Verfahren für und Material eines Formstandards

Beschreibung

[0001] Makro-, mikro- und nanoskalige Partikel spielen in der Entwicklung, Produktion und Weiterverarbeitung in der Verfahrenstechnik, der Biotechnologie, der Nahrungsmittelindustrie oder Pharmazie eine wichtige Rolle. Neben der Partikelgröße wird zunehmend mittels innovativer Messtechniken die Partikelform beurteilt und quantifiziert. Es besteht daher erstens für die Hersteller der entsprechenden Messtechnik die Aufgabe, die entwickelten Messtechnologien und insbesondere die mathematischen Algorithmen zu validieren, zweitens ist aus Sicht der Nutzer die Frage der Vergleichbarkeit, Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit von unterschiedlichen Messtechniken von großer Bedeutung und drittens fordern Qualitätsmanagementsysteme nicht nur im geregelten Markt die Performance-Qualifizierung der eingesetzten Messtechnik. Dafür werden neuartige formdefinierte Referenzpartikel benötigt.

[0002] Flüssig-flüssig, flüssig-fest oder fest-flüssig Dispersionen (z.B. Emulsionen, Suspensionen, oder Suspoemulsionen) makro-, mikro- und nanoskaliger Partikel spielen in der Entwicklung, Produktion und Weiterverarbeitung in der Verfahrenstechnik, der Biotechnologie, der Nahrungsmittelindustrie oder Pharmazie eine wichtige Rolle und werden in allen Lebensbereichen eingesetzt. Dabei kommt es zu einer immer stärkeren Funktionalisierung der Teilchen, welches auch z.T. über spezielle Formgebung erfolgt. Des Weiteren hängen Fließ- und Abriebscharakteristika deutlich von der Form ab. Nachdem im letzten halben Jahrhundert die Bestimmung der Korngröße im F&E-Bereich sowie in der Industrie im Vordergrund stand, haben mit der Erhöhung der Qualitätsanforderungen an innovative Lösungen und Produkte Forderungen an die Quantifizierung der Partikelform und des Aggregationszustandes stark zugenommen. Dies wird nicht zuletzt durch die Erarbeitung eines neuen internationalen Standards ISO/FDIS 9276-6, welcher die notwendigen Kenngrößen definiert, dokumentiert. Exemplarisch seien hier z.B. nur Feret-Durchmesser, Längen-Breiten- Verhältnis, kreis- und ellipsenäquivalenter Durchmesser, der Größtkreis als Makrodeskriptoren und z.B. Sphärizität, Eckigkeit, Konkavität, Konvexität als Mesodeskriptoren genannt.

[0003] In den letzten Jahren wurde daher eine Vielzahl von analytischen Instrumenten zur Formanalyse von Partikeln vor allem im mikroskaligen Größenbereich entwickelt und am Markt platziert. Dabei kommen sehr unterschiedliche Messverfahren zum Einsatz, wie z.B.

Aufbringung der Teilchen auf eine Messfläche und digitale Fotographie mit und ohne Hilfsmittel zur Vergrößerung der Objekte (z.B. ITS Technologies AG., Vilters), Dispergierung der Teilchen in einem gasförmigen Trägermedium und Aufnahme der in einem Messschacht im freien Fall an der Aufnahmeoptik vorbei sinkenden Teilchen (z.B. Nanophox, Sympatec GmbH, Clausthal; CamSizer, Retsch Technology GmbH, Hahn), Dispergierung der Teilchen in einer Flüssigkeit und Aufnahme der Teilchen die ein hydrodynamisch fokussiertes oder nicht-fokussiertes Messvolumen durchströmen (z.B. FlowCam, Fluid Imaging Technologies Inc., Yarmouth, ME). Es sind auch Verfahren bekannt, welche im Sinne einer Sehnenlängen- messung die Unterbrechung eines Laserstrahls durch vorbeigeführte Teilchen detektieren (Laser Obscuration Time (LOT) Technology, Ankersmid, Netherlands). Letztendlich sind auch Entwicklungen auf dem Markt, welche zur Formanalyse die winkelabhängige Streuintensität eingestrahlten Laserlichtes messen.

[0004] Die Erfassung von Mikrodeskriptoren setzt generell die Verbesserung der Messtechnik voraus und ist für die vorliegende Erfmdungsaufgabe eher von untergeordneter Bedeutung.

[0005] Ohne auf technische Probleme der unmittelbaren Erfassung des formabhängigen Primärsignals einzugehen, müssen sich alle Verfahren mathematischer Algorithmen bedienen, welche die experimentell ermittelten Signale in eine dreidimensionale Form der vermessenen Objekte umrechnen und die Teilchenmengenstatistik bezüglich der Fraktionen mit unterschiedlicher Form und Größe angeben. Die Komplexität dieser Aufgabe wird deutlich, wenn man bedenkt, dass sich in vielen technischen Produkten die Teilchen sowohl in ihrem Volumen als auch in ihrer dreidimensionalen Form unterscheiden und das erhobene Primärsignal in der Regel nur ein- oder zweidimensional ist.

[0006] Es besteht daher erstens für die Hersteller von entsprechender Messtechnik die Aufgabe, die entwickelte Messtechnologie und insbesondere die mathematischen Algorithmen zu validieren, zweitens ist aus Sicht der Nutzer die Frage der Vergleichbarkeit, Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit von unterschiedlichen Messtechniken von großer Bedeutung und drittens fordern Qualitätsmanagementsysteme nicht nur im geregelten Markt die Performancequalifizierung der eingesetzten Messtechnik.

[0007] Diese Aufgaben erfordern geeignete Formstandards. Bisher sind weder zertifizierte noch nichtzertifϊzierte isomorphe Referenzpartikel (mit Ausnahme von sphärischen, welche für diese Aufgabe nicht einsetzbar sind) vorhanden, mit welchen man die Berechnungsalgorithmen testen, eine Gerätequalifizierung ermöglichen bzw. unterschiedliche Geräte vom gleichen Typ bzw. unterschiedliche Messverfahren vergleichen kann. Ein Grund dafür ist darin zu sehen, dass die preisgünstige Herstellung von streng isomorphen nichtsphärischen kleinen Partikeln technisch äußerst schwierig ist und selbst bei der Kristallisation eine breite Verteilung sowohl der Formparameter als auch der zahlenmäßigen Kenngrößen auftritt und damit die Anforderungen an Referenzmaterial nicht erfüllt werden können. Klassierungsverfahren bezüglich der Form sind nicht bekannt.

[0008] Es besteht daher die erfinderische Aufgabe ein Verfahren für und die Bereitstellung von isomorphen und möglichst isometrischen nichtsphärischen Formstandards sowie deren Mischungen zur Validierung von Messverfahren und Analysatoren zur Quantifizierung von Partikelformen und deren Kenngrößen insbesondere im mikro- bzw. nanoskaligen Größenbereich zu realisieren. Des Weiteren sollen die erfindungsgemäßen Formstandards auch die Qualitätskontrolle bzw. Performancequalifizierung beim Betreiber entsprechender Formmessgeräte eingesetzt werden.

[0009] Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.

[0010] Interessanterweise bietet die Natur eben diese isomorphen Objekte. So zeichnen sich z.B. Samen vieler Pflanzen durch eine recht große Vielfalt an Formen (Zylinderform, EIi- lipsoide, Nierenform) aus (Samenatlas der wichtigsten Futterpflanzen und ihrer Unkräuter, Deut. Bauerverlag, Berlin, 1955; Wunderbare Pflanzenwelt. Samen und Früchte. Stuttgart Parkland 1995, ISBN: 38880597960). Auch findet sich z.B. bei Kieselalgen, Sporen oder Pflanzenpollen eine sehr große Formenvielfalt bei sehr geringer Variabilität der Formkenngrößen. Der erfinderische Ansatz besteht also darin, geeignete Objekte zu identifizieren und eben diese Objekte als Ausgangspunkt für technisch verwertbare Formstandards zu nützen. Vorteilhaft sind dabei zwei Aspekte. Zum einem sind die biologischen Objekte sehr isomorph (gleiche Form) und zweitens sehr isometrisch (zahlenmäßig gleiche Kenngrößen). Beispielhaft seien hier die Pollen genannt, welche sich trotz einer hohen Formvielfalt für unterschiedliche Spezies durch eine hohe ähnlichkeit bezüglich der Form und der Größe (Figuren 1 bis 5) bei der jeweiligen Spezies auszeichnen. Durch die Vielfalt und die Formkonstanz der sehr

isomorphen Objekte, können nach entsprechender Aufarbeitung in idealer Weise Partikel mit unterschiedlichen morphologischen Kenngrößen bereitgestellt werden, um damit die Algorithmen sowie die Sensitivität der infrage stehenden Messmethoden bzgl. unterschiedlicher Formindizes zu testen und unterschiedliche technologische Messverfahren zu vergleichen. Es ist auch von Vorteil, dass z. B. Samen im Millimeterbereich, Pollen und Zellen im Mikrometerbereich sowie Sporen im Nanometerbereich angesiedelt sind und somit Formstandards mit unterschiedlichen äquivalentgrößen für verschiedene Messverfahren entsprechend deren Größenauflösung bereitgestellt werden können. überraschenderweise wurden auch biologische Objekte gefunden, welche durch einfache Behandlung in ihrer Form graduell verändert und danach diese Form durch eine chemische Behandlung z. B. mit Glutaraldehyd „eingefroren" werden kann. Als Beispiel sei hier der Säugererythrozyt genannt. Die typische eingedell- te diskusähnliche Grundform ist schematisch in Figur 6 gezeigt. Bemerkenswerterweise variiert das Volumen dieser Zellen bei isomorpher Form sehr stark z.B. 87 fl (Mensch), 50 fl (Rind) und 31 fl (Schaf). Das Volumen zeichnet sich dabei durch eine hohe Konstanz aus (Standardabweichung beim menschlichen gesunden Erythrozyten ca. 10 %). Durch Erhöhung des osmotischen Druckes des Suspensionsmediums kann die normale diskoide Form (Sphäri- zitätsindex 0,78) weiter eingedellt oder durch Verringerung die Form kontinuierlich bis zur Kugelgestalt (Sphärizitätsindex 1,0) geschwollen werden (Meier et al. Studia biophysica, 1983, 93, 101 - 109). Damit lassen sich in Einfacherweise graduell unterschiedliche Formen herstellen, mit Glutaraldehyd fixieren und die Empfindlichkeit der in den Geräten eingesetzten mathematischen Algorithmen überprüfen und unterschiedliche Gerätetechnologien und Auswerteansätze vergleichen.

[0011] Es ist auch möglich z.B. durch adsorbierende oder nicht-adsorbierende Polymere gezielt aus den Einzelpartikeln Aggregate bzw. Agglomerate zu erzeugen und damit die Formvielfalt weiter wesentlich zu erhöhen.

[0012] Interessanterweise hat sich auch gezeigt, dass die Oberfläche der Objekte (z.B. Pollen von Lilien) eine sehr ausgeprägte Struktur aufweisen und damit auch die Empfindlichkeit der Messverfahren auf Oberflächenstrukturen und die Bewertung von Meso- und Mikrodeskripto- ren getestet werden kann.

[0013] Entsprechend den unterschiedlichen Messtechniken macht es sich erforderlich, dass die Formstandardpartikel trocken oder nass dispergiert zum Einsatz kommen. Im Fall der

Herstellung von Suspensionen kann die Variation der Partikelvolumenkonzentration bzw. Massenkonzentration zusätzlich von Interesse sein. Besonders vorteilhaft ist es, dass unterschiedliche isomorphe Standardpartikel unabhängig von ihrer Dispergierform in beliebigen Verhältnissen gemischt werden können und damit bi-, tri- bzw. polymodale isomorphe und/oder isometrische Testproben zur Verfügung stehen.

[0014] Es hat sich weiterhin gezeigt, dass durch die Modifizierung der Oberfläche z.B. durch die Bindung eines Farbstoffes oder die Beschichtung mit einem Material mit geeignetem Brechungsindex der Einsatz kontrastarmer Formstandards z.B. für strömungsoptische Verfahren verbessert werden kann.

[0015] Für die Gewinnung des Ausgangsmaterials kann vorteilhafterweise auf Verfahren zurückgegriffen werden, welche z.B. für Blutzellen in der Transfusiologie, für die Gewinnung von Pollen als Ernährungszusatzstoffe bzw. allergenes Testmaterial, für die Anzucht und Ernte von Kieselalgen, die Ernte von Pflanzensamen etc. entwickelt wurden. Für die erfinderische Lösung sind hohe Anforderungen an die Artenreinheit zu stellen. In der Regel ist das gewonnene biologische Ausgangsmaterial aufzureinigen und gegebenenfalls zu klassieren. Vorteilhaft ist, dass von Natur aus diese Objekte häufig trocken dispergiert vorliegen. Als positiv hat sich herausgestellt, dass z.B. Samen, Pollen oder Sporen bis auf eine speziesabhängige Restfeuchte getrocknet werden können und bei Einhaltung dieser bei der Lagerung eine lange Verwendbarkeit gewährleistet ist. Die zusätzliche Behandlung mit Chemikalien zur Hemmung des Metabolismus oder Insektiziden, Fungiziden etc. wirkt sich positiv auf die Qualität der trocken gelagerten Formstandards aus und es sind Aufbewahrungszeiten von Jahren möglich. Auch ist es vorteilhaft möglich, die Ausgangsobjekte, Zwischenprodukte oder die finalen Referenzformstandards gekühlt (z.B. 4°C) oder tiefgekühlt (z.B. 18 ⁰ C) zu lagern und damit die Aufbewahrungszeiten auf Jahre zu verlängern.

[0016] Die Flüssigdispergierung geht von trockenen Objekten oder fixierten biologischen Objekten aus. Dabei sind die Dispergierflüssigkeiten so auszuwählen, dass trockene Objekte in der jeweilige Flüssigkeit sich nicht lösen, schrumpfen oder schwellen. Häufig hat sich als vorteilhaft der Einsatz nichtwässriger niedrigviskoser Dispergiermedien z.B. wasserfreies Siliconöl oder Alkohol herausgestellt.

[0017] Für die graduelle Veränderung der Form können gezielt Medien, welche das Objekt schwellen oder schrumpfen lassen, eingesetzt werden. So können Säugerzellen durch Ringerlösungen mit eingestelltem nichtphysiologischem osmotischen Druck in ihrer Form gezielt verändert werden. Die erhaltene Form kann vorteilhaft z.B. durch Fixierung mit Glutaralde- hyd stabilisiert und nass dispergiert über Jahre formkonstant aufbewahrt werden.

[0018] Bei der Sammlung der Objekte sowie der Dispergierung ist generell darauf zu achten, dass es nicht zur Beschädigung der Partikel bzw., wenn nicht ausdrücklich gewünscht, nicht zur Verklebung, Aggregation oder Flockung der Einzelpartikel kommt. Letztere oder von Natur aus vorliegende Aggregate oder Verklumpungen können vorteilhaft durch entsprechende Aufarbeitungsschritte (z.B. Waschungen) und/oder den Einsatz von oberflächenaktiven Stoffen, Dispergiermitteln und Stabilisatoren unterbunden werden. Insbesondere in Nassdispersionen wirkt sich die Zugabe von Antibiotika, welche z.B. eine bakterielle Zersetzung der Referenzpartikel verhindern, positiv auf die Lagerfähigkeit der Probe aus.

[0019] In einigen Fällen hat es sich jedoch als vorteilhaft erwiesen, die Aggregation von Teilchen in bestimmten Medien oder nach Oberflächenmodifizierung (z.B. Ankopplung von Rezeptoren) die Aggregatbildung gezielt zu induzieren und so größere Sekundärpartikel basierend auf isomorphen Primärpartikeln zu erhalten. Eine Oberflächenmodifizierung ohne Aggregatbildung kann auch dann von Vorteil sein, wenn dadurch der Formstandard für speziell Messverfahren erst einsetzbar wird. Die Anfärbung bzw. die Auflagerung einer Reflexionsschicht wurde als ein Behandlungsbeispiel erfolgreich praktiziert.

[0020] Es hat sich gezeigt, dass die Gewinnung von größeren Mengen des Ausgangsmaterials nicht immer gegeben ist. In diesen Fällen ist durch den Verschnitt mehrerer Ausgangsproben eine repräsentative Losmenge zu gewinnen und diese entsprechend zu bearbeiten. Die Erhebung der Formkenngrößen mittels einer Referenzmethode (z.B. Scanningmikroskopie) ist durch das Nehmen von repräsentativen Proben aus der Gesamtheit zu bewerkstelligen. Beispielhaft sind einige ermittelte Kenngrößen für 5 verschiedene Standards in Fig. 1 bis 5 angegeben. Vorteilhaft wird anschließend das gesamte Los mit einer entsprechenden Probenteilungstechnologie (z.B. Riffler) so konfektioniert und in entsprechende Probengefäße abgefüllt, dass die Probe später ohne weitere Präparation dem zu validieren Messverfahren zugeführt werden kann (ready to use).

[0021] Das mit der erfinderischen Lösung herstellbare Material für Formstandards eignet sich auch besonders gut mehrere unterschiedliche isomorphe Referenzpartikel (Proben) in beliebigen Mengen zu Mischen und damit polyisomorphe Testproben mit bekannter Zusammensetzung herzustellen. Dabei kann in Abhängigkeit von der speziellen Messtechnik die Teichen- menge(n) sowohl als Massen-, Volumen- oder Anzahlkonzentration eingestellt werden.

[0022] Die bezüglich ihrer Form und der Verteilung der Formkenngrößen mit einer Referenzmethode, welche an ein staatliches Normal angeschlossen sein sollte, charakterisierten Proben, wurden nun entsprechend den Vorschriften des Geräteherstellers einer Formanalyse mit dem System PowerShape (IST AG) unterzogen. Dazu wurden exemplarisch trockene diskoide Formstandards manuell auf der Aufnahmefläche verteilt und die Form der Teilchen mittels des Scanners in digitaler Weise (4000 dpi) aufgenommen. Anschließend wurden mittels der aktuellen Software von 3125 Teilchen die Formdiskriptoren Konvexität (0,9376), El- liptizität (1,6220) oder Kristallinität (1,1338) sowie die Korngröße (21,13 μm) bestimmt. Die Standardabweichungen der Formwerte lagen zwischen 22,4 % und 3,9 %. Aus den experimentellen Werten geht hervor, dass die Auswertealgorithmen prinzipiell stabil arbeiten und eine sinnvolle Rückklassifizierung ermöglichen, die Ausrichtung der Referenzpartikel auf der Aufnahmefläche jedoch das Ergebnis beeinflusst und dadurch höhere Standardabweichungen resultieren. Ein weiteres Testexperiment wurde mit einer Nassdispersion mit dem System Image-Pro Plus durchgeführt. In diesem Fall waren die Teilchen in einem Alkohol- Wassergemisch dispergiert und die Konzentration der Referenzteilchen wurde entsprechend den Herstellangaben eingestellt. In diesem Fall konnten z.B. u.a. die Länge, die Breite, der Perimeter, der min Feret Diameter, der maximale Feret Diameter, die Rundheit und die Kompaktheit von 50 Partikeln bestimmt werden. Die maximalste Standardabweichung von allen Formdiskriptoren war in diesem Fall (dynamische Bildauswertung) nur 5,9%. Länge und Breite stimmten mit den Referenzwerten sehr gut überein. Es zeigte sich weiter, dass in dem obigen Dispersionsmedium die Partikel quellen. So betrug die Rundheit unmittelbar nach der Dispergierung 0,52 und nach 11 Tagen 0,74. Der Quellvorgang kann durch die Wassermenge kontrolliert werden.

Erläuterung der Figuren 1 bis 5

Figur 1:

Figur 2:

Figur 3:

Figur 4:

Figur 5 :

Form: Zusamperimeter [μm] mengesetzte a b C V/A [μm] Pollenformen

Pinus nigra 41±4 .1 29 ±3.0 32 ±3 .1 5.58 n 123 86 38

Pinus sylves-

37 ±3 .5 26 ±2.4 29 ±3 .5 5.01 tris n 129 90 41

Figur 6:

Die typische eingedellte diskusähnliche Grundform (Eryform) ist schematisch in Figur 6 gezeigt.