eines optischen Mediums

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Brechungsindex eines opti schen Mediums in einem Mikroskop, das ein einem Probenraum zugewandtes Objektiv aufweist, wobei das optische Medium mit dem zu bestimmenden Brechungsindex ei nes von zwei optischen Medien ist, die in dem Probenraum an zwei entgegengesetzte Oberflächen eines Deck- oder Tragglases grenzen und dadurch zwei teilreflektierende Grenzflächen bilden, die in unterschiedlichen Abständen von dem Objektiv angeordnet sind. Der Erfindung betrifft ferner ein Mikroskop mit einer Einrichtung zur Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums.

Die lichtmikroskopische Abbildung einer Probe wird durch die verschiedenen optischen Medien beeinflusst, die in einem Probenraum eines Mikroskops aneinandergrenzen. Diese optischen Medien bilden infolge ihrer unterschiedlichen Brechungsindizes Grenz flächen, an denen sich der Brechungsindex sprunghaft ändert. Jede dieser Grenzflä chen wirkt sich abhängig davon, wie groß der Sprung des Brechungsindex dort ist, un terschiedlich auf die optische Abbildung aus. Insbesondere die sphärische Aberration wird durch die sprunghafte Variation des Brechungsindex signifikant beeinflusst. Zu den an der Abbildung mitwirkenden optischen Medien zählen üblicherweise ein Deck oder Tragglas sowie die beiden Medien, die von entgegengesetzten Seiten her an das Deck- oder Tragglas grenzen. Letztere sind beispielsweise durch ein Immersionsme dium, das sich zwischen dem Deck- oder Tragglas und dem Objektiv befindet, und ein die Probe umgebendes Einbettmedium gebildet.

Um eine wirksame Korrektion der Abbildungsfehler, die durch eine sprunghafte Varia tion des Brechungsindex beeinflusst werden, zu ermöglichen, ist es wichtig, die Bre chungsindizes der verwendeten optischen Medien zu kennen. Dabei sind häufig die Brechungsindizes des Deck- oder Tragglases und des Immersionsmediums von vorne- herein mit hoher Genauigkeit bekannt. Dies gilt jedoch nicht für den Brechungsindex des die Probe umgebenden Einbettmediums. Dieser Brechungsindex ist deshalb in ei ner eigens hierfür vorgesehenen Messung außerhalb oder innerhalb des Mikroskops zu ermitteln.

Eine Messung des Brechungsindex außerhalb des Mikroskops ist mit der Unwägbarkeit einer nach der Messung erfolgenden Probenpräparation verbunden. Eine Korrelation des außerhalb des Mikroskops gewonnenen Messwertes mit dem in der lichtmikrosko pischen Abbildung tatsächlich wirksamen Brechungsindex kann nicht sichergestellt werden. So wird in manchen Anwendungen, z. B. in der Lebendzellmikroskopie, der Brechungsindex des Einbettmediums signifikant von der Probe beeinflusst und ist so mit außerhalb der mikroskopischen Präparation gar nicht mit hinreichender Genauig keit messbar.

DE 10 2006 021 996 Al offenbart ein Mikroskop zur internen Totalreflexionsmikrosko pie, kurz TIRF, das eine Bestimmung des Brechungsindex innerhalb des Mikroskops er möglicht. Dieses TIRF-Mikroskop umfasst ein Objektiv, durch das die Probe mit einer evaneszenten Beleuchtung beaufschlagt wird. Das an der Probe totalreflektierte Be leuchtungslicht wird mittels eines Detektors erfasst. Anhand des Übergangs, an dem die Intensität des an der Probe reflektierten Beleuchtungslichts von einem maximalen Wert auf Null abfällt, wird der Einfallswinkel der Totalreflexion bestimmt. Auf Basis des Einfallswinkels wird dann der Brechungsindex ermittelt. Eine derartige Bestimmung des Brechungsindex erfordert jedoch ein Immersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur, um die Probe unter Totalreflexion beleuchten zu können. Ein solches Objektiv ist aufwändig zu fertigen und somit teuer.

Zum Stand der Technik wird ferner auf DE 10 2010 030 430 Al verwiesen, worin eine triangulierende Autofokuseinrichtung für ein Mikroskop offenbart ist. Diese Autofokus einrichtung erzeugt ein Spaltbild auf der Probe, das auf einen positionssensitiven De tektor abgebildet wird. Über die durch den Detektor erfasste Einfallsposition wird der Autofokus gesteuert. Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und ein Mikroskop anzugeben, die eine einfache und präzise Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums er möglichen.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 und das Mikroskop nach An spruch 9 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind jeweils in den abhängigen Ansprü chen angegeben.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Bestimmung des Brechungsindex eines op tischen Mediums in einem Mikroskop, das ein einem Probenraum zugewandtes Objek tiv aufweist, wobei das optische Medium mit dem zu bestimmenden Brechungsindex eines von zwei optischen Medien ist, die in dem Probenraum an zwei entgegenge setzte Oberflächen eines Deck- oder Tragglases grenzen und dadurch zwei teilreflektie rende Grenzflächen bilden, die in unterschiedlichen Abständen von dem Objektiv an geordnet sind. Bei dem Verfahren wird ein Messlichtbündel durch das Objektiv unter schrägem Einfall auf das Deck- oder Tragglas gelenkt. Es werden zwei räumlich vonei nander getrennte Reflexionslichtbündel erzeugt, indem das Messlichtbündel jeweils zum Teil an den beiden Grenzflächen reflektiert wird. Die beiden Reflexionslichtbündel werden durch das Objektiv empfangen und auf einen positionssensitiven Detektor ge lenkt. Die Intensitäten der beiden Reflexionslichtbündel werden mittels des positions sensitiven Detektors erfasst. Auf Grundlage der erfassten Intensitäten der beiden Re flexionslichtbündel wird der Brechungsindex des optischen Mediums ermittelt.

Unter Deck- oder Tragglas wird in dieser Anmeldung insbesondere ein eine Probe be deckendes Deckglas, ein Objektträger, ein Boden einer Petrischale oder ein Boden ei nes Näpfchens einer Mikrotiterplatte verstanden.

Die Intensitäten der beiden Reflexionslichtbündel hängen von der Reflexion und der Transmission des Messlichtbündels an den beiden Grenzflächen ab, die durch das Deck- oder Tragglas und die beiden optischen Medien, die von entgegengesetzten Sei ten her an das Deck- oder Tragglas grenzen, definiert sind. Die Reflexions- und Trans missionsvorgänge, auf denen letztlich die Intensitäten der beiden räumlich voneinan der getrennten Reflexionslichtbündel beruhen, werden somit wesentlich durch die Brechungsindizes des Deck- oder Tragglases sowie der an das Deck- oder Tragglas grenzenden optischen Medien bestimmt. Sind der Brechungsindex des Deck- oder Tragglases sowie der Brechungsindex eines der beiden daran angrenzenden optischen Medien bekannt, so lässt sich der Brechungsindex des anderen Mediums zuverlässig aus den durch den positionssensitiven Detektor erfassten Intensitäten und der Kennt nis des Einfallswinkels des Messlichtbündels im Probenraum bestimmen.

Die räumliche Trennung der beiden Reflexionslichtbündel wird dadurch erzielt, dass das Messlichtbündel schräg auf das Deck- oder Tragglas gelenkt wird. Da die beiden teilreflektierenden Grenzflächen axial zueinander versetzt, d.h. entlang der optischen Achse des Objektivs voneinander beabstandet sind, sorgt der schräge Einfall des Mess lichtbündels auf die beiden Grenzflächen dafür, dass die beiden Reflexionslichtbündel auf unterschiedlichen optischen Wegen zurück in das Objektiv reflektiert werden. Im Ergebnis können so die beiden Reflexionslichtbündel auf dem positionssensitiven De tektor an verschiedenen Einfallsorten getrennt voneinander erfasst werden.

Die Erfindung ermöglicht eine einfache und präzise Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums innerhalb des Mikroskops. Diese kann gewinnbringend zur Einstellung weiterer Mikroskopparameter genutzt werden. Insbesondere ermöglicht die Erfindung eine Automatisierung einer am Mikroskopobjektiv vorgesehenen Korrek tionseinsteinstellung für unterschiedliche Einbettmedien, indem beispielsweise eine in dem Mikroskopobjektiv enthaltene Korrekturlinse in Abhängigkeit des ermittelten Bre chungsindex automatisch angesteuert wird. Auch ist es möglich, eine Modellierung ei ner Punktspreizfunktion im Rahmen einer Dekonvolution in Abhängigkeit des ermittel ten Brechungsindex vorzunehmen. In einer vorteilhaften Weiterbildung wird der Brechungsindex des einen optischen Me diums in Abhängigkeit des Brechungsindex des anderen optischen Mediums, des Bre chungsindex des Deck- oder Tragglases und der numerischen Apertur des Messlicht bündels ermittelt. Dabei kann die numerische Apertur des Messlichtbündels über die Brennweite des Objektivs und die Position des Messlichtbündels in der Objektivpupille bestimmt werden.

Die Reflexions- und Transmissionsgrade der beiden Grenzflächen, die Brechungsindizes des Deck- oder Tragglases und der optischen Medien, welche die jeweilige Grenzfläche definieren, und die numerische Apertur des Messlichtbündels sind über die sogenann ten Fresnelschen Formeln miteinander verknüpft. Die Reflexions- und Transmissions grade lassen sich auf Basis der Intensitäten der beiden Reflexionslichtbündel bestim men. Sind zudem der Brechungsindex des Deck- oder Tragglases, die numerische Apertur des Messlichtbündels sowie der Brechungsindex eines der beiden optischen Medium bekannt, so kann der Brechungsindex des anderen Mediums einfach berech net werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Brechungsindex des einen optischen Mediums auf Grundlage des Verhältnisses der Intensitäten der beiden Reflexionslicht bündel ermittelt. Dadurch ist die erfindungsgemäße Messung des Brechungsindex gleichsam selbstrefentiell. Dies bedeutet, dass der Brechungsindex unabhängig von der Intensität des Messlichtbündels bestimmt werden kann, d.h. keine Kenntnis dieser In tensität erforderlich ist.

Vorzugsweise wird das Messlichtbündel in einen Teilbereich einer Eintrittspupille des Objektivs geleitet, der gegenüber der Mitte der Eintrittspupille versetzt ist. Auf diese Weise wird die Eintrittspupille des Objektivs durch das Messlichtbündel dezentral un terleuchtet, wodurch das Messlichtbündel beim Austritt aus dem Objektiv schräg zu dessen optischer Achse gestellt wird. Diese dezentrale Unterleuchtung der Eintrittspu pille ermöglicht so auf besonders einfache Weise die gewünschte räumliche Trennung der an den beiden Grenzflächen erzeugten Reflexionslichtbündel. Die Reflexionslicht bündel werden dann vorzugsweise so zurück in das Objektiv geleitet, dass sie in der der Ausbreitungsrichtung des Messlichtbündels entgegengesetzten Richtung einen an deren Teilbereich der Eintrittspupille durchsetzen, der gegenüber dem vorgenannten Teilbereich der Eintrittspupille versetzt ist.

In einer vorteilhaften Ausführung ist vorgesehen, dass durch das Messlichtbündel an den beiden Grenzflächen jeweils ein Messmuster erzeugt wird und dass die beiden Messmuster durch die beiden Reflexionslichtbündel auf den positionssensitiven Detek tor abgebildet werden. So ist es beispielsweise möglich, das jeweilige Messmuster in Form eines Bildes einer Spaltblende zu generieren, die Teil der das Messlichtbündel emittierenden Lichtquelle ist oder dieser vorgeordnet ist.

Vorzugsweise werden die beiden auf den positionssensitiven Detektor abgebildeten Messmuster in Form einer räumlichen Intensitätsverteilung erfasst, aus der die Intensi täten der beiden Reflexionslichtbündel bestimmt werden. Sind die auf den positions sensitiven Detektor abgebildeten Messmuster beispielsweise durch die Bilder einer Spaltblende gegeben, so erhält man die vorgenannte Intensitätsverteilung, indem das jeweilige Blendenbild auf dem Detektor über eine Richtung integriert wird, die parallel zur Längsausrichtung der Spaltblende liegt. Die auf dem Detektor erfasste Lage des je weiligen Blendenbildes, die von dem Abstand zwischen der zugehörigen, teilreflektie renden Grenzfläche und dem Objektiv abhängt, spiegelt sich in diesem Fall durch einen in der Intensitätsverteilung auftretenden Peak wider.

Vorzugsweise ist das optische Medium, dessen Brechungsindex erfindungsgemäß zu bestimmen ist, ein Einbettmedium für eine Probe, das an eine der beiden Oberflächen des Deck- oder Tragglases grenzt. In diesem Fall ist das andere optische Medium, des sen Brechungsindex von vorneherein bekannt ist, vorzugsweise ein Immersionsme dium, das einerseits an die andere Oberfläche des Deck- oder Tragglases und anderer- seits an das Objektiv grenzt. Es versteht sich jedoch von selbst, dass das erfindungsge mäße Verfahren hierauf nicht beschränkt ist. So ist es möglich, den Brechungsindex je des beliebigen Mediums zu ermitteln, sofern dieses unmittelbar an eine der beiden Oberflächen des Deck

oder Tragglases grenzt und dadurch eine teilreflektierende Grenzfläche bildet.

Das erfindungsgemäße Mikroskop umfasst einen Probenraum mit einem Deck- oder Tragglas und zwei optischen Medien, ein dem Probenraum zugeordnetes Objektiv, zwei teilreflektierende Grenzflächen, die in dem Probenraum in unterschiedlichen Ab ständen von dem Objektiv angeordnet und dadurch gebildet sind, dass die beiden opti schen Medien in dem Probenraum an zwei entgegengesetzte Oberflächen des Deck oder Tragglases grenzen, sowie eine Einrichtung zur Bestimmung des Brechungsindex eines der beiden optischen Medien. Die vorgenannte Einrichtung ist ausgebildet, ein Messlichtbündel durch das Objektiv unter schrägem Einfall auf das Deck- oder Tragglas zu lenken. Ferner ist die Einrichtung ausgebildet, zwei räumlich voneinander getrennte Reflexionslichtbündel zu erzeugen, indem das Messlichtbündel jeweils zum Teil an den beiden Grenzflächen reflektiert wird. Die Einrichtung weist einen positionssensitiven Detektor auf und ist ausgebildet, die beiden Reflexionslichtbündel durch das Objektiv zu empfangen und auf den positionssensitiven Detektor zu lenken. Der positionssensi tive Detektor ist ausgebildet, die Intensitäten der beiden Reflexionslichtbündel zu er fassen. Die zur Bestimmung des Brechungsindex vorgesehene Einrichtung umfasst fer ner eine Ermittlungseinheit, die ausgebildet ist, auf Grundlage der erfassten Intensitä ten der beiden Reflexionslichtbündel den Brechungsindex des optischen Mediums zu ermitteln.

Vorzugsweise weist die Einrichtung eine Aperturblende mit einer Blendenöffnung auf, die dezentriert mit Abstand zur optischen Achse des Objektivs angeordnet ist. Die Aperturblende begrenzt den Querschnitt des Messlichtbündels derart, dass letzteres die Eintrittspupille des Objektivs dezentral unterleuchtet und dadurch schräg zur opti schen Achse aus dem Objektiv austritt. Auf diese Weise ist sichergestellt, dass die an den beiden teilreflektierenden Grenzflächen erzeugten Reflexionslichtbündel räumlich voneinander getrennt zurück in das Objektiv geleitet und letztlich auf dem positions sensitiven Detektor an verschiedenen Einfallsorten erfasst werden können. Die dezent rale Unterleuchtung der Eintrittspupille des Objektivs hat ferner den Vorteil, dass achs- nahe Strahlanteile vermieden werden, die sogenannte Reflexe erster Ordnung verursa chen, die am stärksten an den Flächenscheiteln der das Objektiv bildenden Linsen ent stehen und das Signal-Rausch-Verhältnis verschlechtern.

In einer bevorzugten Ausführung hat die Einrichtung eine Lichtquelle, die das Mess lichtbündel im Infrarot-Wellenlängenbereich emittiert. Dies hat den Vorteil, dass die durch das Messlichtbündel an dem Deck- oder Tragglas erzeugten Messmuster für das menschliche Auge nicht sichtbar sind und somit die Beobachtung der Probe durch das Mikroskop nicht stören. Es ist jedoch ebenso möglich, ein Messlichtbündel im sichtba ren Wellenlängenbereich einzusetzen. Falls das Messlichtbündel aus Licht im Infrarot- Wellenlängenbereich besteht, kann mittels eines geeigneten Modells des Mediums o- der einer Kalibration auf den Brechungsindex im sichtbaren Spektralbereich geschlos sen werden.

Vorzugsweise ist der positionssensitive Detektor ein Zeilendetektor, der so ausgerich tet ist, dass er die Intensitätsverteilung der beiden Reflexionslichtbündel, welche die beiden Bilder der Messmuster widerspiegelt, in ihrer Gesamtheit erfassen kann. Alter nativ kann der positionssensitive Detektor auch als Flächendetektor, z.B. als zweidi mensionale CCD-Kamera ausgeführt sein.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung hat die Ermittlungseinheit einen Speicher, in dem Parameter zur Ermittlung des Brechungsindex des optischen Mediums speicherbar sind. Dadurch ist es beispielsweise möglich, die für die Ermittlung des Brechungsindex relevanten Parameter für eine Vielzahl von Mikroskopkomponenten vorzuhalten, die je nach Anwendung wahlweise in dem Mikroskop zum Einsatz kommen. So können etwa die Brechungsindizes verschiedener Immersionsmedien und verschiedener Deck- oder Traggläser sowie die optischen Daten verschiedener Objektive gespeichert und nach Bedarf zur Bestimmung des gesuchten Brechungsindex ausgelesen werden.

Vorzugsweise sind die entgegengesetzten Oberflächen des Deck- oder Tragglases plan parallel zueinander ausgebildet.

Die erfindungsgemäße Einrichtung ist aufgrund ihrer vorliegend beschriebenen struk turellen und funktionellen Eigenschaften auch dazu geeignet, in dem Mikroskop als Au tofokuseinrichtung genutzt zu werden. Zudem bietet die Einrichtung aufgrund ihrer Ei genschaften die Möglichkeit, neben dem Brechungsindex eines optischen Mediums an dere, die lichtmikroskopische Abbildung beeinflussende Größen zu bestimmen, wie etwa die Dicke und/oder die Verkippung des Deck- oder Tragglases.

Die Erfindung ist auf eine Vielzahl von Mikroskoptypen anwendbar, z.B. inverse oder aufrechte Durchlichtmikroskope.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:

Figur 1 eine schematische Darstellung eines inversen Durchlichtmikroskops als ers tes Ausführungsbeispiel;

Figur 2 eine zur Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums be stimmte Einrichtung, die Teil des Mikroskops nach Figur 1 ist;

Figur 3 eine schematische Darstellung, die einen Probenraum des Mikroskops nach

Figur 1 zeigt;

Figur 4 eine durch einen positionssensitiven Detektor der Einrichtung nach Figur 2 erfasste Intensitätsverteilung; Figur 5 ein Flussdiagramm, das eine spezielle Ausführungsform des erfindungsge mäßen Verfahrens zur Bestimmung des Brechungsindex zeigt;

Figur 6 eine Kennlinie, die das Verhältnis der Intensitäten der beiden Reflexions lichtbündel in Abhängigkeit des Brechungsindex des Einbettmediums an gibt; und

Figur 7 eine schematische Darstellung eines aufrechten Durchlichtmikroskops, das ein zweites Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Mikroskops bil det.

Figur 1 zeigt ein Mikroskop 10 als erstes Ausführungsbeispiel, auf das die erfindungsge mäße Brechungsindexbestimmung anwendbar ist.

Das Mikroskop 10 ist als inverses Durchlichtmikroskop ausgeführt. Es umfasst demnach ein Objektiv 12, das von unten einem in Figur 1 mit dem Bezugszeichen 14 versehenen Probenraum zugewandt ist, sowie eine Lichtquelle 16, die von oben auf den Proben raum 14 gerichtet ist. Das Mikroskop 10 weist ferner einen Tubus 18 mit einem Okular 20 auf, durch das eine Bedienperson ein durch das Objektiv 12 eingefangenes Proben bild betrachten kann. Zudem ist eine Steuereinheit 22 vorgesehen, welche die ver schiedenen Mikroskopkomponenten ansteuert.

In dem Probenraum des Mikroskops 10 befindet sich ein Deckglas 24 zum Bedecken einer in Figur 1 nicht explizit dargestellten Probe. Auf dem Deckglas 24 befindet sich ein optisches Medium 26, in das die Probe eingebettet ist und das im Weiteren als Ein bettmedium 26 bezeichnet wird. In dem Probenraum 14 ist ferner ein Immersionsme dium 28 angeordnet, das in Figur 1 von oben an das Objektiv 12 und von unten an das Deckglas 24 grenzt. Das Mikroskop 10 weist ferner eine in Figur 1 allgemein mit dem Bezugszeichen 30 be- zeichnete Einrichtung auf, die dazu dient, den Brechungsindex des die Probe aufneh menden Einbettmediums 26 zu ermitteln. Die Einrichtung ist in Figur 2 genauer darge stellt.

Wie in Figur 2 gezeigt, weist die Einrichtung 30 eine Lichtquelle 32 auf, die ein Mess lichtbündel 34 im Infrarot-Wellenlängenbereich emittiert. Die Lichtquelle 32 ist bei spielweise eine LED, die eine Spaltblende 33 aufweist, durch die das Messlichtbündel 34 auf eine Beleuchtungsoptik 36 gerichtet wird. Nach Durchtritt durch die Beleuch tungsoptik 36 fällt das Messlichtbündel 34 auf eine Aperturblende 38, die mittig auf der optischen Achse Ol der Beleuchtungsoptik 36 positioniert ist und eine Blendenöff nung 39 aufweist, die dezentriert mit Abstand zur optischen Achse Ol der Beleuch tungsoptik 36 angeordnet ist. Die Blendenöffnung der Aperturblende 38 begrenzt den Strahlquerschnitt des Messlichtbündels 34 derart, dass nur der in Figur 2 unterhalb der optischen Achse Ol der Beleuchtungsoptik 36 liegende Teil des Messlichtbündels 34 die Aperturblende in Richtung eines Umlenkprismas 40 passiert.

Das in seinem Strahlquerschnitt begrenzte Messlichtbündel 34 wird an dem Umlenk prisma 40 in eine Transportoptik 42 reflektiert, die aus einer längs ihrer optischen Achse 02 verschiebbaren Fokussierlinse 44, einer Streulichtblende 46 und einer weite ren Linse 48 gebildet ist. Nach Durchtritt durch die Transportoptik 42 fällt das Mess lichtbündel 34 auf einen dichroitischen Strahlteiler 50, der Licht im Infrarot-Wellenlän genbereich reflektiert, während er Licht im sichtbaren Bereich transmittiert. Durch den dichroitischen Spiegel 50 wird das Messlichtbündel 34 in Richtung des Objektivs 12 re flektiert. Das an dem dichroitischen Spiegel 50 reflektierte Messlichtbündel 34 verläuft dabei mit einem Parallelversatz zur optischen Achse 03 des Objektivs 12. Auf diese Weise wird das Messlichtbündel 34 in einen Teilbereich einer Eintrittspupille 52 des Objektivs 12 geleitet, der gegenüber der optischen Achse 03 des Objektivs 12 und da mit gegenüber der Mitte der Eintrittspupille 52 seitlich versetzt ist (vgl. Figur 3). Die Eintrittspupille 52 des Objektivs 12 wird somit dezentral unterleuchtet, was dazu führt, dass das Messlichtbündel 34 unter einem Winkel a schräg zur optischen Achse 03 in den Probenraum 14 gelenkt wird.

Der Einfachheit halber sind in der Darstellung nach Figur 2 das Einbettmedium 26 und das Immersionsmedium 28, die in dem Probenraum 14 von entgegengesetzten Seiten her an das Deckglas 24 grenzen, weggelassen. Das unter schrägem Einfall in den Pro benraum 14 geleitete Messlichtbündel 34 wird, wie weiter unten unter Bezugnahme auf Figur 3 genauer erläutert ist, an dem Deckglas 24 reflektiert, wodurch zwei in das Objektiv 12 zurückgeleitete Reflexionsbündel entstehen, die in der schematischen An sicht nach Figur 2 (im Unterschied zur Detailansicht nach Figur 3) in Form eines einzi gen, mit 54 bezeichneten Lichtbündels dargestellt sind.

Nach Durchtritt durch das Objektiv 12 fallen die beiden Reflexionslichtbündel 54 auf den dichroitischen Spiegel 50, der die Reflexionslichtbündel 54 in die Transportoptik 42 lenkt. Nach Passieren der Transportoptik 42 fallen die Reflexionslichtbündel 54 auf das Umlenkprisma 40, das die Reflexionslichtbündel 54 auf eine Detektoroptik 56 reflek tiert. Die Detektoroptik 56 richtet die Reflexionslichtbündel 54 auf ein Spektralfilter 58, das nur für Licht im Infrarot-Wellenlängenbereich durchlässig ist und Streulicht außer halb dieses Wellenlängenbereichs blockiert. Die durch das Spektralfilter 58 transmit- tierten Reflexionslichtbündel 54 fallen schließlich auf einen positionssensitiven Detek tor 60, der im Stande ist, die Intensitäten der Reflexionslichtbündel 54 ortsaufgelöst zu erfassen.

In der Figur 2 ist der Vollständigkeit halber auch die über den dichroitischen Spiegel 50 realisierte Ankopplung des Tubus 18 an die Einrichtung 30 veranschaulicht. Demnach dient der dichroitische Spiegel 50 im vorliegenden Ausführungsbeispiel auch dazu, das für die eigentliche mikroskopische Bildgebung genutzte, sichtbare Detektionslicht 62, welches das Objektiv 12 aus dem Probenraum 14 in Richtung des dichroitischen Spie gels 50 leitet, durch Transmission dem Tubus 18 zuzuführen. In Figur 3 ist genauer gezeigt, wie durch Reflexion des Messlichtbündels die beiden (in Figur 3 mit 54a, 54b bezeichnet) Reflexionslichtbündel generiert werden, die erfin dungsgemäß zur Bestimmung des Brechungsindex des Einbettmediums 26 genutzt werden. Demnach wird das die Eintrittspupille 52 des Objektivs 12 dezentral unter leuchtende Messlichtbündel 34 durch das Objektiv 12 unter einem Winkel a schräg zur optischen Achse 03 auf die dem Objektiv 12 zugewandte, in Figur 3 mit 64 bezeichnete Vorderfläche des Deckglases 24 gelenkt. Da das Deckglas 24 und das an dessen Vorder fläche 64 grenzende Immersionsmedium 28 unterschiedliche Brechungsindizes aufwei sen, bilden die Vorderfläche 64 des Deckglases 24 und das daran angrenzende Immer sionsmedium 28 eine erste Grenzfläche, an der das einfallende Messlichtbündel 34 zum Teil reflektiert wird. Der an dieser ersten Grenzfläche reflektierte Teil des Mess lichtbündels erzeugt das erste Reflexionslichtbündel 54a, das zurück in das Objektiv 12 geleitet wird.

Der andere Teil 66 des Messlichtbündels 34, der die erste Grenzfläche transmittiert, wird beim Eintritt in das Deckglas 24 von der optischen Achse 03 des Objektivs 12 weggebrochen und schließt mit dieser einen Winkel ß ein, der größer als der Winkel a ist. Dieser transmittierte Teil 66 des Messlichtbündels 34 wird zum Teil an einer zwei ten Grenzfläche reflektiert, die durch die Rückfläche 68 des Deckglases 24 und das da ran angrenzende Einbettmedium 26 definiert ist, das einen anderen Brechungsindex als das Deckglas 24 aufweist. Durch diese zweite Teilreflexion des Messlichtbündels 34 an der zweiten Grenzfläche wird das zweite Reflexionslichtbündel 54b erzeugt, das durch die Vorderfläche 64 des Deckglases 24 tritt und dann zurück in das Objektiv 12 gelangt.

Wie in der Darstellung nach Figur 3 veranschaulicht ist, sorgt der schräge Einfall des Messlichtbündels 34 in den Probenraum 14 dafür, dass die durch die beiden Teilreflexi onen an der Vorderfläche 64 bzw. der Rückfläche 68 des Deckglases 24 erzeugten Re flexionslichtbündel 54a, 54b auf unterschiedlichen optischen Wegen zurück in das Ob jektiv 12 gelangen. Auf diese Weise treffen die beiden Reflexionslichtbündel 54a, 54b an verschiedenen Einfallsorten auf den positionssensitiven Detektor 60. Mit anderen Worten, werden die beiden an der Vorderfläche 64 bzw. der Rückfläche 68 des Deck glases 24 in Form der Spaltbilder generierten Messmuster räumlich voneinander ge trennt auf den positionssensitiven Detektor 60 abgebildet, wie in dem Diagramm nach Figur 4 veranschaulicht ist.

Figur 4 zeigt eine beispielhafte Intensitätsverteilung V, welche die beiden Reflexions lichtbündel 54a, 54b gemeinsam auf dem positionssensitiven Detektor 60 erzeugen. Dabei gibt die Abszisse 70 des Diagramms den Einfallsort auf dem Detektor 60 und die Ordinate 72 die an dem jeweiligen Einfallsort gemessene Intensität wider. Die Intensi tätsverteilung V nach Figur 4 zeigt zwei Peaks, von denen der mit PI bezeichnete Peak dem ersten Reflexionslichtbündel 54a und der mit P2 bezeichnete Peak dem zweiten Reflexionslichtbündel 54b zugeordnet ist. Aus dem Umstand, dass der Peak PI höher und schärfer als der Peak P2 ist, lässt sich erkennen, dass in dem Beispiel nach Figur 3 das Messlichtbündel 34 auf die Vorderfläche 64 des Deckglases 24 fokussiert ist. Dies bedeutet, dass an der Vorderfläche 64 des Deckglases 24 ein fokussiertes Bild der Spaltblende 33 der Lichtquelle 32 erzeugt wird, während an der Rückfläche 68 des Deckglases 24 ein demgegenüber defokussiertes Bild der Spaltblende 33 entsteht. Dies korrespondiert insoweit mit der Darstellung nach Figur 3, als die erste Teilreflektion an der Vorderfläche 64 des Deckglases 24 an einem Punkt stattfindet, der auf die optische Achse 03 des Objektivs 12 zentriert ist. Demgegenüber findet die zweite Teilreflexion an der Rückfläche 38 des Deckglases 24 an einem hierzu quer zur optischen Achse 03 versetzten Punkt statt. Die Flächen unterhalb der in Figur 4 gezeigten Peaks PI, P2 sind jeweils ein Maß für die Intensität des jeweiligen Reflexionslichtbündels 54a, 54b.

Figur 5 zeigt ein Flussdiagramm, das rein beispielhaft veranschaulicht, wie der Bre chungsindex des Einbettmediums 26 erfindungsgemäß ermittelt werden kann.

In einem ersten Schritt S1 wird das Messlichtbündel 34 durch das Objektiv 12 in den Probenraum 18 geleitet. Nach Durchtritt durch die Immersionsflüssigkeit 28 trifft das Messlichtbündel 34, wie in Figur 3 gezeigt, unter dem Winkel a schräg auf die Vorder fläche 64 des Deckglases 24. Der Winkel a kann aus dem Abstand zwischen dem Objek tiv 12 und der Vorderfläche 64 des Deckglases 24 sowie der numerischen Apertur des Messlichtbündels 34 bestimmt werden. Dabei ergibt sich die numerische Apertur 34 des Messlichtbündels anhand der Brennweite des Objektivs 12 und der Position des Messlichtbündels 34 in der Eintrittspupille 52 des Objektivs 12 bzw. anhand der Positi onierung der Blendenöffnung 39 der Aperturblende 38 und des Vergrößerungsmaß stabs, mit dem die Aperturblende 38 in die Eintrittspupille 52 des Objektivs 12 abgebil det wird.

In einem zweiten Schritt S2 werden die beiden räumlich voneinander getrennten Refle xionslichtbündel 54a, 54b durch die beiden Teilreflexionen an der Vorderfläche 64 bzw. der Rückfläche 68 des Deckglases 24 generiert.

In einem dritten Schritt S3 werden die beiden Reflexionslichtbündel 54a, 54b auf den positionssensitiven Detektor 60 geleitet. Da die beiden Reflexionslichtbündel 54a, 54b räumlich voneinander getrennt sind, treffen sie an unterschiedlichen Einfallsorten auf den positionssensitiven Detektor 60.

In einem vierten Schritt S4 werden die im Weiteren als l _a bzw. I _b bezeichneten Intensi täten der beiden Reflexionslichtbündel 54a, 54b durch den positionssensitiven Detek tor 60 erfasst. Dies geschieht beispielsweise durch Integration der in Figur 4 dargestell ten Intensitätsverteilung V. So sind die Flächen unterhalb der beiden Peaks PI, P2 der Intensitätsverteilung V jeweils ein Maß für die Intensität des jeweiligen Reflexionslicht bündels 54a, 54b. Durch Integration des Messsignals oder einer an den jeweiligen Peak PI, P2 angepassten Kurve, z.B. einer Gauß-Kurve, kann so die jeweilige Intensität l _a , I _b bestimmt werden. In einem fünften Schritt S5 wird schließlich der Brechungsindex des Einbettmediums 26 auf Grundlage der Intensitäten l _a , l _b der beiden Reflexionslichtbündel 54a, 54b er mittelt. Grundlage hierfür sind die folgenden Überlegungen.

Im Folgenden wird erläutert, wie sich die Intensitäten l _a , l _b der beiden Reflexionslicht bündel 54a und 54b im Einzelnen berechnen lassen.

Die Intensität I _a des Reflexionslichtbündels 54a ergibt sich nach folgender Beziehung:

Dabei bezeichnen R _a; die Reflexionsgrade der durch das Deckglas 24 und das Immersi onsmedium 28 gebildeten Grenzfläche 64 für senkrecht (i =1) und parallel (i =||) po larisiertes Licht, das unter einem Winkel 90°— a einfällt und vorliegend durch das Messlichtbündel 34 gegeben ist. Ferner bezeichnet S den Intensitätsanteil von senk recht polarisiertem Licht und / die Intensität des Messlichtbündels 34.

Die Intensität I _b des Reflexionslichtbündels 54b ergibt sich nach folgender Beziehung:

Hier bezeichnen R _bi und T _{b ;} den Reflexions- bzw. Transmissionsgrad der durch das Deckglas 24 und das Einbettmedium 26 gebildeten Grenzfläche 68 für senkrecht (i =1) und parallel (i =||) polarisiertes Licht, das unter einem Winkel 90°— ß einfällt und vorliegend durch den transmittierten Teil 66 des Beleuchtungslichtbündels 34 gegeben ist. T _ai bezeichnet die Transmissionsgrade der ersten Grenzfläche 64 für senkrecht (ί = 1) und parallel (i =||) polarisiertes Licht, das unter einem Winkel 90°— a einfällt und vorliegend durch das Messlichtbündel 34 gegeben ist. Ferner bezeichnet T _o , die Trans missionsgrade der Grenzfläche 64 für senkrecht (i =1) und parallel (i =||) polarisiertes Licht, das unter einem Winkel 90°— ß einfällt und vorliegend durch den Teil gegeben ist, der an der Grenzfläche 68 zurück in Richtung des Objektivs 12 reflektiert wird.

Das Verhältnis der beiden Intensitäten I _a , I _b ist von der Intensität / des Messlichtbün dels 34 unabhängig, wie die folgende Beziehung zeigt:

Somit handelt sich vorliegend um eine selbstreferentielle Messung. Die Reflexions- und Transmissionsgrade /?, und G, können mithilfe der Fresnelschen Formeln (siehe BORN und WOLF, Principles of Optics, Cambridge University Press, 7. Auflage, 1999, Seiten 40 bis 45), auf Grundlage der Brechungsindizes der optischen Medien 26, 28 an den Grenzflächen 64, 68 und der numerischen Apertur des einfallenden Messlichtbündels 34 bestimmt werden. Die numerische Apertur des Messlichtbündels 34 lässt sich über die Brennweite des Objektivs 12 und die Position des Messlichtbündels 34 in der Ein trittspupille 52 des Objektivs 12 bestimmen.

Bei bekannter numerischer Apertur des Messlichtbündels 34 und bekannten Bre chungsindizes des Immersionsmediums 28 und des Deckglases 24 ist der Brechungsin dex des Einbettmediums 26 die einzige Unbekannte und kann anhand der Beziehung (3) bestimmt werden. Dies kann analytisch, durch numerische Verfahren oder mithilfe einer Lookup-Tabelle mit austabellierten Werten und Interpolation erfolgen.

Figur 6 zeigt eine beispielhafte Kennlinie K, die das Verhältnis der beiden Intensitäten 4, in Abhängigkeit des Brechungsindex des Einbettmediums 26 angibt. Auf der Abs zissenachse 74 des Diagramms ist der Brechungsindex des Einbettmediums 26 angege ben. Auf der Ordinatenachse 76 des Diagramms ist das Verhältnis der beiden Intensitä ten I _a , angegeben. Bei der Ermittlung der Intensitäten I _a , I _b wurde Wasser als Im mersionsmedium 28 verwendet. Figur 7 zeigt ein Mikroskop 78, das im Unterschied zu dem in Figur 1 dargestellten Mik roskop 10 als aufrechtes Durchlichtmikroskop ausgeführt ist. Dabei sind in Figur 7 die jenigen Mikroskopkomponenten, die den Komponenten des Mikroskops 10 nach Figur 1 entsprechen, mit den schon in Figur 1 verwendeten Bezugszeichen versehen.

Im Unterschied zur Ausführungsform nach Figur 1 ist bei dem in Figur 7 dargestellten Mikroskop das Objektiv 12 oberhalb des Probenraums 18 angeordnet, während sich die Lichtquelle 16 unterhalb des Probenraums 18 befindet. Dementsprechend befindet sich das Immersionsmedium 28, das zum einen an das Objektiv 12 und zum anderen an das Deckglas 24 grenzt, oberhalb des Deckglases 24, während sich das Einbettmedium 26, dessen Brechungsindex erfindungsgemäß zu bestimmen ist, unterhalb des Deckgla ses 24 angeordnet ist.

Die erfindungsgemäße Bestimmung des Brechungsindex des Einbettmediums 28 er folgt bei dem Mikroskop 78 nach Figur 7 in gleicher Weise wie bei dem in Figur 1 ge zeigten Mikroskops 10.

Die Erfindung wurde vorstehend anhand spezieller Ausführungsbeispiele erläutert. Es versteht sich von selbst, dass die Erfindung nicht auf diese Ausführungsbeispiele be schränkt ist und eine Reihe von Abwandlungen möglich sind.

So entsteht in dem Beispiel nach Figur 3 an der Vorderfläche 64 des Deckglases 24 ein fokussiertes Bild und an der Rückfläche 68 des Deckglases 64 ein defokussiertes Bild der Spaltblende 33. Es ist jedoch umgekehrt ebenso möglich, dass das fokussierte Spaltbild an der Rückseite 68 und das fokussierte Spaltbild an der Vorfläche 64 des Deckglases 24 zu erzeugen. Auch kann die Fokusebene innerhalb des Deckglases 24 lie gen, so dass keines der beiden Spaltbilder fokussiert ist. Bezugszeichenliste

Mikroskop

Objektiv

Probenraum

Lichtquelle

Tubus

Steuereinheit

Okular

Deckglas

, 28 optisches Medium

Einrichtung

Lichtquelle

Spaltblende

Messlichtbündel

Beleuchtungsoptik

Aperturblende

Blendenöffnung

Umlenkprisma

Transportoptik

Fokussierlinse

Streulichtblende

Strahlteiler

Eintrittspupille

, 54a, 54b Reflexionslichtbündel

Detektoroptik

Spektralfilter

Detektor

Abbildungsstrahlengang, 68 Oberfläche 66 transmittiertes Messlichtbündels

70, 74 Abszisse

72, 76 Ordinate

K Kennlinie

Ol, 02, 03 optische Achse

PI, P2 Spitze

V Intensitätsverteilung

a, ß Winkel