TRANSMISIÓN VERTICAL, LA CRONIFICACIÓN Y/O EL ACLARAMIENTO DEL VIRUS DE

LA HEPATITIS C

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra dentro del campo de la Biología Molecular y la Medicina Clínica. Específicamente, se refiere a un método in vitro de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C (VHC) y/o su herencia y/o su cronificación y/o aclaramiento en el descendiente. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se calculan 170 millones de personas infectadas por el virus de la hepatitis C (VHC) en todo el mundo. En Estados Unidos y Europa, la prevalencia está entre 1-2%, pero puede ser del 8% en algunos países en vías de desarrollo [Arshad et al., 201 1. J. Viral. Hepat. 18: 229 -236, Zahran et al., 2010. Int. J. Gynaecol. Obstet. 11 1 : 171 -174] y entre un 0,05%-5% en los niños [Schwimmer et al., 2000. Semin. Liver Dis. 20:37-46]. En España, su prevalencia en gestantes es del 0,5% al 1 ,4% [Ruiz Extremera A, et al., 2005. Am J Obstet Gynecol. 193 (6):2010-6, Muñoz-Almagro C, et al., 2002. Med Clin (Barc) 1 18(12):452-4], semejante a la de la población general.

En la transmisión vertical (TV) del VIH, VHB y del VHC el momento de mayor riesgo de transmisión es el parto y se acepta que las madres sin viremia no transmiten la infección.

Aunque la tasa de TV del VHC es baja, 1-8% en madres no coinfectadas y en torno a 20% en las coinfectadas (VIH), hay que tener en cuenta que el 90% de los niños infectados han adquirido el virus por transmisión vertical. También se conoce que en los primeros meses de vida los niños pueden aclarar espontáneamente el virus. Por otro lado, de los que persisten con viremias intermitentes, un 53% quedarán crónicamente infectados [Ruiz-Extremera A, et al., 201 1 ; 53(6): 1830-8]. A pesar de los numerosos estudios publicados, los únicos factores que tienen evidencia científica, relacionados con un mayor riesgo de TV son la alta carga viral en la madre y la coinfección con el VIH.

Los resultados del grupo europeo para el estudio de la TV del VHC [Pembrey L et al., 2005. J Hepatol 43:515-25] son parecidos y no han conseguido implicar a otros factores como el tipo de parto, horas de bolsa rota, drogadicción materna, procedimientos obstétricos y lactancia materna. No obstante, a medida que aumenta el conocimiento sobre el VHC y la importancia de los factores inmunogenéticos del hospedador, es posible profundizar en los factores que l influyen en que unos niños se infecten y otros no, ante iguales condiciones de carga viral materna o intervenciones obstétricas.

Aunque la prevención farmacológica de la TV del VHC no era posible con el tratamiento convencional de interferón pegilado alfa y la ribavirina porque están contraindicados en el embarazo y durante el período neonatal, la situación ha cambiado con el desarrollo de agentes antivirales de acción directa, que han mostrado su elevada eficacia en bajar y negativizar la carga viral del VHC de forma relativamente rápida y sin necesidad de añadir interferón pegilado y ribavirina, de otro lado, por la experiencia en el tratamiento de adultos con estos fármacos se sabe que cuentan con muy pocos efectos adversos y parecen bastante seguros. La profilaxis de dicha transmisión va a ser posible, como ha sucedido con la TV del VIH, al aplicar los antivirales en la última etapa de la gestación e incluso con la administración al recién nacido.

Se necesitarán ensayos clínicos y posiblemente pruebas diagnósticas para conocer que niños tienen mayor riesgo de infectarse por el VHC y/o cronificar la infección ya que el coste de estos fármacos es muy elevado y la tasa de transmisión baja.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

El objeto de la invención está relacionado con el estudio de los genes implicados en la respuesta inmunológica frente al VHC: las moléculas HLA clase I, clase II y los receptores tipo inmunoglobinas de las células NK (KIRs), que pueden ayudar a aclarar algunos de estos mecanismos.

Estos nuevos marcadores genéticos permiten conocer que madre gestante con VHC tiene mayor probabilidad de transmitir el virus a su hijo, así como la probabilidad de que puede tener su hijo de cronificar el virus si se infecta, basándonos en el análisis de los distintos genotipos de la madre y/o hijo. Empleando estos marcadores, las madres con mayor riesgo de transmisión podrían ser tratadas con antivirales directos para impedir la transmisión a su hijo en el parto, como por ejemplo ocurre en la transmisión vertical del VIH.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que una madre portadora del virus de la hepatitis C (ARN- VHC (+)) transmita verticalmente el virus a su descendencia, o de que un individuo cuya madre es portadora del virus de la hepatitis C, herede y/o cronifique y/o aclare, en caso de que sea contagiado, el virus de la hepatitis C, que comprende a) obtener una muestra biológica aislada de la madre, y b) determinar el genotipo de los genes HLA y KIR en la muestra aislada del paso (a).

Transmisión Vertical

En cuanto a la transmisión vertical del VHC de una madre portadora a sus descendientes, la invención se centra en los siguientes aspectos:

Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que una madre ARN-VHC (+) transmita verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de la madre gestante, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-C y KIR en la muestra aislada del paso (a). En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo de los genes KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, y KIR2DS4

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C a la descendencia, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) del primer método de la invención y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial: c1) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 5 veces mayor, y preferiblemente 6 veces mayor, de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2, en comparación con una madre que no lo presente. c2) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 3 veces mayor, y preferiblemente 3,9 veces mayor, de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2), en comparación con una madre que presente otro genotipo. c3) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad de al menos 9 veces mayor, y preferiblemente 10,7 veces mayor, de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en combinación con el genotipo KIR2DL2 y KIR2DL3, en comparación con una madre que no presente dichos genotipos. c4) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 5 veces mayor, y preferiblemente 6 veces mayor, de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2 en combinación con KIR2DL1 , o el genotipo HLA-C2 en combinación con KIR2DS4, en comparación con una madre que no lo presente; c5) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 4 veces mayor, y preferiblemente 5 veces mayor, de no transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C1 o HLA-C1 en homocigosis (HLA-C1 C1), en comparación con una madre que no lo presente. c6) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 2 veces mayor, y preferiblemente 2,5 veces mayor, de no transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-

C1 en combinación con KIR2DL3, en comparación con una madre que no lo presente; c7) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad al menos 3 veces mayor, y preferiblemente 3,3 veces mayor, de no transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA- C1 en combinación con KIR2DS4, en comparación con una madre que no lo presente.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante primer kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1 y/o KIR2DS4.

En una realización preferida, el kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1 y/o KIR2DS4, y donde:

- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4);

- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1 y/o SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4).

- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 4 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 6 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 8 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 y/o SEQ I D NO: 14 (KIR2DS4). En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.

Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso del primer kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C.

Un sexto aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN-VHC (+), de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada del individuo, y b) detectar el genotipo de los genes HLA-C y KIR en la muestra aislada del paso (a).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo de los genes KIR2DL2, KIR2DL3, y KIR2DS3

Un séptimo aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN-VHC (+), de ahora en adelante cuarto método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el tercer método de la invención, y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial: c1) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 3 veces mayor, y preferiblemente 3,3 veces mayor, de ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en comparación con un individuo que no lo presente c2) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 4 veces mayor, preferiblemente 4,2 veces mayor, de ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en combinación con la homocigosis de KIR2DL2

(KIR2DL2/2DL2), en comparación con un individuo que no lo presente. c3) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 13 veces mayor, y preferiblemente 14 veces mayor, de ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en combinación con la homocigosis de KIR2DL3

(KIR2DL3/2DL3), en comparación con un individuo que no lo presente. c4) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 13 veces mayor, y preferiblemente 14,3 veces mayor, de no ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo KIR2DS3, en comparación con un individuo que no lo presente. c5) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 3 veces mayor, y preferiblemente 3,3 veces mayor, de no ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA- C1 , en comparación con un individuo que no lo presente. c6) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 4 veces mayor, y preferiblemente 5 veces mayor de no ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C1 en combinación con KIR2DL3, en comparación con un individuo que no lo presente.

En otra realización preferida de este aspecto, la muestra biológica aislada del individuo del paso (a) es una muestra de sangre.

Un octavo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante segundo kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar el genotipo HLA-C y KIR2DL2, KIR2DL3, y/o KIR2DS3. Preferiblemente comprende los elementos necesarios para determinar el genotipo HLA-C y todos los genes KIR.

En una realización preferida de este aspecto el segundo kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, y/o KIR2DS3, y donde:

- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ I D NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), y/o SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3);

- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y

500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4).

- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 4 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 6 (KIR2DL3), y/o SEQ ID NO: 16 (KIR2DS3). En otra realización preferida de este aspecto los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.

Un noveno aspecto de la invención se refiere al uso del primer o segundo kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C.

Cronificación y Aclaramiento del VHC Un décimo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante quinto método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de una madre gestante, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-DQA1, HLA-B y KIR en la muestra aislada del paso (a).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo de los genes KIR2DS1, KIR3DS1 y KIR3DL1.

Un undécimo aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar la cronificación de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante sexto método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el quinto método de la invención, y además y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial: c1) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo HLADQA-01 , en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 1 ,5 veces mayor, y preferiblemente 2 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c2) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR2DS1 , en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 6 veces mayor, y preferiblemente 7 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c3) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR3DS1 , en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 12 veces mayor, y preferiblemente 13 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c4) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR3DL1 en combinación con KIR3DS1 , en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 12 veces mayor, y preferiblemente 13 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c5) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo HLA-Bw6, en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 14 veces mayor, y preferiblemente 15,6 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre. Un duodécimo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante tercer kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-DQA1, HLA-B, KIR2DS1, KIR3DS1 y/o KIR3DL1.

En una realización preferida, el tercer kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-DQA1, HLA-B, KIR2DS1, KIR3DS1 y/o KIR3DL1, y donde:

- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 19 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 21 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).

- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y

500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 19 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 21 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).

- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 18 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 20 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 22 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 24 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 26 (HLA-B).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.

Un decimotercer aspecto de la invención se refiere al uso del tercer kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.

Un decimocuarto aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante séptimo método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de una madre gestante, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-B y KIR en la muestra aislada del paso (a).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo del gen KIR3DL1.

Un decimoquinto aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar el aclaramiento del VHC en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante octavo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el séptimo método de la invención, y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial: c1) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR3DL1 en homocigosis, en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 12 veces mayor, y preferiblemente 12,5 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c2) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo HLA-Bw4 en homocigosis (HLA-Bw4-Bw4), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 16 veces mayor, y preferiblemente 16,7 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo con una madre que no lo presente.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre.

Un decimosexto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante cuarto kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-B y/o KIR3DL1.

En una realización preferida, el cuarto kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-B y/o KIR3DL1, y donde: - los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).

- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).

- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 24 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 26 (HLA-B).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.

Un decimoséptimo aspecto de la invención se refiere al uso del cuarto kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.

Un decimoctavo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante noveno método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-DQ y KIR en la muestra aislada del paso (a).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo de los genes KIR2DS3.

Un decimonoveno aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar el aclaramiento del VHC en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante décimo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el noveno método de la invención, y y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial c1) clasificar al individuo del paso (a) si presenta el genotipo HLA-DQ*03, en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 18 veces mayor, y preferiblemente 20 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo que no lo presente. c2) clasificar al individuo del paso (a), si presenta el genotipo KIR2DS3, en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 1 ,5 veces mayor, y preferiblemente 2 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo que no lo presente.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre. Un vigésimo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante quinto kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-DQ y/o KIR2DS3.

En una realización preferida, el quinto kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-DQ y/o KIR2DS3, y donde: - los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 27 (HLA-DQ) y/o SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3).

- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 27 (HLA-DQ) y/o SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3).

- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 28 (HLA-DQ) y/o SEQ ID NO: 16 (KIR2DS3). En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.

Un vigesimoprimer aspecto de la invención se refiere al uso del quinto kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.

Un vigesimosegundo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante undécimo método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo y otra muestra biológica aislada de su madre gestante, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 y HLA-DPB1 en las muestras aisladas del paso (a).

Un vigesimotercer aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar la cronificación de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante duodécimo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el undécimo método de la invención, y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial c1) clasificar al individuo del paso (a), si presenta al menos un 60% de corcondancia alélica en los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA- DPA 1 y HLA-DPB1, y preferiblemente al menos un 65,60% de concordancia alélica en dichos genes, con la madre gestante del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 2 veces mayor, y preferiblemente 3 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo que no presente concordancia alélica con su madre. c2) clasificar al individuo del paso (a), si presenta al menos un 50% de corcondancia alélica en los genes HLA-A, HLA-B y HLA-C, y preferiblemente al menos un 58,40% de concordancia alélica en dichos genes, con la madre gestante del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 1 ,1 veces mayor, y preferiblemente 1.9 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo que no presente concordancia alélica con su madre. c3) clasificar al individuo del paso (a), si presenta al menos un 70% de corcondancia alélica en los genes HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1, y preferiblemente al menos un 75% de concordancia alélica en dichos genes, con la madre gestante del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 1 , 1 veces mayor, y preferiblemente 1 ,6 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo que no presente concordancia alélica con su madre.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada del individuo del paso (a) es una muestra de sangre y la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre. Un vigesimocuarto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante sexto kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y/o HLA-DPB1.

En una realización preferida, el sexto kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1, HLA-DPA 1 y/o HLA-DPB1, y donde:

- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 31 (HLA-A), SEQ ID NO: 25 (HLA-B), SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 35 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 37 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 39 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 41 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 43 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 45 (HLA- DPA1) y/o SEQ ID NO: 47 (HLA-DPB1).

- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 31 (HLA-A), SEQ ID NO: 25 (HLA-B), SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 35 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 37 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 39 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 41 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 43 (HLA- DPA1), SEQ ID NO: 45 (HLA-DPA1) y/o SEQ ID NO: 47 (HLA-DPB1). - los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 32 (HLA-A), SEQ ID NO: 26 (HLA-B), SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 36 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 18 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 38 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 40 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 42 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 44 (HLA- DPA1), SEQ ID NO: 46 (HLA-DPA1) y/o SEQ ID NO: 48 (HLA-DPB1).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.

Un vigesimoquinto aspecto de la invención se refiere al uso del sexto kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.

Implementación de los métodos de la invención

Una vez obtenida la muestra y determinados los genotipos correspondientes, los métodos o procedimientos para la obtención de datos útiles previamente descritos pueden ejecutarse mediante medios informáticos, por lo que la invención también comprende los siguientes aspectos:

Un vigesimosexto aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que, una vez tomada la muestra y determinados los correspondientes genotipos, un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.

Un vigesimoséptimo aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención. Un vigesimoctavo aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig.1. Curvas de rendimiento diagnóstico (ROC) para las concordancias alélicas (Todos HLA, HLA-clase I y HLA-clase II).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones y consideraciones generales

En esta memoria se entiende por "transmisión vertical" la transmisión de una infección u otra enfermedad, en particular la transmisión del virus de la hepatitis C, de la madre a su hijo o descendiente inmediatamente antes y después del parto durante el período perinatal. Por tanto, la transmisibilidad de un agente patógeno se refiere a su capacidad para transmitirse vertical mente. Se considera que ha ocurrido transmisión vertical cuando se detectan. Equivalentemente por "heredar" se entiende que la madre transmite verticalmente la enfermedad a su descendiente.

Preferiblemente, en esta memoria se entiende por transmisión vertical la transmisión de cualquier agente infeccioso de la madre a su hijo, intraútero, en el parto o en el periodo postnatal bien por lactancia materna o por el contacto intimo de la madre y el hijo. Los agentes capaces de transmitirse intraútero tienen capacidad de producir corioamnionitis y alteración de la barrera placentaria relacionándose con abortos o malformaciones. Para los virus de la hepatitis B y C el momento de máximo riesgo es el parto no habiéndose comunicado transmisión por lactancia materna. El diagnóstico de infección en los niños se efectúa por la presencia de ARN-VHC positivo en al menos dos muestras de sangre consecutivas o por la presencia de anti-VHC positivo después de los 18 meses de vida. La cronificación de la infección por VHC es la presencia de ARN-VHC de forma permanente. En este estudio a los niños se les determinó el ARN-VHC al nacer, a los 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18 y 24 meses y anualmente hasta los 6 años.

En esta memoria se entiende como "virus de la hepatitis C" a los virus clasificados en el grupo IV (virus de ARN monocatenario positivo), de la familia Flaviviridae y del género Hepacivirus.

El gen HLA-C pertenece al complejo mayor de histocompatibilidad de clase I de cadena pesada. Esta molécula es un heterodímero que consiste en una cadena pesada y una cadena ligera (beta-2-microglobulina). La cadena pesada está anclada en la membrana. Las moléculas de clase I juegan un papel central en el sistema inmunológico mediante la presentación de péptidos derivados de lumen del retículo endoplásmico. Se expresan en casi todas las células. La cadena pesada es de aproximadamente 45 kDa y su gen contiene 8 exones. El exón uno codifica el dominio del péptido líder, los exones 2 y 3 codifican los dominios alfal y alfa2, ambos se unen al péptido, el exón 4 codifica el dominio alfa 3, el exón 5 codifica la región transmembrana, y los exones 6 y 7 codifican la cola citoplásmica. Los polimorfismos en el exón 2 y el exón 3 son responsables de la especificidad de unión de péptidos de cada clase de una molécula. El estudio de estos polimorfismos se realiza de forma rutinaria para la médula ósea y el trasplante de riñon. Se han descrito más de un centenar de alelos HLA-C. Los genes KIR pertenecen a los receptores de tipo inmunoglobulina de las células asesinas (KIR), son glicoproteínas transmembranales expresadas por células y subconjuntos de células T asesinas naturales. Los genes KIR son polimórficos y altamente homólogos y se encuentran en un grupo en el cromosoma 19q13.4 en el complejo receptor de leucocitos 1 Mb (LRC). El contenido de genes de la agrupación de genes KIR varía entre los haplotipos, aunque varios genes "marco" se encuentran en todos los haplotipos (KIR3DL3, KIR3DP1 , KIR3DL4, KIR3DL2). Las proteínas KIR se clasifican por el número de dominios de inmunoglobulina extracelulares (2D o 3D) y por si tienen un dominio citoplásmico largo (L) o corto (S). Las proteínas KIR con el dominio citoplásmico largo transducen señales inhibidoras tras la unión a través de un motivo inhibidor basado en un ligando tirosina inmune (ITIM), mientras que las proteínas KIR con el dominio citoplásmico corto carecen del motivo ITIM y en lugar de asociarse con la proteína tirosina quinasa TYRO proteína de unión para transducir señales de activación. Los ligandos para varias proteínas KIR son subconjuntos de moléculas HLA de clase I; por lo tanto, se cree que las proteínas KIR desempeñan un papel importante en la regulación de la respuesta inmune.

En esta memoria se entiende por "genotipo" a la información genética que posee un organismo en particular, en forma de ADN. Normalmente el genoma de una especie incluye numerosas variaciones o polimorfismos en muchos de sus genes. El genotipado se usa para determinar qué variaciones específicas existen en el individuo. Específicamente, el genotipo puede definirse como el conjunto de genes de un organismo, y aún más concretamente el "genotipo de un gen" como el conjunto de información genética para ese gen concreto.

Con carácter general, cada kit o dispositivo descrito en la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.

Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.

Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes empleados en los métodos descritos, y/o capaces de hibridar con la secuencias de dichos genes, estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida).

Una micromatriz de ARN es una matriz sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda de una película fina de silicio) que evalúa grandes cantidades de diferentes ARN que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre manchas sobre un sustrato sólido. Cada mancha contiene una secuencia específica de ácido nucleico, normalmente una secuencia de ADN, como sondas (o indicadores). Aunque el número de manchas no está limitado de manera alguna, existe una realización preferida en la que la micromatriz se personaliza para los procedimientos de la invención. Dicha matriz personalizada comprenderá preferentemente cincuenta manchas o menos, tal como treinta manchas o menos, incluyendo veinte manchas o menos.

A modo de ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos pueden ser construidas en la superficie un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.

Así, las sondas de oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleótidos.

La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse a, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: RNA mensajero, RNA total, un fragmento de PCR, etc.

Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada es sangre periférica. El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" en esta memoria, es sinónimo de "paciente", y no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.

El término "fármaco", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es producida por la infección del virus de la hepatitis C.

Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender las cinco bases que aparecen biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir para distintos propósitos, por ejemplo, para estabilizar o desestabilizar la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más restos de base modificados, no estándar, derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a, N ⁶ -metil-adenina, N ⁶ - terc-butil-bencil-adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5- clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,beta-D- galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2- dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6- metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D- manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxi uracilo, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wybutoxosina, pesudouracilo, queosina, 2- tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo (es decir, timina), éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina, y 5-propinil pirimidina. Otros ejemplos de restos de bases modificados, no estándar, o derivatizados pueden encontrarse en las Patentes de EEUU Nos. 6.001.61 1 ; 5.955.589; 5.844.106; 5.789.562; 5.750.343; 5.728.525; y 5.679.785. Además, una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender uno o más restos de azúcares modificados incluyendo, pero sin limitarse a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxirribonucleótidos (ADN ó DNA). Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.

En la presente invención se entiende por variante o fragmento biológicamente activo, aquellas variantes o fragmentos de los péptidos indicados que tienen un efecto fisiológico, metabólico o inmunológico igual, o presentan la misma utilidad que los descritos. Esto es, son funcionalmente equivalentes. Dichos efectos se pueden determinar mediante métodos convencionales.

El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul et al., 1999. J. Mol. Biol. 215: 403-410. En realizaciones preferidas de la invención, la determinación de genotipos se realiza mediante PCR. En otra realización preferida, la detección además comprende el uso de la tecnología Luminex.

La tecnología xMAP de Luminex está basada en el uso de microesferas de poliestireno (perlas) de 5,6 micrones, cada una internamente teñida/coloreada con una combinación única de tinte rojo e infrarrojo. La combinación de diferentes intensidades de los dos tintes permite la identificación de cada perla por su característica única cuando estimulados por un rayo láser. Esto permite analizar hasta 100 parámetros simultáneamente en un solo tubo.

La química de la superficie de las esferas (o perlas) les permite recubrirse químicamente con un número de diferentes objetos, incluyendo secuencias de ADN de HLA y antígenos HLA. Las esferas por lo tanto pueden utilizarse para determinar en la muestras la presencia o ausencia de analitos específicos. La plataforma de Luminex utiliza los principios de citometría de flujo para alinear las esferas y pasarlas por un par de láseres. Se utiliza un láser rojo para estimular e identificar así esferas específicas y se utiliza un láser verde para estimular y así detectar cualquier tinte asociado a las esferas durante el ensayo. Por cuanto la identificación de la perlas y la fluorescencia asociada capturada por las esferas se realiza en cada perla individual, un sistema multiplexado puede desarrollarse con, normalmente, hasta 100 esferas. Las sondas utilizadas para recubrir las 100 perlas son cuidadosamente seleccionadas de modo que los analitos individuales de interés pueden identificarse mediante los patrones de reacción única de las perlas. El tipaje de HLA utilizando Luminex requiere un paso previo que implica una amplificación mediante PCR (PCR - polymerase chain reaction) de regiones específicas dentro de la clase de MHC I o II con grupos de cebadores (primers) específicos, con oligonucleótidos o sondas específicas de secuencias (PCR-SSO) seguidos por un proceso de sondeo del amplicón con esferas de Luminex, cada una cubierta con probes de oligonucleótidos específicos de secuencia para identificar la presencia o ausencia de alelos específicos. La asignación del tipo HLA se basa entonces en la reacción patrón observado, y se compara la secuencia con diferentes patrones conocidos.

Los cebadores/primers utilizados para la amplificación son biotinilados. La amplificación puede ser simétrica, que por lo tanto requiere un paso de desnaturalización para crear dos hebras de cadena simple/single strands o puede ser asimétrica para generar un exceso de una sola hebra. El único producto trenzado es entonces hibridado mediante un termociclador a 60 °C y posteriormente con un múltiplex de hasta 100 perlas, pueden ser identificados por su tinción interna de forma selectiva, ya que están recubiertos con secuencias de oligonucleótidos específicos. El ADN amplificado híbrida el ADN complementario sondeado en las esferas. A continuación la metodología requiere varias etapas de lavado. El amplicon enlazado es detectado por el marcado con un conjugado estreptavidina-ficoeritrina (SAPE), con estreptavidina vinculante a la biotina utilizado para etiquetar los iniciadores y ficoeritrina sirviendo como el tinte asociado para la presencia de amplicon enlazado. Otra vez un paso de lavado puede ser necesario según el kit en uso. Finalmente las muestras se pasan a una placa para su lectura en el Luminex mediante el uso del software específico, y son determinadas posteriormente con el programa adecuado que será el que nos genera el tipaje completo.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Método de la invención En este contexto, el primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que una madre portadora del virus de la hepatitis C (ARN-VHC (+)) transmita verticalmente el virus a su descendencia, o de que un individuo cuya madre es portadora del virus de la hepatitis C, herede y/o cronifique y/o aclare, en caso de que sea contagiado, el virus de la hepatitis C, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de la madre, y b) determinar el genotipo de los genes HLA y KIR en la muestra aislada del paso (a).

Transmisión Vertical

En un primer conjunto de realizaciones particulares, los autores de la presente invención han estudiado la importancia de los marcadores HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4 y KIR2DS3 en la probabilidad de que una madre ARN-VHC (+) transmita verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia y/o, en la probabilidad de contagio mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN-VHC (+). Así, un segundo aspecto de la invención se refiere a un método, primer método de la invención, de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que una madre ARN-VHC (+) transmita verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de la madre gestante, y b) detectar el genotipo de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4) en la muestra aislada del paso (a).

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método, de ahora en adelante segundo método de la invención, de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C, que comprende los pasos (a) y (b) según el primer método de la invención, y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial: c1) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad mayor, al menos 5 veces mayor, preferiblemente al menos 6 veces mayor, y aún más preferiblemente 6,2 veces mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2, en comparación con una madre que no lo presente. c2) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad mayor, al menos 2 veces mayor, preferiblemente al menos 3 veces mayor, y aún más preferiblemente 3,9 veces mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2), en comparación con una madre que no lo presente. c3) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad mayor, al menos 9 veces mayor, preferiblemente al menos 10 veces mayor, y aún más preferiblemente 10,7 veces mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en combinación con KIR2DL2 y KIR2DL3, en comparación con una madre que no lo presente. c4) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad mayor, al menos 4 veces mayor, preferiblemente al menos 5 veces mayor, y aún más preferiblemente 6 veces mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C2 en combinación con KIR2DL1 o HLA-C2 en combinación con KIR2DS4, en comparación con una madre que no lo presente. c5) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad mayor, al menos 3 veces mayor, preferiblemente al menos 4 veces mayor, y aún más preferiblemente 5 veces mayor de no transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C1 o HLA-C1 en homocigosis (HLA- C1 C1), en comparación con una madre que no lo presente. c6) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad mayor, al menos 2 veces mayor, y aún más preferiblemente 2,5 veces mayor de no transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C1 en combinación con KIR2DL3, en comparación con una madre que no lo presente. c7) clasificar a la madre del paso (a), en el grupo de madres con una probabilidad mayor, al menos 2 veces mayor, preferiblemente al menos 3 veces mayor, y aún más preferiblemente 3,3 veces mayor de no transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia si presenta el genotipo HLA-C1 en combinación con KIR2DS4, en comparación con una madre que no lo presente.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre.

Los pasos (b) y/o (c), del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la detección del paso (b) se realiza mediante PCR. En otra realización preferida, la detección además comprende el uso de la tecnología Luminex.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante primer kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar el genotipo de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4), tal y como se han definido el primer método de la invención.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el primer kit o dispositivo de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleotídicas, que comprenden sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 1 1 y/o SEQ ID NO: 13, así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4), para posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4), son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente ³² P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica. Así pues, el primer kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1 y/o KIR2DS4, y donde:

- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1 y/o SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4);

- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4).

- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 4 (KIR2DL2), SEQ ID

NO: 6 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 8 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 y/o SEQ I D NO: 14 (KIR2DS4).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14, o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el flurocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones. Otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleotidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias de los genes HLA-C y/o KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4). Más preferiblemente las secuencias de los HLA-C y/o KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4) son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1. Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso del primer kit o dispositivo de la invención, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la transmisión vertical del virus de la hepatitis C.

Un sexto aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN-VHC (+), de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada del individuo, y b) detectar el genotipo de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3) en la muestra aislada del paso (a). Un séptimo aspecto de la invención se refiere a un método, cuarto método de la invención, de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN-VHC (+), que comprende los pasos (a) y (b) del tercer método de la invención, y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial: c1) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 3 veces mayor, preferiblemente 4 veces mayor, y aún más preferiblemente 4,2 veces mayor de ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en combinación con la homocigosis de KIR2DL2 (KIR2DL2/2DL2), en comparación con individuo que no lo presente. c2) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 13 veces mayor, preferiblemente 13,5 veces mayor, y aún más preferiblemente 14 veces mayor de ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C2 en homocigosis (HLA-C2C2) en combinación con la homocigosis de KIR2DL3 (KIR2DL3/2DL3), en comparación con un individuo que no lo presente. c3) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 13 veces mayor, preferiblemente 14 veces mayor, y aún más preferiblemente 14,3 veces mayor de no ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo KIR2DS3, en comparación con un individuo que no lo presente. c4) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 2 veces mayor, preferiblemente 3 veces mayor, y aún más preferiblemente 3,3 veces mayor de no ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C1 , en comparación con un individuo que no lo presente. c5) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 4 veces mayor, preferiblemente 4,5 veces mayor, y aún más preferiblemente 5 veces mayor de no ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C si presenta el genotipo HLA-C1 en combinación con KIR2DL3, en comparación con un individuo que no lo presente.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada del individuo del paso (a) es una muestra de sangre.

Los pasos (b) y/o del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c).

Un octavo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante segundo kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar el genotipo de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3), tal y como se han definido el tercer método de la invención.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el segundo kit o dispositivo de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleotídicas, que comprenden sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 15, así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el segundo kit o dispositivo de la invención puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3), para posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3), son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente ³² P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el segundo kit o dispositivo de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 16 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el flurocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida de este aspecto el segundo kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, y/o KIR2DS3, y donde:

- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ I D NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KI R2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), y/o SEQ I D NO: 15 (KIR2DS3); - las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 3 (KIR2DL2), SEQ ID NO: 5 (KIR2DL3), SEQ ID NO: 7 (KIR2DL1), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 13 (KIR2DS4).

- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 4 (KIR2DL2), SEQ ID

NO: 6 (KIR2DL3), y/o SEQ ID NO: 16 (KIR2DS3).

Otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3). Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS3), son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1.

Un noveno aspecto de la invención se refiere al uso del segundo kit o dispositivo de la invención, para la obtención de datos útiles predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un niño con una madre ARN-VHC (+).

Cronificación y/o aclaramiento del VHC

En otro conjunto de realizaciones particulares, los autores de la presente invención han estudiado la importancia de los marcadores HLA-DQA01, KIR2DS1, KIR3DS1, KIR3DL1, HLA- B, HLA-DQB3, KIR2DS3, HLA-A, HLA-C, HLA-DRB 1, HLA-DQB1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1 en la probabilidad de que un individuo cronifique la hepatitis C y en la probabilidad de que aclare el virus de la hepatitis C.

Así, un décimo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante quinto método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de una madre gestante, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-DQA1, HLA-B y KIR en la muestra aislada del paso (a).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo de los genes KIR2DS1, KIR3DS1 y KIR3DL1. Un undécimo aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar la cronificacion de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante sexto método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el quinto método de la invención, y además comprende uno o más de los siguientes pasos, preferiblemente todos ellos y más preferiblemente todos ellos de forma secuencial: c1) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo HLADQA-01 , en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 1 ,5 veces mayor, y preferiblemente 2 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c2) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR2DS1 , en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 6 veces mayor, y preferiblemente 7 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c3) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR3DS1 , en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 12 veces mayor, y preferiblemente 13 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c4) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR3DL1 en combinación con KIR3DS1 , en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 12 veces mayor, y preferiblemente 13 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente. c5) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo HLA-Bw6, en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 14 veces mayor, y preferiblemente 15,6 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo con una madre que no lo presente.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre. Los pasos (b) y/o (c), del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la detección del paso (b) se realiza mediante PCR. En otra realización preferida, la detección además comprende el uso de la tecnología Luminex.

Un duodécimo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante tercer kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-DQA1, HLA-B, KIR2DS1, KIR3DS1 y/o KIR3DL1. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el tercer kit o dispositivo de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleotídicas, que comprenden sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ I D NO: 21 , SEQ ID NO: 23 y/o SEQ ID NO: 25, así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes HLA-DQA1, HLA-B y KIR (KIR2DS1, KIR3DS1 y KIR3DL1), para posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-DQA1, HLA-B y KIR (KIR2DS1, KIR3DS1 y KIR3DL1), son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente ³² P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica.

En una realización preferida, el tercer kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-DQA1, HLA-B, KIR2DS1, KIR3DS1 y/o KIR3DL1, y donde:

- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 19 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 21 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).

- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 19 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 21 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B). - los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 18 (HLA-DQA01), SEQ ID NO: 20 (KIR2DS1), SEQ ID NO: 22 (KIR3DS1), SEQ ID NO: 24 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 26 (HLA-B).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26, o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el flurocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones. El kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.

Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.

Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias de los genes HLA-DQA1, HLA-B y KIR (KIR2DS1, KIR3DS1 y KIR3DL1). Más preferiblemente las secuencias de los HLA-DQA1, HLA-B y KIR (KIR2DS1, KIR3DS1 y KIR3DL1) son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.

Un decimotercer aspecto de la invención se refiere al uso del tercer kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.

En esta memoria se entiende por "cronificación" de la hepatitis C en niños a la presencia de ARN-VHC positivo en al menos dos muestras de sangre consecutivas o por la presencia de anti-VHC positivo después de los 18 meses de vida. La cronificación de la infección por VHC es la presencia de ARN-VHC de forma permanente. Preferiblemente, el estudio en los niños consiste en determinar el ARN-VHC al nacer, a los 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18 y 24 meses y anualmente hasta los 6 años.

Se acepta que los hijos de madres positivas pueden aclarar el virus en los primeros meses del nacimiento (Ceci O, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2001 Nov; 33(5): 570-5), hasta en el 75% de los casos. Los niños que se infectan y quedan crónicamente infectados, suelen estar asintomáticos, pero presentan elevación de transaminasas entre los seis y doce meses de vida (Bortolotti F, J. Pediatr. 1997; 130: 990-993). El curso clínico de la infección es aparentemente leve y no existe consenso en cuanto al momento de tratarlos. La terapéutica en niños con infección crónica no está bien definida, lo que indica que es necesario investigar sobre la epidemiología, curso clínico y tratamiento del VHC en los niños (Joñas MM. Hepatology 2002 Nov;36 (5 Suppl 1):S173-8. Estudios recientes demuestran que en las biopsias hepáticas de niños con infección crónica por VHC existe una actividad inflamatoria moderada, sin embargo, hay una tendencia importante a la fibrosis y la evolución de la misma puede ser grave aunque la duración de la infección sea corta (Badizadegan K, Hepatology 1998 Nov 28(5): 1416-23. En un metanalisis Jacobson KR, (J Pediatr Gastroenterol Nutr 2002 Jan;34(1):52-8), que incluye a 366 niños tratados con INF y 105 no tratados, la respuesta virológica fue del 36% para el grupo tratado y del 5% para el grupo control. La respuesta fue más favorable en el genotipo no-1 (70%) que el genotipo 1 (27%). Estos datos sugieren que el INF-alfa es una propuesta terapéutica con una seguridad y eficacia razonable para el tratamiento de la hepatitis C crónica en niños. También se ha ensayado el tratamiento combinado con ribavirina Wirth S, Hepatology 2002 Nov;36(5): 1280-4), mejorando los resultados anteriores, ya que la tasa de respuesta virologica del 61 %, aunque la presencia de efectos adversos graves es del 21 %. Se desconoce la efectividad del IFN-Peg más ribavirina.

En esta memoria se entiende como "virus de la hepatitis C" a los virus clasificados en el grupo IV (virus de ARN monocatenario positivo), de la familia Flaviviridae y del género Hepacivirus.

Un decimocuarto aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante séptimo método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de una madre gestante, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-B y KIR en la muestra aislada del paso (a).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo del gen KIR3DL1.

Un decimoquinto aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar el aclaramiento del VHC en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante octavo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el séptimo método de la invención, y además comprende: c1) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo KIR3DL1 en homocigosis, en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 12 veces mayor, y preferiblemente 12,5 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo con una madre que no lo presente.

En otra realización preferida, el octavo método de la invención comprende: c2) clasificar al individuo con madre gestante del paso (a), si dicha madre presenta el genotipo HLA-Bw4 en homocigosis (HLA-Bw4-Bw4), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 16 veces mayor, y preferiblemente 16,7 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo con una madre que no lo presente.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre. Los pasos (b) y/o del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c). Un decimosexto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante cuarto kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-B y/o KIR3DL1.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el cuarto kit o dispositivo de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleotídicas, que comprenden sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25, así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el cuarto kit o dispositivo de la invención puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes HLA-B y KIR (KIR3DL1), para posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-B y KIR (KIR3DL1), son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente ³² P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el cuarto kit o dispositivo de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el flurocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización preferida, el cuarto kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-B y/o KIR3DL1, y donde:

- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).

- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 23 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 25 (HLA-B).

- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 24 (KIR3DL1) y/o SEQ ID NO: 26 (HLA-B).

El cuarto kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.

Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.

Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias de los genes HLA-B y KIR (KIR3DL1). Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-B y KIR (KIR3DL1) son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.

Un decimoséptimo aspecto de la invención se refiere al uso del cuarto kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.

En esta memoria se entiende por "aclaramiento" del virus de la hepatitis C la presencia de ARN-VHC positivo en al menos dos muestras o alguna más, de sangre consecutivas, y en todos los demás controles, hasta el alta hospitalaria, presentarán ARN-VHC negativo. Preferiblemente, el estudio en los niños consiste en determinar el ARN-VHC al nacer, a los 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18 y 24 meses (o hasta alta hospitalaria).

Un decimoctavo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante noveno método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-DQ y KIR en la muestra aislada del paso (a). En una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se determina el genotipo de los genes KIR2DS3.

Un decimonoveno aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar el aclaramiento del VHC en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante décimo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el noveno método de la invención, y además comprende: c1) clasificar al individuo del paso (a) si presenta el genotipo HLA-DQ*03, en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 18 veces mayor, y preferiblemente 20 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo que no lo presente. En otra realización preferida, el décimo método de la invención comprende: c2) clasificar al individuo del paso (a), si presenta el genotipo KIR2DS3, en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 1 ,5 veces mayor, y preferiblemente 2 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C, comparación con un individuo que no lo presente. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre.

Los pasos (b) y/o del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c). Un vigésimo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante quinto kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-DQ y/o KIR2DS3. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el quinto kit o dispositivo de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleotídicas, que comprenden sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 15, así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el quinto kit o dispositivo de la invención puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes HLA-DQ y KIR (KIR2DS3), para posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-DQ y KIR (KIR2DS3), son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente ³² P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el quinto kit o dispositivo de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 16 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el flurocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización preferida, el quinto kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-DQ y/o KIR2DS3, y donde:

- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 27 (HLA-DQ) y/o SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3). - las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 27 (HLA-DQ) y/o SEQ ID NO: 15 (KIR2DS3).

- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 28 (HLA-DQ) y/o SEQ ID NO: 16 (KIR2DS3).

El quinto kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.

Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención. Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias de los genes HLA-DQ y KIR (KIR2DS3). Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-DQ y KIR (KIR2DS3) son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.

Un vigesimoprimer aspecto de la invención se refiere al uso del quinto kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.

Un vigesimosegundo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante undécimo método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo y otra muestra biológica aislada de su madre gestante, y b) determinar el genotipo de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 y HLA-DPB1 en las muestras aisladas del paso (a).

Un vigesimotercer aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar la cronificación de la hepatitis C en un individuo con una madre ARN-VHC (+) en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, de ahora en adelante duodécimo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el undécimo método de la invención, y además comprende: c1) clasificar al individuo del paso (a), si presenta concordancia alélica en los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1, al menos un 60% de corcondancia alélica, y preferiblemente al menos un 65,60% de concordancia alélica en dichos genes, con la madre gestante del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 2 veces mayor, y preferiblemente 3 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo que no presente concordancia alélica con su madre. En otra realización preferida, el duodécimo método de la invención comprende: c2) clasificar al individuo del paso (a), si presenta concordancia alélica en los genes en los genes HLA-A, HLA-B y HLA-C, al menos un 50% de corcondancia alélica, y preferiblemente al menos un 58,40% de concordancia alélica en dichos genes, con la madre gestante del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 1 , 1 veces mayor, y preferiblemente 1 ,9 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo no que presente concordancia alélica con su madre.

En otra realización preferida, el duodécimo método de la invención comprende: c3) clasificar al individuo del paso (a), si presenta concordancia alélica en los genes HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1, al menos un 70% de corcondancia alélica, y preferiblemente al menos un 75% de concordancia alélica en dichos genes, con la madre gestante del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad mayor, al menos 1 ,1 veces mayor, y preferiblemente 1 ,6 veces mayor de cronificar la hepatitis C, en comparación con un individuo que no presente concordancia alélica con su madre. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada del individuo del paso (a) es una muestra de sangre y la muestra biológica aislada de la madre gestante del paso (a) es una muestra de sangre. Los pasos (b) y/o del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c).

Un vigesimocuarto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante sexto kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los genotipos HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA1 y/o HLA-DPB1.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el sexto kit o dispositivo de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleotídicas, que comprenden sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 31 , SEQ I D NO: 25, SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 17, SEQ I D NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ I D NO: 43, SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 47, así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el quinto kit o dispositivo de la invención puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1, para posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1, son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente ³² P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el sexto kit o dispositivo de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 48 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el flurocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización preferida, el sexto kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar los genotipos HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 y/o HLA-DPB1, y donde:

- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 31 (HLA-A), SEQ ID NO: 25 (HLA-B), SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 35 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 37 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 39 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 41 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 43 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 45 (HLA- DPA1) y/o SEQ ID NO: 47 (HLA-DPB1).

- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 31 (HLA-A), SEQ ID NO: 25 (HLA-B), SEQ ID NO: 1 (HLA-C), SEQ ID NO: 35 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 17 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 37 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 39 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 41 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 43 (HLA- DPA1), SEQ ID NO: 45 (HLA-DPA1) y/o SEQ ID NO: 47 (HLA-DPB1). - los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 32 (HLA-A), SEQ ID NO: 26 (HLA-B), SEQ ID NO: 2 (HLA-C), SEQ ID NO: 36 (HLA-DRB1), SEQ ID NO: 18 (HLA-DQA1), SEQ ID NO: 38 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 40 (HLA-DQB1), SEQ ID NO: 42 (HLA-DPA1), SEQ ID NO: 44 (HLA- DPA1), SEQ ID NO: 46 (HLA-DPA1) y/o SEQ ID NO: 48 (HLA-DPB1). El sexto kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.

Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención. Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias de los genes HLA-A, HLA- B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA- DPA1 y/o HLA-DPB1 son las secuencias nucleotídicas indicadas para cada gen en la tabla 1.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.

Un vigesimoquinto aspecto de la invención se refiere al uso del sexto kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.

Los genes HLA-A, HLA-B y HLA-C pertenecen al complejo mayor de histocompatibilidad de clase I de cadena pesada. Estas moléculas son heterodímeros que consiste en una cadena pesada y una cadena ligera (beta-2-microglobulina). La cadena pesada está anclada en la membrana. Las moléculas de clase I juegan un papel central en el sistema inmunológico mediante la presentación de péptidos derivados de lumen del retículo endoplásmico. Se expresan en casi todas las células. La cadena pesada es de aproximadamente 45 kDa y su gen contiene 8 exones. El exon uno codifica el dominio del péptido líder, los exones 2 y 3 codifican los dominios alfal y alfa2, ambos se unen al péptido, el exón 4 codifica el dominio alfa 3, el exón 5 codifica la región transmembrana, y los exones 6 y 7 codifican la cola citoplásmica. Los polimorfismos en el exón 2 y el exón 3 son responsables de la especificidad de unión de péptidos de cada clase de una molécula. El estudio de los polimorfismos de estos genes se realiza de forma rutinaria para la médula ósea y el trasplante de riñon. Se han descrito más de un centenar de alelos HLA-A, HLA-B y HLA-C.

Los genes HLA-DQA1 , HLA-DQB1 , pertenecen a los HLA de clase II de cadena alfa y beta. La molécula de clase II es un heterodímero que consiste en un alfa (DQA) y una cadena beta (DQB), ambas ancladas en la membrana. Desempeña un papel central en el sistema inmunológico mediante la presentación de péptidos derivados de proteínas extracelulares. Las moléculas de clase II se expresan en células presentadoras de antígeno (APC: B linfocitos, células dendríticas, macrófagos). La cadena alfa es de aproximadamente 33-35 kDa. Está codificado por los exones 5; el exón 1 codifica el péptido líder, los exones 2 y 3 codifican los dos dominios extracelulares, y el exón 4 codifica el dominio transmembrana y la cola citoplásmica. Dentro de la molécula de DQ, tanto la cadena alfa y la cadena beta contienen los polimorfismos que especifican las especificidades de unión de péptidos, lo que resulta en hasta cuatro moléculas diferentes. La determinación de estos polimorfismos se realiza de forma rutinaria para el trasplante de médula ósea. HLA-DRB1 pertenece a los HLA de clase II de la cadena beta. La molécula de clase II es un heterodímero que consiste en un alfa (DRA) y una cadena beta (DRB), ambas anclada sen la membrana. Desempeña un papel central en el sistema inmunológico mediante la presentación de péptidos derivados de proteínas extracelulares. Las moléculas de clase II se expresan en células presentadoras de antígenos (APC: los linfocitos B, células dendríticas, macrófagos). La cadena beta es de aproximadamente 26-28 kDa. Se está codificada por 6 exones. Exon uno codifica el péptido líder; los exones 2 y 3 codifican los dos dominios extracelulares; exón 4 codifica el dominio transmembrana; y el exón 5 codifica la cola citoplásmica. Dentro de la molécula DR la cadena beta contiene todos los polimorfismos que especifican las especificidades de unión de péptidos. Cientos de alelos DRB1 se han descrito y tipificación de estos polimorfismos se realiza de forma rutinaria para la médula ósea y el trasplante de riñon. DRB1 se expresa a un nivel cinco veces más alto que sus paralogs DRB3, DRB4 y DRB5. DRB1 está presente en todos los individuos. Las variantes alélicas de DRB1 están vinculados ya sea con ninguno o uno de los genes DRB3, DRB4 y DRB5. Hay 4 pseudogenes relacionadas: DRB2, DRB6, DRB7, DRB8 y DRB9. HLA-DPA1 y HLA-DPB1 pertenecen a los HLA de clase II cadena alfa y beta. Esta molécula de clase II es un heterodímero que consiste en un alfa (DPA) y una cadena beta (DPB), ambas ancladas en la membrana. Desempeña un papel central en el sistema inmunológico mediante la presentación de péptidos derivados de proteínas extracelulares. Las moléculas de clase II se expresan en células presentadoras de antígenos (APC: los linfocitos B, células dendríticas, macrófagos). La cadena alfa es de aproximadamente 33-35 kDa y su gen contiene 5 exones. Exon uno codifica el péptido líder, los exones 2 y 3 codifican los dos dominios extracelulares, el exón 4 codifica el dominio transmembrana y la cola citoplásmica. Dentro de la molécula DP tanto la cadena alfa y la cadena beta contienen los polimorfismos que especifican las especificidades de unión de péptidos, lo que resulta en un máximo de 4 moléculas diferentes Los genes KIR pertenecen a los receptores de tipo inmunoglobulina de las células asesinas (KIR), son glicoproteínas transmembranales expresadas por células y subconjuntos de células T asesinas naturales. Los genes KIR son polimórficos y altamente homólogos y se encuentran en un grupo en el cromosoma 19q13.4 en el complejo receptor de leucocitos 1 Mb (LRC). El contenido de genes de la agrupación de genes KIR varía entre los haplotipos, aunque varios genes "marco" se encuentran en todos los haplotipos (KIR3DL3, KIR3DP1 , KIR3DL4, KIR3DL2). Las proteínas KIR se clasifican por el número de dominios de inmunoglobulina extracelulares (2D o 3D) y por si tienen un dominio citoplásmico largo (L) o corto (S). Las proteínas KI R con el dominio citoplásmico largo transducen señales inhibidoras tras la unión a través de un motivo inhibidor basado en un ligando tirosina inmune (ITIM), mientras que las proteínas KI R con el dominio citoplásmico corto carecen del motivo ITIM y en lugar de asociarse con la proteína tirosina quinasa TYRO proteína de unión para transducir señales de activación. Los ligandos para varias proteínas KIR son subconjuntos de moléculas HLA de clase I ; por lo tanto, se cree que las proteínas KI R desempeñan un papel importante en la regulación de la respuesta inmune.

Tabla 1. Secuencias de la invención

dominios y de cola

citoplasmática larga, 1

HLA-B Complejo mayor de 3106 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 histocompatibilidad,

Clase I, B

HLA-DQB3 Complejo mayor de 3121 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28 histocompatibilidad,

Clase II, DQ beta 3

HLA-A Complejo mayor de 3105 SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 histocompatibilidad,

Clase I, A

HLA-DRB1 Complejo mayor de 3123 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36 histocompatibilidad,

Clase II, DR beta 1

HLA-DQB1 Complejo mayor de 31 19 SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, histocompatibilidad, SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40 Clase II, DQ beta 1

HLA-DPA1 Complejo mayor de 31 13 SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, histocompatibilidad, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, Clase II, DP alfa 1 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46

HLA-DPB1 Complejo mayor de 31 15 SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 48 histocompatibilidad,

Clase II, DP beta 1

SEQ ID NO: 1 :

TCCGCAGTCCCGGTTCTAAAGTCCCCAGTCACCCACCCGGACTCACATTCTCCCCAGA GGCCGAGATGCGGGTCATGGCGCCCCGAGCCCTCCTCCTGCTGCTCTCGGGAGGCCT GGCCCTGACCGAGACCTGGGCCTGCTCCCACTCCATGAGGTATTTCGACACCGCCGTGTC CCGGCCCGGCCGCGGAGAGCCCCGCTTCATCTCAGTGGGCTACGTGGACGACACG CAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGAGGGGAGCCGCGGGCGCC GTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGAAGTACAAGCG CCAGGCACAGGCTGACCGAGTGAGCCTGCGGAACCTGCGCGGCTACTACAACCAGAG CGAGGACGGGTCTCACACCCTCCAGAGGATGTCTGGCTGCGACCTGGGGCCCGACGGGC GCCTCCTCCGCGGGTATGACCAGTCCGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTG AACGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGCCGCGGACACCGCGGCTCAGATCACCCAGCGC AAGTTGGAGGCGGCCCGTGCGGCGGAGCAGCTGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGC GTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCGCAGAA CCCCCAAAGACACACGTGACCCACCACCCCCTCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGC TGGGCCCTGGGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCGGGATGGGG AGGACCAGACCCAGGACACCGAGCTTGTGGAGACCAGGCCAGCAGGAGATGGAACCT TCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGACAAGAGCAGAGATACACGTGCCA TATGCAGCACGAGGGGCTGCAAGAGCCCCTCACCCTGAGCTGGGAGCCATCTTCCCAG CCCACCATCCCCATCATGGGCATCGTTGCTGGCCTGGCTGTCCTGGTTGTCCTAGCTGTC CTTGGAGCTGTGGTCACCGCTATGATGTGTAGGAGGAAGAGCTCAGGTGGAAAAGGA GGGAGCTGCTCTCAGGCTGCGTGCAGCAACAGTGCCCAGGGCTCTGATGAGTCTCTCA TCACTTGTAAAGCCTGAGACAGCTGCCTGTGTGGGACTGAGATGCAGGATTTCTTCACA CCTCTCCTTTGTGACTTCAAGAGCCTCTGGCATCTCTTTCTGCAAAGGCACCTGAATGT GTCTGCGTTCCTGTTAGCATAATGTGAGGAGGTGGAGAGACAGCCCACCCCCGTGTCCAC CGTGACCCCTGTCCCCACACTGACCTGTGTTCCCTCCCCGATCATCTTTCCTGTTCC AGAGAGGTGGGGCTGGATGTCTCCATCTCTGTCTCAAATTCATGGTGCACTGAGCTGCA ACTTCTTACTTCCCTAATGAAGTTAAGAACCTGAATATAAATTTGTGTTCTCAAATATTT G CTATGAAGCGTTGATGGATTAATTAAATAAGTCAATTCCTAGAAGTTGAGAGAGCAAATA AAGACCTGAGAACCTTCCAGAA

SEQ ID NO: 2:

MRVMAPRALLLLLSGGLALTETWACSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQF VRF DSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQADRVSLRNLRGYYNQSEDGSHT LQRMSGCDLGPDGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAE QLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEIT L TWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAWVPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLS WEPSSQPTIPIMGIVAGLAVLWLAVLGAVVTAMMCRRKSSGGKGGSCSQAACSNSAQGS DESLITCKA

SEQ ID NO: 3:

CGCGGCCGCCTGTCTGCACAGACAGCACCATGTCGCTCATGGTCGTCAGCATGGCGTG TGTTGGGTTCTTCTTGCTGCAGGGGGCCTGGCCACATGAGGGAGTCCACAGAAAACCT TCCCTCCTGGCCCACCCAGGTCGCCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCATCCTGCAAT GTTGGTCAGATGTCAGGTTTGAGCACTTCCTTCTGCACAGAGAAGGGAAGTTTAAGGAC ACTTTGCACCTCATTGGAGAGCACCATGATGGGGTCTCCAAAGCCAACTTCTCCATCGG TCCCATGATGCAAGACCTTGCAGGGACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTACTCACTCCC CCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGACCCTCTGGACATCGTCATCACAGGTCTATATGAG AAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCACGGTTCTGGCAGGAGAGAGCGTGACCT TGTCCTGCAGCTCCCGGAGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCAGGGAGGGGGAGGC CCATGAATGTAGGTTCTCTGCAGGGCCCAAGGTCAACGGAACATTCCAGGCCGACTTTC CTCTGGGCCCTGCCACCCACGGAGGAACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCGTGACTC TCCATACGAGTGGTCAAACTCGAGTGACCCACTGCTTGTTTCTGTCACAGGAAACCCTT CAAATAGTTGGCCTTCACCCACTGAACCAAGCTCTAAAACCGGTAACCCCCGACACCTG CACATTCTGATTGGGACCTCAGTGGTCATCATCCTCTTCATCCTCCTCTTCTTTCTCCTT CATCGCTGGTGCTCCAACAAAAAAAATGCTGCGGTAATGGACCAAGAGTCTGCAGGGA ACAGAACAGCGAATAGCGAGGACTCTGATGAACAAGACCCTCAGGAGGTGACATACAC ACAGTTGAATCACTGCGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCCCTTCTCAGAGGCCCA AGACACCCCCAACAGATATCATCGTGTACACGGAACTTCCAAATGCTGAGTCCAGATCC AAAGTTGTCTCCTGCCCATGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGCGTCTTCTAGGGAG ACAACAGCCCTGTCTCAAAACCGGGTTGCCAGCTCCCATGTACCAGCAGCTGGAATCT GAAGGCATGAGTCTGCATCTTAGGGCATCGCTCTTCCTCACACCACAAATCTGAATGTG CCTCTCACTTGCTTACAAATGTCTAAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAGAAAAAACACACT CCTTTGCTTAGCCCACAGTTCTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCCAACCTAAC TGGCTTACTTCCTAGTCTACTTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAATTCCAAAC ATACAAGAGGCTCCCTCTTAACGCAGCACTTAGACACGTGTTGTTCCACCTTCCCTCAT GCTGTTCCACCTCCCCTCAGACTAGCTTTCAGTCTTCTGTCAGCAGTAAAACTTATATAT TTTTTAAAATAACTTCAATGTAGTTTTCCATCCTTCAAATAAACATGTCTGCCCCCATG

SEQ ID NO: 4:

MSLMWSMACVGFFLLQGAWPHEGVHRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVRFEHF LL HREGKFKDTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDI VI GLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHECRFSAGPKVNGTFQ ADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPR HLHILIGTSVVIILFILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQESAGNRTANSEDSDEQDPQEVTY TQL NHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAESRSKVVSCP

SEQ ID NO: 5:

AGCTGGGGCGCGGCCGCCTGTCTGCACAGACAGCACCATGTCGCTCATGGTCGTCAG CATGGTGTGTGTTGGGTTCTTCTTGCTGCAGGGGGCCTGGCCACATGAGGGAGTCCAC AGAAAACCTTCCCTCCTGGCCCACCCAGGTCCCCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCAT CCTGCAATGTTGGTCAGATGTCAGGTTTCAGCACTTCCTTCTGCACAGAGAAGGGAAGT TTAAGGACACTTTGCACCTCATTGGAGAGCACCATGATGGGGTCTCCAAGGCCAACTTC TCCATCGGTCCCATGATGCAAGACCTTGCAGGGACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTAC TCACTCCCCCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGACCCTCTGGACATCGTCATCACAGGTC TATATGAGAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCACGGTTCTGGCAGGAGAGAG CGTGACCTTGTCCTGCAGCTCCCGGAGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCAGGGAG GGGGAGGCCCATGAACGTAGGTTCTCTGCAGGGCCCAAGGTCAACGGAACATTCCAGG CCGACTTTCCTCTGGGCCCTGCCACCCACGGAGGAACCTACAGATGCTTCGGCTCTTT CCGTGACTCTCCATACGAGTGGTCAAACTCGAGTGACCCACTGCTTGTTTCTGTCACAG GAAACCCTTCAAATAGTTGGCCTTCACCCACTGAACCAAGCTCCGAAACCGGTAACCCC AGACACCTGCATGTTCTGATTGGGACCTCAGTGGTCATCATCCTCTTCATCCTCCTCCTC TTCTTTCTCCTTCATCGCTGGTGCTGCAACAAAAAAAATGCTGTTGTAATGGACCAAGAG CCTGCAGGGAACAGAACAGTGAACAGGGAGGACTCTGATGAACAAGACCCTCAGGAGG TGACATATGCACAGTTGAATCACTGCGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCCCTTCTC AGAGGCCCAAGACACCCCCAACAGATATCATCGTGTACACGGAACTTCCAAATGCTGAG CCCTGATCCAAAGTTGTCTCCTGCCCATGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGATCTT CTAGGGAGACAACAGCCCTGTCTCAAAACTGGGTTGCCAGCTCCAATGTACCAGCAGC TGGAATCTGAAGGCGTGAGTCTGCATCTTAGGGCATCGCTCTTCCTCACACCACAAATC TGAACGTGCCTCTCCCTTGCTTACAAATGTCTAAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAGAGAA AACACACTCCTTTGCTTAGCCCACAATTCTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCC AACCTAACTGGCTTACTTCCTAGTCTACTTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAA TTCCAAACATACAAGAGGCTCCCTCTTAACACGGCACTTAGACACGTGCTGTTCCACCT TCCCTCATGCTGTTCCACCTCCCCTCAGACTAGCTTTCAGCCTTCTGTCAGCAGTAAAAC TTATATATTTTTTAAAATAATTTCAATGTAGTTTTCCCTCCTTCAAATAAACATGTCTGC CC TCA SEQ ID NO: 6:

MSLM WSM VCVGFFLLQGAWPH EGVH RKPSLLAH PGPLVKSEETVI LQCWSDVRFQH FLL HREGKFKDTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDI VI TGLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRFSAGPKVNGTFQ ADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSETGNPR

5 HLHVLIGTSWIILFILLLFFLLHRWCCNKKNAWMDQEPAGNRTVNREDSDEQDPQEVTYA QLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAEP

SEQ ID NO: 7:

GAGCTCGGTCGCGGCTGCCTGTCTGCTCCGGCAGCACCATGTCGCTCTTGGTCGTCA G CATGGCGTGTGTTGGGTTCTTCTTGCTGCAGGGGGCCTGGCCACATGAGGGAGTCCAC AGAAAACCTTCCCTCCTGGCCCACCCAGGTCGCCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCA TCCTGCAGTGTTGGTCAGATGTCATGTTTGAACACTTCCTTCTGCACAGAGAGGGGATG TTTAACGACACTTTGCGCCTCATTGGAGAACACCATGATGGGGTCTCCAAGGCCAACTT CTCCATCAGTCGCATGACGCAAGACCTGGCAGGGACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTA CTCACTCCCCCTATCAGGTGTCAGCTCCCAGTGACCCTCTGGACATCGTGATCATAGGT CTATATGAGAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCTGGGCCCCACGGTTCTGGCAGGAGAGA ATGTGACCTTGTCCTGCAGCTCCCGGAGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCAGGGAA GGGGAGGCCCATGAACGTAGGCTCCCTGCAGGGCCCAAGGTCAACGGAACATTCCAG GCTGACTTTCCTCTGGGCCCTGCCACCCACGGAGGGACCTACAGATGCTTCGGCTCTT TCCATGACTCTCCATACGAGTGGTCAAAGTCAAGTGACCCACTGCTTGTTTCTGTCACA GGAAACCCTTCAAATAGTTGGCCTTCACCCACTGAACCAAGCTCCAAAACCGGTAACCC CCGACACCTGCACATTCTGATTGGGACCTCAGTGGTCATCATCCTCTTCATCCTCCTCTT CTTTCTCCTTCATCGCTGGTGCTCCAACAAAAAAAATGCTGCGGTAATGGACCAAGAGT CTGCAGGAAACAGAACAGCGAATAGCGAGGACTCTGATGAACAAGACCCTCAGGAGGT GACATACACACAGTTGAATCACTGCGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCCCTTCTCA GAGGCCCAAGACACCCCCAACAGATATCATCGTGTACACGGAACTTCCAAATGCTGAGT CCAGATCCAAAGTTGTCTCCTGCCCATGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGCGTCTT CTAGGGAGACAACAGCCCTGTCTCAAAACCGGGTTGCCAGCTCCCATGTACCAGCAGC TGGAATCTGAAGGCGTGAGTCTGCATCTTAGGGCATCGATCTTCCTCACACCACAAATC TGAATGTGCCTCTCTCTTGCTTACAAATGTCTAAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAGAAAA AACACACTCCTTTGCTTAACCCACAGTTCTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCC AACCTAACTGGCTTACTTCCTAGTCTACTTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAA TTCCAAACATACAAGAGGCTCCCTCTTAACGCAGCACTTAGACACGTGTTGTTCCACCTT CCCTCATGCTGTTCCACCTCCCCTCAGACTAGCTTTCAGTCTTCTGTCAGCAGTAAAACT TATATATTTTTTAAAATAACTTCAATGTAGTTTTCCATCCTTCAAATAAACATGTCTGCC CC CATGGT SEQ ID NO: 8:

MSLLWSMACVGFFLLQGAWPHEGVHRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLH REGMFNDTLRLIGEHHDGVSKANFSISRMTQDLAGTYRCYGSVTHSPYQVSAPSDPLDIV II GLYEKPSLSAQLGPTVLAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGPKVNGTFQA DFPLGPATHGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRH LHILIGTSWIILFILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQESAGNRTANSEDSDEQDPQEVTYTQ LN HCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAESRSKVVSCP SEQ ID NO: 9:

TGTAAACTGCATGGGCAGGGCGCCAAATAACATCCTGTGCGCTGCTGAGCTGAGCTGG GGCGCGGCCGCCTGTCTGCACCGGCAGCACCATGTCGCTCATGGTCATCATCATGGCG TGTGTTGGGTTCTTCTTGCTGCAGGGGGCCTGGCCACAGGAGGGAGTCCACAGAAAAC CTTCCTTCCTGGCCCTCCCAGGTCACCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCATCCTGCAA TGTTGGTCGGATGTCATGTTTGAGCACTTCCTTCTGCACAGAGAGGGGAAGTTTAACAA CACTTTGCACCTCATTGGAGAGCACCATGATGGGGTTTCCAAGGCCAACTTCTCCATTG GTCCCATGATGCCTGTCCTTGCAGGAACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTCCTCACTCC CCCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGACCCTCTGGACATGGTGATCATAGGTCTATATGA GAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCACGGTTCAGGCAGGAGAGAATGTGACC TTGTCCTGCAGCTCCCGGAGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCAGGGAAGGGGAGG CCCATGAACGTAGGCTCCCTGCAGTGCGCAGCATCAACGGAACATTCCAGGCCGACTT TCCTCTGGGCCCTGCCACCCACGGAGGGACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCGTGAC GCTCCCTACGAGTGGTCAAACTCGAGTGATCCACTGCTTGTTTCCGTCACAGGAAACCC TTCAAATAGTTGGCCTTCACCCACTGAACCAAGCTCCAAAACCGGTAACCCCAGACACC TACATGTTCTGATTGGGACCTCAGTGGTCAAAATCCCTTTCACCATCCTCCTCTTCTTTC TCCTTCATCGCTGGTGCTCCGACAAAAAAAATGCTGCTGTAATGGACCAAGAGCCTGCA GGGAACAGAACAGTGAACAGCGAGGATTCTGATGAACAAGACCATCAGGAGGTGTCAT ACGCATAATTGGATCACTGTGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCCCTTCTGAGAGG CCCAAGACACCCCCAACAGATACCAGCATGTACATAGAACTTCCAAATGCTGAGCCCAG ATCCAAAGTTGTCTTCTGTCCACGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGATCTTCTAGG GAGACAACAGCCCTGTCTCAAAACCGGGTTGCCAGCTCCCATGTACCAGCAGCTGGAA TCTGAAGGCATCAGTCTTCATCTTAGGGCATCGCTCTTCCTCACACCACGAATCTGAAC ATGCCTCTCTCTTGCTTACAAATGTCTAAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAGAGAAAACAC ACTCCTTTGCTTAGCCCACAATTCTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCCAACCT AACTGGCTTACTTCCTAGTCTACCTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAATTCC AAACATACAAGAGGCTGCCTCTTAACACAGCACTTAGACACGTGCTGTTCCACCTCCCT TCAGACTATCTTTCAGCCTTCTGCCAGCAGTAAAACTTATAAATTTTTTAAATAATTTCA AT GTAGTTTTCCCGCCTTCAAATAAACATGTCTGCCCTCATGG SEQ ID NC O:

MSLMVIIMACVGFFLLQGAWPQEGVHRKPSFLALPGHLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLL H REGKFNNTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMPVLAGTYRCYGSVPHSPYQLSAPSDPLDMV II GLYEKPSLSAQPGPTVQAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAVRSINGTFQA DFPLGPATHGGTYRCFGSFRDAPYEWSNSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRH LHVLIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSDKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSY A

SEQ ID NO: 11 :

TGTAAACTGCATGGGCAGGGCGCCAAATAACATCCTGTGCGCTGCTGAGCTGAGCTGG GGCGCGGCCGCCTGTCTGCACCGGCAGCACCATGTCGCTCATGGTCATCATCATGGCG TGTGTTGGGTTCTTCTTGCTGCAGGGGGCCTGGCCACAGGAGGGAGTCCACAGAAAAC CTTCCTTCCTGGCCCTCCCAGGTCACCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCATCCTGCAA TGTTGGTCGGATGTCATGTTTGAGCACTTCCTTCTGCACAGAGAGGGGAAGTTTAACAA CACTTTGCACCTCATTGGAGAGCACCATGATGGGGTTTCCAAGGCCAACTTCTCCATTG GTCCCATGATGCCTGTCCTTGCAGGAACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTCCTCACTCC CCCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGACCCTCTGGACATGGTGATCATAGGTCTATATGA GAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCACGGTTCAGGCAGGAGAGAATGTGACC TTGTCCTGCAGCTCCATCTATCCAGGGAAGGGGAGGCCCATGAACGTAGGCTCCCTGC AGTGCGCAGCATCAACGGAACATTCCAGGCCGACTTTCCTCTGGGCCCTGCCACCCAC GGAGGGACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCGTGACGCTCCCTACGAGTGGTCAAACT CGAGTGATCCACTGCTTGTTTCCGTCACAGGAAACCCTTCAAATAGTTGGCCTTCACCC ACTGAACCAAGCTCCAAAACCGGTAACCCCAGACACCTACATGTTCTGATTGGGACCTC AGTGGTCAAAATCCCTTTCACCATCCTCCTCTTCTTTCTCCTTCATCGCTGGTGCTCCGA CAAAAAAAATGCTGCTGTAATGGACCAAGAGCCTGCAGGGAACAGAACAGTGAACAGC GAGGATTCTGATGAACAAGACCATCAGGAGGTGTCATACGCATAATTGGATCACTGTGT TTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCCCTTCTGAGAGGCCCAAGACACCCCCAACAGATA CCAGCATGTACATAGAACTTCCAAATGCTGAGCCCAGATCCAAAGTTGTCTTCTGTCCA CGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGATCTTCTAGGGAGACAACAGCCCTGTCTCAA AACCGGGTTGCCAGCTCCCATGTACCAGCAGCTGGAATCTGAAGGCATCAGTCTTCATC TTAGGGCATCGCTCTTCCTCACACCACGAATCTGAACATGCCTCTCTCTTGCTTACAAAT GTCTAAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAGAGAAAACACACTCCTTTGCTTAGCCCACAATT CTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCCAACCTAACTGGCTTACTTCCTAGTCTAC CTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAATTCCAAACATACAAGAGGCTGCCTCTT AACACAGCACTTAGACACGTGCTGTTCCACCTCCCTTCAGACTATCTTTCAGCCTTCTGC CAGCAGTAAAACTTATAAATTTTTTAAATAATTTCAATGTAGTTTTCCCGCCTTCAAATA AA CATGTCTGCCCTCATGG

SEQ ID NO: 12:

MSLMVIIMACVGFFLLQGAWPQEGVHRKPSFLALPGHLVKSEETVILQCWSDVMFEH FLLH REGKFNNTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMPVLAGTYRCYGSVPHSPYQLSAPSDPLDMV II GLYEKPSLSAQPGPTVQAGENVTLSCSSIYPGKGRPMNVGSLQCAASTEHSRPTFLWALP P TEGPTDASALSVTLPTSGQTRVIHCLFPSQETLQIVGLHPLNQAPKPVTPDTYMF

SEQ ID NO: 13:

TGTAAACTGCATGGGCAGGGCGCCAAATAACATCCTGTGCGCTGCTGAGCTGAGCTG G GGCGCGGCCGCCTGTCTGCACCGGCAGCACCATGTCGCTCATGGTCATCATCATGGCG TGTGTTGGGTTCTTCTTGCTGCAGGGGGCCTGGCCACAGGAGGGAGTCCACAGAAAAC CTTCCTTCCTGGCCCTCCCAGGTCACCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCATCCTGCAA TGTTGGTCGGATGTCATGTTTGAGCACTTCCTTCTGCACAGAGAGGGGAAGTTTAACAA CACTTTGCACCTCATTGGAGAGCACCATGATGGGGTTTCCAAGGCCAACTTCTCCATTG GTCCCATGATGCCTGTCCTTGCAGGAACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTCCTCACTCC CCCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGACCCTCTGGACATGGTGATCATAGGTCTATATGA GAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCACGGTTCAGGCAGGAGAGAATGTGACC TTGTCCTGCAGCTCCATCTATCCAGGGAAGGGGAGGCCCATGAACGTAGGCTCCCTGC AGTGCGCAGCATCAACGGAACATTCCAGGCCGACTTTCCTCTGGGCCCTGCCACCCAC GGAGGGACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCGTGACGCTCCCTACGAGTGGTCAAACT CGAGTGATCCACTGCTTGTTTCCGTCACAGGTAACCCCAGACACCTACATGTTCTGATT GGGACCTCAGTGGTCAAAATCCCTTTCACCATCCTCCTCTTCTTTCTCCTTCATCGCTGG TGCTCCGACAAAAAAAATGCTGCTGTAATGGACCAAGAGCCTGCAGGGAACAGAACAGT GAACAGCGAGGATTCTGATGAACAAGACCATCAGGAGGTGTCATACGCATAATTGGATC ACTGTGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCCCTTCTGAGAGGCCCAAGACACCCCCA ACAGATACCAGCATGTACATAGAACTTCCAAATGCTGAGCCCAGATCCAAAGTTGTCTTC TGTCCACGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGATCTTCTAGGGAGACAACAGCCCTG TCTCAAAACCGGGTTGCCAGCTCCCATGTACCAGCAGCTGGAATCTGAAGGCATCAGTC TTCATCTTAGGGCATCGCTCTTCCTCACACCACGAATCTGAACATGCCTCTCTCTTGCTT ACAAATGTCTAAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAGAGAAAACACACTCCTTTGCTTAGCCC ACAATTCTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCCAACCTAACTGGCTTACTTCCTA GTCTACCTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAATTCCAAACATACAAGAGGCTG CCTCTTAACACAGCACTTAGACACGTGCTGTTCCACCTCCCTTCAGACTATCTTTCAGCC TTCTGCCAGCAGTAAAACTTATAAATTTTTTAAATAATTTCAATGTAGTTTTCCCGCCTT C AAATAAACATGTCTGCCCTCATGG

SEQ ID NO: 14:

MSLMVIIMACVGFFLLQGAWPQEGVHRKPSFLALPGHLVKSEETVILQCWSDVMFEH FLLH REGKFNNTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMPVLAGTYRCYGSVPHSPYQLSAPSDPLDMV II GLYEKPSLSAQPGPTVQAGENVTLSCSSIYPGKGRPMNVGSLQCAASTEHSRPTFLWALP P TEGPTDASALSVTLPTSGQTRVIHCLFPSQVTPDTYMF

SEQ ID NO: 15:

CCGGCAGCACCATGTCGCTCATGGTCATCAGCATGGCATGTGTTGGGTTCTTCTGGCT GCAGGGGGCCTGGCCACATGAGGGATTCCGCAGAAAACCTTCCCTCCTGGCCCACCCA GGTCGCCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCATCCTGCAATGTTGGTCAGATGTCATGTT TGAGCACTTCCTTCTGCACAGAGAGGGGACGTTTAACGACACTTTGCGCCTCATTGGAG AGCACATTGATGGGGTCTCCAAGGCCAACTTCTCCATCGGTCGCATGAGGCAAGACCT GGCAGGGACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTCCTCACTCCCCCTATCAGTTTTCAGCTC CCAGTGACCCTCTGGACATCGTGATCACAGGTCTATATGAGAAACCTTCTCTCTCAGCC CAGCCGGGCCCCACGGTTCTGGCAGGAGAGAGCGTGACCTTGTCCTGCAGCTCCTGG AGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCACGGAGGGGGAGGCCCATGAACGTAGGTTCT CTGCAGGGCCCAAGGTCAACGGAACATTCCAGGCCGACTTTCCTCTGGGCCCTGCCAC CCAAGGAGGAACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCATGACTCTCCCTACGAGTGGTCAA AGTCAAGTGACCCACTGCTTGTTTCTGTCACAGGAAACCCTTCAAATAGTTGGCCTTCAC CCACTGAACCAAGCTCCAAAACCGGTAACCCCAGACACCTACACGTTCTGATTGGGACC TCAGTGGTCAAACTCCCTTTCACCATCCTCCTCTTCTTTCTCCTTCATCGCTGGTGCTCC GACAAAAAAAATGCATCTGTAATGGACCAAGGGCCTGCGGGGAACAGAACAGTGAACA GGGAGGATTCTGACGAACAGGACCATCAGGAGGTGTCATACGCATAATTGGATCACTGT GTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCCCCCTTCTCAGAGGCCCAAGACACCCCCAACAGA TAGCAGCATGTACATAGAACTTCCAAATGCTGAGTCCAGATCCAAAGCTGTCTTCTGTCC ACGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGATCTTCTAGGGAGACAACAGCCCTGTCT

SEQ ID NO: 16:

MSLMVISMACVGFFWLQGAWPHEGFRRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLL HREGTFNDTLRLIGEHIDGVSKANFSIGRMRQDLAGTYRCYGSVPHSPYQFSAPSDPLDI VIT GLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSWSSYDMYHLSTEGEAHERRFSAGPKVNGTFQA DFPLGPATQGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRH LHVLIGTSVVKLPFTILLFFLLHRWCSDKKNASVMDQGPAGNRTVNREDSDEQDHQEVSY A

SEQ ID NO: 17:

ACAATTACTCTACAGCTCAGAACACCAACTGCTGAGGCTGCCTTGGGAAGAGGATGATC CTAAACAAAGCTCTGCTGCTGGGGGCCCTCGCTCTGACCACCGTGATGAGCCCCTGTG GAGGTGAAGACATTGTGGCTGACCACGTTGCCTCTTGTGGTGTAAACTTGTACCAGTTT TACGGTCCCTCTGGCCAGTACACCCATGAATTTGATGGAGATGAGCAGTTCTACGTGGA CCTGGAGAGGAAGGAGACTGCCTGGCGGTGGCCTGAGTTCAGCAAATTTGGAGGTTTT GACCCGCAGGGTGCACTGAGAAACATGGCTGTGGCAAAACACAACTTGAACATCATGAT TAAACGCTACAACTCTACCGCTGCTACCAATGAGGTTCCTGAGGTCACAGTGTTTTCCA AGTCTCCCGTGACACTGGGTCAGCCCAACACCCTCATTTGTCTTGTGGACAACATCTTT CCTCCTGTGGTCAACATCACATGGCTGAGCAATGGGCAGTCAGTCACAGAAGGTGTTTC TGAGACCAGCTTCCTCTCCAAGAGTGATCATTCCTTCTTCAAGATCAGTTACCTCACCTT CCTCCCTTCTGCTGATGAGATTTATGACTGCAAGGTGGAGCACTGGGGCCTGGACCAG CCTCTTCTGAAACACTGGGAGCCTGAGATTCCAGCCCCTATGTCAGAGCTCACAGAGAC TGTGGTCTGTGCCCTGGGGTTGTCTGTGGGCCTCATGGGCATTGTGGTGGGCACTGTC TTCATCATCCAAGGCCTGCGTTCAGTTGGTGCTTCCAGACACCAAGGGCCATTGTGAAT CCCATCCTGGAAGGGAAGGTGCATCGCCATCTACAGGAGCAGAAGAATGGACTTGCTA AATGACCTAGCACTATTCTCTGGCCCGATTTATCATATCCCTTTTCTCCTCCAAATATTT C TCCTCTCACCTTTTCTCTGGGACTTAAGCTGCTATATCCCCTCAGAGCTCACAAATGCCT TTACATTCTTTCCCTGACCTCCTGATTTTTTTTTTCTTTTCTCAAATGTTACCTACAAAG AC ATGCCTGGGGTAAGCCACCCGGCTACCTAATTCCTCAGTAACCTCCATCTAAAATCTCC AAGGAAGCAATAAATTCCTTTTATGAGATCTATGTCAAATTTTTCCATCTTTCATCCAGG G CTGACTGAAACTATGGCTAATAATTGGGGTACTCTTATGTTTCAATCCAATTTAACCTCA T TTCCCAGATCATTTTTCATGTCCAGTAACACAGAAGCCACCAAGTACAGTATAGCCTGAT AATATGTTGATTTCTTAGCTGACATTAATATTTCTTGCTTCCTTGTGTTCCCACCCTTGG C ACTGCCACCCACCCCTCAATTCAGGCAACAATGAAATTAATGGATACCGTCTGCCCTTG GCCCAGAATTGTTATAGCAAAAATTTTAGAACCAAAAAATAAGTCTGTACTAATTTCAAT G TGGCTTTTAAAAGTATGACAGAGAAATAAGTTAGGATAAAGGAAATTTGAATCTCA

SEQ ID NO: 18:

MILNKALLLGALALTTVMSPCGGEDIVADHVASCGVNLYQFYGPSGQYTHEFDGDEQFYV D LERKETAWRWPEFSKFGGFDPQGALRNMAVAKHNLNIMIKRYNSTAATNEVPEVTVFSKS P VTLGQPNTLICLVDNIFPPWNITWLSNGQSVTEGVSETSFLSKSDHSFFKISYLTFLPSA DEI YDCKVEHWGLDQPLLKHWEPEIPAPMSELTETVVCALGLSVGLMGIVVGTVFIIQGLRSV GA SRHQGPL

SEQ ID NO: 19:

CACCGGCAGCACCATGTCGCTCACGGTCGTCAGCATGGCGTGTGTTGGGTTCTTCTT GCT GCAGGGGGCCTGGCCACATGAGGGAGTCCACAGAAAACCTTCCCTCCTGGCCCACCCAG GTCGCCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCATCCTGCAATGTTGGTCAGATGTCATGTTTG A ACACTTCCTTCTGCACAGAGAGGGGATGTTTAACGACACTTTGCGCCTCATTGGAGAACA C CATGATGGGGTCTCCAAGGCCAACTTCTCCATCAGTCGCATGAAGCAAGACCTGGCAGGG ACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTACTCACTCCCCCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGAC C CTCTGGACATCGTGATCATAGGTCTATATGAGAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCC C CACGGTTCTGGCAGGAGAGAATGTGACCTTGTCCTGCAGCTCCCGGAGCTCCTATGACAT GTACCATCTATCCAGGGAAGGGGAGGCCCATGAACGTAGGCTCCCTGCAGGGACCAAGG TCAACGGAACATTCCAGGCCAACTTTCCTCTGGGCCCTGCCACCCATGGAGGGACCTACA GATGCTTCGGCTCTTTCCGTGACTCTCCATACGAGTGGTCAAAGTCAAGTGACCCACTGC T TGTTTCTGTCACAGGAAACCCTTCAAATAGTTGGCCTTCACCCACTGAACCAAGCTCCGA A ACCGGTAACCCCAGACACCTACATGTTCTGATTGGGACCTCAGTGGTCAAAATCCCTTTC A CCATCCTCCTCTTCTTTCTCCTTCATCGCTGGTGCTCCGACAAAAAAAATGCTGCTGTAA TG GACCAAGAGCCTGCAGGGAACAGAACAGTGAACAGCGAGGATTCTGATGAACAAGACCAT CAGGAGGTGTCATACGCATAATTGGATCACTGTGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGC C CTTCTGAGAGGCCCAAGACACCCCCAACAGATACCAGCATGTACATAGAACTTCCAAATG C TGAGCCCAGATCCAAAGTTGTCTTCTGTCCACGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGAT CTTCTAGGGAGA

SEQ ID NO: 20: MSLTVVSMACVGFFLLQGAWPHEGVHRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLL HR EGMFNDTLRLIGEHHDGVSKANFSISRMKQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVI IGLYE KPSLSAQPGPTVLAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGTKVNGTFQANFPL GP ATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSETGNPRHLHVLIG TS VVKIPFTILLFFLLHRWCSDKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSYA

SEQ ID NO: 21 : CCGGCAGCACCATGTTGCTCATGGTCGTCAGCATGGCGTGTGTTGGGTTGTTCTTGGTCC AGAGGGCCGGTCCACACATGGGTGGTCAGGACAAGCCCTTCCTGTCTGCCTGGCCCAGC GCTGTGGTGCCTCGCGGAGGACACGTGACTCTTCGGTGTCACTATCGTCATAGGTTTAAC AATTTCATGCTATACAAAGAAGACAGAATCCACGTTCCCATCTTCCATGGCAGAATATTC CA GGAGGGCTTCAACATGAGCCCTGTGACCACAGCACATGCAGGGAACTACACATGTCGGGG TTCACACCCACACTCCCCCACTGGGTGGTCGGCACCCAGCAACCCCATGGTGATCATGGT CACAGGAAACCACAGAAAACCTTCCCTCCTGGCCCACCCAGGTCCCCTGGTGAAATCAGG AGAGAGAGTCATCCTGCAATGTTGGTCAGATATCATGTTTGAGCACTTCTTTCTGCACAA AG AGTGGATCTCTAAGGACCCCTCACGCCTCGTTGGACAGATCCATGATGGGGTCTCCAAGG CCAATTTCTCCATCGGTTCCATGATGCGTGCCCTTGCAGGGACCTACAGATGCTACGGTT C TGTTACTCACACCCCCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGATCCCCTGGACATCGTGGTCAC A GGTCTATATGAGAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCAAGGTTCAGGCAGGAGAG AGCGTGACCTTGTCCTGTAGCTCCCGGAGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCAGGGAG GGGGGAGCCCATGAACGTAGGCTCCCTGCAGTGCGCAAGGTCAACAGAACATTCCAGGC AGATTTCCCTCTGGGCCCTGCCACCCACGGAGGGACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCG TCACTCTCCCTACGAGTGGTCAGACCCGAGTGACCCACTGCTTGTTTCTGTCACAGGAAA C CCTTCAAGTAGTTGGCCTTCACCCACAGAACCAAGCTCCAAATCTGGTAACCTCAGACAC C TGCACATTCTGATTGGGACCTCAGTGGTCAAAATCCCTTTCACCATCCTCCTCTTCTTTC TC CTTCATCGCTGGTGCTCCAACAAAAAAAAATGCTGCTGTAATGGACCAAGAGCCTGCAGG G AACAGAAGTGAACAGCGAGGATTCTGATGAACAAGACCATCAGGAGGTGTCATACGCATA A TTGGAACACTGTGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGCCCTTCTCAGAGGCCCAAGACA C CCCCAACAGATACCAGCATGTACATAGAACTTCCAAATGCTGAGCCCAGATCCAAAGTTG T CTTCTGTCCACGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGATCTTCTAGGGAGACAACAGCCC TGTCTCAAAACTGGGTTGCCAGCTCCCATGTACCAGCAGCTGGAATCTGAAGGCATCAGT C TTCATCTTAGGGCATCGCTCTTCCTCACACCACAAATCTGAATGTGCCTCTCACTTGCTT AC AAATGTCTAAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAGAAAAAACACACTCCTTTGCTTAGCCCACA G TTCTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCCAACCTAACTGGCTTACTTCCTAGTCT AC TTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAATTCCACACATACAAGAGGCTCCGTCTTA A CGCAGCACTTAGACACGTGCTGTTCCACCTTCCCTCATGCTG

SEQ ID NO: 22: MLLMVVSMACVGLFLVQRAGPHMGGQDKPFLSAWPSAVVPRGGHVTLRCHYRHRFNNFML Y KEDRIHVPIFHGRIFQEGFNMSPVTTAHAGNYTCRGSHPHSPTGWSAPSNPMVIMVTGNH RKP SLLAHPGPLVKSGERVILQCWSDIMFEHFFLHKEWISKDPSRLVGQIHDGVSKANFSIGS MMRA LAGTYRCYGSVTHTPYQLSAPSDPLDIVVTGLYEKPSLSAQPGPKVQAGESVTLSCSSRS SYD MYHLSREGGAHERRLPAVRKVNRTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRHSPYEWSDPSDPL LV SVTGNPSSSWPSPTEPSSKSGNLRHLHILIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSNKKKCCCN GPRAC REQK

SEQ ID NO: 23:

ATAACATCCTGTGCGCTGCTGAGCTGAGCTGGGGCGCAGCCGCCTGTCTGCACCGGC AG CACCATGTCGCTCATGGTCGTCAGCATGGCGTGTGTTGGGTTGTTCTTGGTCCAGAGGGC CGGTCCACACATGGGTGGTCAGGACAAACCCTTCCTGTCTGCCTGGCCCAGCGCTGTGGT GCCTCGAGGAGGACACGTGACTCTTCGGTGTCACTATCGTCATAGGTTTAACAATTTCAT G CTATACAAAGAAGACAGAATCCACATTCCCATCTTCCATGGCAGAATATTCCAGGAGAGC T TCAACATGAGCCCTGTGACCACAGCACATGCAGGGAACTACACATGTCGGGGTTCACACC CACACTCCCCCACTGGGTGGTCGGCACCCAGCAACCCCGTGGTGATCATGGTCACAGGAA ACCACAGAAAACCTTCCCTCCTGGCCCACCCAGGTCCCCTGGTGAAATCAGGAGAGAGAG TCATCCTGCAATGTTGGTCAGATATCATGTTTGAGCACTTCTTTCTGCACAAAGAGGGGA TC TCTAAGGACCCCTCACGCCTCGTTGGACAGATCCATGATGGGGTCTCCAAGGCCAATTTC T CCATCGGTCCCATGATGCTTGCCCTTGCAGGGACCTACAGATGCTACGGTTCTGTTACTC A CACCCCCTATCAGTTGTCAGCTCCCAGTGATCCCCTGGACATCGTGGTCACAGGTCCATA T GAGAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCAAGGTTCAGGCAGGAGAGAGCGTGAC CTTGTCCTGTAGCTCCCGGAGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCAGGGAGGGGGGAGC CCATGAACGTAGGCTCCCTGCAGTGCGCAAGGTCAACAGAACATTCCAGGCAGATTTCCC TCTGGGCCCTGCCACCCACGGAGGGACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCGTCACTCTCC CTACGAGTGGTCAGACCCGAGTGACCCACTGCTTGTTTCTGTCACAGGAAACCCTTCAAG T AGTTGGCCTTCACCCACAGAACCAAGCTCCAAATCTGGTAACCCCAGACACCTGCACATT C TGATTGGGACCTCAGTGGTCATCATCCTCTTCA

TCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTCATCTCTGGTGCTCCAACAAAAAAAATGCTGCTG TAATG GACCAAGAGCCTGCAGGGAACAGAACAGCCAACAGCGAGGACTCTGATGAACAAGACCCT GAGGAGGTGACATACGCACAGTTGGATCACTGCGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCGC C CTTCTCAGAGGCCCAAGACACCCCCTACAGATACCATCTTGTACACGGAACTTCCAAATG C TAAGCCCAGATCCAAAGTTGTCTCCTGCCCATGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGACGT CTTCTAGGGAGACAACAGCCCTGTCTCAAAACCGAGTTGCCAGCTCCCATGTACCAGCAG CTGGAATCTGAAGGCGTGAGTCTTCATCTTAGGGCATCGCTCCTCCTCACGCCACAAATC T GGTGCCTCTCTCTTGCTTACAAATGTCTAGGTCCCCACTGCCTGCTGGAAAGAAAACACA C TCCTTTGCTTAGCCCACAGTTCTCCATTTCACTTGACCCCTGCCCACCTCTCCAACCTAA CT GGCTTACTTCCTAGTCTACTTGAGGCTGCAATCACACTGAGGAACTCACAATTCCAAACA TA CAAGAGGCTCCCTCTTGACGTGGCACTTACCCACGTGCTGTTCCACCTTCCCTCATGCTG T TTCACCTTTCTTCGGACTATTTTCCAGCCTTCTGTCAGCAGTGAAACTTATAAAATTTTT TGT GATTTCAATGTAGCTGTCTCCTCTTCAAATAAACATGTCTGCCCTCAAAAAAAAAAAAAA AAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAA AAAAAA SEQ ID NO: 24:

MSLMVVSMACVGLFLVQRAGPHMGGQDKPFLSAWPSAVVPRGGHVTLRCHYRHRFNN FMLY KEDRIHIPIFHGRIFQESFNMSPVTTAHAGNYTCRGSHPHSPTGWSAPSNPWIMVTGNHR KPS LLAHPGPLVKSGERVILQCWSDIMFEHFFLHKEGISKDPSRLVGQIHDGVSKANFSIGPM MLAL AGTYRCYGSVTHTPYQLSAPSDPLDIVVTGPYEKPSLSAQPGPKVQAGESVTLSCSSRSS YDM YHLSREGGAHERRLPAVRKVNRTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRHSPYEWSDPSDPLL VS VTGNPSSSWPSPTEPSSKSGNPRHLHILIGTSWIILFILLLFFLLHLWCSNKKNAAVMDQ EPAG NRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSK VVSC P SEQ ID NO: 25:

AGTTCTAAAGTCCCCACGCACCCACCCGGACTCAGAGTCTCCTCAGACGCCGAGATG CTG GTCATGGCGCCCCGAACCGTCCTCCTGCTGCTCTCGGCGGCCCTGGCCCTGACCGAGAC CTGGGCCGGCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTACACCTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCG GGGAGCCCCGCTTCATCTCAGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGAGGTTCGACA GCGACGCCGCGAGTCCGAGAGAGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCC GGAGTATTGGGACCGGAACACACAGATCTACAAGGCCCAGGCACAGACTGACCGAGAGA GCCTGCGGAACCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGGTCTCACACCCTCCAG AGCATGTACGGCTGCGACGTGGGGCCGGACGGGCGCCTCCTCCGCGGGCATGACCAGTA CGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGCCG CGGACACGGCGGCTCAGATCACCCAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCGTGAGGCGGAGCA GCGGAGAGCCTACCTGGAGGGCGAGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACG GGAAGGACAAGCTGGAGCGCGCTGACCCCCCAAAGACACACGTGACCCACCACCCCATC TCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGTTTCTACCCTGCGGAGATCACA CTGACCTGGCAGCGGGATGGCGAGGACCAAACTCAGGACACTGAGCTTGTGGAGACCAG ACCAGCAGGAGATAGAACCTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAAGA GCAGAGATACACATGCCATGTACAGCATGAGGGGCTGCCGAAGCCCCTCACCCTGAGATG GGAGCCGTCTTCCCAGTCCACCGTCCCCATCGTGGGCATTGTTGCTGGCCTGGCTGTCCT AGCAGTTGTGGTCATCGGAGCTGTGGTCGCTGCTGTGATGTGTAGGAGGAAGAGTTCAGG TGGAAAAGGAGGGAGCTACTCTCAGGCTGCGTGCAGCGACAGTGCCCAGGGCTCTGATG TGTCTCTCACAGCTTGAAAAGCCTGAGACAGCTGTCTTGTGAGGGACTGAGATGCAGGAT T TCTTCACGCCTCCCCTTTGTGACTTCAAGAGCCTCTGGCATCTCTTTCTGCAAAGGCACC T GAATGTGTCTGCGTCCCTGTTAGCATAATGTGAGGAGGTGGAGAGACAGCCCACCCTTGT GTCCACTGTGACCCCTGTTCCCATGCTGACCTGTGTTTCCTCCCCAGTCATCTTTCTTGT TC CAGAGAGGTGGGGCTGGATGTCTCCATCTCTGTCTCAACTTTACGTGCACTGAGCTGCAA CTTCTTACTTCCCTACTGAAAATAAGAATCTGAATATAAATTTGTTTTCTCAAATATTTG CTAT GAGAGGTTGATGGATTAATTAAATAAGTCAATTCCTGGAATTTGAGAGAGCAAATAAAGA CC TGAGAACCTTCCAGAAAAAAAA

SEQ ID NO: 26: MLVMAPRTVLLLLSAALALTETWAGSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRF DSD AASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGYYNQSEAGSHTLQSMY G CDVGPDGRLLRGHDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYL EG ECVEWLRRYLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGE DQT QDTELVETRPAGDRTFQKWAAWVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSTVPIVG IV AGLAVLAWVIGAWAAVMCRRKSSGGKGGSYSQAACSDSAQGSDVSLTA

SEQ ID NO: 27:

GGGAACTTGTGGTCGCGCGGGCTGTTCCACAGCTCCGGGCCGGGTCAGGGTGGCGGC T GCGGGGGCGGACGGGCTGGGCCGCACTGACTGGCCGGTGATTCCTCGCAGAGGATTTC GTGTACCAGTTTAAGGGCATGTGCTACTTCACCAACGGGACAGAGCGCGTGCGTCTTGTG AGCAGAAGCATCTATAACCGAGAAGAGATCGTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTTC CGGCGCGGTGACGCTGCTGGGGCTGCCTGCCGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGACA TCCTGGAGAGGAAACGGGCGGCGGTGGACAGGGTGTGCAGACACAACTACCAGTTGGAG CTCCGCACGACCTTGCAGCGGCGAGGTGAGCGGCGTCGCCCTCTGCGAGGCCCACCCTT GGCCCCAAGTCTCTGCGCCAGGAGGGGGCAAGGGTCGTGGCCTCTGAACCTGAGCCCCG TTTGTTCCACCCC

SEQ ID NO: 28:

DFVYQFKGMCYFTNGTERVRLVSRSIYNREEIVRFDSDVGEFRRGDAAGAACRRVLE QPEGH PGEETGGGGQGVQTQLPVGAPHDLAAA SEQ ID NO: 29:

CCGGCAGCACCATGTCGCTCATGGTCATCAGCATGGCATGTGTTGGGTTCTTCTGGC TGC AGGGGGCCTGGCCACATGAGGGATTCCGCAGAAAACCTTCCCTCCTGGCCCACCCAGGT CGCCTGGTGAAATCAGAAGAGACAGTCATCCTGCAATGTTGGTCAGATGTCATGTTTGAG C ACTTCCTTCTGCACAGAGAGGGGACGTTTAACGACACTTTGCGCCTCATTGGAGAGCACA T TGATGGGGTCTCCAAGGCCAACTTCTCCATCGGTCGCATGAGGCAAGACCTGGCAGGGAC CTACAGATGCTACGGTTCTGTTCCTCACTCCCCCTATCAGTTTTCAGCTCCCAGTGACCC T CTGGACATCGTGATCACAGGTCTATATGAGAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCC ACGGTTCTGGCAGGAGAGAGCGTGACCTTGTCCTGCAGCTCCTGGAGCTCCTATGACATG TACCATCTATCCACGGAGGGGGAGGCCCATGAACGTAGGTTCTCTGCAGGGCCCAAGGTC AACGGAACATTCCAGGCCGACTTTCCTCTGGGCCCTGCCACCCAAGGAGGAACCTACAGA TGCTTCGGCTCTTTCCATGACTCTCCCTACGAGTGGTCAAAGTCAAGTGACCCACTGCTT G TTTCTGTCACAGGAAACCCTTCAAATAGTTGGCCTTCACCCACTGAACCAAGCTCCAAAA C CGGTAACCCCAGACACCTACACGTTCTGATTGGGACCTCAGTGGTCAAACTCCCTTTCAC C ATCCTCCTCTTCTTTCTCCTTCATCGCTGGTGCTCCGACAAAAAAAATGCATCTGTAATG GA CCAAGGGCCTGCGGGGAACAGAACAGTGAACAGGGAGGATTCTGACGAACAGGACCATC AGGAGGTGTCATACGCATAATTGGATCACTGTGTTTTCACACAGAGAAAAATCACTCCCC C

TTCTCAGAGGCCCAAGACACCCCCAACAGATAGCAGCATGTACATAGAACTTCCAAA TGCT GAGTCCAGATCCAAAGCTGTCTTCTGTCCACGAGCACCACAGTCAGGCCTTGAGGGGATC TTCTAGGGAGACAACAGCCCTGTCT SEQ ID NO: 30:

MSLMVISMACVGFFWLQGAWPHEGFRRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVMFEH FLLHR EGTFNDTLRLIGEHIDGVSKANFSIGRMRQDLAGTYRCYGSVPHSPYQFSAPSDPLDIVI TGLYE KPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSWSSYDMYHLSTEGEAHERRFSAGPKVNGTFQADFPL GP ATQGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLHVLIG TS VVKLPFTILLFFLLHRWCSDKKNASVMDQGPAGNRTVNREDSDEQDHQEVSYA

SEQ ID NO: 31

GAGAAGCCAATCAGTGTCGTCGCGGTCGCTGTTCTAAAGCCCGCACGCACCCACCGG GA

CTCAGATTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCCGTCATGGCGCCCCGAACCCTCCTCCT GCT

ACTCTCGGGGGCCCTGGCCCTGACCCAGACCTGGGCGGGCTCCCACTCCATGAGGTA TT TCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCGTGGGCTAC GTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCC GCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCAGGAGACACGGAAT GTGAAGGCCCAGTCACAGACTGACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAA CCAGAGCGAGGCCGGTTCTCACACCATCCAGATAATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGA CGGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCGGCAGGACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCC TGAACGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGGCGGCTCAGATCACCAAGCGC AAGTGGGAGGCGGCCCATGAGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGATGGCACGTGCGT GGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGACCCCC CCAAGACACATATGACCCACCACCCCATCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGG CCCTGGGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCGGGATGGGGAGGACCAG ACCCAGGACACGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTG GGCGGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGGAGCAGAGATACACCTGCCATGTGCAGCATG AGGGTCTGCCCAAGCCCCTCACCCTGAGATGGGAGCTGTCTTCCCAGCCCACCATCCCCA TCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCCTTGGAGCTGTGATCACTGGAGCTGTGGTCG CTGCCGTGATGTGGAGGAGGAAGAGCTCAGATAGAAAAGGAGGGAGTTACACTCAGGCTG CAAGCAGTGACAGTGCCCAGGGCTCTGATGTGTCCCTCACAGCTTGTAAAGTGTGAGACA GCTGCCTTGTGTGGGACTGAGAGGCAAGAGTTGTTCCTGCCCTTCCCTTTGTGACTTGAA G AACCCTGACTTTGTTTCTGCAAAGGCACCTGCATGTGTCTGTGTTCGTGTAGGCATAATG T GAGGAGGTGGGGAGACCACCCCACCCCCATGTCCACCATGACCCTCTTCCCACGCTGAC CTGTGCTCCCTCCCCAATCATCTTTCCTGTTCCAGAGAGGTGGGGCTGAGGTGTCTCCAT C TCTGTCTCAACTTCATGGTGCACTGAGCTGTAACTTCTTCCTTCCCTATTAAAATTAGAA CC TTAGTATAAATTTACTTTCTCAAATTCTTGCCATGAGAGGTTGATGAGTTAATTAAAGGA GAA GATTCCTAAAATTTGAGAGACAAAATAAATGGAAGACATGAGAACCTTCCAGAGTCCAAA AA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 32:

MAVMAPRTLLLLLSGALALTQTWAGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQF VRFDSD AASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTIQIMY G CDVGSDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHEAEQLRAYL DG TCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGE DQ TQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVWPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWELSSQPTIPIV GII AGLVLLGAVITGAVVAAVMWRRKSSDRKGGSYTQAASSDSAQGSDVSLTACKV

SEQ ID NO: 33:

TCCGCAGTCCCGGTTCTAAAGTCCCCAGTCACCCACCCGGACTCACATTCTCCCCAG AGG CCGAGATGCGGGTCATGGCGCCCCGAGCCCTCCTCCTGCTGCTCTCGGGAGGCCTGGCC CTGACCGAGACCTGGGCCTGCTCCCACTCCATGAGGTATTTCGACACCGCCGTGTCCCGG CCCGGCCGCGGAGAGCCCCGCTTCATCTCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGT GCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGAGGGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGTGGAG CAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGAAGTACAAGCGCCAGGCACAGG CTGACCGAGTGAGCCTGCGGAACCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGACGGGTCT CACACCCTCCAGAGGATGTCTGGCTGCGACCTGGGGCCCGACGGGCGCCTCCTCCGCGG GTATGACCAGTCCGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGCGCTC CTGGACCGCCGCGGACACCGCGGCTCAGATCACCCAGCGCAAGTTGGAGGCGGCCCGT GCGGCGGAGCAGCTGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATA CCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCGCAGAACCCCCAAAGACACACGTGACCC ACCACCCCCTCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCTG CGGAGATCACACTGACCTGGCAGCGGGATGGGGAGGACCAGACCCAGGACACCGAGCTT GTGGAGACCAGGCCAGCAGGAGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCC TTCTGGACAAGAGCAGAGATACACGTGCCATATGCAGCACGAGGGGCTGCAAGAGCCCCT CACCCTGAGCTGGGAGCCATCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCATGGGCATCGTTGCTGG CCTGGCTGTCCTGGTTGTCCTAGCTGTCCTTGGAGCTGTGGTCACCGCTATGATGTGTAG GAGGAAGAGCTCAGGTGGAAAAGGAGGGAGCTGCTCTCAGGCTGCGTGCAGCAACAGTG CCCAGGGCTCTGATGAGTCTCTCATCACTTGTAAAGCCTGAGACAGCTGCCTGTGTGGGA CTGAGATGCAGGATTTCTTCACACCTCTCCTTTGTGACTTCAAGAGCCTCTGGCATCTCT TT CTGCAAAGGCACCTGAATGTGTCTGCGTTCCTGTTAGCATAATGTGAGGAGGTGGAGAGA CAGCCCACCCCCGTGTCCACCGTGACCCCTGTCCCCACACTGACCTGTGTTCCCTCCCCG ATCATCTTTCCTGTTCCAGAGAGGTGGGGCTGGATGTCTCCATCTCTGTCTCAAATTCAT G GTGCACTGAGCTGCAACTTCTTACTTCCCTAATGAAGTTAAGAACCTGAATATAAATTTG TG TTCTCAAATATTTGCTATGAAGCGTTGATGGATTAATTAAATAAGTCAATTCCTAGAAGT TGA GAGAGCAAATAAAGACCTGAGAACCTTCCAGAA

SEQ ID NO: 34:

MRVMAPRALLLLLSGGLALTETWACSHSMRYFDTAVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQF VRFDS DAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQADRVSLRNLRGYYNQSEDGSHTLQRM SGCDLGPDGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKLEAARAAEQLRA YLE GTCVEWLRRYLENGKETLQRAEPPKTHVTHHPLSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDG ED QTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVWPSGQEQRYTCHMQHEGLQEPLTLSWEPSSQPTIPI M GIVAGLAVLVVLAVLGAWTAMMCRRKSSGGKGGSCSQAACSNSAQGSDESLITCKA

SEQ ID NO: 35:

CCTATAACTTGGAATGTGGGTGGAGGGGTTCATAGTTCTCCCTGAGTGAGACTTGCC TGCT TCTCTGGCCCCTGGTCCTGTCCTGTTCTCCAGCATGGTGTGTCTGAAGCTCCCTGGAGGC TCCTGCATGACAGCGCTGACAGTGACACTGATGGTGCTGAGCTCCCCACTGGCTTTGTCT GGGGACACCCGACCACGTTTCCTGTGGCAGCCTAAGAGGGAGTGTCATTTCTTCAATGGG ACGGAGCGGGTGCGGTTCCTGGACAGATACTTCTATAACCAGGAGGAGTCCGTGCGCTTC GACAGCGACGTGGGGGAGTTCCGGGCGGTGACGGAGCTGGGGCGGCCTGACGCTGAGT ACTGGAACAGCCAGAAGGACATCCTGGAGCAGGCGCGGGCCGCGGTGGACACCTACTGC AGACACAACTACGGGGTTGTGGAGAGCTTCACAGTGCAGCGGCGAGTCCAACCTAAGGTG ACTGTATATCCTTCAAAGACCCAGCCCCTGCAGCACCACAACCTCCTGGTCTGCTCTGTG A GTGGTTTCTATCCAGGCAGCATTGAAGTCAGGTGGTTCCTGAACGGCCAGGAAGAGAAGG CTGGGATGGTGTCCACAGGCCTGATCCAGAATGGAGACTGGACCTTCCAGACCCTGGTGA TGCTGGAAACAGTTCCTCGAAGTGGAGAGGTTTACACCTGCCAAGTGGAGCACCCAAGCG TGACAAGCCCTCTCACAGTGGAATGGAGAGCACGGTCTGAATCTGCACAGAGCAAGATGC TGAGTGGAGTCGGGGGCTTTGTGCTGGGCCTGCTCTTCCTTGGGGCCGGGCTGTTCATCT ACTTCAGGAATCAGAAAGGACACTCTGGACTTCAGCCAACAGGATTCCTGAGCTGAAATG C AGATGACCACATTCAAGGAAGAACTTTCTGCCCCGGCTTTGCAGGATGAAAAGCTTTCCT G CTTGGCAGTTATTCTTCCACAAGAGAGGGCTTTCTCAGGACCTGGTTGCTACTGGTTCGG C AACTGCAGAAAATGTCCTCCCTTGTGGCTTCCTCAGCTCCTGCCCTTGGCCTGAAGTCCC A GCATTGATGGCAGCGCCTCATCTTCAACTTTTGTGCTCCCCTTTGCCTAAACCGTATGGC C TCCCGTGCATCTGTATTCACCCTGTATGACAAACACATTACATTATTAAATGTTTCTCAA AGA TGGAGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAA AAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 36:

MVCLKLPGGSCMTALTVTLMVLSSPLALSGDTRPRFLWQPKRECHFFNGTERVRFLD RYFYN QEESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVVESFTVQR RV QPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTF QT LVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSKM LSGVGGFVLGLLFLGAGLFIY FRNQKGHSGLQPTGFLS

SEQ ID NO: 37:

TTTTTATTCTTTCTGCCAGGTACATCAGATCCATCAGGTCCGAGCTGTGTTGACTAC CACTG CTTTTCCCTTCGTCTCAGTTATGTCTTGGAAGAAGGCTTTGCGGATCCCCGGAGACCTTC G GGTAGCAACTGTCACCTTGATGCTGGCGATGCTGAGCTCCCTACTGGCTGAGGGCAGAGA CTCTCCCGAGGATTTCGTGTTCCAGTTTAAGGGCATGTGCTACTTCACCAACGGGACGGA GCGCGTGCGTCTTGTGACCAGATACATCTATAACCGAGAGGAGTACGCGCGCTTCGACAG CGACGTGGGGGTGTACCGCGCGGTGACGCCGCAGGGGCGGCCTGATGCCGAGTACTGG AACAGCCAGAAGGAAGTCCTGGAGGGGACCCGGGCGGAGTTGGACACGGTGTGCAGACA CAACTACGAGGTGGCGTTCCGCGGGATCTTGCAGAGGAGAGTGGAGCCCACAGTGACCA TCTCCCCATCCAGGACAGAGGCCCTCAACCACCACAACCTGCTGGTCTGCTCGGTGACAG ATTTCTATCCAGGCCAGATCAAAGTCCGGTGGTTTCGGAATGATCAGGAGGAGACAGCCG GCGTTGTGTCCACCCCCCTTATTAGGAATGGTGACTGGACTTTCCAGATCCTGGTGATGC T GGAAATGACTCCCCAGCGTGGAGATGTCTACACCTGCCACGTGGAGCACCCCAGCCTCCA GAGCCCCATCACCGTGGAGTGGCGGGCTCAGTCTGAATCTGCCCAGAGCAAGATGCTGA GTGGCGTTGGAGGCTTCGTGCTGGGGCTGATCTTCCTTGGGCTGGGCCTTATCATCCGTC AAAGGAGTCAGAAAGGGCTTCTGCACTGACTCCTGAGACTATTTTAACTAGGATTGGTTA T CACTCTTCTGTGATGCCTGCTTATGCCTGCCCAGAATTCCCAGCTGCCTGTGTCAGCTTG T CCCCCTGAGATCAAAGTCCTACAGTGGCTGTCACGCAGCCACCAGGTCATCTCCTTTCAT C CCCACCCCAAGGCGCTGGCTGTGACTCTGCTTCCTGCACTGACCCAGAGCCTCTGCCTGT GCATGGCCAGCTGCGTCTACTCAGGTCCCAAGGGGTTTCTGTTTCTATTCTTTCCTCAGA C TGCTCAAGAGAAGCACATGAAAAACATTACCTGACTTTAGAGCTTTTTTACATAATTAAA CAT GATCCTGAGTTATCTGTATTCTGAACTTTCTTAATTGAGAAGAGGCAGGAAATCACTGCA GA ATGAAGGAACATCCCTTGAGGTGACCCAGCAAACCTGTGGCCAGAAGGAGGATTGTACCT TGAAAAGACACTGAAAGCATTTTGGGGTGTGAAGTAAGGGTGGGCAGAGGAGGTAGAAAA TAATTCAATTGTCGCATCATTCATGGTTCTTTAATACTGATGCTCAGTGCATTGGCCTTA GA ATATCCCAGCCTCTCTTCTGGTTTGGTGAGTGCTGTGTAAATAAGCATGGTAGAATTGTT TG GAGACATATATAGTGATCCTTGGTCACTGGTGTTTCAAACATTCTGGAAAGTCACATCGA TC AAGAATATTTTTTATTTTTAAGAAAGCATAACCAGCAATAAAAATACTATTTTTGAGTCT AAAT GAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 38:

MSWKKALRIPGDLRVATVTLMLAMLSSLLAEGRDSPEDFVFQFKGMCYFTNGTERVR LVTRYI YNREEYARFDSDVGVYRAVTPQGRPDAEYWNSQKEVLEGTRAELDTVCRHNYEVAFRGIL QR RVEPTVTISPSRTEALNHHNLLVCSVTDFYPGQIKVRWFRNDQEETAGWSTPLIRNGDWT FQI LVMLEMTPQRGDVYTCHVEHPSLQSPITVEWRAQSESAQSKM LSGVGGFVLGLIFLGLGLIIRQ RSQKGLLH

SEQ ID NO: 39:

TTTTTATTCTTTCTGCCAGGTACATCAGATCCATCAGGTCCGAGCTGTGTTGACTAC CACTG CTTTTCCCTTCGTCTCAGTTATGTCTTGGAAGAAGGCTTTGCGGATCCCCGGAGACCTTC G GGTAGCAACTGTCACCTTGATGCTGGCGATGCTGAGCTCCCTACTGGCTGAGGGCAGAGA CTCTCCCGAGGATTTCGTGTTCCAGTTTAAGGGCATGTGCTACTTCACCAACGGGACGGA GCGCGTGCGTCTTGTGACCAGATACATCTATAACCGAGAGGAGTACGCGCGCTTCGACAG CGACGTGGGGGTGTACCGCGCGGTGACGCCGCAGGGGCGGCCTGATGCCGAGTACTGG AACAGCCAGAAGGAAGTCCTGGAGGGGACCCGGGCGGAGTTGGACACGGTGTGCAGACA CAACTACGAGGTGGCGTTCCGCGGGATCTTGCAGAGGAGAGTGGAGCCCACAGTGACCA TCTCCCCATCCAGGACAGAGGCCCTCAACCACCACAACCTGCTGGTCTGCTCGGTGACAG ATTTCTATCCAGGCCAGATCAAAGTCCGGTGGTTTCGGAATGATCAGGAGGAGACAGCCG GCGTTGTGTCCACCCCCCTTATTAGGAATGGTGACTGGACTTTCCAGATCCTGGTGATGC T GGAAATGACTCCCCAGCGTGGAGATGTCTACACCTGCCACGTGGAGCACCCCAGCCTCCA GAGCCCCATCACCGTGGAGTGGCGGGCTCAGTCTGAATCTGCCCAGAGCAAGATGCTGA GTGGCGTTGGAGGCTTCGTGCTGGGGCTGATCTTCCTTGGGCTGGGCCTTATCATCCGTC AAAGGAGTCAGAAAGGACCTCAAGGGCCTCCACCAGCAGGGCTTCTGCACTGACTCCTGA GACTATTTTAACTAGGATTGGTTATCACTCTTCTGTGATGCCTGCTTATGCCTGCCCAGA AT TCCCAGCTGCCTGTGTCAGCTTGTCCCCCTGAGATCAAAGTCCTACAGTGGCTGTCACGC AGCCACCAGGTCATCTCCTTTCATCCCCACCCCAAGGCGCTGGCTGTGACTCTGCTTCCT GCACTGACCCAGAGCCTCTGCCTGTGCATGGCCAGCTGCGTCTACTCAGGTCCCAAGGG GTTTCTGTTTCTATTCTTTCCTCAGACTGCTCAAGAGAAGCACATGAAAAACATTACCTG AC TTTAGAGCTTTTTTACATAATTAAACATGATCCTGAGTTATCTGTATTCTGAACTTTCTT AATT GAGAAGAGGCAGGAAATCACTGCAGAATGAAGGAACATCCCTTGAGGTGACCCAGCAAAC CTGTGGCCAGAAGGAGGATTGTACCTTGAAAAGACACTGAAAGCATTTTGGGGTGTGAAG T AAGGGTGGGCAGAGGAGGTAGAAAATAATTCAATTGTCGCATCATTCATGGTTCTTTAAT A CTGATGCTCAGTGCATTGGCCTTAGAATATCCCAGCCTCTCTTCTGGTTTGGTGAGTGCT G TGTAAATAAGCATGGTAGAATTGTTTGGAGACATATATAGTGATCCTTGGTCACTGGTGT TT CAAACATTCTGGAAAGTCACATCGATCAAGAATATTTTTTATTTTTAAGAAAGCATAACC AGC AATAAAAATACTATTTTTGAGTCTAAATGA

SEQ ID NO: 40:

MSWKKALRIPGDLRVATVTLMLAMLSSLLAEGRDSPEDFVFQFKGMCYFTNGTERVR LVTRYI YNREEYARFDSDVGVYRAVTPQGRPDAEYWNSQKEVLEGTRAELDTVCRHNYEVAFRGIL QR RVEPTVTISPSRTEALNHHNLLVCSVTDFYPGQIKVRWFRNDQEETAGWSTPLIRNGDWT FQI LVMLEMTPQRGDVYTCHVEHPSLQSPITVEWRAQSESAQSKM LSGVGGFVLGLIFLGLGLIIRQ RSQKGPQGPPPAGLLH

SEQ ID NO: 41 :

GCTGTCGAAGCGCGCGAACTCCTCCCGGTTGTAGATGTATCTCTCCAGGAAGCGCTG TGT CCCATTAAACGCGTAGCATTCCTGCCGTCCCTGGAAAAGTCATCAATTATAGACCCCACA A CATGCGCCCTGAAGACAGAATGTTCCATATCAGAGCTGTGATCTTGAGAGCCCTCTCCTT G GCTTTCCTGCTGAGTCTCCGAGGAGCTGGGGCCATCAAGGCGGACCATGTGTCAACTTAT GCCGCGTTTGTACAGACGCATAGACCAACAGGGGAGTTTATGTTTGAATTTGATGAAGAT G AGATGTTCTATGTGGATCTGGACAAGAAGGAGACCGTCTGGCATCTGGAGGAGTTTGGCC AAGCCTTTTCCTTTGAGGCTCAGGGCGGGCTGGCTAACATTGCTATATTGAACAACAACT T GAATACCTTGATCCAGCGTTCCAACCACACTCAGGCCACCAACGATCCCCCTGAGGTGAC CGTGTTTCCCAAGGAGCCTGTGGAGCTGGGCCAGCCCAACACCCTCATCTGCCACATTGA CAAGTTCTTCCCACCAGTGCTCAACGTCACGTGGCTGTGCAACGGGGAGCTGGTCACTGA GGGTGTCGCTGAGAGCCTCTTCCTGCCCAGAACAGATTACAGCTTCCACAAGTTCCATTA C CTGACCTTTGTGCCCTCAGCAGAGGACTTCTATGACTGCAGGGTGGAGCACTGGGGCTTG GACCAGCCGCTCCTCAAGCACTGGGAGGCCCAAGAGCCAATCCAGATGCCTGAGACAAC GGAGACTGTGCTCTGTGCCCTGGGCCTGGTGCTGGGCCTAGTCGGCATCATCGTGGGCA CCGTCCTCATCATAAAGTCTCTGCGTTCTGGCCATGACCCCCGGGCCCAGGGGACCCTGT GAAATACTGTAAAGGTGACAAAATATCTGAACAGAAGAGGACTTAGGAGAGATCTGAACT C CAGCTGCCCTACAAACTCCATCTCAGCTTTTCTTCTCACTTCATGTGAAAACTACTCCAG TG GCTGACTGAATTGCTGACCCTTCAAGCTCTGTCCTTATCCATTACCTCAAAGCAGTCATT CC TTAGTAAAGTTTCCAACAAATAGAAATTAATGACACTTTGGTAGCACTAATATGGAGATT ATC CTTTCATTGAGCCTTTTATCCTCTGTTCTCCTTTGAAGAACCCCTCACTGTCACCTTCCC GA GAATACCCTAAGACCAATAAATACTTCAGTATTTCAGAGCGGGGAGACTCTGAGTCATTC TT ACTGGAAGTCTAGGACCAGGTCACATGTGAATACTATTTCTTGAAGGTGTGGTTTCAACC T CTGTTGCCGATGTGGTTACTAAAGGTTCTGATCCCACTTGAACGGAAAGGTCTGAGGATA T TGATTCAGTCCTGGGTTTTTCCCTAACTACAGGATAGGGTGGGGTAGAGAAAGGATATTT G GGGGAAATTTTACTTGGATGAAGATTTTCTTGGATGTAGTTTGAAGACTGCAGTGTTTGA AG TCTCTGAGGGAAGAGATTTGGTCTGTCTGGATCAAGATTTCAGGCAGATTAGGATTCCAT T CACAGCCCCTGAGCTTCCTTCCCAAGGCTGTATTGTAATTATAGCAATATTTCATGGAGG AT TTTTCTACATGATAAACTAAGAGCCAAGAAATAAAATTTTTAAAATGCCCTAAAAAAAAA AAA AAAAAA

SEQ ID NO: 42:

MRPEDRMFHIRAVILRALSLAFLLSLRGAGAIKADHVSTYAAFVQTHRPTGEFMFEF DEDEMFY VDLDKKETVWHLEEFGQAFSFEAQGGLANIAILNNNLNTLIQRSNHTQATNDPPEVTVFP KEPV ELGQPNTLICHIDKFFPPVLNVTWLCNGELVTEGVAESLFLPRTDYSFHKFHYLTFVPSA EDFYD CRVEHWGLDQPLLKHWEAQEPIQMPETTETVLCALGLVLGLVGIIVGTVLIIKSLRSGHD PRAQ GTL

SEQ ID NO: 43:

GCTGTCGAAGCGCGCGAACTCCTCCCGGTTGTAGATGTATCTCTCCAGGAAGCGCTG TGT CCCATTAAACGCGTAGCATTCCTGCCGTCCCTGGAAAAGTGCTAGAGGCCCACAGTTTCA GTCTCATCTGCCTCCACTCGGCCTCAGTTCCTCATCACTGTTCCTGTGCTCACAGTCATC A ATTATAGACCCCACAACATGCGCCCTGAAGACAGAATGTTCCATATCAGAGCTGTGATCT T GAGAGCCCTCTCCTTGGCTTTCCTGCTGAGTCTCCGAGGAGCTGGGGCCATCAAGGCGGA CCATGTGTCAACTTATGCCGCGTTTGTACAGACGCATAGACCAACAGGGGAGTTTATGTT T GAATTTGATGAAGATGAGATGTTCTATGTGGATCTGGACAAGAAGGAGACCGTCTGGCAT C TGGAGGAGTTTGGCCAAGCCTTTTCCTTTGAGGCTCAGGGCGGGCTGGCTAACATTGCTA TATTGAACAACAACTTGAATACCTTGATCCAGCGTTCCAACCACACTCAGGCCACCAACG A TCCCCCTGAGGTGACCGTGTTTCCCAAGGAGCCTGTGGAGCTGGGCCAGCCCAACACCCT CATCTGCCACATTGACAAGTTCTTCCCACCAGTGCTCAACGTCACGTGGCTGTGCAACGG GGAGCTGGTCACTGAGGGTGTCGCTGAGAGCCTCTTCCTGCCCAGAACAGATTACAGCTT CCACAAGTTCCATTACCTGACCTTTGTGCCCTCAGCAGAGGACTTCTATGACTGCAGGGT G GAGCACTGGGGCTTGGACCAGCCGCTCCTCAAGCACTGGGAGGCCCAAGAGCCAATCCA GATGCCTGAGACAACGGAGACTGTGCTCTGTGCCCTGGGCCTGGTGCTGGGCCTAGTCG GCATCATCGTGGGCACCGTCCTCATCATAAAGTCTCTGCGTTCTGGCCATGACCCCCGGG CCCAGGGGACCCTGTGAAATACTGTAAAGGTGACAAAATATCTGAACAGAAGAGGACTTA G GAGAGATCTGAACTCCAGCTGCCCTACAAACTCCATCTCAGCTTTTCTTCTCACTTCATG TG AAAACTACTCCAGTGGCTGACTGAATTGCTGACCCTTCAAGCTCTGTCCTTATCCATTAC CT CAAAGCAGTCATTCCTTAGTAAAGTTTCCAACAAATAGAAATTAATGACACTTTGGTAGC AC TAATATGGAGATTATCCTTTCATTGAGCCTTTTATCCTCTGTTCTCCTTTGAAGAACCCC TCA CTGTCACCTTCCCGAGAATACCCTAAGACCAATAAATACTTCAGTATTTCAGAGCGGGGA G ACTCTGAGTCATTCTTACTGGAAGTCTAGGACCAGGTCACATGTGAATACTATTTCTTGA AG GTGTGGTTTCAACCTCTGTTGCCGATGTGGTTACTAAAGGTTCTGATCCCACTTGAACGG A AAGGTCTGAGGATATTGATTCAGTCCTGGGTTTTTCCCTAACTACAGGATAGGGTGGGGT A GAGAAAGGATATTTGGGGGAAATTTTACTTGGATGAAGATTTTCTTGGATGTAGTTTGAA GA CTGCAGTGTTTGAAGTCTCTGAGGGAAGAGATTTGGTCTGTCTGGATCAAGATTTCAGGC A GATTAGGATTCCATTCACAGCCCCTGAGCTTCCTTCCCAAGGCTGTATTGTAATTATAGC AA TATTTCATGGAGGATTTTTCTACATGATAAACTAAGAGCCAAGAAATAAAATTTTTAAAA TGC CCTAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 44:

MRPEDRMFHIRAVILRALSLAFLLSLRGAGAIKADHVSTYAAFVQTHRPTGEFMFEF DEDEMFY VDLDKKETVWHLEEFGQAFSFEAQGGLANIAILNNNLNTLIQRSNHTQATNDPPEVTVFP KEPV ELGQPNTLICHIDKFFPPVLNVTWLCNGELVTEGVAESLFLPRTDYSFHKFHYLTFVPSA EDFYD CRVEHWGLDQPLLKHWEAQEPIQMPETTETVLCALGLVLGLVGIIVGTVLIIKSLRSGHD PRAQ GTL

SEQ ID NO: 45 ATTTCCAGTGCTAGAGGCCCACAGTTTCAGTCTCATCTGCCTCCACTCGGCCTCAGTTCC T CATCACTGTTCCTGTGCTCACAGTCATCAATTATAGACCCCACAACATGCGCCCTGAAGA C AGAATGTTCCATATCAGAGCTGTGATCTTGAGAGCCCTCTCCTTGGCTTTCCTGCTGAGT C TCCGAGGAGCTGGGGCCATCAAGGCGGACCATGTGTCAACTTATGCCGCGTTTGTACAGA CGCATAGACCAACAGGGGAGTTTATGTTTGAATTTGATGAAGATGAGATGTTCTATGTGG A TCTGGACAAGAAGGAGACCGTCTGGCATCTGGAGGAGTTTGGCCAAGCCTTTTCCTTTGA GGCTCAGGGCGGGCTGGCTAACATTGCTATATTGAACAACAACTTGAATACCTTGATCCA G CGTTCCAACCACACTCAGGCCACCAACGATCCCCCTGAGGTGACCGTGTTTCCCAAGGAG CCTGTGGAGCTGGGCCAGCCCAACACCCTCATCTGCCACATTGACAAGTTCTTCCCACCA GTGCTCAACGTCACGTGGCTGTGCAACGGGGAGCTGGTCACTGAGGGTGTCGCTGAGAG CCTCTTCCTGCCCAGAACAGATTACAGCTTCCACAAGTTCCATTACCTGACCTTTGTGCC CT CAGCAGAGGACTTCTATGACTGCAGGGTGGAGCACTGGGGCTTGGACCAGCCGCTCCTC AAGCACTGGGAGGCCCAAGAGCCAATCCAGATGCCTGAGACAACGGAGACTGTGCTCTGT GCCCTGGGCCTGGTGCTGGGCCTAGTCGGCATCATCGTGGGCACCGTCCTCATCATAAAG TCTCTGCGTTCTGGCCATGACCCCCGGGCCCAGGGGACCCTGTGAAATACTGTAAAGGTG ACAAAATATCTGAACAGAAGAGGACTTAGGAGAGATCTGAACTCCAGCTGCCCTACAAAC T CCATCTCAGCTTTTCTTCTCACTTCATGTGAAAACTACTCCAGTGGCTGACTGAATTGCT GA CCCTTCAAGCTCTGTCCTTATCCATTACCTCAAAGCAGTCATTCCTTAGTAAAGTTTCCA AC AAATAGAAATTAATGACACTTTGGTAGCAC

TAATATGGAGATTATCCTTTCATTGAGCCTTTTATCCTCTGTTCTCCTTTGAAGAAC CCCTCA CTGTCACCTTCCCGAGAATACCCTAAGACCAATAAATACTTCAGTATTTCAGAGCGGGGA G ACTCTGAGTCATTCTTACTGGAAGTCTAGGACCAGGTCACATGTGAATACTATTTCTTGA AG GTGTGGTTTCAACCTCTGTTGCCGATGTGGTTACTAAAGGTTCTGATCCCACTTGAACGG A AAGGTCTGAGGATATTGATTCAGTCCTGGGTTTTTCCCTAACTACAGGATAGGGTGGGGT A GAGAAAGGATATTTGGGGGAAATTTTACTTGGATGAAGATTTTCTTGGATGTAGTTTGAA GA CTGCAGTGTTTGAAGTCTCTGAGGGAAGAGATTTGGTCTGTCTGGATCAAGATTTCAGGC A GATTAGGATTCCATTCACAGCCCCTGAGCTTCCTTCCCAAGGCTGTATTGTAATTATAGC AA TATTTCATGGAGGATTTTTCTACATGATAAACTAAGAGCCAAGAAATAAAATTTTTAAAA TGC CCTAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 46:

MRPEDRMFHIRAVILRALSLAFLLSLRGAGAIKADHVSTYAAFVQTHRPTGEFMFEF DEDEMFY VDLDKKETVWHLEEFGQAFSFEAQGGLANIAILNNNLNTLIQRSNHTQATNDPPEVTVFP KEPV ELGQPNTLICHIDKFFPPVLNVTWLCNGELVTEGVAESLFLPRTDYSFHKFHYLTFVPSA EDFYD CRVEHWGLDQPLLKHWEAQEPIQMPETTETVLCALGLVLGLVGIIVGTVLIIKSLRSGHD PRAQ GTL

SEQ ID NO: 47 GTCACAGAAGACTACTTGGGTTCATGGTCTCTAATATTTCAAACAGGAGCTCCCTTTAGC G AGTCCTTCTTTTCCTGACTGCAGCTCTTTTCATTTTGCCATCCTTTTCCAGCTCCATGAT GG TTCTGCAGGTTTCTGCGGCCCCCCGGACAGTGGCTCTGACGGCGTTACTGATGGTGCTGC TCACATCTGTGGTCCAGGGCAGGGCCACTCCAGAGAATTACCTTTTCCAGGGACGGCAGG AATGCTACGCGTTTAATGGGACACAGCGCTTCCTGGAGAGATACATCTACAACCGGGAGG AGTTCGCGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTTCCGGGCGGTGACGGAGCTGGGGCG GCCTGCTGCGGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGACATCCTGGAGGAGAAGCGGGCAGTGC CGGACAGGATGTGCAGACACAACTACGAGCTGGGCGGGCCCATGACCCTGCAGCGCCGA GTCCAGCCTAGGGTGAATGTTTCCCCCTCCAAGAAGGGGCCCTTGCAGCACCACAACCTG CTTGTCTGCCACGTGACGGATTTCTACCCAGGCAGCATTCAAGTCCGATGGTTCCTGAAT G GACAGGAGGAAACAGCTGGGGTCGTGTCCACCAACCTGATCCGTAATGGAGACTGGACCT TCCAGATCCTGGTGATGCTGGAAATGACCCCCCAGCAGGGAGATGTCTACACCTGCCAAG TGGAGCACACCAGCCTGGATAGTCCTGTCACCGTGGAGTGGAAGGCACAGTCTGATTCTG CCCGGAGTAAGACATTGACGGGAGCTGGGGGCTTCGTGCTGGGGCTCATCATCTGTGGA GTGGGCATCTTCATGCACAGGAGGAGCAAGAAAGTTCAACGAGGATCTGCATAAACAGGG TTCCTGAGCTCACTGAAAAGACTATTGTGCCTTAGGAAAAGCATTTGCTGTGTTTCGTTA GC ATCTGGCTCCAGGACAGACCTTCAACTTCCAAATTGGATACTGCTGCCAAGAAGTTGCTC T GAAGTCAGTTTCTATCATTCTGCTCTTTGATTCAAAGCACTGTTTCTCTCACTGGGCCTC CA ACCATGTTCCCTTCTTCTTAGCACCACAAATAATCAAAACCCAACATGACTGTTTGTTTT CCT TTAAAAATATGCACCAAATCATCTCTCATCACTTTTCTCTGAGGGTTTTAGTAGACAGTA GG AGTTAATAAAGAAGTTCATTTTGGTTTAAACATAGGAAAGAAGAGAACCATGAAAATGGG GA TATGTTAACTATTGTATAATGGGGCCTGTTACACATGACACTCTTCTGAATTGACTGTAT TTC AGTGAGCTGCCCCCAAATCAAGTTTAGTGCCCTCATCCATTTATGTCTCAGACCACTATT CT TAACTATTCAATGGTGAGCAGACTGCAAATCTGCCTGATAGGACCCATATTCCCACAGCA C TAATTCAACATATACCTTACTGAGAGCATGTTTTATCATTACCATTAAGAAGTTAAATGA ACA TCAGAATTTAAAATCATAAATATAATCTAATACACTTTAACCATTTTCTTTGTGTGCCAT CACA AATACTCCTTAACCAAATACGGCTTGGACTTTTGAATGCATCCAATAGACGTCATTTGTC GT CTAAGTCTGCATTCATCCACCAGCCTAGGCCTCCTGTCTTAATTTTCATACAGACAGAAA TG ACTCCCCACTGGGGAAAGAGCAAAGCAATACATGTAGCACTCTTTTTCAAACACTGGTCT T TTTTTTTTTCTTAACAATCCAACATTGTTATGTGTTTTGCGTCTCATATTGACACCTTTT GGTC AAGGTAGAGGACATGTTTGTTGTAAGCTTTCTTTTTCGTGTAGAGGATGGATTCTTCACT CC TGATACACACAATCAGTGCACAGCAGCTCTCTTATACATCCAGTTGATGCCTTCAGTCTC CC TGGCTTCTTACAAGCATCTTCTGGGCCTTGTGTGTCCCTGGGCACCTGTCCCTGGTCAAT T CCCGAAAGCTACTGTGCTCCTCTTGCCCATCTCCCCTTGCAAATAATATCTTCCATCGGG G GACCGGCTTCCTCCAATTTCAGGAGAGGTGGGGCTGAAGGCACAGACTTGGGCGTCACTG GCACAGATATAAGTAAATACAGCTGGAGTCTGCAGAGAGGCTGGACTGAGTCAGGGAGTC AGGAAAGAGAAGCCACACACAAGGACAACCAATCATGTTTCTCATAATCTTCTTAACCTA G GGAATAGGACACAATCATTTTTTCTTTTTAAAACATCTTTATCCCTGATCAGCCTCATTT CCT CAAAAACTATAAAGGAAAATGCTGCTGACTTGTTTTTGCGTAGTAATTTCAGCTGTCACA TA ATAAGCTAAGGAAGACAGTATATAGTAAATAAGGACCCTTTATCTGTCTTATTTTCCCTT TTG GCTTCACAGGAAACTTGTGAGAAACCTATGCAGCATAAAATTAATATGATTTCAATCCAG GG ATTCAACGATGGAAGGAGGTCATGAGAATAGCAGAAAGTCTTCAAATCGAGATCATTATG A AATCCTCAGACCCAGAGCACATAAATCCTACCCTCAGAGTCACTGAGCAGTTAACATTAC A AATTACAAACCATATCCAGTCAGAGTCATTCTCTTTCCTGCTTGTCTCCTGTACTCATGT TAC AGGTTAGGGCAGTACCCCGAGTGGAGTGAACAATCTCTGGACTAACACTTGTCAGGATCA GAAGCTGAGGTATCTGCACCCACATTACAGGAACAGGATATGTGCTCCTAGGGAACTGAG GGTGTCAGGAGATGAGGAATGTCCCTGGAGTCACAGAAAGAAGGTATCAGATGTGTCTCA CTCTGACATATGCAGGTGTTTATGAAACTCTGGGATTTCTAAGGAAGGATGCAGTGCAGA G ACAGGTCCCAGAGGAGACAAGAGCTGAGAGACCATCCAAACTGGGACCACCTTGTCACTA GACTTCAAATTTTCAATATTGATAGAGTGTTTTCTAAGAGTCAGGCCCTTTGCTGAGTGC TA TGTGCAGCAGGATCAAAGGCAG

CCAGGAGGTAGAGGAGTCTTGAGGTACATCAGTCATTGGAGTTGAAGAGCAGAGATT CAA AGGAAAGTTGGAACTGGAGCTTTAAAGGAGATGTGAAGTGGGTGACTCAACCTCTGACTC A GAAAAATTGATACCTGCAGAAGAAAAAACCCGGCGGGCTTAGGACTCCCAGCTGAGTGTT GTATCCTCCATCCCTTTCCACCTGGTCCCTTCATTTTCTACCCCTCACAGTTCCCTAACG AG AAGGTGGTCCACCCAACAGACAACACTGCCTCAGATGGTTATCAAGGGGTACCCTAAGAA GAAATCATCTCACCCTCTCTTTGTCCCCATTTGTCAAGTAGCAGTGAGGCCGAGCCAGGG G ATGGTGAAAGTGGAAGGAGGTGGGAGTTGGGCATCGGGTGTGAAGATGCTCTTGAAAGG GGTTTTAATAACCACTTGCTACCAGGCCAGTGAACACTTACCATAGTTGATGCCTTTTGA GC ATGTTGCATTGTAAACTGTCCCTGAAATTACTGTGCACTTGGCTTATGGGATGAAACATC CT CCTAGTTCTTTTGTCTCTCAGCTTCTCTGAAGTCTCATTGAGCACCTTCTCTTCAATTTC TTT TACACAGTAAGAATAGGATCAGCTGTGCTAAACTAACAAATACCCAGATATCCAGGTTTG G CTCATGTTACACGTCCAAAGTAAGTCATGCAGGAAGCTCTGCTCATCATCGTACTCAGGA A GTCAGGCTGACAGTCTTTCTCCTGCACATCTGCTCCCAGAACCTCCCCAGCAGAATGAAG GGAACCTAAGAATTTATTCACTGGCTTTTAATGATCCCTCCTAGAAAGAACACACTTCTC GC ATTTCATTTTCCAATGTAAATCATATGGCTGCAACTAACTTCAAATAAGTGGGAATACTT GAA GGTGGAAAACATTTAAGAAGTACACACTAAATAAATAATAAAATACTTCTACAAGAGA SEQ ID NO: 48:

MMVLQVSAAPRTVALTALLMVLLTSWQGRATPENYLFQGRQECYAFNGTQRFLERYI YNREE FARFDSDVGEFRAVTELGRPAAEYWNSQKDILEEKRAVPDRMCRHNYELGGPMTLQRRVQ P RVNVSPSKKGPLQHHNLLVCHVTDFYPGSIQVRWFLNGQEETAGVVSTNLIRNGDWTFQI LVM LEMTPQQGDVYTCQVEHTSLDSPVTVEWKAQSDSARSKTLTGAGGFVLGLIICGVGIFMH RRS KKVQRGSA En el contexto de la presente invención, los genes HLA-C, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4 y KIR2DS3 se definen también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de las proteínas recogidas respectivamente en la Tabla 1 , siendo dichas proteínas el producto de expresión de cada uno de los genes identificados en la tabla. Adicionalmente la presente invención comprende diversas variantes procedentes de cada una de las secuencias identificadas en la tabla 1 :

En este sentido, variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-C comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 2 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-C. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 1 indicada en la Tabla 1.

Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DL2 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 4 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 4 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR2DL2. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 3 indicada en la Tabla 1.

Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DL3 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 6 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 6 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR2DL3. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 5 indicada en la Tabla 1.

Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DL1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 8 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 8 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR2DL1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 7 indicada en la Tabla 1.

Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DS4 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR2DS4. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 9,

SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13 indicadas en la Tabla 1.

Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DS3 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 16 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un

98% o un 99% con la SEQ I D NO: 16 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR2DS3. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 15 indicada en la Tabla 1. En el contexto de la presente invención, los genes HLA-DQA 1, KIR (KIR2DS1, KIR3DS1 y KIR3DL 1, KIR2DS3), HLA-B y HLA-DQB3 se definen también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de las proteínas recogidas respectivamente en la Tabla 1 , siendo dichas proteínas el producto de expresión de cada uno de los genes identificados en la tabla. Adicionalmente la presente invención comprende diversas variantes procedentes de cada una de las secuencias identificadas en la tabla 1. :

En este sentido, variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-DQA 1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 18 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 18 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-DQA1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 17 indicada en la Tabla 1.

Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DS1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 20 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ I D NO: 20 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR2DS1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 19 indicada en la Tabla 1.

Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR3DS1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 22 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ I D NO: 22 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR3DS1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 21 indicada en la Tabla 1. Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR3DL1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 24 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 24 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR3DL1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 23 indicada en la Tabla 1.

Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-B comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 26 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ I D NO: 26 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-B. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 25 indicada en la Tabla 1.

Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-DQB3 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 28 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 28 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-DQB3. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 27 indicada en la Tabla 1.

Variantes de las secuencias asociadas al gen KIR2DS3 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 16 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 16 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KIR2DS3. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 15 indicada en la Tabla 1.

Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-A comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 32 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 32 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-A. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 33 indicada en la Tabla 1.

Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-C comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 2 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-C. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 1 indicada en la Tabla 1. Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-DRB1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 36 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 36 recogida en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-DRB1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 35 indicada en la Tabla 1. Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-DQB1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de las SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40 recogidas en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con las SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40 recogidas en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-DQB1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en las SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 39 indicadas en la Tabla 1.

Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-DPA 1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de las SEQ ID NO: 42, SEQ I D NO: 44 o SEQ ID NO: 46 recogidas en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con las SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 46 recogidas en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-DPA1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en las SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 45 indicadas en la Tabla 1.

Variantes de las secuencias asociadas al gen HLA-DPB1 comprenden: a) molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoácidica de la SEQ ID NO: 48 recogida en la Tabla 1. b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 48 recogidas en la Tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HLA-DRB1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 47 indicada en la Tabla 1.

USO MÉDICO EN UN GRUPO DE PACIENTES

Los autores de la presente invención han identificado nuevos subgrupos de pacientes que se beneficiarán de determinados tratamientos: Transmisión Vertical del VHC

Así pues, otro aspecto de la invención se refiere a un método para asignar a una madre ARN- VHC (+) a uno de dos grupos, en el que el primer grupo comprende madres identificables por el primer o segundo método de la invención (tienen una probabilidad aproximada 6,2, 3,9, 10,7 ó 6 veces mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia); y en el que el segundo grupo representa el resto de las madres.

Nos referimos a antivirales directos frente al VHC con capacidad de negativizar la viremia del VHC de forma aislada o en asociación de otros antivirales de acción directa que no precisan del interferón o ribavirina, previa autorización tras ensayos clínicos en gestantes en el último trimestre de gestación y/o administración a los recién nacidos en las mismas condiciones previas.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para su uso en el tratamiento de una madre ARN-VHC (+) con probabilidad mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia identificable por el primer o segundo método de la invención, o alternativamente, al uso de una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una madre ARN-VHC (+) con probabilidad mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia identificable por el método de acuerdo con el primer o segundo método de la invención.

Fármacos antivirales que pueden emplearse para el tratamiento de una madre ARN-VHC (+) con una probabilidad mayor de transmitir verticalmente el virus de la hepatitis C son, entre otros, pero sin limitarnos a, interferón pegilado, ribavirina, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, o cualquiera de sus combinaciones.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para asignar a un individuo con una madre ARN-VHC (+) a uno de dos grupos, en el que el primer grupo comprende individuos con una madre ARN-VHC (+) identificables por el tercer o cuarto método de la invención (tienen una probabilidad 3,3, 4,2 ó 14 veces mayor de ser contagiados mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C); y en el que el segundo grupo representa el resto de los individuos con una madre ARN-VHC (+).

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para su uso en el tratamiento de un individuo con una madre ARN-VHC (+) con una probabilidad mayor de ser contagiados mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C identificable por el tercer o cuarto método de la invención, o alternativamente, al uso de una composición farmacéutica que comprende fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo con una madre ARN-VHC (+) con el XXXX probabilidad de ser contagiado mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C identificable por el método de acuerdo con el tercer o cuarto método de la invención.

Fármacos antivirales que pueden emplearse para el tratamiento de un individuo con una madre ARN-VHC (+) con una probabilidad 3 mayor de ser contagiados mediante transmisión vertical por el virus de la hepatitis C son, entre otros, pero sin limitarnos a, interferón pegilado, ribavirina, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, o cualquiera de sus combinaciones.

Otro aspecto de la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante primer microarray de la invención, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o ARNm de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4, KIR2DS3). Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-C y KIR (KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DS4, KIR2DS3) son las secuencias nucleotídicas correspondientes indicadas en la tabla 1.

Otro aspecto de la invención se refiere a un microarray de proteínas, de ahora en adelante primer microarray de proteínas de la invención, que comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. Las sondas son anticuerpos fijados a portaobjetos de vidrio y los blancos son muestras de suero o tejido.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del primer microarray de la invención, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que una madre ARN-VHC (+) transmita verticalmente el virus de la hepatitis C a su descendencia. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del primer microarray de la invención, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de infección mediante transmisión vertical del virus de la hepatitis C de un individuo con una madre ARN-VHC (+).

Cronificación y/o aclaramiento

También se han determinado nuevos subgrupos de pacientes que se beneficiarán de tratamientos asociados a antivirales directos frente al VHC con capacidad de negativizar la viremia del VHC de forma aislada o en asociación de otros antivirales de acción directa que no precisan del interferon o ribavirina, previa autorización tras ensayos clínicos en gestantes en el último trimestre de gestación y/o administración a los recién nacidos en las mismas condiciones previas. Así pues, otro aspecto de la invención se refiere a un método para asignar a un individuo con una madre ARN-VHC (+) a uno de dos grupos, en el que el grupo 1 comprende individuos identificables por el primer o sexto método de la invención (tienen una probabilidad aproximada 2, 7, 13 ó 15,6 veces mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sean contagiados por transmisión vertical); y en el que el grupo 2 representa el resto de individuos. Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para su uso en el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, identificable por el quinto o décimo método de la invención, o alternativamente, al uso de una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, identificable por el método de acuerdo con el quinto o décimo método de la invención. Fármacos antivirales que pueden emplearse para el tratamiento de un individuo con una probabilidad mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical son, entre otros, pero sin limitarnos a, interferón pegilado, ribavirina, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, o cualquiera de sus combinaciones. Así pues, otro aspecto de la invención se refiere a un método para asignar a un individuo con una madre ARN-VHC (+) a uno de dos grupos, en el que el grupo 3 comprende individuos identificables por el séptimo o duodécimo método de la invención (tienen una probabilidad aproximada 12,5 ó 16,7 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sean contagiados por transmisión vertical); y en el que el grupo 4 representa el resto de individuos. Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para su uso en el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor de no aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, identificable por el séptimo o duodécimo método de la invención, o alternativamente, al uso de una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor no aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, identificable por el método de acuerdo con el séptimo o duodécimo método de la invención.

Fármacos antivirales que pueden emplearse para el tratamiento de un individuo con una probabilidad mayor de no aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical son, entre otros, pero sin limitarnos a, interferón pegilado, ribavirina, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, o cualquiera de sus combinaciones.

Así pues, otro aspecto de la invención se refiere a un método para asignar a un individuo con una madre ARN-VHC (+) a uno de dos grupos, en el que el primer grupo comprende individuos identificables por el noveno o decimocuarto método de la invención (tienen una probabilidad aproximada 2 ó 20 veces mayor de aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sean contagiados por transmisión vertical); y en el que el segundo grupo representa el resto de individuos.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para su uso en el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor de no aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, identificable por el séptimo o duodécimo método de la invención, o alternativamente, al uso de una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor no aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical, identificable por el noveno o decimocuarto método de la invención.

Fármacos antivirales que pueden emplearse para el tratamiento de un individuo con una probabilidad mayor de no aclarar el virus de la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical son, entre otros, pero sin limitarnos a, interferón pegilado, ribavirina, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, o cualquiera de sus combinaciones.

Así pues, otro aspecto de la invención se refiere a un método para asignar a un individuo con una madre ARN-VHC (+) a uno de dos grupos, en el que el primer grupo comprende individuos identificables por el undécimo u decimosexto método de la invención (tienen una probabilidad aproximada 3, 1 ,9, ó 1 ,6 veces mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sean contagiados por transmisión vertical); y en el que el segundo grupo representa el resto de individuos.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para su uso en el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical identificable por el undécimo u decimosexto método de la invención, o alternativamente, al uso de una composición farmacéutica que comprende un fármaco antiviral, preferiblemente de acción directa, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo con probabilidad mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical identificable por undécimo u decimosexto método de la invención.

Fármacos antivirales que pueden emplearse para el tratamiento de un individuo con una probabilidad mayor de cronificar la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical son, entre otros, pero sin limitarnos a, interferón pegilado, ribavirina, telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofusbuvir, declatasvir, o cualquiera de sus combinaciones.

Otro aspecto de la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante segundo microarray de la invención, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o ARNm de los genes HLA-DQA01 , KIR2DS1, KIR3DS1, KIR3DL1, HLA-B, HLA-DQB3, KIR2DS3, HLA-A, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB 1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1. Más preferiblemente las secuencias de los genes HLA-DQA01, KIR2DS1, KIR3DS1, KIR3DL1, HLA-B, HLA-DQB3, KIR2DS3, HLA-A, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DPA 1 y HLA-DPB1 son las secuencias nucleotídicas correspondientes indicadas en la tabla 1.

Otro aspecto de la invención se refiere a un microarray de proteínas, de ahora en adelante segundo microarray de proteínas de la invención, que comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 18, SEQ I D NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 36, SEQ I D NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ I D NO: 44, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 48 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. Las sondas son anticuerpos fijados a portaobjetos de vidrio y los blancos son muestras de suero o tejido.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del segundo microarray de la invención, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) cronifique la hepatitis C en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del segundo microarray de la invención, para predecir o pronosticar la probabilidad de que un individuo con una madre ARN-VHC (+) aclare el VHC en el caso que sea contagiado por transmisión vertical.

Implementación de los métodos de la invención

Una vez obtenida la muestra y determinados los genotipos correspondientes, los métodos o procedimientos para la obtención de datos útiles previamente descritos pueden ejecutarse mediante medios informáticos, por lo que la invención también comprende los siguientes aspectos:

El vigesimosexto aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que, una vez tomada la muestra y determinados los correspondientes genotipos, un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.

La invención abarca programas de ordenador que pueden estar en forma de código fuente, de código objeto o en un código intermedio entre código fuente y código objeto, tal como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para usar en la implementación de los procesos de acuerdo con la invención. En particular, los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube que implementen el procedimiento de la invención.

Estos programas pueden estar dispuestos sobre o dentro de un soporte apto para su lectura, en adelante, "medio portador" o "portador". El medio portador puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de portar el programa. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, el medio portador puede estar constituido por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como variante, el medio portador podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa, estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de, los procesos correspondientes.

A modo de ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible. Por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios.

En este sentido, el vigesimoséptimo aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

Finalmente, el vigesimoctavo aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

Transmisión vertical del VHC

PACIENTES Y METODOS

El estudio se realizó en 98 madres ARN-VHC (+) y sus 120 hijos. De los 24 niños infectados: 16 aclararon el virus y 8 presentaron cronificación. Se determinaron los HLA clasel (A, B, Cw), y clasell (DRB1 , DQA1 , DQB1 , DPA1 , DPB1). El valor de p fue corregido por Bonferroni (Pe). También se determinaron 16 los receptores KIRs de las células NK, 14 genes (KIR2DL1 , 2DL2, 2DL3, 2DL4, 2DL5, 3DL1 , 3DL2, 3DL3, 2DS1 , 2DS2, 2DS3, 2DS4, 2DS5 y 3DS1), y 2 psudogenes (KIR2DP1 , 3DP1). Métodos LABType SSO Typing Test y Genotyping PCR kit (One Lambda Inc., Canoga Park, USA), para la tecnología xMAP de Luminex. RESULTADOS

Estudio de la TV: Los niños con KIR2DL3 tienen menor riesgo de infección (OR: 0,07,

P=0,019). La presencia en la madre de Cw*06 (OR: 5,8, P=0,007, Pc=0,07), Cw*0602 (OR:

5,7, P=0,007, Pc=0,08) aumenta el riesgo de infección de su hijo (este caso es únicamente una "tendencia" ya que la Pe no llega a ser menor o igual a 0.05). Por tanto este dato se podría quitar para evitar confusión). Respecto a los ligandos C1 y C2, la presencia de HLA-C1 en las madres y/o en los niños muestran menor riesgo de infección (madres: OR: 0,2, P=0,009, niños: OR: 0,3, P=0,042), mientras que los que tienen el ligando HLA-C2, tienen mayor riesgo de infección (madres: OR: 6,2, P=0,019, niños: 0R:3,3, P=0,042). En el estudio de los fenotipos KIR así como la unión con su ligando, de todas las combinaciones encontradas estadísticamente significativas, hay que resaltar que cuando el KIR está unido al ligando C1 , es protector frente a la TV y si la unión se produce al ligando C2 favorece la TV. En las madres: KIR2DL2/2DL3-C2C2 (OR: 10,7, P=0,045), KIR2DL1-C2 (OR: 6, 1 , P=0,020), KIR2DS4-C2 (OR: 6,2, P=0,019), KIR2DL3-C1 (OR: 0,4, P=0,05). En los niños: KIR2DL2/2DL2 (OR: 14,6, P=0,019), KIR2DL2/2DL3 (OR: 0,4, P=0,049), KIR2DL3/2DL3-C2C2 (OR: 0,2, P=0,009).

- DRB1*04 25 (25) 2(8) 23 (31) 0,2 0,04-0,9 0,040 ns

- DRBT13 35 (35) 13 (54) 22 (29) 2,8 1,1-7,2 0,033 ns

- DQA1*03 24 (24) 2(8) 22 (29) 0,2 0,05-1,0 0,049 ns

Niño (n=99)

- DPB1*02 32 (32) 12 (50) 20 (27) 2,7 1,0-7,0 0,041 ns

KIR Genotyping children, n(%)

KIR2DL3 93 (95) 20 (83) 73 (99) 0,07 0,01-0,6 0,019 —

Tabla 2: Resultados significativos de A elos HLA y Kl para la TV. Corrección por Bonferroni de los HLA. Valores absolutos con porcentajes entre paréntesis. cOR: Relación de probabilidad bruta (Odds crude ratio), Cl: intervalo de confianza, Pe, Corrección de P por Bonferroni, p- valor< 0,05

TRANSMISIÓN VERTICAL (solo madres RNA-VHC(+)

No

KIR/LIGANDS Total Infectados p- infectados cOR Cl

MADRES (n=98) (n=24) valor

(n=74)

- HLA-C1 75 (78) 14 (58) 61 (85) 0,2 0,09-0,7 0,009

- HLA-C2 68 (71) 22 (92) 46 (64) 6,2 1,4-28,6 0,019

- HLA-Cw

- HLA-C1C1 28 (29) 2(8) 26 (36) 0,2 0,04-0,7 0,019

- HLA-C1C2 47 (49) 12 (50) 35 (49) — — ns

- HLA-C2C2 21 (22) 10 (42) 11 (15) 3,9 1,4-11,1 0,009

-2DL2/2DL2-C1C1 2(2) 0(0) 2(3) — — ns

-2DL2/2DL2-C1C2 6(6) 1 (14) 5(7) — — ns

-2DL2/2DL2-C2C2 1 O) 1 (4) 0(0) — — ns

-2DL2/2DL3-C1C1 11 (12) 1 (4) 10 (14) — — ns

-2DL2/2DL3-C1C2 29 (31) 9 (39) 20 (28) — — ns

-2DL2/2DL3-C2C2 4(4) 3 (13) 1 O) 10,7 1,1-108 0,045

-2DL3/2DL3-C1C1 15 (16) 1 (4) 14 (19) — — ns

-2DL3/2DL3-C1C2 11 (12) 1 (4) 10 (14) — — ns

-2DL3/2DL3-C2C2 16 (17) 6 (26) 10 (14) — — ns

-2DL1-C2 67 (71) 22 (92) 45 (64) 6,1 1,3-28,1 0,020

-2DL2-C1 48 (51) 11 (48) 37 (51) — — ns

-2DL3-C1 67 (70) 13 (54) 54 (75) 0,4 0,1-1,0 0,050

con porcentajes entre paréntesis, cOR: Relación de probabilidad bruta (Odds crude ratio), Cl: intervalo de confianza, Pe, Corrección de P por Bonferroni, p-valor< 0,05 MULTIVARIANTE FINAL TV:

Tabla 4. Modelo final de multivariante: Las variables introducidas en el estudio han sido: CV madre en el parto, Genotipo viral, tipo de parto, lactancia y ligando HLA-C1 y C2 de la madre. aOR: Relación de probabilidad ajustada (Adjusted Odds Ratio). Cl: Intervalo de confianza. Grupo de referencia: ligandos HLA, no presencia; CV<600.000 lU/mL, genotipo no-1. La aOR es la probabilidad de que exista TV en presencia del alelo con respecto a la no presencia. P- valor≤0.05.

Se puede concluir que los estudios de factores genéticos de madres y recién nacidos son necesarios para entender los procesos mediante los cuales se producen la TV y las posibilidades de infección crónica en el RN. Es posible afirmar que los ligandos HLA tipo C1 están relacionados con la protección frente a la infección por el virus y los de tipo C2 estarían a favor de la transmisión vertical. Observamos el mismo efecto cuando estos ligandos se unen a los receptores KIR.

Cronificación y aclaramiento del VHC

PACIENTES Y METODOS El estudio se realizó en 98 madres ARN-VHC (+) y sus 120 hijos. De los 24 niños infectados: 16 aclararon el virus y 8 presentaron cronificación. Se determinaron los HLA clasel (A, B, Cw), clasell (DRB1 , DQA1 , DQB1 , DPA1 , DPB1). El valor de p corregido por Bonferroni (Pe) y 16 receptores KIRs de las células NK (KIR2DL1 , 2DL2, 2DL3, 2DL4, 2DL5, 3DL1 , 3DL2, 3DL3, 2DS1 , 2DS2, 2DS3, 2DS4, 2DS5 y 3DS1). Métodos LABType SSO Typing Test y Genotyping PCR kit (One Lambda Inc., Canoga Park, USA), para la tecnología xMAP de Luminex.

RESULTADOS Cronificación: La presencia en la madre de DQA1*01 (RR: 2,1 , P=0,009, Pc=0,036), KIR2DS1 (OR: 7,2, P=0,042), KIR3DS1 (OR: 13, P=0,013) favorece la cronificación de la infección en el niño. La presencia en el niño del alelo DQB1*03 (OR:0,05, P=0,012, Pc=0,048) y del KIR2DS3 (RR:0,5, P=0,013) se relaciona con el aclaramiento viral, así como la homocigosis del KIR3DL1/3DL1 (OR:0,08, P=0,0013) y del ligando HLA-Bw4/Bw4 (OR:0,06, P=0,022), mientras que la unión del KIR3DS1-Bw4 (OR=7,2, P=0,042), KIR2DS1-C2 (OR=7,2, P=0,042) así como la heterocigosis del KIR3DL1/3DS1 (OR: 13, P=0.013), favorecen la cronificación del virus. Concordancia alélica madre/hijo: Al realizar el análisis conjunto de todos los HLA, fue mayor entre los niños con infección crónica que en aquellos que habían aclarado el virus (74% ± 3.8 vs 60% ± 1 ,4, P=0,008). También existe relación con la cronificación cuando agrupamos los alelos en clase I (63% ± 2.7 vs 53% ± 1 ,7, P=0,009) y en clase II (81 % ± 5.8 vs 65% ± 2.6, P=0,024), Cuando analizamos por alelos de forma individual existen diferencias significativas en el HLA-DRB1 (81 % ± 9.1 vs. 56% ± 4.2, P=0,013), y en el HLA-DQA1 (81 % ± 9.1 vs. 59% ± 5.0, P=0,036).

CRONIFICACIÓN

Todos Crónico Aclaramiento

HLA/KIR (n=24) cOR Cl p- Pe

(n=8) (n=16) valor

Tipaje genómico de alta resolución

de HLA

Madre, n(%)

DQA1*0101 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns

DQB1*0604 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns

Hijo, n(%)

B*0801 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns

DRB1*0301 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns

DQA1*0501 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns

DQB1*0201 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns

Tipaje genómicc > de baja

resolución de H _A

Madre, n(%)

DRB1*13 13 (54) 7 (88) 6 (38) 1 1 ,7 1 , 1-1 19,5 0,039 ns

DQA1*01 15 (63) 8 (100) 7 (44) 2, 1 n/a 0,009 0,036

DQB1*06 13 (54) 7 (88) 6 (38) 1 1 ,7 1 , 1-1 19,5 0,039 ns

Hijo, n(%)

B*08 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns

DRB1*03 3 (13) 3 (38) 0 (0) 4,2 n/a 0,028 ns

DRB1*04 6 (25) 0 (0) 6 (38) 0,6 n/a 0,06 ns

DQA1*03 6 (25) 0 (0) 6 (38) 0,6 n/a 0,06 ns

DQB1*03 13 (54) 1 (13) 12 (75) 0,05 0,004-0,5 0,012 0,048

Genotipado KIR

Madre, n(%)

KIR2DS1 8 (33) 5 (63) 3 (18) 7.2 1.1-48.5 0,042 — KIR3DS1 9 (38) 6 (75) 3 (19) 13.0 1.7-99.4 0,013 —

Hijo, n(%)

KIR2DS3 7 (29) 0 (0) 7 (44) 0.5** n/a 0,054 —

Tabla 5. Alelos HLA y Kl R "solos" relacionados con la cronificacion de la enfermedad.

Valores absolutos con porcentajes entre paréntesis. cOR: Relación de probabilidad bruta (Odds crude ratio), Cl: intervalo de confianza, Pe, Corrección de P por Bonferroni, p-valor< 0,05

Tabla 6. Ligandos HLA-Bw y su unión a los receptores KIR "relacionados con la cronificacion de la enfermedad.Valores absolutos con porcentajes entre paréntesis. cOR: Relación de probabilidad bruta (Odds crude ratio), Cl: intervalo de confianza, Pe, Corrección de P por Bonferroni, p-valor< 0,05

CRONIFICACION

% Concordancia Crónico

Aclaramiento(n=16) p-valor

alélica madre/hijo (n=8)

Tipaje genómico de baja resolución de HLA

TODOS LOS HLA 74 ± 3,8 60 ± 1 ,4 0,008

HLA CLASE 1 63 ± 2,7 53 ± 1 ,7 0,009

HLA CLASE II 81 ± 5,8 65 ± 2,6 0,024

HLA-A 56 ± 6,3 50 ± 0,0 ns

HLA-B 63 ± 8,2 56 ± 4,2 ns

HLA-Cw 69 ± 9, 1 53 ± 3, 1 0,058

HLA-DRB1 81 ± 9, 1 56 ± 4,2 0,013

HLA-DQA1 81 ± 9, 1 59 ± 5,0 0,036

HLA-DQB1 69 ± 9, 1 59 ± 5,0 ns

HLA-DPA1 100 ± 0,0 84 ± 5,9 0,082

HLA-DPB1 75 ± 9,4 67 ± 6,3 ns

KIR 84 ± 4,0 85 ± 3,5 ns

Tabla 7. Porcentajes de las concordancias alélicas madre/hijo para la cronificación

Se ha realizado el análisis mediante curvas de rendimiento diagnóstico (ROC) para estas concordancias alélicas obteniendo los siguientes resultados (ver figura 1).

En la figura 1 se observan las siguientes áreas bajo la curva: 1.- Porcentaje HLA-Todos: 0,828

2. - Porcentaje HLA-clase I: 0,781

3. - Porcentaje HLA-clase II: 0,781

Si se considera la concordancia alélica como un test diagnóstico para la cronificación del VHC en el niño, se puede decir que la determinación de la misma teniendo en cuenta Todos los HLA es una buena prueba diagnóstica, según los datos, ya que realizando la curva ROC, se obtiene un área bajo la curva de 0,828. El mejor punto de corte es 65,6% que corresponde a la concordancia alélica. La sensibilidad obtenida es del 75% y la especificidad del 87%. VPP=74% y VPN=87%.

Por tanto para el total de Todos los HLA, podemos decir que para el 100% de niños infectados, cuya concordancia alélica con su madre sea mayor al 65,6%, el 74% de ellos va a cronificar la enfermedad.

Para los HLA clase I, del 100% de niños infectados cuya concordancia alélica con su madre sea mayor al 58.4%, el 65% de ellos va a cronificar la enfermedad.

En el caso de los HLA clase II, del 100% de niños infectados cuya concordancia alélica con su madre sea mayor al 75%, el 62% de ellos va a cronificar la enfermedad.

El mejor test en este caso sería por tanto el que engloba al total de alelos HLA. % Concordancia alélica madre/hijo para la cronificación

Area bajo Punto de

Test diagnostico Sensibilidad Especificidad VPP VPN la curva corte

Todos los HLA 0,828 65,60% 75% 87% 74% 87%

HLA clase 1 0,78 58,40% 75% 81 % 65% 87%

HLA clase II 0,78 75% 62,50% 81 % 62% 82%

Tabla 8. Tabla de datos procedentes de las curvas ROC Para el estudio de test diagnóstico de alelos individuales, debido a que el hijo puede tener únicamente un 50% de concordancia con la madre o un 100%, se considera un test positivo cuando la concordancia es del 100% y un test negativo cuando es del 50%. En este caso no podemos realizar curvas ROC porque tenemos dos variables cualitativas debido a que solo podemos tener dos situaciones: 100% o 50% de concordancia (puesto que cada individuo solo tenemos dos alelos de cada tipo). Hemos considerado una condordancia del 100% para un test positivo y una concordancia del 50% para un test negativo. La sensibilidad y la especificidad se calcularán a partir de las tablas de contingencia.

Tabla 9. Test diagnóstico para alelos individuales significativos

Por tanto (tabla 9) para el HLA-DRB1 , del 100% de niños infectados, cuya concordancia alélica con su madre sea del 100%, el 71 % va a cronificar la enfermedad Para el HLA-DQA1 , del 100% de niños infectados, cuya concordancia alélica con su madre sea del 100%, el 62% va a cronificar la enfermedad

Por tanto, los estudios de factores genéticos de madres y recién nacidos son necesarios para entender los procesos mediante los cuales se producen la TV y las posibilidades de infección crónica en el RN. Los ligandos HLA-Bw estarán relacionados con la cronificación del virus de la hepatitis C en niños. Además se puede afirmar que el porcentaje de concordancia alélica entre madre/hijo es vital para conocer la evolución de la enfermedad en el niño, mientras que este factor no tiene ninguna relación con la transmisión vertical del virus.