CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra en el campo de la biotecnología, particularmente en procesos de obtención efe extractos a partir de células vegetases y a sus composiciones agroquimicas para el control de plagas. DESCRIPCIÓN DEL ESTADO DE LA TECNICA

Entre los agentes más estudiados para el contral de poblaciones de insectos se encuentran los limonoides producidos por el árboi de Neem (Azadirachta indica), originario de India y Pakistán. Este tipo de compuestos se consideran ambientalmente amigables y tienen efecto antialimentario en muchas especies de insectos plagas y sobre algunas bacterias gram positivas, nemátodos, moluscos y hongos nocivos, incluyendo especies de Aspergilius sp. productores de aflatoxinas. La producción de biocompuestos con base en limonoidas se puede realizar por un proceso de extracción a partir de las semílías del árbol de Neem (Azadirachta indica), el cual no genera heterogeneidad en el contenido de limonoides debido a variaciones genéticas, climáticas y geográficas (Sidhu, Kumar, & Behl, 2003). Es por ello que se han diseñado procesos cíe obtención a escaía de biorreactores a partir de cultivos in vitro de células y de raices peludas (hairy roots) de Neem (Azadirachta indica).

El empleo de raices peludas de Neem para producir limonoides trae consigo muchas dificultades en el escalado e industrialización, en tanto que el uso de células en suspensión permite desarrollar procesos en biorreactores con condiciones específicas de mezclado, aireación, formación de aglomerados, y en general, condiciones más apropiadas para el escalado (Prakash & Srivastava, 2007).

Para incrementar la producción de las células en suspensión, se han optimizado variables como la composición del medio de cultivo, la modificación de ios requisitos nutricionales de las células y el suministro de precursores y elicitores que mejoren el crecimiento celular y la producción de metabolitos secundarios (Linden, Haigh, Mirjalili, & Phisaphalong, 2001).

Uno de los compuestos limonoides más estudiados, la azadiractina, se obtiene principalmente de las semillas del árbol de Neem (Azadirachta indica). La Azadiractina tiene un alto vaior agregado y se utiliza comercialmente como un agente para el control de poblaciones de insectos de amplio espectro. Desde su descubrimiento, las investigaciones se han centrado en su actividad y en procesos para aumentar su producción (Srivastava & Srivastava, 2013) (Singh & Chaturvedi, 2013). Sin embargo, azadiractina no es el único limonoide identificado en Neem, otros limonoides relacionados como nimbin. salannina, isonimbinolide, entre otros, también presentan una actividad significativa contra varias especies de insectos (Simmonds, Jarvis, Johnson, Jones, & Morgan, 2004). El documento IN00148DE2010A describe un procedimiento para transformar células de Neem y formar raices peludas. El documento divulga los medios de crecimiento y las características técnicas para la producción de azadiractina. El documento CN103493844A ilustra un procedimiento para la producción de células mutantes de Neem, los medios para el cultivo de callos y células en suspensión y la producción de azadiractina, asi como los detalles de la liofilización y extracción con solventes a nivel de laboratorio para el análisis de la azadiractina.

Si bien en el estado de la técnica se encuentran divulgados varios procesos para obtener compuestos biocidas a partir del árbol de Neem, es necesario el desarrollo de procesos que optimicen la producción de extractos y metabolitos activos que sean fácilmente escalables a nivel industrial y que no generen prácticas destructivas como tala de árboles y deforestación. Asimismo, es necesario desarrollar formulaciones a partir de dichos extractos para usarlos en agricultura como agentes controladores de insectos y otras plagas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION

La invención se refiere a un proceso para obtener un extracto a partir de un cultivo de células de Neem (Azadirachta indica) en suspensión y composiciones agroquimicas que comprenden dicho extracto. El proceso involucra el cultivo de las células y su posterior extracción con solventes y/o resinas de adsorción. El extracto obtenido comprende compuestos activos tales como azadiractinas y terpenoides, los cuates pueden ser empleados para el control de plagas en diversos cultivos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Diagrama del proceso para la producción y separación de limonoides a partir de células de Neem (basado en vaporización de agua y extracción con etanol).

FIG. 2, Diagrama del proceso para la producción y separación de limonoides a partir de células de Neem (basado en resinas de adsorción y extracción con etanol).

FIG, 3. Gráfica de la cinética de producción de células de Neem utilizando el medio MS y el medio de propagación de células (MS modificado) en un biorreactor de tanque agitado. FiG, 4. Gráficas de la cinética de producción de biomasa viable (células vivas}, biomasa no viable (células muertas), limonoides (extracto) y consumo de azúcar en un cultivo de células de Neem en un biorreactor de tanque agitado. (4A) Etapa 1 : cultivo en el medio de propagación de células - MS modificado. (4B) Etapa 2: cultivo en el medio de producción.

FIG. 5. Gráfica de Concentración vs Tiempo del extracto metanólico obtenido en el cultivo de células de Neem en un biorreactor de tanque agitado con el medio de producción de limonoides (puntos claros). Puntos negros representan el extracto en un medio MS de referencia.

FSG. 6. Prueba de bioactividad de los extractos obtenidos en los cultivos de células de Neem en matraz Eríenmeyer y en biorreactor de tanque agitado. (6A) Fotografía de las hojas afectadas sin el extracto. (6B) Gráfica del porcentaje de índice antialimentario.

FSG, 7. Gráfica de la concentración del extracto etanólico obtenido a partir de cultivos de células de Neem utilizando el proceso de extracción 1 (vaporización con agua + extracción etanólica) y el proceso de extracción 2 (resinas XAD + extracción etanólica). FIG. 8, Fotografía del ensayo de evaluación de la efectividad de la Composición A bajo condiciones de laboratorio. Ensayo de escogencia sobre discos de maíz con larvas de Spodoptera frugiperda o gusano cogollero del maíz. FSG. 9. Gráfica de la efectividad de la Composición A sobre larvas de Spodoptera frugiperda a nivel de laboratorio. A) Porcentaje de área foliar afectada. B) Efecto anfíalimentario.

Los tratamientos con tetras iguales no presentan diferencias significativas de acuerdo con el test LSD de Físher. El efecto antiaiimentarío del insecticida químico es igual cero (0) debido a que las larvas se mueren dentro de la caja de Petri, sin alimentarse del tratamiento control (disco de hoja sin insecticida).

FIG. 10, Gráfica del porcentaje de área foliar afectada de la Composición A a nivel de campo. Los porcentajes de área foliar afectada de los tratamientos con letras iguales no presentan diferencias significativas de acuerdo con el test LSD de Fisher.

FIG. 11. Fotografía del grado de afectación de las hojas de maiz por Spodoptera frugiperda en un bioensayo en el campo con la Composición A. a) Insecticida químico comercial, b) Agua, c) Emulsión base. d) Extracto, e) Composición A.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Ei proceso involucra, como etapa inicial, el cultivo en condiciones in vito de las células de hojas o semillas de Neem (Azadirachta indica) en un medio de cultivo adecuado supíementado y con condiciones de crecimiento específicas, de forma tai que las células crezcan en forma desdiferenciada y formen los callos después de varias semanas, lo que para efectos del proceso de la invención se denomina etapa de propagación. Las células obtenidas pueden disgregarse mediante agitación para obtener un cultivo de células en suspensión, cuya viabilidad se puede verificar empleando un colorante de exclusión (v.g. Azul de Evans).

Eí cultivo de células en suspensión se somete a un estrés celular bajo condiciones que favorecen la producción de metabolitos activos, y posteriormente estos metabofitos son extraídos por procesos que involucran centrifugación, lisis, filtración de la biomasa y extracción con solventes. Como resultado, se obtiene un extracto de Neem (Azadirachta indica) que puede ser utilizado en formulaciones agroquimicas como agentes controladores de poblaciones de insectos plagas.

La etapa de cultivo se puede realizar en un contenedor apropiado y emplear un medio de cultivo con sales de Murashigue y Skook, MS (composición comercial), supíementado con sacarosa, ácido indo! butírico (IBA) y benzil amina purina (BAP), y propiciar condiciones adecuadas de agitación, pH, temperatura y ausencia de luz. En una modalidad preferida del proceso de la invención, ía etapa de cultivo se lleva a cabo en un biorreactor con medio MS supíementado, agitación entre 100 y 150 rpm, pH entre 5,0 y 6,0, temperatura entre 20°C y 35°C con ausencia de luz.

En !a etapa de propagación, las células son expuestas a un segundo medio de cultivo con sales de Murashigue y Skook, MS, caracterizado por tener MSx1.5 supíementado con sacarosa, ácido indolbutírico. bencilarninopurina y acetato de sodio. Se adecuan las condiciones de pH, temperatura, oxígeno disuelto, agitación y ausencia de luz para favorecer ¡a propagación celular. En una modalidad preferida, la etapa de propagación se lleva a cabo en un biorreactor con un medio MSx1.5 suplementado, pH entre 5,0 y 7,0, en oscuridad, agitación entre 100 y 120 rpm y con control de oxígeno entre 20 y 40%. Los cultivos de células vegetales en suspensión obtenidas en la etapa de propagación tienen un contenido de agua entre el 90 y 95%. Alternativamente y para disminuir los costos asociados a la vaporización del agua, el medio de cultivo con células de la etapa de propagación puede concentrarse mediante centrifugación y las células someterse a lisis celular mediante disrupción mecánica.

La biomasa seca obtenida se somete a lisis celular con un sistema de disrupción celular y posteriormente se realiza la extracción con un solvente orgánico seleccionado de metano!, etanol, isopropanol, cloroformo y mezclas de los mismos, dependiendo de la polaridad del extracto que se desea obtener. Previo a la producción y extracción de los compuestos bioactivos con solventes orgánicos, las células pueden centrifugarse y luego la biomasa se puede liofilszar en condiciones de vacío y a temperaturas inferiores a 40'C.

Los residuos celulares se filtran y el liquido se hace pasar por una resina polimérica de adsorción, preferiblemente una resina tipo Amberlite XAD-7HP. Posteriormente y para separar los metabolitos activos adsorbidos por la resina, se realiza una extracción con solventes orgánicos seleccionados de metano!, etanol, isopropanol, cloroformo y mezclas de los mismos, siendo el etanol el más preferido.

Los residuos celulares o torta de filtración resultantes de la etapa anterior pueden ser también sometidos a extracción con solventes, preferiblemente con el mismo solvente, para garantizar una total extracción de ios metaboütos activos producidos. Las dos corrientes de etanol resultantes de esta etapa del proceso, se concentran a baja presión y temperaturas entre 30 y 40°C para obtener el extracto concentrado que contiene los metabolitos activos.

Posterior a la extracción y concentración de los meíabolitos, éstos se pueden identificar mediante técnicas como cromatografía. Se puede detectar la presencia de ácidos grasos, fitoesteroles, triterpenos, azadiracíinas, limonoides y oíros terpenoides en el extracto resultante del proceso. La Tabla 1 presenta las fracciones obtenidas a partir del extracto y Sos posibles compuestos químicos presentes en cada fracción. A medida que se desciende en la Tabla, aumenta la polaridad de los compuestos presentes en cada fracción, iniciando con compuestos poco polares (solubles en 95:5 v/v hexano/acetato de etilo), como los ácidos grasos, y finalizando con compuestos polares (solubles en metanol) que podrían incluir terpenoides altamente oxigenados.

Tabla 1. Fracciones químicas separadas del extracto obtenido. a partir de cultivos de células de Neem

Mediante resonancia magnética nuclear (RMN) se identificó además la presencia de estigmasterol y α-sitosterol. Los análisis por HPLC permitieron confirmar la presencia de azadiractina en el extracto, aunque no es su principal compuesto. Mediante HPLC acoplada a espectrometría de masas (HPLC-MS), se identificaron en el extracto diferentes iones moleculares, que permiten presumir que existen los terpenoides y limonoides presentados en la Tabla 2. Tabla 2. Compuestos presentes en cultivos de células de Aleen? según las masas de los iones obtenidos por HPLC-MS.

ND. No disponible. Aza, Isómeros de azadiractina. C1 , C2, compuestos 1 y 2 observados en espectro de Aza. Exp, Vaior experimental. (*) Masa del compuesto obtenida mediante la expresión "masa del compuesto = masa del ión + 17".

Con el extracto obtenido según el proceso de la invención, se pueden diseñar composiciones agroquimicas (v.g. soluciones, emulsiones, suspensiones y granulados solubles) mediante la adición de aditivos, coadyuvantes y vehículos agroquímicamente aceptables, considerando para ello las propiedades fisicoquímicas de cada uno de ellos, tales como solubilidad y polaridad. Las composiciones agroquimicas pueden aplicadas bien sea solas o junto con otros agentes biocidas para el control de poblaciones de insectos. La presente invención será presentada en detalle a través de los siguientes Ejemplos, ¡os cuales son suministrados solamente con propósitos ilustrativos y no con el objetivo de limitar su alcance.

EJEMPLOS.

EJEMPLO 1. Establecimiento del cultivo in vitro y cultivo de las células de Neem

Un medio con sales de Murashigue y Skook, MS (composición comercial), sacarosa 30g/L, ácido indol butírico (IBA) 4 mg/l, benzil amino purina (BAP) 1 mg/l, pH 5,8, Phytagel 2g/l, 25ºC, en condiciones de oscuridad, permite la obtención de los callos en periodos entre 2 y 4 meses. A su vez, estos callos pueden adicionarse a medios líquidos sin el agente gelificante, conteniendo las sales MS, sacarosa, con ¡os reguladores IBA y BAP definidos anteriormente.

Mediante agitación entre 100 y 120 rpm, 28ºC y oscuridad, se disgregan las células y se obtiene el cultivo de células en suspensión después de varias semanas. La viabilidad de las células puede verificarse periódicamente utilizando un colorante de exclusión como el azul de Evans.

EJEMPLO 2. Propagación de las células de Neem Se empleó un medio con 6,6 g/L de sales de Murashigue y Skook, MS, sacarosa 45 g/L, ácido indoi butírico (IBA) 4 mg/l, benzii amino purina (BAP) 1 mg/l, pH 5,8, acetato de sodio 0,1 g/L, 25°C, en oscuridad, para permitir un mayor crecimiento de las células (FIG. 3). C.S. corresponde a las células secas. A nivel de matraces las células pueden cultivarse a 100 - 120 rpm en oscuridad o luz. A nivel de biorreactor de tanque agitado, estas pueden cultivarse con velocidades de 200 a 450 rpm - dependiendo del impulsor utilizado y con control de oxigeno entre 20 y 40 %.

EJEMPLO 3. Producción de metabolitos activos

Se acondicionó un biorreactor con un filtro interno para retener las células obtenidas según el Ejemplo 2, de forma tal que se retiró más del 50 % del medio de cultivo agotado, concentrando asi las células en su interior. Luego, se realizó una segunda etapa llenando nuevamente el reactor con un medio de cultivo modificado que contiene sales inorgánicas, sacarosa 40 - 60 g/l, ácido salicíllco 137,3 mg/l, ácido jasmónico 2,9 mg/l, quitosano 18,5 mg/l, pH 5,8, con velocidad de 200 a 450 rpm y con control de oxígeno entre 80 y 90 %. Utilizando las condiciones indicadas en el Ejemplo 2 se incrementó la producción de compuestos bioactivos, tal como se muestra en la FIG. 4 (cinética en el medio de propagación de células y en el medio de producción) y FIG 5 (cinética completa de producción del extracto en el cultivo en dos etapas). Además, se conservaron las propiedades bioactivas del extracto cuando se escaló el proceso a un biorreactor de tanque agitado (FIG. 6).

EJEMPLO 4. Extracción y purificación parcial del extracto

Se tomó 1 Litro de suspensión de células de Neem, obtenidas según el Ejemplo 2, con una concentración de 12 - 15 g células secas/L. Estas células se filtraron y liofilizaron. La biomasa seca se lisó mecánicamente y se extrajo 3 veces con etanoi. E! solvente se evaporizó hasta sequedad para obtener el extracto del proceso de vaporización agua + extracción.

Paralelamente se tomó 1 Litro de la misma suspensión de células de Neern, la biomasa se lisó mecánicamente y luego se filtró. El liquido filtrado se hace pasar por un lecho de adsorción que contiene 100 g de resina Amberlite XAD-7HP y luego la resina se desorbió con etanoi. La biomasa filtrada se desorbió a su vez con etanoi. Las dos soluciones de etanoi obtenidas se evaporaron hasta sequedad para obtener así el extracto con los compuestos bioactivos del proceso resina + extracción, En cada caso se obtuvieron entre 8,3 y 6,8 g de extracto. Aunque no hay diferencias significativas en la cantidad obtenida entre ambos procesos, el proceso resina + extracción es más eficiente por no requerir de vaporización del agua (FIG. 7). EJEMPLO 5. Composiciones Agroquímicas del Extracto da Neem

A partir del Extracto obtenido según el Ejemplo 4, se prepararon composiciones agroquímicas tipo emulsión. En la Tabla 3 se describe la composición A, que incluye como aditivos compuestos químicos comerciales. La Tabla 4, describe la Composición B que incluye aditivos compuestos orgánicos menos tóxicos y amigables con el medio ambiente. Tabla 3. Composición A

Para obtener la Composición A, se mezclan el extracto, los protectores del extracto (fotoprotector, estabilizadores) con el aceite, dado el carácter hidrofóbico de los mismos. Una vez disueltos los componentes, se agrega el tensoactivo a la fase oleosa y se agita la mezcla. Lentamente, se adiciona agua a la preparación anterior, agitando constantemente hasta obtener una emulsión del tipo aceite/agua. Este procedimiento se conoce como método de inversión de fases (Adamson y Gast, 1997).

Para la agitación de las emulsiones, se empleó una batidora o mezcladora de inmersión operada a la velocidad mínima. Para obtener la Composición B, se mezclan el extracto con el aceite y luego se agrega el tensoactivo a la fase oleosa y se agita la mezcla. Por separado, se mezcla el agua con el fotoprotector y estabilizador correspondiente. Lentamente se incorpora la fase acuosa a la fase oleosa, agitando constantemente hasta obtener una emulsión. Las composiciones A y B pueden diluirse unas 50 veces con agua para aplicaciones en e\ campo, dependiendo del cultivo y las plagas a controlar (Tablas 5 y 8),

Tabla 5. Composición A diluida

Al efectuar la aplicación en campo de las composiciones A y B, se puede agregar un adherente foliar (v.g, INEX-A®) para aumentar la adherencia foliar de la composición. Se recomienda seguir las recomendaciones de uso del producto comercial.

EJEHPLO 8, Evaluación del efecto biocida de ¡as Composiciones Agroquimicas

Para evaluar el efecto de las composiciones obtenidas según el Ejemplo 5, se emplearon larvas del segundo instar de Spodoptera frugiperda sometidas a 6 horas de ayuno antes de los experimentos. El montaje consistió en una caja de Petri plástica de 5 cm de diámetro con una película de agar-agar en su interior. Sobre el agar se dispuso dos discos de hoja de maiz de 1 ,5 cm de diámetro, de los cuales, uno se impregnaron con el tratamiento y el otro actúa como control. Además de los discos, sobre el agar se depositó una larva de S. frugiperda del segundo instar (F!G 8),

La efectividad de los tratamientos se evaluó a las 98 horas, determinando su índice antialimentario y el porcentaje de área foliar afectada en los discos de hoja de maíz (Capataz-Tafur, Orozco-Sánchez, Vergara-Ruiz, & Hoyos-Sánchez, 2007). El índice antialimentario (E.A.A) se calculó con la fórmula propuesta por Kerney el al, (Keamey, Allan, Hooker, & Mordue (Luntz), 1994)

Para determinar el área consumida en los discos de hoja, se tomaron fotografías del experimento y se analizaron con ef programa !mage J 1.44 (FIG. 9).

Para ios bioensayos en el campo se preparó un terreno mediante arado de cincel y grada rotativa para pulirlo, dependiendo de las características del suelo. Para cultivos de maíz, por sitio se deposita una semilla de la variedad ICA V109 a una distancia de 0,80 metros entre surcos y 0,12 metros entre plantas.

La resiembra se puede llevar a cabo una semana después de la siembra. Al cabo de ocho días de la emergencia del maiz, se ralea el cultivo dejando aproximadamente 4 plantas por metro lineal. Las formulaciones diluidas se pueden aplicar semanalmente, dependiendo también de ías condiciones ambientales y del cultivo. Puede hacerse seguimiento del área follar afectada, del estado fisiológico de !as plantas y la cantidad de maíz colectado al final de la cosecha.

EJEMPLO 7, Bioensayos con fas formulaciones a nivel de campo

Las Composiciones A y B del Ejemplo 5 se evaluaron sobre cultivos de maiz sembrados en el Centro Agropecuario Cotové de la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellin. La zona de vida del lugar es la del bosque seco tropical (bs-T), el cual está ubicado a una altura aproximada de 540 m.s.n.m., precipitación anual promedio de 1031 mm y temperatura promedio entre 23°C y 33°C.

ES terreno fue sometido previamente a un arado de cincel y grada rotativa para pulirlo. La siembra se realizó empleando una sembradora Super Tatu modelo PS0T2. Por sitio se depositó una semilla de la variedad fCA V109 a una distancia de 0,80 metros entre surcos y 0,12 metros entre plantas.

La resiembra se llevó a cabo manualmente una semana después de la siembra. Al cabo de ocho días de la emergencia del maíz, se raleó el cultivo dejando aproximadamente 4 plantas por metro lineal. Dadas las continuas lluvias que tuvieron lugar durante el experimento, no fue necesaria la instalación de ningún sistema artificial de riego. El terreno fue dividido en tres bloques de 60 m ² para un total de 180m ² tratados y evaluados, aunque en total se sembraron 550m ² . A su vez, los bloques fueron fraccionados en 15 espacios de 4 m ² y en cada uno se hizo la aplicación de un tratamiento.

Una vez por semana se aplicaron 150 mL de las composiciones A y B diluidas. Para mejorar su adherencia a las hojas, los tratamientos administrados se mezclados con INEX-A®. El proceso de aplicación inició 20 días después de la emergencia de las plantas y tuvo una duración de 15 días. La aspersión se realizó con una aspersora ROYAL CARDEN CONDOR de 1 ,8 L de boquilla ajustable con orificio 200/mm.

Para la evaluación a las 96 horas después de la última aplicación, se tomaron al azar tres hojas de la planta seleccionada. Con el fin de eliminar los efectos de borde que pudieran generarse, la unidad elegida correspondía a la planta sembrada en el centro de las subdivisiones de 4m ² . En cada caso se tomó una fotografía para determinar el área consumida por los insectos (mediante el uso del programa Image J 1.44) y de ésta forma se pudo calcular el porcentaje de área foliar afectada (FIG. 10 y FIG. 11).

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