-19 y E- 20 se les adiciona 0.6 DL (0.00011 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 47 a 44%. Al finalizar la E-20

(etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se contabilizan 1245 dias de selección.

Para las E-21 y E-22 se adiciona se agrega 0.5 DL (0.00000030 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 43 a 40% (Al igual que en las etapas anteriores la E-22 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para las E-23 y E-24 se aumenta a 0.6 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 40 a 38%. Al finalizar la E-24 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1430 dias de trabajo. En las etapas E-25 y E-26 se agrega 0.7 DL (0.00012 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 25 a 23% (Al igual que en las etapas anteriores la E-26 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En E-27 y E-28 se les adiciona 0.8 DL (0.00014 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 34 a 33%. Al finalizar la E-28 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan los 1595 dias de adaptación.

Para las E-29 y E-30 se adiciona el 0.7 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 32 a 30% (Al igual que en las etapas anteriores la E-30 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En las E-31 y E-32 se aumenta al 0.8 DL de bifentrina (0.00000042 gr) presentando mortalidad de 30 a 28%. Al finalizar la E-32

(etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1729 dias de trabajo. En las etapas E-33 y E-34 el 0.9 DL (0.00016 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 28 a 27% (Al igual que en las etapas anteriores la E-34 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-35 y E- 36 se les adiciona 1 DL (0.00018 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 27 a 26%. Al finalizar la E-36 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1845 dias de adaptación.

Las E-37 y E-38 se adiciona 0.9 DL de bifentrina (0.00000042 gr) ; presentando mortalidad de 27 a 26% (Al igual que en las etapas anteriores la E-38 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Las E-39 y E-40 se aumenta a 1 DL de bifentrina (0.00000048 gr) disminuyendo la mortalidad a 25-24% Al finalizar la 40 etapa llevamos 1952 dias de trabajo.

Las E-41 y E-42 se adiciona 1.1 DL de tiodicarb (0.0002 gr) ; presentando mortalidad de 23 a 22% (Al igual que en las etapas anteriores la E-42 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Las E-43 y E-44 se aumenta a 1.2 DL de tiodicarb (0.00022 gr) disminuyendo la mortalidad a 20% D1 finalizar la 44 etapa llevamos 2040 días de trabajo.

Las E-45 y E-46 se adiciona 1.1 DL de bifentrina (0.00000054 gr) presentando mortalidad de 20 a 18% (Al igual que en las etapas anteriores la E-46 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). Las E-47 y E-48 se aumenta a 1.2 DL de bifentrina (0.00000060 gr) disminuyendo la mortalidad a 16-14% Al finalizar la 48 etapa llevamos 2110 días de trabajo. Las E-49 y E-50 se adiciona 1.1 DL de tiodicarb (0.00024 gr) ; presentando mortalidad de 14% (Al igual que en las etapas anteriores la E-50 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las E-51 y E-52 se aumenta a 1.2 DL de tiodicarb (0.00026 gr) disminuyendo la mortalidad a 11%. Al finalizar la 52 etapa llevamos 2198 días de trabajo.

Las E-53 y E-54 se adiciona 1.2 DL de bifentrina (0.00000066 gr) presentando mortalidad de 8% (Al igual que en las etapas anteriores la E-54 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Las E-55 y E-56 se aumenta a 1.3 DL de bifentrina (0.00000072 gr) disminuyendo la mortalidad a 8% Al finalizar la 56 etapa llevamos 2268 dias de trabajo.

Tabla No.2. Cuadro Comparativo Características Iniciales y Finales

Trichoderma harzianum

Es un hongo que se le puede encontrar en diferentes materiales orgánicos, suelos y en condiciones ambientales diferentes, por lo cual hace que sea muy fácil su adaptabilidad y propagación; prefieren un pH ácido de 4 a 4.5 y una alta humedad. Son productores de toxinas y antibióticos. Su micelio es de color blancuzco, aunque eventualmente y con el tiempo después de esporular se torna verde oscuro; presentan diversas ramificaciones perpendiculares, grupos de 2 a 3 ramas de apariencia piramidal; y por ende una abundante producción de conidios, con dimensiones de 5 a 10 pm de largo y de 3.0 a 4.5 pm de ancho. En laboratorio crece en Sustrato de arroz con una humedad del 47% por un periodo de 7 dias a 28 °C en presencia de luz constante.

ETAPAS REALIZADAS EN EL LABORATORIO CON T. harzianum

Se inician los procedimientos, manejando las condiciones de su hábitat natural: Humedad de 30 a 40% y gradualmente se aumenta hasta un 70%. Temperatura de 28 a 30°C las cuales se mantienen durante todo el periodo de investigación. pH 7.0 a 7.5. Estas condiciones son nuestro punto de partida para ir adaptando la cepa a tiodicarb o a bifentrina. Se realizaron 56 etapas, iniciando los procesos con el medio de cultivo convencional. Durante las etapas E-l y E-2 (Etapa

1 y Etapa 2) al medio de cultivo se le adiciona 0.1 DL de tiodicarb (0.0000175 gr) . Luego de la incubación se registra un crecimiento lento hasta las 72 horas. Hasta el dia 68 de incubación se tiene una mortalidad de 85% y en la E-2 del 83%. El 20% restante se mantiene por 10 dias en observación diaria, para continuar con la adaptación del microorganismo. Se mantiene la humedad y la temperatura del hábitat. (En la etapa 2 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de cepas resistentes) . Las cepas resistentes son transferidas a medios de cultivo sólidos con 0.2 DL (0.000035 gr) de tiodicarb (E-3 y E-4, nuevamente en la E-4 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) presentando mortalidad de 83 a 82%. Al finalizar la etapa E-4 se han seleccionado los organismos por 396 dias.

Las Etapas E-5 y E-6 se les someten a una primera adición de bifentrina; el medio de cultivo se adiciona con 0.1 DL de bifentrina (0.00000006 gr) , presentando mortalidad de 83 a 82% (de la misma manera que el caso anterior, la E-6 se utiliza para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) . Las Etapas E-7 y E-8 se aumenta al 0.2 DL de bifentrina (0.00000012 gr) presentando mortalidades entre

81 a 80%. Al finalizar la E-8 {etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) el proceso de adaptación llega a 776 dias. En las Etapas E-9 y E-10 se agrega 0.3 DL (0.000053 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 78 a 76% (Al igual que en las etapas anteriores la E-10 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-ll y E- 12 se les adiciona 0.4 DL (0.000070 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 75%. Al finalizar la etapa E-12 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1124 dias de proceso de selección.

En las etapas E-13 y E-14 se adiciona 0.3 DL (0.00000018 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 73 a 70% y en la siguiente etapa aumenta a 65% (Al igual que en las etapas anteriores la E-14 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-15 y E-16 se aumenta a 0.4 DL (0.00000024 gr) presentando mortalidad de 69%. Al finalizar la etapa 16 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1368 dias de proceso de selección.

En las etapas E-17 y E-18 se agrega 0.5 DL (0.000087 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 69 a 67% (Al igual que en las etapas anteriores la E-18 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para la etapa E-19 y E- 20 se les adiciona 0.6 DL (0.00011 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 66%. Al finalizar la E-20 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se contabilizan 1723 dias de selección. Para las E-21 y E-22 se adiciona se agrega 0.5 DL (0.00000030 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 65% (Al igual que en las etapas anteriores la E-22 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). Para las E-23 y E-24 se aumenta a 0.6 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando menor mortalidad de 65 a 63%. Al finalizar la E-24 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 1975 dias de trabajo.

En las etapas E-25 y E-26 se agrega 0.7 DL (0.00012 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 60% (Al igual que en las etapas anteriores la E-26 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En E-27 y E-28 se les adiciona 0.8 DL (0.00014 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 58 a 56%. Al finalizar la E-28 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan los 2203 días de adaptación. Para las E-29 y E-30 se adiciona el 0.7 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 55 a 52% (Al igual que en las etapas anteriores la E-30 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las E-31 y E-32 se aumenta al 0.8 DL de bifentrina (0.00000042 gr) presentando mortalidad de 48 a 44%. Al finalizar la E-32 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 2397 días de trabajo.

En las etapas E-33 y E-34 el 0.9 DL (0.00016 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 42 a 40% (Al igual que en las etapas anteriores la E-34 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-35 y E- 36 se les adiciona 1 DL (0.00018 gr) de tiodicarb, presentando disminución de mortalidad de 38 a 35%. Al finalizar la E-36 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 2556 días de adaptación.

Las E-37 y E-38 se adiciona 0.9 DL de bifentrina (0.00000042 gr) ; presentando mortalidad de 24 a 22% (Al igual que en las etapas anteriores la E-38 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Las E-39 y E-40 se aumenta a 1 DL de bifentrina (0.00000048 gr) manteniendo la mortalidad del 28 a 25% Al finalizar la 40 etapa llevamos 2686 días de trabajo; 5.6 años de investigación.

Las E-41 y E-42 se adiciona 1.1 DL de tiodicarb (0.0002 gr) ; presentando mortalidad de 24 a 22% (Al igual que en las etapas anteriores la E-42 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Las E-43 y E-44 se aumenta a 1.2 DL de tiodicarb (0.00022 gr) disminuyendo la mortalidad a 18% Al finalizar la 44 etapa llevamos 2805 días de trabajo.

Las E-45 y E-46 se adiciona 1.1 DL de bifentrina (0.00000054 gr) ; presentando mortalidad de 20 a 18% (Al igual que en las etapas anteriores la E-46 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). Las E-47 y E-48 se aumenta a 1.2 DL de bifentrina (0.00000060 gr) disminuyendo la mortalidad a 16-14% Al finalizar la 48 etapa llevamos

2914 días de trabajo.

Las E-49 y E-50 se adiciona 1.1 DL de tiodicarb (0.00024 gr) ; presentando mortalidad de 10% (Al igual que en las etapas anteriores la E-50 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las E-51 y E-52 se aumenta a 1.2 DL de tiodicarb (0.00026 gr) disminuyendo la mortalidad a 8%. Al finalizar la 52 etapa llevamos 2198 dias de trabajo. Las E-53 y E-54 se adiciona 1.2 DL de bifentrina (0.00000066 gr) ; presentando mortalidad de 10% (Al igual que en las etapas anteriores la E-54 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Las E-55 y E-56 se aumenta a 1.3 DL de bifentrina (0.00000072 gr) disminuyendo la mortalidad a 8% Al finalizar la 56 etapa llevamos 3001 dias de trabajo.

Tabla No.3 Cuadro Comparativo Características Iniciales y Finales

Metharhizium anisolapliae

Los hongos se caracterizaron por presentar hifas lisas, septadas conidias predominantemente cilindricas, agrupadas, verduzcas uninucleadas de extremos redondeados, el tamaño promedio fue de 6 mm de largo y 2.5 mm de ancho.

El hábitat natural de éste hongo son larvas de suelo conocidas comúnmente como Gallina ciega, nombre científico Phillophaga , en suelos de cultivo de caña de azúcar donde se presenta esta plaga, generando afectaciones considerables a los cultivos.

Los hongos se caracterizan por presentar hifas lisas, septadas conidias predominantemente cilindricas, agrupadas, verduzcas uninucleadas de extremos redondeados, el tamaño promedio es de 6 mm de largo y 2.5 mm de ancho.

ETAPAS REALIZADAS EN EL LABORATORIO CON Metharhizium anisolapliae

Se inicia con las condiciones de hábitat. En laboratorio crece en sustrato de arroz con una humedad del 47% por un periodo de 7 dias a 28°, y exposición constante a la luz en PDA aproximadamente en 7 dias a 28 °C. Estas condiciones son nuestro punto de partida para ir adaptando la cepa a tiodicarb y bifentrina. Durante todas las etapas estamos utilizando lámpara de luz fría para ir adaptando al microorganismo a luz solar. Se realizaron 40 etapas iniciando los procesos con el medio de cultivo especial, al cual se le enriqueció con minerales. Durante las etapas E-l y E-2 (Etapa 1 y Etapa 2) al medio de cultivo se le adiciona 0.1 DL de tiodicarb (0.0000175 gr) . Luego de la incubación se registra un crecimiento lento hasta las 72 horas. Hasta el dia 45 de incubación se tiene una mortalidad del 58 a 56%. El 40% restante se mantiene por 10 dias en observación diaria, para continuar con la adaptación del microorganismo. Se mantiene la humedad y la temperatura del hábitat. (En la etapa 2 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de cepas resistentes) . Las cepas resistentes son transferidas a medios de cultivo sólidos con

0.2 DL (0.000035 gr) de tiodicarb (E-3 y E-4, nuevamente en la E-4 se utiliza la misma concentración de tiodicarb para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes) presentando mortalidad de 55%. Al finalizar la etapa E-4 se han seleccionado los organismos por 220 dias.

Las Etapas E-5 y E-b se les someten a una primera adición de bifentrina; el medio de cultivo se adiciona con 0.1 DL de bifentrina (0.00000006 gr) , presentando mortalidad de 54 a 52% (de la misma manera que el caso anterior, la E-6 se utiliza para reforzar el crecimiento de las cepas resistentes). Las Etapas E-7 y E-8 se aumenta al 0.2 DL de bifentrina (0.00000012 gr) presentando mortalidad de 50 a 48%. Al finalizar la E-8 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) el proceso de adaptación llega a 5421 dias.

En las Etapas E-9 y E-10 se agrega 0.3 DL (0.000053 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 52 a 48% (Al igual que en las etapas anteriores la E-10 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-ll y E- 12 se les adiciona 0.4 DL (0.000070 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 45 a 43%. Al finalizar la etapa

E-12 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 606 días de proceso de selección.

En las etapas E-13 y E-14 se adiciona 0.3 DL (0.00000018 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 40 a 38% (Al igual que en las etapas anteriores la E-14 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En las etapas E-15 y E-16 se aumenta a 0.4 DL (0.00000024 gr) presentando mortalidad de 38 a 35%. Al finalizar la etapa 16 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 754 días de proceso de selección.

En las etapas E-17 y E-18 se agrega 0.5 DL (0.000087 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 34 a 33% (Al igual que en las etapas anteriores la E-18 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para la etapa E-19 y E- 20 se les adiciona 0.6 DL (0.00011 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 33 a 31%. Al finalizar la E-20 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se contabilizan 874 días de selección.

Para las E-21 y E-22 se adiciona se agrega 0.5 DL (0.00000030 gr) de bifentrina, presentando mortalidad de 29 a 25% (Al igual que en las etapas anteriores la E-22 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Para las E-23 y E-24 se aumenta a 0.6 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 22 a 20%. Al finalizar la E-24 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 978 dias de trabajo.

En las etapas E-25 y E-26 se agrega 0.7 DL (0.00012 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 18 a 15% (Al igual que en las etapas anteriores la E-26 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes). En E-27 y E-28 se les adiciona 0.8 DL (0.00014 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 12 a 11%. Al finalizar la E-28 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan los 1060 dias de adaptación.

Para las E-29 y E-30 se adiciona el 0.7 DL de bifentrina (0.00000036 gr) presentando mortalidad de 11 a 9% (Al igual que en las etapas anteriores la E-30 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las E-31 y E-32 se aumenta al 0.8 DL de bifentrina (0.00000042 gr) presentando mortalidad de 7 a 5%. Al finalizar la E-32 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) se alcanzan 1125 dias de trabajo.

En las etapas E-33 y E-34 el 0.9 DL (0.00016 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 15% (Al igual que en las etapas anteriores la E-34 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . En las etapas E-35 y E- 36 se les adiciona 1 DL (0.00018 gr) de tiodicarb, presentando mortalidad de 15%. Al finalizar la E-36 (etapa de reforzamiento del crecimiento de las cepas resistentes) llevamos 2556 dias de adaptación.

Las E-37 y E-38 se adiciona 0.9 DL de bifentrina (0.00000042 gr) ; presentando mortalidad de 24 a 22% (Al igual que en las etapas anteriores la E-38 es para reforzamiento de crecimiento de cepas resistentes) . Las E-39 y E-40 se aumenta a 1 DL de bifentrina (0.00000048 gr) manteniendo la mortalidad en 28 a 25% Al finalizar la 40 etapa llevamos 2686 dias de trabajo Tabla No.4. Cuadro Comparativo Características Iniciales y Finales

REFERENCIAS

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microorganismos específicamente adaptados a el y su proceso de inoculación. Patente No. 26662, otorgada por el

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Orozco J. C, Martínez P. Evaluación de la inoculación con microorganismos fijadores de nitrógeno asimbióticos aislados de la rizosfera de Pinus patula en Colombia. Instituto de Investigaciones Biológicas Alexander von Humboldt, Estación

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