Der weltweit Jahresbedarf am Zuckeralkohol D-Mannitol (D-Mannit) beläuft sich auf 30.000 Tonnen im Jahr. D-Mannitol findet Verwendung im Lebensmittelbe- reich als zahnschonender Süßstoff, in der Medizin als Plasmaexpander und Va- sodilator (Hexanitroderivat), sowie in der pharmazeutischen Industrie zur Produk- tion von Tabletten.

Die großtechnische Produktion von D-Mannitol erfolgt bisher über die katalyti- sche Hydrierung an Metallkatalysatoren von Glucose/Fructose-Gemischen als Ausgangsmaterialien. Aufgrund der fehlenden Stereospezifität der katalytischen Hydrierung beträgt die Ausbeute an D-Mannitol nur 25-30% mit einem dreifachen Überschuß an D-Sorbitol (Makkee M, Kieboom APG, Van Bekkum H (1985), Production methods of D-mannitol. StarchlStärke 37 : 136-140).

D-Mannitol und D-Sorbitol unterscheiden sich nur durch ihre Konfiguration am Kohlenstoffatom C-2 (Stereoisomere), so dass eine Abtrennung des unerwünsch- ten Sorbitols mit Schwierigkeiten verbunden und aufwändig ist.

Eine Alternative bietet die Herstellung von D-Mannitol durch enzymatische Hyd- rierung von D-Fructose in einem mikrobiellen Biotransformationsverfahren, bei dem eine rekombinante Mannitol-Dehydrogenase (MDH) aus Pseudomonas fluo- rescens isoliert wird und zusammen mit einer Formiat-Dehydrogenase (FDH) aus Candida boidinii und NADH in einem Membranreaktor inkubiert wird (Slatner, M. et al. (1998) Biotransf. 16 : 351-363). Durch den Einsatz der Formiat- Dehydrogenase wird ein Reduktions-Oxidationszyklus für NADH geschaffen, welches durch die Membran im Reaktionsgefäß zurückgehalten wird. Dadurch konnten lediglich 70-90% der Fructose in D-Mannitol umgewandelt werden. Fer- ner besitzt die eingesetzte Mannitol-Dehydrogenase eine mangelnde Stabilität (50 h Halbwertszeit ; nach Stabilisierung mit Dithiothreitol : 100h), Empfindlichkeit

gegenüber hohen Temperaturen >30°C sowie gegenüber Scherkräften. Ein wei- terer großer Nachteil liegt darin, dass Membranreaktoren auf Grund der hohen Kosten für isolierte Enzyme, benötigte Cofaktoren und Membranen für eine groß- technische Produktion ungeeignet sind.

Eine weitere Möglichkeit der D-Mannitol Produktion bietet ein fermentatives Ver- fahren, wobei Ausbeuten von ca. 85% unter Einsatz von D-Fructose/D-Glucose- Gemischen als Substrate und dem heterofermentativen Milchsäurebakterium Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291 als katalysierenden Organismus in einer Fermentation mit wachsenden Zellen erhalten wurden (Soetaert (1991) Synthesis of D-mannitol and L-sorbose by microbial hydrogenation and dehydro- genation of monosaccharides. PhD Thesis, University of Gent)). Das Gen der MDH aus Leuconostoc pseudomesenteroides und dessen Charakterisierung ist ebenfalls bekannt (J. Aarnikunnas et. al., Applied Microbiology and Biotechnolo- gy, 13. Juli 2002). Die hierbei für die Reduktion von Fructose zu D-Mannitol not- wendigen Reduktionsäquivalente stammen aus der Oxidation von Glucose zu organischen Säuren. Neben dem Problem der nur 85% igen Umsetzung des Sub- strates Fructose zu D-Mannitol ist der Einsatz von D-Glucose nachteilig, da eine Kontamination des Zielproduktes mit organischen Säuren während der Fermen- tation auftritt und diese organischen Säuren durch aufwendige Prozeßschritte entfernt werden müssen. Bei Fermentationen mit wachsenden Zellen kann keine 100% ige Umsetzung des Substrates zum Produkt erzielt werden, da ein Teil des Substrates zum Zellaufbau bzw. zur Neubildung von Biomasse verbraucht wird.

Zudem ist die Fermentation von Leuconostoc mesenteroides schwierig (Schleim- bildung) und teuer aufgrund der komplexen Medien und die Aufarbeitung des Überstandes daher ebenfalls aufwändig.

Aus der Literatur sind drei weitere Mannitol-2-Dehydrogenasen bekannt und auch hinsichtlich ihrer biochemischen Eigenschaften und Nukleotid- /Aminosäuresequenzen beschrieben. Hierzu gehört die Mannitol-2- Dehydrogenase aus Pseudomonas fluorescens DSM 50106 (Brünker P, Altenbuchner J, Mattes R (1998) Structure and function of the genes involved in mannitol, arabitol and glucitol utilization from Pseudomonas fluorescens DSM 50106. Gene 206 : 117-126. ), aus Rhodobacter sphaeroides Si4 (Schneider KH, Giffhorn F, Kaplan S (1993) Cloning, nucleotide sequence and characterization of

the mannitol dehydrogenase gene from Rhodobacter sphaeroides. J. Gen.

Microbiology 139 : 2475-2484) sowie aus Agarics bisporus (Stoop JM, Mooibroeck H (1998) Cloning and characterization of NADP-mannitol dehydrogenase cDNA from the button mushroom Agarics bisporus, and its expression in response to NaCI stress. Appl. Environ. Microbiol. 64 : 4689- 4696. ). Die beiden Erstgenannten gehören zur Gruppe der langkettigen De- hydrogenase/Reduktase Protein Familie (LDR), die letztgenannte zur Gruppe der kurzkettigen Dehydrogenase/Reduktase Protein Familie (SDR).

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von D-Mannitol bereitzustellen, das die beschriebenen Nachteile des Standes der Technik vermeidet.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Produktion von D-Mannitol mittels ei- nes Mannitol-2-Dehydrogenase (MDH) exprimierenden Organismus, wobei die Zucker-Substrate und/oder Zucker-Substratvorläufer der MDH über ein nicht- phosphorylierendes Zucker-Transportsystem in den Organismus transportiert werden, gelöst.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird erreicht, dass der mit der MDH um- zusetzende Zucker ohne eine vorherige Phosphorylierung direkt durch die MDH zu D-Mannitol umgesetzt werden kann. Durch diese direkte Umsetzung werden überraschenderweise gegenüber dem bisherigen Stand der Technik verbesserte Ausbeuten und Konzentrationen des D-Mannitol im Reaktionsüberstand ermög- licht. Teilweise werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren schon Ausbeuten von bis 100 % bezogen auf das Substrat (Glukose) erhalten. Ferner werden Kon- zentrationen bis zu 40 g/L mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielt.

Unter Organismus werden sowohl ein-als auch mehrzellige Organismen, insbe- sondere Mikroorganismen verstanden.

Ferner wird die Aufgabe durch einen Mikroorganismus gelöst, der die Enzyme MDH gemäß Sequenz Nr. 2 und FDH gemäß Sequenz Nr. 3 zur mikrobiellen Herstellung von D-Mannitol exprimiert und ein nicht-phosphorylierendes Zucker-

Transportsystem aufweist, das die Zucker-Substrate und/oder Zucker- Substratvorläufer der MDH in den Mikroorganismus transportiert.

Unter der Bezeichnung D-Mannitol soll nachfolgend auch D-Mannit verstanden werden.

Im Rahmen dieser Erfindung werden alle Nukleotidsequenzen, die für eine Man- nitol-2-Dehydrogenase codieren unter der Bezeichnung"mdh-Gensequenz"zu- sammengefasst. Das Enzym Mannitol-2-Dehydrogenase wird im Folgenden unter der Bezeichnung"MDH"zusammengefasst.

Entsprechend werden alle Nukleotidsequenzen, die für eine Formiat- Dehydrogenase codieren unter der Bezeichnung"fdh-Gensequenz"zusammen- gefasst. Das Enzym Formiat-Dehydrogenase wird im Folgenden unter der Be- zeichnung"FDH"zusammengefasst.

Auch werden alle Nukleotidsequenzen, die für einen Glukosefacilitator codieren unter der Bezeichnung"g/f-Gensequenz"zusammengefasst. Das Protein Gluko- sefacilitator wird im Folgenden unter der Bezeichnung"GLF"zusammengefasst.

Ferner werden unter Nukleotidsequenz alle Nukleotidsequenzen verstanden, die (i) exakt den dargestellten Sequenzen entsprechen ; oder (ii) mindestens eine Nukleotidsequenz umfaßen, die innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes den dargestellten Sequenzen entspricht ; oder (iii) mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit einer zur Nukleotidsequenz (i) oder (ii) komplemetären Nukleotidsequenz hybridisiert, und gegebenenfalls (iiii) funkti- onsneutrale Sinnmutationen in (i) umfasst. Dabei bedeutet der Begriff funktions- neutrale Sinnmutationen den Austausch chemisch ähnlicher Aminosäuren, wie z.

B. Glycin durch Alanin oder Serin durch Threonin.

Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vo- rausgehenden (5-oder upstream) und/oder nachfolgenden (3-oder downstream) Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA- Stabilität oder das RNA Processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele

für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Te- minatoren oder Translationsverstärker.

Unter die jeweiligen Enzyme fallen auch Isoformen, die als Enzyme mit gleicher oder vergleichbarer Substrat-und Wirkungsspezifität verstanden werden, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen.

Unter modifizierten Formen sind erfindungsgemäß Enzyme zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N-und/oder C-Teminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne je- doch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaustauschen nach bekannten Methoden vorgenommen werden.

Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Zucker-Transportsystem um den Glu- kosefacilitator (GLF) gemäß Nukleotidsequenz Nr. 1, der bevorzugterweise aus einem Eukaryonten z. B. einer Hefe stammt. Bevorzugterweise kann auch der GLF aus Zymomonas mobilis eingesetzt werden, der von T. Conway et al (Jour- na of Bacteriology, Dec. 1990, p. 7227-7240) kloniert wurde.

Aus der Deutschen Patentanmeldung 198 18 541.3 ist zwar ein Verfahren zur Herstellung von Substanzen aus dem aromatischen Stoffwechsel bekannt, bei dem ein Mikroorganismus eingesetzt wird, der eine erhöhte Aktivität eines Gluko- se-oxidierenden Enzyms aufweist und Glukose oder Glukose-haltige Substrate durch Oxidation zu Glukonolakton oder Glukonat sowie durch Phosphorylierung des Glukonats zu 6-Phosphoglukonat umgesetzt, wobei neben der Erhöhung der Enzymaktivität der Oxidase und/oder der Phosphatase zur Erhöhung der vor- handenen Menge PEP die Aktivität eines PEP-unabhängigen Glukose- Transportproteins erhöht werden, bei dem es sich um den Glukosefacilitator (GLF) aus Zymomonas mobilis handeln kann. Ein Verfahren zur Herstellung von Mannitol ist allerdings daraus nicht zu entnehmen.

Der GLF kann neben Fructose auch Glukose oder Xylose transportieren, wovon insbesondere Glukose als preiswerter Fructose-Vorläufer interessant ist. Die

Glukose kann, wie noch beschrieben werden wird, in Fructose umgewandelt werden.

Die für MDH codierende Sequenz aus Mikroorganismen der Familie der Lacto- bacteriaceae, insbesondere Leuconostoc pseudomesenteroides eignet sich be- sonders für die Umsetzung zu D-Mannitol aufgrund der hohen Aktivität und Stabi- lität der daraus synthetisierten MDH.

Bevorzugt exprimiert der Organismus die Sequenz Nr. 2 codierend für MDH.

Als Organismus eignen sich besonders Mikroorganismen aus der Gattung Bacil- lus, Pseudomonas, Lactobacillus, Leuconostoc, den Enterobakteriaceae oder methylotrophen Hefen und Pilzen. Weiterhin können auch alle in der Lebensmit- telindustrie verwendeten Mikroorganismen eingesetzt werden.

Besonders bevorzugt stammt der eingesetze Organismus aus der Gruppe Ach- romobacter parvolus, Methylobacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec. 101, Pseudomonas oxalaticus, Moraxella sp., Agrobacteri- um sp., Paracoccus sp., Ancylobacter aquaticus, Maxcobacterium vaccae, Pseu- domonas fluorescens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lac- tobacillus sp., Lactobacillus brevis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Gluco- nobacter oxydans, Candida boidinii, Candida methylica oder auch Hansenula polymorpha, Aspergillus nidulans oder Neurospora crassa oder insbesondere Escherichia coli oder Bacillus subtilis.

Die Analyse der D-Mannitol-Konzentration kann enzymatisch/photometrisch nach der Methode von K. Horikoshi (Horikoshi K. (1963) Meth. Enzym. Analysis, 3rd ed. Vol. 6. H. U. Bergmeyer, Hrsg., Verlag Chemie, Weinheim), oder durch Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Lindroth et al. (1979) Analytical Chemistry 51 : 1167-1174) beschrieben.

Zur Etablierung eines Oxidations-Reduktionszyklus kann eine Formiat- Dehydrogenase (FDH) codierende Sequenz eingesetzt werden. Vorzugsweise stammt diese aus Mycobacterium vaccae und besitzt eine Nukleotidsequenz ge- mäß Sequenz Nr. 3. Diese ist für sich gesehen aus K. Soda et al, Appl. Microbiol.

Biotechnol (1995) 44,479-483 bekannt.

Hierdurch wird eine erhebliche Steigerung der Ausbeute bzw. der Umsatzrate des Substrates Fructose zu Mannitol durch Schaffung eines Cofaktor- Regenerationssystems ermöglicht. Dabei wird nicht mehr das Substrat für die Bereitstellung der für die Reduktion von Fructose zu Mannitol notwendigen Re- duktionsäquivalente verbraucht, sondern durch ein zweites Enzymsystem bereit- gestellt. Folglich steht das Coenzym NADH in erhöhtem Maße für die Umsetzung zu Mannitol zur Verfügung. Eines der am häufigsten eingesetzten Systeme ist die Regenerierung mit einer Formiat-Dehydrogenase, z. B. aus Mycobacterium vac- cae. Durch den Einsatz dieses Enzyms zusammen mit einer beliebigen MDH, bevorzugt aus Leuconostoc pseudomesenteroides, wird ein Oxidations- Reduktionszyklus geschaffen, in dem Formiat als Elektronendonator und D- Fructose als Elektronenakzeptor fungiert. Dabei katalysiert das Enzym Formiat- Dehydrogenase die Oxidation von Formiat zu C02 und das Enzym MDH die Re- duktion von D-Fructose zu D-Mannitol (s. Fig. 1). Der intrazelluläre Nicotinsäu- reamid-Adenin-Dinucleotid (NAD)-Pool dient als Elektronen-Shuttle zwischen beiden Enzymen. Die Oxidation von Formiat zu C02 ist thermodynamisch güns- tig, da die freie Standardbildungsenergie AG°'für C02 deutlich negativ ist und das C02 durch Ausgasen aus dem Reaktionsgleichgewicht entfernt wird. Die er- höhte intrazelluläre NADH-Konzentration, resultierend u. a. aus der Formiatoxida- tion, steigert die Reduktionskraft für die Reduktion von D-Fructose zu D-Mannitol, katalysiert durch MDH.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens wird neben den bereits genannten Kohlenstoffquellen als Substrat für die Herstellung D-Glucose eingesetzt. D-Glucose kann durch Umwandlung mit dem Enzym D- Glucose/Xylose-Isomerase (EC 5.3. 1.5) zu D-Fructose umgewandelt werden (2).

Die Umwandlung ist sowohl innerhalb als auch außerhalb des Organismus mög- lich. Der Einsatz von D-Glucose als Substrat in einem Verfahren zur Produktion von D-Mannitol bewirkt eine deutliche Verbesserung der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens.

Für das beschriebene Verfahren eignen sich nicht nur Mikroorganismen, in die eine Formiat-Dehydrogenase und eine MDH eingebracht und/oder verstärkt wird, sondern auch Mikroorganismen, die bereits über eine Formiat-Dehydrogenase oder gegebenenfalls eine MDH verfügen, wie z. B. Achromobacter parvolus, Me- thylobacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec.

101, Pseudomonas oxalaticus, Moraxella sp., Agrobacterium sp., Paracoccus

sp., Ancylobacter aquaticus. Dazu gehören Mikroorganismen wie z. B. Pseudo- monas fluorescens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lacto- bacillus sp., Lactobacillus brevis, Gluconobacter oxydans sowie bevorzugt auch Leuconostoc pseudomesenteroides oder Mikroorganismen, die bereits über bei- de Enzyme verfügen und jeweils in ihrer Aktivität verstärkt werden. Weiterhin geeignet sind beispielsweise auch methylotrophe Hefen wie Candida boidinii, Candida methylica oder auch Hansenula polymorpha, Pilze wie Aspergillus nidu- lans und Neurospora crassa sowie alle auch in der Lebensmittelindustrie ver- wendeten Mikroorganismen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem Mikroorganismus ist es nun- mehr möglich, eine verbesserte Umsetzung des Substrates in das Produkt D- Mannitol zu erreichen. Es wird gegenüber bisher bekannten Verfahren eine er- höhte Produktivität, sowie eine erhöhte Ausbeute (bis zu 100 %) an D-Mannitol erreicht. Es wurden schon Konzentrationen bis zu 40 g/L erzielt. Das Verfahren ist daher für eine großtechnisch rentable Herstellung von D-Mannitol besonders geeignet. Durch die Schaffung des Regenerationssystems mit Hilfe der Formiat- Dehydrogenase kann für die NADH verbrauchende MDH in erhöhtem Maße ohne eine nachteilige Bildung von stoffwechselbedingten Nebenprodukten mit ruhen- den Zellen eine erhöhte Umsetzung des Substrates in das Produkt D-Mannitol ermöglicht werden.

Unter die Erfindung fallen auch die Verwendung von Nukleotidsequenzen gemäß Sequenzen Nr. 1,2 und 3 codierend für GLF, MDH und FDH zur Verwendung in einem der oben beschriebenen Mikroorganismen.

Ebenso umfasst die Erfindung eine Genstruktur enthaltend mindestens eine oder mehrere der obigen Nukleotidsequenzen.

Ein Vektor enthaltend mindestens eine oder mehrere der obigen Nukleotidse- quenzen oder eine oder mehrere der vorgenannten Genstrukturen ist ebenfalls in der Erfindung enthalten.

Die Erfindung umfasst auch die Verwendung der vorgenannten Nukleotidse- quenzen, Genstrukturen und Vektoren in den beschriebenen Mikroorganismen

bzw. Mikroorganismen, die diese Nukleotidsequenzen, Genstrukturen und Vekto- ren enthalten.

Die Zeichnungen zeigen beispielhaft Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfah- rens sowie eine schematische Darstellung der wichtigsten Stoffwechselwege, die für das Verfahren eine Rolle spielen. Es zeigt : Fig. 1 : Oxidoreduktionszyklus mit Formiat-Dehydrogenase und MDH schema- tisch in einer Zelle.

Fig. 2 : Ableitung einer degenerierten 24 Basen-Oligonukleotid-Sonde von der N-terminalen Aminosäuresequenz der MDH Untereinheit von Leuco- nostoc pseudomesenteroides ATCC 12291.

Fig. 3 : Genkarte des 4,191 bp Eco RI Fragments isoliert aus der genomischen DNA-Plasmidbank von Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 nach Immuno-Screeening des mdh-Gens. Die Pfeile zeigen die Richtung der Translation des mdh ORF sowie 4 ORFs an.

Sequenz Nr. 1 zeigt die Nukleotidsequenz codierend für GLF aus Zymomonas mobils.

Sequenz Nr. 2 zeigt die Nukleotidsequenz codierend für MDH aus Leuconostoc pseudomesenteroides.

Sequenz Nr. 3 zeigt die Nukleotidsequenz codierend für FDH aus Mycobacteri- um vaccae N10.

Im Folgenden soll die Erfindung beispielhaft beschrieben werden.

I) Mannitol-2-Dehydrogenase aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 : Reinigung und Charakterisierung des Enzyms ; Kionie- rung und funktionelle Expression des mdh-Gens in Escherichia coli a) Bakterienstämme und Plasmide Als Quelle für die Isolierung der MDH wurde Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 eingesetzt. E. coli JM 109 (DE 3) (Promega) diente als Wirtsorga- nismus zur Herstellung einer partiellen Plasmidbank für die Isolierung der geno- mischen DNA aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291. Ein Teil der Plasmidbank wurde durch Ligation eines 4.0-4. 5 kb Eco RI Fragments genomi- scher DNA aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 in pUC18 her- gestellt. b) Kultivierungsbedingungen Zur Kultivierung von Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 wurde folgendes Kultivierungsmedium verwendet : Trypton 10 g/I, Hefeextrakt 10 g/l, K2HP04 10 g/l, D-Fructose 20 g/I, D-Glucose 10 g/I, Vitamin/Mineral-Lösung 10 ml/l, in destilliertem Wasser ; pH-Wert auf 7,5 unter Verwendung von Ortho-Phosphorsäure.

Zur Subklonierung und Präparation der Plasmidbank der genomischen Leuco- nostoc DNA, wurde E. coli JM109 (DE 3) mit 170 Upm bei 37°C in Luria-Bertani Medium unter Zusatz von Ampicillin (100 pg/ml) oder Carbenicillin (50 pg/ml) kultiviert. c) Bestimmung der Aktivität von MDH aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 Die Enzymaktivität wird in der vorliegenden Erfindung photometrisch über die Abnahme der NADH-Konzentration für die Reduktionsreaktion D-Fructose + NADH + H+ + D-Mannitol + NAD+

bestimmt. Der Ansatz zur Messung der Aktivität der MDH enthielt 200 uM NADH und 200 mM D-Fructose in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer bei pH 6,5. Die spezi- fischen Aktivitäten der Rohextrakte und der partiell gereinigten Enzymisolate werden als Units pro Milligramm Protein (U/mg) angegeben, wobei 1 U als 1 , umol Substratabnahme pro Minute definiert wird. d) Bestimmung der Proteinkonzentrationen Alle Proteinkonzentrationsbestimmungen wurden nach der Methode von Bradford durchgeführt. e) Auftrennung von Proteinen mittels Polyacrylamidgelelektrophorese Reinheitsanalysen von Rohextrakten und partiell gereinigten Enzymisolaten, so- wie Präparationen vorbereitend auf Western-Blots wurden elektrophoretisch in diskontinuierlichen 12 % igen SDS-Polyacrylamidgelen durchgeführt nach der Methode von Lämmli. f) Isolierung der Mannitol-2-Dehydrogenase aus Leuconostoc pseudomesente- roides ATCC 12291 Zur Isolierung der Mannitol-2-Dehydrogenase wurden nach einem Zellaufschluß folgende Verfahrensschritte durchgeführt : Ammoniumsulfat-Präzipitation, Hydro- phobe Interaktionschromatographie, Anionentauscherchromatographie I, Anio- nentauscherchromatographie 11, Größenausschlusschromatographie, sowie ein Chromato-focusing pH 5-4.

Die spezifische Aktivität der MDH betrug bei pH = 5,35 für die Reduktion von D- Fructose zu D-Mannitol 450 U/mg g) Molekulargenetische Methoden Die Isolierung von genomischer DNA aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291, die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen, die Mar- kierung von DNA-Sonden mit Digoxigenin modifiziertem dUTP und immunologi- sche Detektion und DNA-DNA-Hybridisierung (Southern Blot) wurden durchge- führt.

Die aminoterminale Ansequenzierung der 43 kDa-Enzymuntereinheit mittels Ed- man-Abbau und anschließender HPLC-Analyse ergab die oktamere Aminosäu- reabfolge MEALVLTG. Unter Verwendung einer Codon usage-Statistik für Leu- conostoc pseudomesenteroides, wurde eine 2048fach degenerierte Oligonukleo- tid-Sonde zur Detektion des Mannitol-2-Dehydrogenase-Gens an genomischer DNA von Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 abgeleitet (siehe Fig.

2). Die 24 bp-DNA-Sonde wurde mit einem Digoxigenin-11-dUTP-Schwanz am 3'-Ende versehen und diente zum Immuno-Screening von partiellen Plasmidban- ken genomischer DNA von L. pseudomesenteroides ATCC 12291. Auf diesem Wege wurde ein 4,2 kb-DNA-Fragment isoliert (Fig. 3). Mit geeigneten Primern wurde das mdh-Gen von diesem Fragment amplifiziert, in den Vektor pET24a (+) ligiert und in E. coli BL21 (DE3) transformiert und exprimiert. Zellextrakte von E. coli BL21 (DE3) pET24a (+) Lmdh zeigten nach Induktion in der SDS- Polyacrylelektrophorese eine starke Überexpressionsbande bei 43 kDa und eine spezifische Aktivität der Mannitol-2-Dehydrogenase von 70 U/mg Protein, wäh- rend die Kontrollen (Zellen ohne Plasmid, Zellen mit leerem Plasmid) keine Akti- vität zeigten.

Die Nukleotidsequenz des mdh-Gens aus L. pseudomesenteroides ATCC 12291 ist in Sequenz Nr. 2 gezeigt.

II) Biotransformation von D-Fructose zu D-Mannitol mit einem rekom- binanten E. coli-Stamm In einem rekombinanten E. coli-Stamm wurden die Enzyme Formiat- Dehydrogenase (EC 1.2. 1.2) und Mannitol-2-Dehydrogenase (EC 1.1. 1.67) übe- rexprimiert, um in den Zellen einen Oxidations-Reduktionszyklus zu etablieren. In diesem Oxidations-Reduktionszyklus wird Wasserstoff von Formiat über zellulä- res NAD+ auf D-Fructose übertragen, wobei D-Fructose zu D-Mannitol reduziert wird (s. Fig. 1). Zusätzlich wurde in den Zellen der Glukosefacilitator exprimiert, um die Verfügbarkeit des Substrats Fructose zu verbessern.

(a) Stämme und Vektoren Es wurden die Stämme E. coli BL21 (DE3) Star (Invitrogen) verwendet. Als Vek- toren wurden pET-24a (+) fdh/mdh, kodierend für den ORF der Formiat-

Dehydrogenase aus Mycobacterium vaccae, der Mannitol-2-Dehydrogenase aus Leuconostoc pseudomesenteroides und pZY507g1f kodierend für den Glukosefa- cilitator aus Zymomonas mobilis verwendet.

Für die Biotransformation wurden chemisch kompetente E. coli BL21 (DE 3) Star mit pET-24a (+) fdhlmdh und pZY507g1f kotransformiert und auf LB-Agarplatten mit 25 pg/ml Chloramphenicol und 30 ug/ml Kanamycin selektiert. Als Kontrollen wurden E. coli BL21 (DE 3) Star entweder mit pET-24a (+) fdhlmdh oder pZY507g/f allein transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LB- Agarplatten mit entweder 25 pg/ml Chloramphenicol (pZY507g/f) oder mit 50 pg/ml Kanamycin (pET-24a (+) fdhlmdh). LB-Agarplatten für E. coli BL21 (DE 3) Star transformiert mit p pET-24a (+) fdh/mdh enthielten zusätzlich l% (v/v) D- Glucose zur Verminderung der Basalexpression der Mannitol-2-Dehydrogenase und der Formiat-Dehydrogenas.

(b) Biotransformation Nach der Überexpression von FDH, MDH und GLF in E. coli, werden nicht wach- sende Zellen in einer Biotransformation eingesetzt. Je 1,0 g induzierte Zellen von E. coli BL21 (DE 3) Star pET-24a (+) fdhlmdh/pZY507gif wurden mit 100 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 7,0 gewaschen und in 50 mi Reaktionslösung mit 500 mM D-Fructose und 500 mM Natriumformiat in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 6,7 resuspendiert. Die Ansätze wurden in 100 ml-Kolben ohne Schikane bei 100-120 Upm und 30°C für 24 h geschüttelt. Zu den Zeitpunkten 0,1, 2,3, 4,5, 6,8, 17 und 23 h nach Reaktionsstart wurden 1-2 ml-Proben des Überstandes genommen zur Messung der Konzentrationen von Formiat, D-Fructose und D- Mannitol. Die Proben wurden bei 5000g für 1 min zentrifugiert, der Überstand 0,2 pm-filtriert und bis zur Messung durch HPLC bei-20°C gelagert. Als Kontrolle wurden 1,0 g nicht induzierte Zellen von E. coli BL21 (DE 3) Star pET- 24a (+) fdhlmdh/pZY507gIf in gleicher Weise in der Biotransformation eingesetzt.

Die Konzentrationsbestimmungen von Formiat, D-Fructose und D-Mannitol im Reaktionsüberstand und im zellfreie Rohextrakt wurden mit einer HPLC-Anlage (Merck/Hitachi) durchgeführt.

Tabelle 1 zeigt beispielhaft Ergebnisse, die mit transformierten Mikroorganismen erreicht werden konnten.

Es konnte gezeigt werden, dass die parallele Überexpression der Formiat- Dehydrogenase und der Mannitol-2-Dehydrogenase und des Glukosefacilitators in E. coli zu einer sehr hohen Produktion von D-Mannitol durch diese Zellen in einem Reaktionsmedium mit D-Fructose und Formiat führt. Die bis zu 244 mM Mannitol nach 23 h stehen dem Verfahren ohne GLF mit nur 15 mM nach 17 h und dem Verfahren ohne FDH mit 20 mM nach 17 h gegenüber. Es konnte also eine ca. 12-15-fache Verbesserung erzielt werden.

Tabelle 1 Mannitol-Fructose-Formiat- rekombinante Bedingungen Produktion Verbrauch Verbrauch Gene [mM] [mM] [mM] fdh/mdh/glf +IPTG / +Formiat / 23 h 244 332 471 fdh/mdh/glf-IPTG/+ Formiat/17 h 0 n. d. n. d. fdh/mdh/glf + IPTG/-Formiat/17 h 11 76 n. d. mdh/glf + IPTG/+ Formiat/17 h 20 48 81 mdh/glf-IPTG/+ Formiat/17 h 0 n.d. n.d. fdh/mdh + IPTG/+Formiat/17 h 15 61 159 fdh/mdh-IPTG/+ Formiat/17 h 0 n. d. n. d. mdh + IPTG/+Formiat/17 h 0 57 35 mdh-IPTG/+ Formiat/17 h 0 n.d. n.d. fdh/glf +/-IPTG/+ Formiat/17 h 0 n. d. n. d. fdh +/-IPTG/+ Formiat/17 h 0 n. d. n. d. glf +/-IPTG/+ Formiat/17 h 0 n.d. n.d.

SEQUENZ Nr. 1 :

SEQUENZ Nr. 2 :

SEQUENZ Nr. 3 :