CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se enmarca en el campo de los bioprocesos, particularmente en procesos para obtener extractos bacterianos con actividad biocida.

DESCRIPCIÓN DEL ESTADO DE LA TÉCNICA Se han reportado varios métodos de obtención de extractos activos a partir de microorganismos. El documento US5494809 describe un método para obtener metabolitos secundarios (Iturina A) con actividad antifúngica a partir de bacterias del género Bacillus (Bacillus amyloliquefaciens), para lo cual inicialmente se cultiva el microorganismo en un medio de cultivo bajo condiciones aeróbicas a 30°C y agitación de 150 rpm. Luego, el medio de cultivo se filtra para separar la biomasa y la fracción filtrada se pasan por una columna hidrofóbica adsorbente ODS C-18.

El documento US 20160073642 describe un proceso para incrementar la producción de biomasa de microorganismos del género Bacillus, entre ellos Bacillus subtilis y Bacillus amyloliquefaciens, así como la de sus metabolitos biológicamente activos (lipopéptidos de la familia de las surfactinas, iturinas y fengicinas). Los metabolitos activos se extraen mediante procedimientos de extracción con solventes, precipitación, adsorción o cromatografía. El documento US9125419 divulga una cepa de Bacillus {Bacillus sp. F727) aislada y sus metabolitos con actividad biocida. El microorganismo se cultiva empleando un medio de cultivo convencional. Los metabolitos secundarios se extraen del cultivo bacteriano con una resina adsorbente hidrofóbica (Amberlite XAD-7). La resina y las células filtradas se dejan durante 2 horas en acetona, después de lo cual se filtra y se seca al vacío hasta obtener el extracto bacteriano crudo, del cual se pueden obtener fracciones con actividad fungicida. Se han reportado estudios para utilizar las bacterias Bacülus mojavensis, Xenorhabdus nematophila, Xenorhabdus sp. y Photorhabdus sp. en programas de control de diferentes hongos y protistas generalmente causales de enfermedades en diferentes cultivos. San- Blas (2012) ¹ reporta que Xenorhabdus sp. y Photorhabdus sp., en cultivos axénicos, tienen una acción antifúngica de hasta el 97% sobre el hongo Moniliophthora roreri, agente causal de una de las enfermedades más devastadoras en el cultivo del cacao (Theobroma cacao). Por su parte, Fang (2014) ² determinó la capacidad antimicrobiana de Xenorhabdus nematophila contra Botrytis cinérea y Phytophthora capsici, dos microorganismos causantes de diversas enfermedades en cultivos de hortalizas alrededor del mundo. Los autores probaron los extractos (metabolitos libres de células bacterianas) contra estos patógenos, encontrando que causan una protección a las plantas hasta de un 70%.

La necesidad permanente de buscar nuevos compuestos para satisfacer la demanda de productos con actividad biocida, ha conllevado a los investigadores a desarrollar un proceso más eficiente de obtención de extractos biocidas a partir de diferentes tipos de microorganismos, de forma tal que se amplíe su espectro de acción y sea más viable su escalado. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1 Fotografías correspondientes a diferentes tiempos de observación del extracto UNCSAB03-07-05, el lado izquierdo corresponde al papel filtro con extracto bacteriano, lado derecho corresponde a papel filtro con agua destilada.

FIG. 2 Gráfica del porcentaje de participación de extractos que causan la muerte al 100% de las hormigas a las 24, 48 y más de 48 horas.

¹ San-Blas, E., Carrillo, Z., & Parra, Y. (2012). Effect of Xenorhabdus and Photorhabdus bacteria and fheir exudates on Moniliophthora roreri. Archives OfPhytopathology And Plant Protection, 45(16), 1950-1967. doi: 10.1080/03235408.2012.718688.

² Fang, X., Zhang, M., Tang, Q., Wang, Y., & Zhang, X. (2014). Inhibitory effect of Xenorhabdus nematophila TB on plant pathogens Phytophthora capsici and Botrytis cinérea in vitro and in planta. Scientific Reports, 4, 4300. doi:10.1038/srep04300 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un proceso para obtener extractos biocidas a partir de microorganismos del género Bacillus sp, Serratia sp, Pseudomonas sp, Burkholderia sp, Brevundimonas sp, Escherichia sp, Delftia sp, Acinetobacter sp, Photorhabdus sp y Xenorhabdus sp, que comprende las etapas de aislamiento y cultivo del microorganismo; preparación de un pre-inóculo y ponerlo en contacto con una resina adsorbente hidrofóbica, y por último, eluir con un solvente orgánico hasta obtener el extracto. Los extractos obtenidos exhiben actividad fungicida, insecticida y/o de repelencia.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los microorganismos que pueden ser utilizados en el proceso de la presente invención, son aquellos que tengan la capacidad de producir sustancias activas. Bacterias del género Bacillus sp, Serratia sp, Pseudomonas sp, Burkholderia sp, Brevundimonas sp, Escherichia sp, Delftia sp, Acinetobacter sp, Photorhabdus sp y Xenorhabdus sp son bacterias asociadas a nematodos entomopatógenos y patógenas de insectos que producen metabolitos secundarios con actividad biocida. El proceso para obtener extractos bacterianos a partir de dichas bacterias comprende las etapas de: a) aislar, purificar y cultivar el microorganismo;

b) preparar un pre-inóculo del microorganismo;

c) poner en contacto el pre-inóculo con una resina adsorbente hidrofóbica bajo condiciones ambientales adecuadas; y

d) separar y eluir la resina con un solvente orgánico hasta obtener el extracto.

La etapa a) del proceso comprende el aislamiento, purificación y cultivo del microorganismo. Para el aislamiento, se colectan individuos de la hormiga Atta cephalotes, se maceran en un tubo de ensayo conteniendo esferas de vidrio y agua peptonada, se agitan a 2500-5000 rpm, se realizan diluciones seriadas entre 10 ^"1 y 10 ^"8 , se siembran en cajas de Petri con medio de cultivo y se incuban a una temperatura entre 20 y 35°C.

El medio de cultivo debe contener fuentes de carbono y nitrógeno o los nutrientes necesarios para el crecimiento del microorganismo. En una modalidad preferida, el medio de cultivo comprende al menos una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales, buffers y nutrientes.

Para el aislamiento de los microorganismos (v.g. Xenorhabdus sp. y Photorhabdus sp), se toman individuos juveniles de nematodos entomopatógenos, se inyectan en una larva de Gallería mellonella de último instar, a la cual, una vez infectada (entre 2 y 3 días), se le extrae una gota de hemolinfa de la parte inferior de la cabeza. Se siembra en una caja de Petri con medio NBTA que comprende caldo nutritivo, agar, azul de bromotimol, agua y cloruro de trifenil tetrazolium siguiendo la metodología descrita en Stock, P., & Goodrich-Blair, H ³ . (2012).

Una vez aisladas las bacterias, se purifican por la metodología de agotamiento o cualquier otra técnica conocida por un técnico en la materia, y se cultivan a las mismas condiciones utilizadas para el aislamiento. Posteriormente se conservan las cepas puras en un congelador entre -80 y -20°C. El cultivo de las bacterias conservadas se realiza en medio de cultivo XG a las condiciones antes mencionadas.

La etapa b), denominada preparación del pre-inóculo del microorganismo, consiste en cultivar las bacterias almacenadas en cajas de Petri con medio de cultivo XG con pH entre 5,5 y 8,0. De allí se toman entre 2 y 5 colonias aisladas y se llevan a caldo nutritivo donde se dejan crecer por un periodo entre 18 y 48 horas a una temperatura entre 20 y 35°C y se agitan entre 90 y 200 rpm. El caldo nutritivo debe contener peptona, extracto de carne, extracto de levadura, cloruro de sodio y/o los nutrientes necesarios para permitir el desarrollo del microorganismo. En una modalidad preferida, el caldo nutritivo tiene

³ Stock, P., & Goodrich-Blair, H. (2012). Nematode parasites, pathogens and associates of insects and invertebrates of economic importance. In L. A. Lacey (Ed.), Manual of Techniques in Invertebrate Pathology (Second edi., pp. 373 - 423). Academic Press. extracto de carne 1,0 g, extracto de levadura 2,0 g, peptona 5,0 g y cloruro de sodio 5,0 g-

Una vez obtenido el pre-inóculo continúa la etapa c), donde se inocula un volumen del pre-inóculo en caldo nutritivo en presencia de entre el 2 y 5% de una resina adsorbente hidrofóbica, en condiciones apropiadas (temperatura entre 20 y 35°C y agitación entre 100 y 200 rpm) durante 5 a 10 días. Durante la inoculación las bacterias producen los metabolitos secundarios (alrededor del día 5), pero varía dependiendo del microorganismo utilizado. La resina hidrofóbica permite retener los metabolitos secundarios secretados por las bacterias y evita su degradación. Preferiblemente, la resina adsorbente hidrofóbica es una resina hidrofóbica poliaromática es una resina Amberlita XAD 16N ^® .

Finalmente se separa y se eluye la resina adsorbente hidrofóbica con un solvente adecuado hasta obtener el extracto bacteriano. Se separa la resina (v.g. por decantación) desechando el medio y luego la resina se transfiere a un recipiente que contiene un volumen de solvente adecuado (entre 5 y 20 mL) para eluir los metabolitos secundarios, lo que puede tomar un tiempo entre 12 y 36 horas. Se entiende por eluir a la aplicación de un solvente o fase móvil que permita arrastrar o separar los componentes que quedaron retenidos en la resina. Entre los solventes se pueden mencionar acetona, metanol, isopropanol y sus mezclas.

Una vez eluidos los metabolitos secundarios, se filtra el sobrenadante y se concentran (v.g. en un rotoevaporador o en cualquier equipo que permita evaporar el solvente), hasta un volumen entre 0,5 y 2,0 mL. El extracto bacteriano obtenido se almacena a una temperatura entre 1 y 10°C. La concentración de metabolitos secundarios en los extractos bacterianos obtenidos es superior a 1000 ppm, más preferiblemente, superior a 10000 ppm. La actividad biocida de los extractos obtenidos se puede evaluar sobre diferentes patógenos, por ejemplo, sobre el hongo L. gongylophorus.

Los siguientes Ejemplos ilustran la invención, sin estar el concepto inventivo restringido a los mismos. EJEMPLOS

Ejemplo 1. Aislamiento, purificación y cultivo de Bacillus mojavensis UNCSAB02- 24 aislado de una hormiga (Atta cephalotes) cortadora de hojas

Se tomaron 6 hormigas cortadoras en un tubo de ensayo estéril con esferas de vidrio de 6 mm de diámetro y se agregó agua peptonada hasta cubrir en su totalidad los insectos. Se agitaron en un agitador vortex a 3000 rpm a velocidad constante por un minuto a temperatura ambiente. Luego se realizaron diluciones seriadas y se sembraron las diluciones 10 ^"3 y 10 ^"5 en superficie en cajas de Petri con agar nutritivo (medio de cultivo) por un periodo de 24 horas a 30°C.

Las bacterias obtenidas se aislaron y se purificaron por la metodología de agotamiento en las mismas condiciones. Posteriormente, se conservaron las cepas puras en micro-tubos con 70% de caldo nutritivo y 30% de glicerol a 99% en un congelador a -20°C. Se obtuvo un cultivo puro de Bacillus mojavensis.

Ejemplo 2. Preparación del pre-inóculo de Bacillus mojavensis UNCSAB02-24, inoculación y obtención del extracto

El cultivo puro obtenido según el Ejemplo 1 y almacenado a -20°C, se cultivó en cajas de Petri con medio XG con un pH 7,0. Se hizo un pre-inóculo a partir de este cultivo en el que se tomaron 3 colonias aisladas y se colocaron en 5 mL de caldo nutritivo, se dejaron por 24 horas a 30°C y 150 rpm.

Para la preparación del extracto se inocularon 100 μL· de este cultivo y se transfirieron a un Erlenmeyer con 100 mL de caldo nutritivo y en presencia de 2,5 mL de resina Amberlita XAD 16N en solución acuosa obtenidos a partir de la mezcla de 50g de resina y 50mL de agua estéril, se esterilizaron. Se incubó por 7 días a 30°C y 150 rpm. Posteriormente se descartó el medio y se recuperó la resina, la cual se transfirió a 15 mL de metanol al 99,99% y se dejó eluir por 24 horas. Se filtró el sobrenadante y se concentró en un rotoevaporador hasta obtener aproximadamente 1 mL de extracto bacteriano metanólico. El extracto obtenido se almacenó a 4°C.

Ejemplo 3. Evaluación del efecto antifúngico del extracto de Bacillus mojavensis UNCSAB02-24 contra Leucoagaricus gongyloyhorus

Se determinó la actividad fungicida del extracto bacteriano metanólico obtenido en el Ejemplo 2 frente al hongo simbionte de la hormiga Atta cephalotes. Para esto, se aisló el hongo de los jardines de las hormigas, se tomó una porción de micelio del hongo y se sembró en cajas de Petri con medio PDA acidificado con ácido láctico al 4% a un pH de 4,0. Después de 4 semanas de crecimiento, se tomó una muestra con un sacabocados con un diámetro de 8 mm y se trasladó a una caja de Petri con medio PDA y 400 μΕ del extracto bacteriano. Se evaluó el crecimiento del micelio por un periodo de 4 semanas. Se realizó un bioensayo con 3 repeticiones y un control, los datos se analizaron estadísticamente con el programa Statsgraphics Centurión® con pruebas de bondad de ajuste, se determinó que de acuerdo con el estadístico log verosimilitud, la distribución de mejor ajuste es la distribución log-logística, con un 95% de confianza. En todos los casos, la eficacia de los tratamientos y las repeticiones se evaluó a través de un análisis de varianza (ANDE VA), concluyendo que los tratamientos difieren en su efecto medio (nivel de significancia P<0,05). Los resultados se muestran en las Tablas 1 y 2.

Tabla 1. Resultados ANDEVA obtenidos para el bioensayo

UNCSAB02-18 3 69,84 23,28 333,77

UNCSAB02-19 2 73,31 36,66 149,66

UNCSAB 02-21 2 48,98 24,49 475,91

UNCSAB02-21A 3 67,54 22,51 192,59

UNCSAB 02-23 3 78,02 26,01 429,32

UNCSAB 02-24 3 322,15 107,38 1,43

UNCSAB 02-26 3 131,31 43,77 651,57

UNCSAB 02-27 2 28,62 14,31 321,99

Tabla 2. Análisis de varianza del bioensayo fungicida

El extracto bacteriano metanólico (92000 ppm) obtenido a partir de Bacillus mojavensis UNCSAB02-24 exhibió un porcentaje de inhibición del 100% contra el hongo Leucoagaricus gongylophorus.

Ejemplo 4. Aislamiento, purificación y cultivo de Xenorhabdus nematophila UNCSAB03-25-01 y Xenorhabdus sp. UNCSAB03-23-04 aislados del nematodo Steinernema sp

Se tomó una larva de último instar de Gallería mellonella y se inoculó con 200 juveniles infectivos del nematodo. Posteriormente, a los 3 días se esterilizó la larva en alcohol al 70% por 5 minutos y se pasó por agua destilada estéril. Luego con la ayuda de una jeringa se rompió el integumento debajo de la cabeza del insecto y se tomó una gota de la hemolinfa, se sembró en caja de Petri con medio NBTA por un periodo de 48 horas a 25°C. Una vez aisladas las bacterias, se realizó el procedimiento expuesto en el Ejemplo 1 para la purificación y cultivo de Xenorhabdus nematophila UNCSAB03-25-01 y Xenorhabdus nematophila UNCSAB03-23-04. Se obtuvo un cultivo puro de Xenorhabdus nematophila UNCSAB03-25-01 y un cultivo puro de Xenorhabdus nematophila UNCSAB03-23-04.

Ejemplo 5. Preparación del pre-inóculo de Xenorhabdus nematophila UNCSAB03- 25-01 y Xenorhabdus sp. UNCSAB03-23-04, inoculación y obtención del extracto Se realizó el mismo procedimiento expuesto en el Ejemplo 2 para la preparación del pre- inóculo de Xenorhabdus nematophila UNCSAB03-25-01 y Xenorhabdus sp. UNCSAB03-23-04 obtenidos mediante el Ejemplo 4.

Se obtuvo 1 mL de extracto bacteriano metanólico producido a partir de Xenorhabdus nematophila UNCSAB03-25-01 y Xenorhabdus sp. UNCSAB03-23-04. El extracto obtenido se almacenó a 4°C.

Ejemplo 6. Aislamiento, purificación y conservación de Photorhabdus sp. UNCSAB03-24-01

Se realizó el procedimiento expuesto en el Ejemplo 4 para el aislamiento, purificación y conservación de Photorhabdus sp. UNCSAB03-24-01 aislado del nematodo Heterorhabditis sp. Se infectó la larva de Gallería mellonella con 200 juveniles infectivo de nematodos, se esperaron entre 24 y 48 horas para realizar una punción cerca a la cabeza de la larva y obtener una gota de hemolinfa, la cual se siembra en el agar NBTA. Una vez aisladas las bacterias, se realizó el procedimiento expuesto en el Ejemplo 1 para la purificación y cultivo de Photorhabdus sp. UNCSAB 03 -24-01. Se obtuvo un cultivo puro de Photorhabdus sp. UNCSAB03-24-01. Ejemplo 7. Preparación del pre-inóculo de Photorhabdus sp. UNCSAB03-24-01, inoculación y obtención del extracto Se realizó el procedimiento expuesto en el Ejemplo 2 para la preparación del pre-inóculo de Photorhabdus sp. UNCSAB03-24-01 obtenido mediante el Ejemplo 6. Se obtuvo 1 mL de extracto bacteriano metanólico a partir de Photorhabdus sp. UNCSAB03-24-01. El extracto obtenido se almacenó a 4°C.

Ejemplo 8. Aislamiento, purificación y cultivo de Bacillus thuringiensis/cereus UNCSAB03-03-06, Bacillus amyloliquefaciens ss amyloliquefaciens UNCSAB03-03- 12, Serratia marcescens ss marcescens UNCSAB03-04-01, Bacillus oleronius UNCSAB03-04-03, Serratia marcesens ss marcesens UNCSAB03-04-05, Burkholderia dolosa UNCSAB03-07-04, Pseudomonas chlororaphis ss aurantiaca UNCSAB03-07-05, Brevundimonas diminuta UNCSAB03-09-04, Pseudomonas aerusinosa UNCSAB03-13-01, Pseudomonas tolaasii UNCSAB03-16-01, Pseudomonas aeruginosa UNCSAB03-16-02, Pseudomonas aeruginosa UNCSAB03- 16-03, Pseudomona marginalis UNCSAB03-18-04, Serratia liquefaciens UNCSAB03- 19-01, Pseudomonas aeruginosa UNCSAB03-20-01, Escherichia hermannii UNCSAB03-21-02, Serratia liquefasciensl grimesii UNCSAB03-21-03, Pseudomonas nitroreducens UNCSAB03-21-06, Serratia marcescens ss marcescens UNCSAB03-22- 01, Delftia tsuruhatensis UNCSAB03-22-02, Acinetobacter beiierinckii UNCSAB03- 22-05, Serratia marcescens ss marcescens UNCSAB03-23-01, Photorhabdus sp. UNCSAB03-24-01, Xenorhabdus nematophila UNCSAB03-25-01

Se tomó una larva de último instar de Gallería mellonella y se inoculó con 200 juveniles infectivos del nematodo. Posteriormente, a los 3 días se pasó por agua destilada estéril. Se obtiene un concentrado del cual se tomaron ΙΟΟμΕ de nematodos juveniles, en un tubo de microcentrífuga se maceraron y se realizaron diluciones seriadas y se sembraron las diluciones 10 ^"3 y 10 ^"5 en superficie en cajas de Petri con agar nutritivo (medio de cultivo) por un periodo de 24 horas a 30°C.

Las bacterias obtenidas se aislaron y se purificaron por la metodología de agotamiento en las mismas condiciones. Posteriormente, se conservaron las cepas puras en micro-tubos con 70% de caldo nutritivo y 30% de glicerol a 99% en un congelador a -20°C. Ejemplo 9. Preparación del pre-inóculo de Bacillus thuringiensis/cereus UNCSAB03-03-06, Bacillus amyloliquefaciens ss amyloliquefaciens UNCSAB03-03- 12, Serratia marcescens ss marcescens UNCSAB03-04-01, Bacillus oleronius UNCSAB03-04-03, Serratia marcesens ss marcesens UNCSAB03-04-05, Burkholderia dolosa UNCSAB03-07-04, Pseudomonas chlororaphis ss aurantiaca UNCSAB03-07-05, Brevundimonas diminuta UNCSAB03-09-04, Pseudomonas aeruginosa UNCSAB03-13-01, Pseudomonas tolaasii UNCSAB03-16-01, Pseudomonas aeruginosa UNCSAB03-16-02, Pseudomonas aeruginosa UNCSAB03- 16-03, Pseudomona marginalis UNCSAB03-18-04, Serratia liquefaciens UNCSAB03- 19-01, Pseudomonas aeruginosa UNCSAB03-20-01, Escherichia hermannii UNCSAB03-21-02, Serratia liquefasciensl grimesii UNCSAB03-21-03, Pseudomonas nitroreducens UNCSAB03-21-06, Serratia marcescens ss marcescens UNCSAB03-22- 01, Delftia tsuruhatensis UNCSAB03-22-02, Acinetobacter beijerinckii UNCSAB03- 22-05, Serratia marcescens ss marcescens UNCSAB03-23-01, Photorhabdus sp. UNCSAB03-24-01. Xenorhabdus nematovhila UNCSAB03-25-01

El cultivo puro obtenido en el Ejemplo 8 y almacenado a -20°C, se cultivó en cajas de Petri con medio agar nutritivo con un pH 7,5. Se hizo un pre-inóculo a partir de este cultivo en el que se tomaron 3 colonias aisladas y se colocaron en 5 mL de caldo nutritivo, se dejaron por 24 horas a 27 °C y 120 rpm.

Para la preparación del extracto se inocularon 100 μΕ de este cultivo y se transfirieron a un Erlenmeyer con 100 mL de caldo nutritivo y en presencia de 2,5 mL de resina Amberlita XAD 16N en solución acuosa obtenidos a partir de la mezcla de 50g de resina y 50mL de agua estéril, se esterilizaron. Se incubó por 7 días a 27°C y 120 rpm. Posteriormente se descartó el medio y se recuperó la resina por decantación, la cual se transfirió a 15 mL de metanol al 99,99% y se dejó eluir por 24 horas, se filtró el sobrenadante y se concentró en un rotoevaporador hasta obtener aproximadamente 2 mL de extracto bacteriano metanólico producido a partir de cada una de las especies. El extracto obtenido se almacenó a 4°C. Ejemplo 10. Efecto antifúngico del extracto de Xenorhabdus nematoyhila UNCSAB03-25-01, Xenorhabdus nematoyhila UNCSAB03-23-04 y Photorhabdus sp. UNCSAB03-24-01 contra Leucoagaricus gongyloyhorus, Burkholderia dolosa UNCSAB03-07-04 Pseudomonas chlororayhis ss aurantiaca UNCSAB03-07-05, Pseudomonas aeruginosa UNCSAB03-16-0Z Pseudomonas aeruginosa UNCSAB03- 16-03, Pseudomona marginalis UNCSAB03- 18-04.

Se determinó la efectividad de los extractos bacterianos metanólicos obtenidos según el Ejemplo 5, Ejemplo 7 y Ejemplo 9, frente al hongo simbionte de la hormiga Atta cephalotes siguiendo el procedimiento expuesto en el Ejemplo 3:

Se realizó un bioensayo con 3 repeticiones y un testigo, donde las mediciones se realizaron cada 7 días por cinco semanas calculando el área de crecimiento con la ayuda de un programa de procesamiento científico de imágenes, particularmente programa ImageJ versión 1.49q (Rasband, n.d.)- Los valores del área bajo la curva de crecimiento para las tres bacterias en promedio, la desviación estándar y la comparación entre cada extracto restando con el testigo (Mediante una prueba de Dunett) se exponen en la Tabla 3 y Tabla 4, las diferencias significativas se resaltan con un *:

Tabla 3 Promedios y desviación estándar de cada extracto obtenido

UNCSAB03- 16-03 33,804 1,298

UNCSAB03- 16-04 40,637 3,986

UNCSAB03- 16-05 43,619 8,198

UNCSAB03- 18-04 32,095 5,821

UNCSAB03-19-03 52,968 3,023

UNCSAB03-23-04 16,680 0,023

UNCSAB03-24-01 23,041 3,225

UNCSAB03-25-01 15,265 0,663

Testigo 46,227 5,119

Tabla 4. Comparaciones de medias, bioensayo fungicida, en la casilla de comparación es cada extracto restado con el testigo (negativo)

En el test de Dunnett se puede afirmar con una confiabilidad del 95% que la diferencia mínima significativa para que un tratamiento sea diferente al testigo debe tener un valor mínimo de 10,353 cm ² , lo que confirma que los extractos ensayados causaron una inhibición del crecimiento del hongo estadísticamente significativa.

Los porcentajes de inhibición contra el hongo Leucoagaricus gongylophorus exhibidos por los extractos bacterianos metanólicos obtenidos en este Ejemplo están entre el 25% y el 80%, se resalta el porcentaje de inhibición: 79% Xenorhabdus nematophila UNCSAB03-25-01, 78% Xenorhabdus sp UNCSAB03-23-04, 58% Photorhabdus sp. UNCSAB03-24-01 y 41% Pseudomona marginalis UNCSAB03- 18-04. Las partes por millón (ppm) contenidas en los extractos bacterianos con un total de 50500 ppm en UNCSAB03-25-01, 32000 ppm en UNCSAB 03 -24-01.

Ejemplo 11. Efecto de repelencia del extracto de Bacillus amyloliquefaciens ss amyloliquefaciens UNCSAB03-03-12, Pseudomonas chlororaphis ss aurantiaca UNCSAB03-07-05, Pseudomonas aeruginosa UNCSAB03-20-01, Pseudomonas nitroreducens UNCSAB03-21-06, Serratia marcescens ss marcescens UNCSAB03-22- 01, Delftia tsuruhatensis UNCSAB03-22-02, Serratia marcescens ss marcescens UNCSAB03-23-01, Xenorhabdus nematophila UNCSAB03-23-04, Xenorhabdus nematophila UNCSAB03-25-01.

Para el bioensayo por repelencia se usaron dos papeles filtro separados por 0,5 cm entre ellos, cada uno a un lado del fondo de una caja de Petri de090 mm. En uno de los papeles filtro se adicionó el extracto bacteriano y en el otro el agua destilada.

Las mediciones se realizaron cada 5 minutos por 60 minutos, contando las hormigas a cada lado en el periodo de tiempo exacto, se registró con la ayuda de una cámara fotográfica.

Los extractos inicialmente se encontraban suspendidos en metanol, sin embargo, para los experimentos de Bioensayo insecticida por contacto y Bioensayo por repelencia se tomó la cantidad del extracto suspendido en metanol y se procedió a evaporarlo con el fin de suspender el extracto bacteriano en agua destilada. Los datos del bioensayo de repelencia se dividen por observaciones cada cinco minutos (FIG. 1) durante una hora, para lo cual cada una de las observaciones puede analizarse como una prueba de preferencia, usando la prueba del signo para la comparación de muestras pareadas y su interpretación. Este bioensayo dio como resultado ocho extractos con efecto repelente significativo hacia las obreras de Atta cephalotes.

Si se define P como la probabilidad de que una hormiga se ubique en el sector impregnado con el extracto, x será el número de hormigas encontradas en el extracto, en una lectura determinada, pudiendo tomar 11 posibles valores: 0, 1, 2, 9, 10. Considérese el siguiente juego de hipótesis:

H ₀ : p≥ 0.5

H _a : p < 0.5

La hipótesis nula plantea que el extracto no tiene efecto repelente (pudiendo, de hecho, ser atrayente). La hipótesis alternativa plantea que el extracto tiene efecto repelente. Solamente, mediante el rechazo de la hipótesis nula podría probarse el efecto repelente del extracto.

Usando un script en R (R Core Team, 2014), puede generarse la siguiente tabla, con los valores P para cada uno de los posibles resultados: este valor P es una distribución binomial que se basa en la prueba estadística del signo.

Tabla 5 Valor P para los diferentes resultados en el bioensayo de repelencia

Luego, únicamente puede afirmarse que el extracto tiene un efecto repelente significativo cuando se observa una hormiga o ninguna (valores P menores o iguales que 0,05). En tales casos, puede afirmarse con una confianza del 95% que la probabilidad de encontrar hormigas en el extracto es inferior a 0,5 (efecto repelente). La tercera columna, calculada con base en la función inf.p en el software R, muestra el límite superior del estimador por intervalo de dicha probabilidad, obtenidos mediante el método exacto de Clopper- Pearson, de manera que haya coincidencia con la prueba de hipótesis. Este límite superior se puede interpretar como la máxima probabilidad de encontrar una hormiga en futuras ocasiones en el extracto probado.

Así se tiene, por ejemplo, una confianza del 95% de que en los casos en que se observó una hormiga en la porción con extracto, la máxima probabilidad de preferencia sería de 0,3942, lo que implica una inhibición 0,6058. Cuando se observan dos hormigas en el extracto no puede afirmarse con una probabilidad de error inferior a 0,05 que el extracto tenga efecto repelente. En este caso, la verdadera probabilidad de preferencia podría ser tan alta como 0.5069, lo cual implica que no habría ningún tipo de repelencia.

En la Tabla 6 se tabulan los datos del bioensayo repelencia. Los datos corresponden a las hormigas observadas en el lado del extracto en cada tiempo. En verde se marcan los que se encuentran por debajo del 0,05 en el valor P por lo tanto son observaciones estadísticamente significativas. La columna de la derecha corresponde a un puntaje dado para interpretar de forma más fácil la tabla.

Tabla 6.

Extracto - Ti me po 05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Sumatoria

UN CSAB03- 22-01

UN CSAB03- 23-01

UNCSAB03-23-04

UN CSAB03- 20-01 10

UNCSAB03-21-06 10

UN CSAB03- 22-02 10

UN CSAB03- 25-01 10

UNCSAB03-07-05 11

UNCSAB03-03-12 13

UNCSAB03-04-01 16

UNCSAB03-09-03 16

UNCSAB03-21-02 16

UNCSAB03-03-06 19

UN CSAB03- 22-05 21

UNCSAB03-09-04 26

UNCSAB03-21-03 26

UNCSAB03-16-01 27

UN CSAB03- 24-01 27

UNCSAB03- 13-01 28

UNCSAB03-04-05 29

UN CSAB03- 23-02 39

Testigo 54

UNCSAB03- 19-01 56

UNCSAB03- 12-04 61

Uno de los extractos con mayor actividad en el bioensayo repelencia fue UNCSAB03- 23-01, al cual se determinó que contiene 32000 ppm.

Ejemplo 12. Efecto insecticida por ingestión del extracto de Bacillus thurinsiensis/cereus UNCSAB03-03-06, Serratia marcescens ss marcescens UNCSAB03-04-01, Serratia marcescens ss marcescens UNCSAB03-04-05, Serratia marcescens ss marcescens UNCSAB03-23-01, Pseudomonas aerusinosa UNCSAB03- 13-01, Pseudomonas tolaasii UNCSAB03-16-01, Serratia liquefaciens UNCSAB03- 19-01, Escherichia hermannii UNCSAB03-21-02, Serratia liguefaciens/srimesii UNCSAB03-21-03, Pseudomonas nitroreducens UNCSAB03-21-06, Serratia marcescens ss marcescens UNCSAB03-22-01, Acinetobacter beijerinckii UNCSAB03- 22-05, Photorhabdus sp UNCSAB03-24-01.

Para este bioensayo se usó una porción de dieta de 8 mm, la cual, contiene el extracto bacteriano de la siguiente forma: en una caja de Petri de 050 mm se adicionan 10 mL de dieta (descrita en el bioensayo anterior) y se mezclan con 400 μL· de extracto bacteriano, Estos extractos fueron suspendidos en metanol por lo que se dejó la caja de Petri abierta en la cámara de flujo laminar por 10 minutos para que se evaporara el metanol.

La dieta se suministró todos los días y consistió en una porción de 8 mm, lo mismo para el testigo. Se colocaron un total de 5 hormigas obreras por caja de Petri, las mediciones se realizaron cada 24 horas por 5 días contando el número de hormigas muertas por caja de Petri, este bioensayo se realizó por triplicado.

Para el análisis de los datos se utilizó el programa Excel y se compararon los resultados utilizando una técnica adecuada para estos casos, la técnica se denomina área bajo la curva de la mortalidad acumulada, para cada una de las unidades experimentales. Este análisis también se realiza en el bioensayo del Ejemplo 10 y por medio del programa estadístico SAS (SAS Institute Inc., 2002) se recopiló la información del área bajo la curva, con la cual se realizó un análisis de varianza y se generó la diferencia mínima significativa que debe cumplir cada tratamiento para diferenciarse estadísticamente del testigo, esto por medio de una prueba de DUNNETT.

Para este bioensayo los extractos bacterianos, UNCSAB03-22-05 y UNCSAB03-04-01 lograron matar el 100 % de las hormigas en menos de 48 horas. A las 72 horas después del inicio del bioensayo, se observó que 11 extractos bacterianos (52,3 %) lograron matar un promedio mayor a 4,67 hormigas. A este grupo se pertenecen las bacterias Photorhabdus sp. (UNCSAB03-24-01), Serrada marcescens sub. marcescens UNCSAB03-04-05 y Pseudomonas tolaasii UNCSAB03-16-01.

La Tabla 6 muestra los resultados promedio del bioensayo ingestión. Se presenta el promedio de las tres repeticiones, los números representan los promedios de las hormigas muertas acumuladas.

Tabla 7

En el análisis de varianza Tabla 7, se puede observar que el valor P es menor a 0,05 por lo tanto se puede concluir que de los 21 tratamientos al menos 2 son diferentes. En la Tabla 8 se tabulan los promedios de las tres repeticiones con sus respectivas desviaciones estándar. Es importante recalcar que los valores de las tablas se refieren al área bajo la curva de cada tratamiento. En la Tabla 9 se muestran los resultados del test de Dunnet.

Tabla 7 Tabla 8.

Tabla 9

En la Tabla 10, se muestra la comparación de tratamientos con respecto al testigo del bioensayo insecticida por ingestión. La casilla de comparación corresponde a cada extracto restado con el testigo (negativo). Los extractos que están marcados con asterisco son aquellos que tienen una diferencia estadísticamente significativa con respecto al testigo. Esto se deduce a partir de comparar la diferencia mínima significativa, Tabla 9, con respecto a la columna promedios de la Tabla 10. Tabla 10

En la Tabla 11 se puede observar que el valor P es menor a 0,05, por lo tanto se puede concluir que de los 21 tratamientos, al menos 2 son diferentes. En la Tabla 9 se muestran los resultados del test de Dunnet.

Tabla 11 Tabla 12

La Tabla 13 muestra la comparación de tratamientos con respecto al testigo bioensayo insecticida por ingestión, 24 horas. En la casilla de comparación es cada extracto restado con el testigo (negativo).

En la Tabla 14 se puede apreciar que solo el primer extracto UNCSAB03-22-05 está marcado con asterisco, lo cual significa que tiene una diferencia estadísticamente significativa con respecto al testigo. Esto se traduce en que solo este extracto se diferencia del testigo a las primeras 24 horas del bioensayo ya que causó la muerte de más de tres hormigas para este tiempo.

Comparación Promedio

UNCSAB03-22-05 - Testigo 12,253***

UNCSAB03-22-01 - Testigo 0,733

UNCSAB03-21 -02 - Testigo 0,679

UNCSAB03-21 -06 - Testigo 0,636

UNCSAB03-19-01 - Testigo 0,561

UNCSAB03-23-01 - Testigo 0,518

UNCSAB03-22-02 - Testigo 0,464

UNCSAB03-04-01 - Testigo 0,388

UNCSAB03-04-05 - Testigo 0,345

UNCSAB03-21 -03 - Testigo 0,345

UNCSAB03-03-12 - Testigo 0, 173

UNCSAB03-12-04 - Testigo 0, 173

UNCSAB03-13-01 - Testigo 0, 173

UNCSAB03-03-06 - Testigo 0, 173

UNCSAB03-09-04 - Testigo 0, 173

UNCSAB03-07-05 - Testigo 0, 173

UNCSAB03-23-02 - Testigo 0, 173

UNCSAB03-23-04 - Testigo 0, 173

UNCSAB03-16-01 - Testigo 0,000

UNCSAB03-24-01 - Testigo 0,000

En la UNCSAB03-25-01 - Testigo 0,000

Tabla 14 se puede observar que el valor P es menor a 0,05 por lo tanto se puede concluir que de los 21 tratamientos al menos dos son diferentes. En la Tabla 9 se muestran los resultados del test de Dunnet.

Tabla 14

Tabla 14

Tabla 15.

La Tabla 16 muestra la comparación de tratamientos con respecto al testigo bioensayo insecticida por ingestión, 48 horas. En la casilla de comparación es cada extracto restado con el testigo (negativo). De acuerdo con la Tabla, los primeros 13 extractos están marcados con asterisco, lo cual significa que tienen una diferencia estadísticamente significativa con respecto al testigo. A partir del UNCSAB03-24-01, que tiene un promedio de 1,03, el cual es superior a la diferencia mínima significativa de la prueba de Dunnett 0,9642 (Tabla 15), podemos afirmar que si se repite el bioensayo podemos obtener los mismos resultados con un 95% de confiabilidad.

Los dos extractos con mayor actividad en el bioensayo por ingestión fueron UNCSAB03- 22-05 y UNCSAB03-04-01, de los cuales se determinó las partes por millón (ppm) contenidas en el extracto total. UNCSAB03-22-05 con 34000 ppm y UNCSAB03-04-01 con 31000 ppm.

Tabla 17

Ejemplo 13. Efecto insecticida por contacto del extracto de Bacillus thuringiensis/cereus UNCSAB03-03-06; Bacillus amyloliauefaciens ss amyloliauefaciens UNCSAB03-03-12, Serratia marcescens ss marcescens UNCSAB03-04-01, Serratia marcesens ss marcesens UNCSAB03-04-05, Pseudomon s chlororaphis ss aurantiaca UNCSAB03-07-05, Brevundimonas diminuta UNCSAB03-09-04, Pseudomonas aeruginosa UNCSAB03- 13-01, Serratia liauefaciens UNCSAB03-19-01, Escherichia hermannii UNCSAB03- 21-02, Serratia liauefaciens/ grimesii UNCSAB03-21-03, Pseudomonas nitroreducens UNCSAB03-21-06, Serratia marcescens ss marcescens UNCSAB03-22-01, Delftia tsuruhatensis UNCSAB03-22-02, Acinetobacter beijerinckii UNCSAB03-22-05, Serratia marcescens ss marcescens UNCSAB03-23-01, Xenorhabdus nematophila UNCSAB03-25-01. Para este bioensayo se tomó como base la metodología propuesta por Boulogne y colaboradores (2012), para la cual las hormigas entran en contacto con el extracto por medio del papel filtro al fondo de la caja de Petri. Se empleó una caja de Petri de 050 mm en la cual en el fondo de esta se encontraba un papel filtro, al cual se aplicó 500 μL· del extracto o de agua destilada (testigo). Se usaron 5 hormigas obreras mayores.

Para asegurar que la muerte no se debió a la falta de alimento, se suministró una dieta artificia ⁴ (Bueno, Morini, Pagnocca, Hebling, & Silva, 1997) dentro de la caja de Petri. Las mediciones se realizaron cada 24 horas por 5 días contando el número de hormigas muertas por caja de Petri. En este bioensayo se obtuvo como resultado que 5 extractos mataron el 100 % de las hormigas en 24 horas, otros 13 extractos lograron causar la muerte del 100% de las hormigas en menos de 48 horas. La Tabla 17 muestra el resumen de resultados del bioensayo insecticida por contacto. Se muestran los extractos que lograron matar las hormigas en menos de 48 horas. Los números representan las hormigas muertas acumuladas.

⁴ La dieta artificial consistió en peptona bacteriológica, agar bacteriológico, extracto de levadura y glucosa. Tabla 18

En la

Tabla 18 están reportados los mejores extractos que logran matar las hormigas en menos de 24 horas a partir de bacterias aisladas de nematodos de la familia Rhabditidae.

Tabla 18

En el bioensayo de contacto se puede observar que alrededor del 20 % de los extractos tiene una acción insecticida considerable, estos resultados se pueden ver en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia., en la cual se muestra el número de extractos que matan las hormigas en tres rangos de tiempo diferentes. Además de esta tabla se puede apreciar en la FIG. 2 de forma más didáctica. La Tabla 20 muestra el porcentaje de participación del número de extractos por tiempo de exposición, bioensayo contacto.

Tabla 20

24 horas 5,4%

48 horas 13 14,0%

> 48 horas 75 80,6%

Se determinó la concentración en partes por millón (ppm) de dos de los cinco mejores extractos en este bioensayo, los resultados fueron: UNCSAB-03-06 con 31500 ppm y UNCSAB-03-04-05 39500 ppm.

Ejemplo 14. Características morfológicas de las colonias formadas por las cepas bacterianas.

En las Tablas 21 a 49 se indican las características morfológicas de las cepas de microorganismos de los Ejemplos 3 y 8, así como de las cepas de otros microorganismos cultivados bajo el mismo procedimiento indicado, para obtener extractos con actividad biocida.

Tabla 21. Características Morfológicas Bacillus mojavensis (UNCSAB02-24)

Tabla 22. Características Morfológicas Xenorhabdus nemato hila (UNCSAB03-25-

Tabla 23. Características Morfológicas Xenorhabdus sp. (TJNCSAB03-23-04) Medio Forma Elevación Borde Brillo Textura Color

NBTA Redonda Elevada Regular Brillante Cremosa Azul

Tabla 24. Características Morfológicas Photorhabdus SD. (UNCSAB03-24-01)

Medio Forma Elevación Borde Brillo Textura Color

NBTA Redonda Elevada Regular Brillante Cremosa Café

Tabla 25. Características Morfológicas Acinetobacter beiierinckii (UNCSAB03-22- 05)

Tabla 26. Características Morfológicas Bacillus thurinsiensis/cereus (UNCSAB03-

03-6) Tabla 27. Características Morfológicas Bacillus amyloliquefaciens ss amyloli uefaciens (UNCSAB03-03-12)

Tabla 29. Características Morfológicas Brevundimonas diminuta (UNCSAB03-09- 04] Medio Forma Elevación Borde Brillo Textura Color

Agar Irregular Elevada Irregular Brillante Cremosa Blanco nutritivo

Tabla 30. Características Morfológicas Burkholderia dolosa UNCSAB03-07-04)

Medio Forma Elevación Borde Brillo Textura Color

Agar Blanco irregular Elevada irregular Brillante cremosa nutritivo Amarillo

Tabla 31. Características Morfológicas Delftia tsuruhatensis (UNCSAB03-22-02)

Tabla 32. Características Morfológicas Escherichia hermannii (UNCSAB03-21-02)

Tabla 34. Características Morfológicas Pseudomonas aerusinosa (UNCSAB03-13- oí]

Tabla 35. Características Morfológicas Pseudomonas aerusinosa (UNCSAB03-16- 02) Agar

móvil Elevada Regular Brillante Cremosa Transparente nutritivo

Tabla 36. Características Morfológicas Pseudomonas aerusinosa (UNCSAB03-16- 03} Tabla 37. Características Morfológicas Pseudomonas aerusinosa (UNCSAB03-20-

Tabla 38. Características Morfológicas Pseudomonas chlororaphis ss aurantiaca (UNCSAB03-07-05)

Tabla 39. Características Morfológicas Pseudomonas marsinalis (UNCSAB03-18- 04

Tabla 40. Características Morfológicas Pseudomonas nitroreducens (UNCSAB03- 21-06)

Agar

móvil elevada regular brillante rugosa Blanco nutritivo

Tabla 42. Características Morfológicas Serratia liguefaciens (UNCSAB03-19-01)

Tabla 44. Características Morfológicas Serratia marcescens ss marcescens OJNCSAB03-04-01)

Tabla 45. Características Morfológicas Serratia marcescens ss marcescens OJNCSAB03-04-05)

Tabla 46. Características Morfológicas Serratia marcescens ss marcescens (UNCSAB03-22-01)

Tabla 47. Características Morfológicas Serratia marcescens ss marcescens (UNCSAB03-23-01) Agar

Redonda Elevada Regular Brillante Cremosa Blanco nutritivo

Tabla 48. Características Morfológicas Xenorhabdus nematoyhila (UNCSAB03-23- 04) Tabla 49. Características Morfológicas Xenorhabdus nematoyhila (UNCSAB03-25-

E jemplo 15. Caracterización de las cepas Se caracterizó la cepa de los microorganismos empleando el sistema de identificación y caracterización biológica Biolog GEN III microplate®. Con dicho sistema de identificación es posible analizar un microorganismo con 94 pruebas fenotípicas: 71 ensayos de utilización de fuentes de carbono y 23 ensayos de sensibilidad química. El panel provee patrones fenotípicos del microorganismo que pueden ser usadas para identificarlo a nivel de especie. Las Tablas 34 a 42 muestran la Identificación y

Caracterización biológica. Se incluyen tanto un control negativo como uno positivo (Tablas 34 a 42).

Tabla 50.

Minociclina - - -

Gelatina + - -

Glicil-L-Prolina + +/- +/-

L-Alanina + + +

L-Arginina + +/- +/-

L- Acido Aspartico + + +

L- Acid Glutamico + + +

L-Histidina + + +

L- Acido Piroglutamico +/- +/- +/-

L-Serina + + +

Lincomicina - + +

Guanidina HC1 + +/- +/-

Niaproof 4 - - -

Pectina + - -

Acid D-Galacturonico + - -

Acido L-Galactonico + +/- +/-

Lactona

Acido D-Gluconico + +/- +/-

Acido D-Glucuronico + +/- +/-

Glucuronamido +/- +/- +/-

Acido Mucico +/- +/- +/-

Acido Quinico + +/- +/-

Acid D-Sacarico +/- +/- +/-

Vancomicina - + +

Violeta de Tetrazolio - + +

Azul de Tetrazolio - + +

Acido p- +/- - -

Hidroxifenilacetico

Metil Piruvato +/- + -

Acido D-Láctico metil +/- - +/- éster

Acido L-Lactico + + +

Acido Cítrico + - +/-

Acido oc-ceto-Glutarico +/- +/- +/-

Acido D-Malico - +/- +/-

Acido L-Malico + +/- +/-

Acido Bromo-Succinico + +/- +/-

Acido Nalidixico +/- - -

Cloruro de Litio + - -

Telurito de Potasio + + +

Tween 40 +/- + +

Acido 7-Amino-Butírico +/- - -

Acido oc-Hidroxi- - +/- +/-

Butírico

Acido -Hidroxi-D,L- +/- - -

Butírico Acido α-Ceto-Butírico - - -

Acido Acetoacetico + + +

Acido Propionico +/- - -

Acido Acético + + +

Acido Fórmico + - -

Aztreonam - - +/-

Butirato de Sodio + - -

Bromato de Sodio - - -

Tabla 51

D-Manosa +/- - +

D-Fructosa - +/- +

D-Galactosa +/- - +/-

Metil Glucosa - - +/-

D-Fucosa - - +/-

L-Fucosa +/- - +/-

L- Ramnosa +/- - +/-

Inosina - + +/-

Lactato de Sodio

+ + +

1%

Acido Fusidico - - -

D-Serina + + -

D-Sorbitol - - +

D-Manitol - - +

D-Arabitol - - - mio-Inositol - - -

Glicerol - +/- +

D-Glucosa-6-P0 ₄ +/- + +/-

D-Fructosa-6-P0 ₄ +/- + +/-

Acido D-Aspártico - - +

D-Serina +/- - -

Troleandomicina - - -

Rifamicina SV + - -

Minociclina - - -

Gelatina - + +

Glicil-L-Prolina - - +

L-Alanina + +/- +

L-Arginina - +/- +

L- Acido Aspartico + +/- +

L- Acid Glutamico + +/- +

L-Histidina + +/- +

L- Acido

Piroglutamico +/-

L-Serina + + +/-

Lincomicina + - -

Guanidina HC1 +/- + +

Niaproof 4 +/- - -

Pectina - - +

Acid D-

Galacturonico +/- + +

Acido L-

Galactonico +/- +/- -

Lactona

Acido D-Gluconico - +/- +

Acido D-

Glucuronico +/- +/- +/- Glucuronamido +/- +/- +/-

Acido Mucico - - +/-

Acido Quinico - - +/-

Acid D-Sacarico - - +/-

Vancomicina + - -

Violeta de

+

Tetrazolio +/-

Azul de Tetrazolio + - -

Acido p-

Hidroxifenilacetico

Metil Piruvato + +/- +

Acido D-Láctico

metil éster +/-

Acido L-Lactico - +/- +

Acido Cítrico + - +

Acido oc-ceto-

+ +/-

Glutarico

Acido D-Malico + - +

Acido L-Malico + + +

Acido Bromo-

+

Succinico +/-

Acido Nalidixico +/- - -

Cloruro de Litio +/- + +

Telurito de Potasio + + +

Tween 40 + +/- +

Acido γ-Amino- +

Butririco +/-

Acido oc-Hidroxi-

Butirico

Acido β-Hidroxi- D,L-Butirico +/- - -

Acido oc-ceto-

+

Butirico

Acid Acetoacetico +/- + +

Acid Propionico + - +/-

Acido Acético + +/- +

Acid Fórmico +/- - +

Aztreonam + + -

Butirato de Sodio - + -

Bromato de Sodio - +/- -

Tabla 52.

Prueba Resultado D-Arabitol - +/- - mio-Inositol - +/- -

Glicerol - +/- +/-

D-Glucosa-6-P0 ₄ - +/- +/-

D-Fructosa-6-P0 ₄ - + -

Acido D-Aspártico - - -

D-Serina - - +/-

Troleandomicina +/- + +

Rifamicina SV +/- + +

Minociclina + +/- +

Gelatina +/- +/- +/-

Glicil-L-Prolina - +/- +/-

L-Alanina - + +/-

L-Arginina - + +

L- Acido Aspartico - + +/-

L- Acid Glutamico - + +

L-Histidina - + +

L- Acido

Piroglutamico + +/-

L-Serina - + +/-

Lincomicina +/- + +

Guanidina HC1 + +/- +

Niaproof 4 +/- + +

Pectina - - +/-

Acid D-Galacturonico - +/- +/-

Acido L-Galactonico

Lactona +/-

Acido D-Gluconico - + +

Acido D-Glucuronico - +/- -

Glucuronamido - + +

Acido Mucico - +/- -

Acido Quinico - + +

Acid D-Sacarico - - -

Vancomicina +/- + +

Violeta de Tetrazolio +/- + +

Azul de Tetrazolio +/- + +

Acido p- Hidroxifenilacetico + +

Metil Piruvato - + -

Acido D-Láctico

metil éster +/-

Acido L-Lactico - - +

Acido Cítrico - + +

Acido oc-ceto- Glutarico + +

Acido D-Malico - + - Acido L-Malico - + +

Acido Bromo- Succinico + +/-

Acido Nalidixico +/- + +

Cloruro de Litio + - -

Telurito de Potasio + + +

Tween 40 - + -

Acido 7-Amino- Butririco + +

Acido oc-Hidroxi- Butirico +/-

Acido -Hidroxi-D,L- Butirico + +

Acido oc-ceto-Butirico - +/- -

Acid Acetoacetico - +/- +/-

Acid Propionico - + +

Acido Acético - + +/-

Acid Fórmico - +/- -

Aztreonam + + +/-

Butirato de Sodio + +/- -

Bromato de Sodio +/- - -

Tabla 53.

N-Acetil-D- Glucosamina +/- +/- +/-

N-Acetil-β-Ο-

- - - Manosamina

N-Acetil-D-

- - - Galactosamina

Acido N-Acetil

- - - Neuraminico

NaCl 1% + + +

NaCl 4% +/- +/- -

NaCl 8% - - - oc-D-Glucosa + + +/-

D-Manosa +/- + +/-

D-Fructosa +/- +/- +/-

D-Galactosa +/- + +

Metil Glucosa - - +/-

D-Fucosa +/- +/- +/-

L-Fucosa +/- +/- +/-

L- Ramnosa +/- - +/-

Inosina +/- +/- +/-

Lactato de Sodio 1% + + +

Acido Fusidico + + +

D-Serina +/- - -

D-Sorbitol - + -

D-Manitol + + +/-

D-Arabitol - +/- +/- mio-Inositol - +/- +

Glicerol +/- +/- +/-

D-Glucosa-6-P0 ₄ +/- - -

D-Fructosa-6-P0 ₄ - +/- +/-

Acido D-Aspártico - - +

D-Serina +/- - -

Troleandomicina + + +

Rifamicina SV + + +

Minociclina + - -

Gelatina - +/- -

Glicil-L-Prolina +/- - -

L-Alanina +/- + +/-

L-Arginina + + +

L- Acido Aspartico + +/- +/-

L- Acid Glutamico + +/- +

L-Histidina + + +

L- Acido Piroglutamico +/- +/- +

L-Serina +/- + +

Lincomicina + + +

Guanidina HC1 +/- +/- +/- Niaproof 4 + + +

Pectina - - -

Acid D-Galacturonico +/- + +

Acido L-Galactonico

Lactona +/- +/-

Acido D-Gluconico + + +

Acido D-Glucuronico +/- + +

Glucuronamido - +/- +

Acido Mucico - + +

Acido Quinico + + +

Acid D-Sacarico - + +

Vancomicina + + +

Violeta de Tetrazolio + + +

Azul de Tetrazolio + + +

Acido p-

+ +

Hidroxifenilacetico

Metil Piruvato +/- +/- +/-

Acido D-Láctico metil

éster

Acido L-Lactico + + +/-

Acido Cítrico + + +

Acido oc-ceto-Glutarico + + +

Acido D-Malico - - -

Acido L-Malico + + +

Acido Bromo-

Succinico +/- +/-

Acido Nalidixico + +/- -

Cloruro de Litio - +/- +/-

Telurito de Potasio + + +

Tween 40 + +/- +/-

Acido 7-Amino-

+ +

Butririco +/-

Acido oc-Hidroxi-

Butirico

Acido -Hidroxi-D,L-

Butirico +/- +/- +/-

Acido oc-ceto-Butirico - - -

Acid Acetoacetico +/- - -

Acid Propionico + + +/-

Acido Acético + + +

Acid Fórmico - - -

Aztreonam + +/- +/-

Butirato de Sodio - - -

Bromato de Sodio - +/- - Tabla 54.

Acido Fusidico - - +/-

D-Serina + - -

D-Sorbitol - - -

D-Manitol - +/- +/-

D-Arabitol - - - mio-Inositol - - -

Glicerol - - +

D-Glucosa-6-P0 ₄ +/- - +

D-Fructosa-6-P0 ₄ +/- - +

Acido D-Aspártico - + +/-

D-Serina - - -

Troleandomicina +/- + +

Rifamicina SV + + +

Minociclina - - -

Gelatina + - -

Glicil-L-Prolina + - +

L-Alanina - +/- +

L-Arginina - - -

L- Acido Aspartico + + +

L- Acid Glutamico + + +

L-Histidina + + +/-

L- Acido Piroglutamico - +/- +/-

L-Serina - - +

Lincomicina + + +

Guanidina HC1 +/- +/- +

Niaproof 4 - +/- +

Pectina - - -

Acid D-Galacturonico - +/- +

Acido L-Galactonico

Lactona +/- - -

Acido D-Gluconico - + +

Acido D-Glucuronico +/- +/- +

Glucuronamido +/- +/- +/-

Acido Mucico - + +

Acido Quinico - - -

Acid D-Sacarico - +/- +

Vancomicina - + +

Violeta de Tetrazolio + + +

Azul de Tetrazolio + + +

Acido p-

- + - Hidroxifenilacetico

Metil Piruvato - +/- +

Acido D-Láctico metil

- - éster +/-

Acido L-Lactico - +/- +

Acido Cítrico - +/- +/- Acido α-ceto-Glutarico - + -

Acido D-Malico - + -

Acido L-Malico - + +/-

Acido Bromo-

- + - Succinico

Acido Nalidixico + - -

Cloruro de Litio +/- +/- +/-

Telurito de Potasio - - +/-

Tween 40 - +/- -

Acido γ-Amino-

- - - Butririco

Acido oc-Hidroxi-

- - Butirico +/-

Acido -Hidroxi-D,L- Butirico +/- +/- -

Acido oc-ceto-Butirico - + -

Acid Acetoacetico +/- +/- +/-

Acid Propionico - + -

Acido Acético +/- + +

Acid Fórmico - +/- -

Aztreonam + +/- +/-

Butirato de Sodio - +/- +/-

Bromato de Sodio - - -

Tabla 55.

β-Metil-D-Glucosido - - -

D-Salicina - - -

N-Acetil-D-

+/- +/-

Glucosamina

N-Acetil- -D-

Manosamina

N-Acetil-D-

Galactosamina

Acido N-Acetil

Neuraminico

NaCl 1 % + + +

NaCl 4% +/- +/- +/-

NaCl 8% - - - oc-D-Glucosa + + +

D-Manosa +/- - +/-

D-Fructosa +/- +/- +

D-Galactosa +/- +/- +/-

Metil Glucosa - - -

D-Fucosa +/- +/- +/-

L-Fucosa +/- +/- +/-

L- Ramnosa +/- +/- +/-

Inosina +/- +/- +

Lactato de Sodio 1 % + + +

Acido Fusidico + + +

D-Serina +/- +/- +/-

D-Sorbitol - - -

D-Manitol + +/- +

D-Arabitol +/- - +/- mio-Inositol +/- - +

Glicerol + +/- +

D-Glucosa-6-P0 ₄ +/- - -

D-Fructosa-6-P0 ₄ - - -

Acido D-Aspártico - - -

D-Serina - +/- +

Troleandomicina + + +

Rifamicina SV + + +

Minociclina + + +

Gelatina - - -

Glicil-L-Prolina + + -

L-Alanina +/- +/- +

L-Arginina + + +

L- Acido Aspartico + + +

L- Acid Glutamico + + +

L-Histidina + + +

L- Acido Piroglutamico + + +

L-Serina +/- +/- + Lincomicina + + +

Guanidina HC1 +/- +/- +/-

Niaproof 4 + + +

Pectina - - -

Acid D-Galacturonico +/- - +/-

Acido L-Galactonico

Lactona +/- +/- +/-

Acido D-Gluconico + + +

Acido D-Glucuronico +/- +/- +/-

Glucuronamido + - +/-

Acido Mucico - - +

Acido Quinico + + +

Acid D-Sacarico - - +

Vancomicina + + +

Violeta de Tetrazolio + + +

Azul de Tetrazolio + + +

Acido p-

+ + +

Hidroxifenilacetico

Metil Piruvato +/- +/- +/-

Acido D-Láctico metil

éster

Acido L-Lactico + +/- +

Acido Cítrico + + +

Acido oc-ceto-Glutarico + +/- +

Acido D-Malico - - -

Acido L-Malico + + +

Acido Bromo-Succinico +/- - -

Acido Nalidixico + + +

Cloruro de Litio - - +

Telurito de Potasio + + +

Tween 40 +/- +/- +/-

Acido γ-Amino- + + +

Butririco

Acido oc-Hidroxi-

Butirico

Acido -Hidroxi-D,L-

Butirico +/- +/- +/-

Acido oc-ceto-Butirico - - -

Acid Acetoacetico +/- - +/-

Acid Propionico + + +

Acido Acético + +/- +

Acid Fórmico - - -

Aztreonam +/- + +/-

Butirato de Sodio - - -

Bromato de Sodio +/- +/- +/- Tabla 56.

D-Serina +/- + +

D-Sorbitol - +/- +/-

D-Manitol - + +/-

D-Arabitol - +/- - mio-Inositol - + +

Glicerol +/- + +/-

D-Glucosa-6-P0 ₄ - + +

D-Fructosa-6-P0 ₄ - + +

Acido D-Aspártico - + +/-

D-Serina - + +

Troleandomicina + + +

Rifamicina SV + + +

Minociclina + +/- +/-

Gelatina - + +

Glicil-L-Prolina - + +

L-Alanina +/- + +

L-Arginina + +/- +/-

L- Acido Aspartico + + +

L- Acid Glutamico + + +

L-Histidina - + +

L- Acido Piroglutamico - +/- +/-

L-Serina +/- + +

Lincomicina + + +

Guanidina HC1 +/- +/- +

Niaproof 4 + + +

Pectina - + +/-

Acid D-Galacturonico +/- + +

Acido L-Galactonico

Lactona +/- + +

Acido D-Gluconico + + +

Acido D-Glucuronico +/- + +

Glucuronamido +/- + +

Acido Mucico - +/- +/-

Acido Quinico + +/- -

Acid D-Sacarico - +/- +/-

Vancomicina + + +

Violeta de Tetrazolio + + +

Azul de Tetrazolio + + +

Acido p- Hidroxifenilacetico +/- +/-

Metil Piruvato + +/- +/-

Acido D-Láctico metil

éster +/-

Acido L-Lactico + + +

Acido Cítrico + + +

Acido oc-ceto-Glutarico + + + Acido D-Malico - + +

Acido L-Malico + + +

Acido Bromo- Succinico +/- +/- +/-

Acido Nalidixico + - -

Cloruro de Litio - +/- +/-

Telurito de Potasio + - -

Tween 40 +/- +/- +

Acido 7-Amino- Butririco +

Acido oc-Hidroxi- Butirico +/- +/-

Acido -Hidroxi-D,L- Butirico +

Acido a-ceto-Butirico - - -

Acid Acetoacetico - +/- -

Acid Propionico + +/- -

Acido Acético + + +/-

Acid Fórmico +/- +/- +/-

Aztreonam +/- +/- +/-

Butirato de Sodio +/- +/- +/-

Bromato de Sodio - - -

Tabla 57.

D-Salicina + + +

N-Acetil-D-

+ + +

Glucosamina

N-Acetil- -D-

+/- +/- +

Manosamina

N-Acetil-D-

+ + +

Galactosamina

Acido N-Acetil

+/-

Neuraminico

NaCl 1 % + + +

NaCl 4% + +/- +/-

NaCl 8% +/- - - oc-D-Glucosa +/- + +

D-Manosa + + +

D-Fructosa + + +

D-Galactosa + + +

Metil Glucosa +/- + +/-

D-Fucosa + + +

L-Fucosa + +/- +

L- Ramnosa +/- +/- +/-

Inosina + + +

Lactato de Sodio 1 % + + +

Acido Fusidico + + +/-

D-Serina + +/- +

D-Sorbitol + + +

D-Manitol + + +

D-Arabitol +/- + +/- mio-Inositol + + +

Glicerol + + +

D-Glucosa-6-P0 ₄ + + +

D-Fructosa-6-P0 ₄ + + +

Acido D-Aspártico +/- +/- +/-

D-Serina + + +

Troleandomicina + + +

Rifamicina SV + + +

Minociclina + +/- +

Gelatina + + +

Glicil-L-Prolina + + +

L-Alanina + + +

L-Arginina +/- +/- +/-

L- Acido Aspartico + + +

L- Acid Glutamico + + +

L-Histidina + + +

L- Acido Piroglutamico +/- +/- -

L-Serina + + +

Lincomicina + + + Guanidina HC1 + + +

Niaproof 4 + + +

Pectina + + +/-

Acid D-Galacturonico + +/- +

Acido L-Galactonico

Lactona +/- +/-

Acido D-Gluconico + + +

Acido D-Glucuronico + +/- +

Glucuronamido +/- + +

Acido Mucico - +/- -

Acido Quinico - - -

Acid D-Sacarico +/- +/- -

Vancomicina + + +

Violeta de Tetrazolio + + +

Azul de Tetrazolio + + +

Acido p-

+ + +

Hidroxifenilacetico

Metil Piruvato +/- + +/-

Acido D-Láctico metil

- éster +/- -

Acido L-Lactico + + +

Acido Cítrico + + +

Acido oc-ceto-Glutarico + + +/-

Acido D-Malico +/- + +/-

Acido L-Malico + + +

Acido Bromo-Succinico +/- +/- +/-

Acido Nalidixico - - -

Cloruro de Litio + +/- +

Telurito de Potasio - - -

Tween 40 +/- +/- +/-

Acido γ-Amino-

+/- +/-

Butririco +/-

Acido oc-Hidroxi-

+/- +

Butirico

Acido -Hidroxi-D,L-

+ +

Butirico +/-

Acido oc-ceto-Butirico - - -

Acid Acetoacetico +/- +/- +

Acid Propionico - + +

Acido Acético + +/- +/-

Acid Fórmico +/- +/- +/-

Aztreonam +/- +/- +/-

Butirato de Sodio +/- +/- +/-

Bromato de Sodio - - - Tabla 58.

L- Ramnosa +/- - +/-

Inosina +/- +/- +

Lactato de Sodio 1 % + +/- +

Acido Fusidico - - +/-

D-Serina + + +

D-Sorbitol - - +/-

D-Manitol - - +/-

D-Arabitol - - +/- mio-Inositol + +/- +

Glicerol + + +/-

D-Glucosa-6-P0 ₄ + + +

D-Fructosa-6-P0 ₄ + + +

Acido D-Aspártico + + +/-

D-Serina - - +

Troleandomicina + + +

Rifamicina SV + + +

Minociclina - - +

Gelatina - - +

Glicil-L-Prolina +/- +/- +

L-Alanina + + +

L-Arginina +/- +/- +/-

L- Acido Aspartico + + +

L- Acid Glutamico + + +

L-Histidina - + +

L- Acido Piroglutamico +/- +/- -

L-Serina + + +

Lincomicina + + +

Guanidina HC1 +/- +/- +

Niaproof 4 - - +

Pectina - - +

Acid D-Galacturonico - - +

Acido L-Galactonico

Lactona +/- +/- -

Acido D-Gluconico +/- +/- +

Acido D-Glucuronico +/- +/- +

Glucuronamido +/- +/- +

Acido Mucico +/- +/- -

Acido Quinico +/- +/- -

Acid D-Sacarico +/- - -

Vancomicina + + +

Violeta de Tetrazolio + + +

Azul de Tetrazolio + + +

Acido p-

- - + Hidroxifenilacetico

Metil Piruvato + + +/- Acido D-Láctico metil

éster

Acido L-Lactico + + +

Acido Cítrico +/- - +

Acido oc-ceto-Glutarico +/- +/- +/-

Acido D-Malico +/- +/- +/-

Acido L-Malico - +/- +

Acido Bromo-Succinico +/- +/- -

Acido Nalidixico - - -

Cloruro de Litio - - +

Telurito de Potasio + + -

Tween 40 + + +/-

Acido γ-Amino- +

Butririco

Acido oc-Hidroxi-

Butirico +/- +/- +/-

Acido -Hidroxi-D,L-

- - Butirico +/-

Acido oc-ceto-Butirico + + -

Acid Acetoacetico + + +

Acid Propionico - + -

Acido Acético + + +/-

Acid Fórmico - - +/-

Aztreonam +/- - +/-

Butirato de Sodio - - +/-

Bromato de Sodio - - -