Procédé d'obtention d'extraits d'algues marines

La présente invention concerne un procédé de fractionnement d'algues marines en ses différents compartiments biochimiques.

Les algues marines contiennent des composés actifs comme des sucres, des acides aminés, des polysaccharides de réserve et pariétaux, des métabolites secondaires comme les polyphénols, des lipides. Ces composés peuvent être utilisés comme principes actifs pour la fabrication de préparations cosmétiques. Pour cela, il est nécessaire de développer des méthodes efficaces qui permettent d'extraire le principe actif sélectivement dans des conditions optimisées, c'est-à- dire sans perte de l'efficacité de la molécule active et avec des rendements acceptables pour une exploitation à l'échelle industrielle.

On connaît des procédés d'extraction, tels que celui décrit dans le document FR 2 946 878, permettant l'obtention d'un extrait d'algue par un procédé mettant en œuvre une extraction aqueuse ou hydro glycérinée avec un chauffage maintenu pendant une durée inférieure à deux heures. Il est possible d'obtenir un extrait par cette méthode, cependant il n'est pas mentionné la valorisation des co-produits d'extraction qui peuvent contenir des principes actifs et qu'il serait intéressant de valoriser aux fins de préparation des compositions cosmétiques, voire thérapeutiques. En outre, un tel procédé d'extraction aqueuse permet de n'avoir accès qu'à un extrait cytoplasmique ne contenant que les composés hydrosolubles de bas poids moléculaires et ne donne pas accès à d'autres types d'extraits aux fins de valoriser toutes les substances actives de l'algue. Pour pallier aux déficiences de l'état de l'art et permettre d'obtenir des extraits contenant une plus grande diversité de principes actifs à partir d'algues dans de bonnes conditions, la présente invention a pour objet un procédé de fractionnement d'une suspension aqueuse d'algue marine, comprenant les étapes successives consistant à :

a) découper ladite algue après récolte et séchage; b) ajouter 30 à 98 % en masse d'eau ;

c) ajouter une base pour ajuster le pH de la solution entre 7 et 10 ;

porter le mélange obtenu à l'étape c) à une température de 60°C à 80°C ;

e) ajouter une protéase et laisser agir sous agitation pendant au moins 2 heures en régulant le pH entre 7 et 10 ;

f) abaisser la température du mélange en dessous de 45°C ; g) acidifier tel que le mélange ait un pH de 1 .5 à 2.5 ; et h) récupérer la pâte obtenue par décantation et filtration, et collecter le filtrat.

Les pourcentages massiques sont exprimés par rapport à la masse totale du mélange obtenu comprenant l'algue sèche. Alternativement on peut utiliser une algue réduite en poudre.

Avantageusement le pH est de 7.5 et 10, voire il est maintenu entre 7.5 et 8.5, idéalement à 8, pendant les étapes c) à f). A l'étape f), la température est avantageusement abaissée en dessous de

40°C.

Les inventeurs ont mis en évidence que l'action d'une protéase sur une suspension aqueuse dans laquelle on a préalablement dispersé une matière composée d'au moins une algue marine, permettait d'obtenir non seulement un extrait enzymatique (polypeptidique) incorporant des substances actives mais encore augmentait la solubilisation d'autres constituants comme les polyphénols pour la préparation de compositions cosmétiques. Les espèces d'algues utilisées peuvent aussi bien provenir des trois embranchements que sont les algues rouges (Rhodophyta), les algues brunes (Classe des Phaeophyceae dans l'embranchement des Ochrophyta) et les algues vertes (Chlorophyta). Le procédé selon l'invention a permis d'obtenir des extraits utiles dans le domaine cosmétique de la macro-algue brune Pylaiella littoralis appartenant à l'ordre des Ectocarpales dont aucune espèce n'a encore été valorisée pour ses propriétés cosmétiques. Le texte de la description qui suit donne d'autres exemples d'algues valorisées illustrant les trois catégories susvisées (brune, rouge et verte).

La pâte obtenue est ensuite reprise dans l'eau et traitée par la protéase comme indiqué précédemment dans le cadre de la présente invention.

De préférence, l'algue qui est traitée dans le procédé selon l'invention est choisie parmi Pylaiella spp (genre), Calliblepharis Jubata (espèce), Bifurcaria spp (genre), Polysiphonia spp (genre) et/ou Cladophora spp (genre). C'est-à-dire que la source d'algue utilisée pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention peut être un mélange d'au moins une des espèces d'algues citées précédemment ou appartenant aux genres énumérés ci-avant. L'algue traitée suivant le procédé selon l'invention est avantageusement sélectionnée parmi au moins l'une des espèces suivantes : Pylaiella littoralis, Calliblepharis Jubata, Bifurcaria bifurcata, Polysiphonia elongata, et Cladophora rupestris.

Les protéases de choix pour opérer le traitement enzymatique dans le cadre du procédé selon l'invention sont avantageusement des sérines protéase, de préférence, on utilise la subtilisine.

De préférence, le procédé selon l'invention comporte, en outre, après l'action de la protéase dans le milieu aqueux, une étape de traitement par au moins un acide. L'extrait enzymatique peut être contenu dans un filtrat. Le filtrat est remis au contact des résidus solides (rinçage) au moins une fois pour extraire le maximum de substances actives piégées dans les résidus solides qui se présentent généralement sous forme d'une pâte. L'acidification du milieu permet de dénaturer l'enzyme. On peut utiliser une toile en nylon pour effectuer la séparation du filtrat des résidus solides. Le pH du filtrat est réglé préférentiellement à 4.5 par ajout d'hydroxyde de sodium à 10% puis conservé par exemple avec du benzoate de sodium. Le pH est ensuite ajusté entre 4 et 5 (bornes comprises) par adjonction de la quantité nécessaire d'un acide organique, tel que l'acide citrique. Le filtrat est avantageusement repris sur un filtre presse équipé de plaques comportant des pores (porosité) de 0.5 à 0.8 μηι, voire de 0.6 à 0.7 μηι, de diamètre.

Entre l'étape b) et l'étape c) du procédé selon l'invention tel que décrit précédemment, on ajoute avantageusement 30 à 70 % en masse de glycérine.

La présente invention concerne aussi un procédé de traitement de résidus solides récupérés en dernière étape du procédé décrit précédemment dans le cadre de l'invention, en reprenant dans de l'eau les résidus solides obtenus, par exemple sous forme d'une pâte, et en les traitant par adjonction d'un acide pour atteindre un pH de 1 .5 à 2.5, en appliquant ensuite un chauffage pendant au moins 3 heures à au moins 70°C , et finalement en ajoutant une base de sorte à obtenir un pH de 6 à 8 pour obtenir un extrait polysaccharidique après filtration. On effectue une séparation de la pâte et du filtrat, et on rince la pâte au moins une fois avec le filtrat. On peut utiliser une toile en nylon pour effectuer cette séparation. Le filtrat obtenu comporte l'extrait polysaccharidique. Le filtrat est conservé par exemple avec du benzoate de sodium. Le pH est ensuite ajusté entre 4 et 5 (bornes comprises) par adjonction de la quantité nécessaire d'un acide organique, tel que l'acide citrique. Le filtrat est avantageusement repris sur un filtre presse équipé de plaques comportant des pores (porosité) de 0.5 à 0.8 μηι, voire de 0.6 à 0.7 μηι, de diamètre, pour récupérer en sortie l'extrait polysaccharidique attendu.

Les polysaccharides sont extraits dans des conditions douces sans excès d'acide. La catalyse de la réaction d'hydrolyse se produit grâce aux protons internes des polysaccharides anioniques. Cette réaction provoque la réduction de la taille des polymères et en facilite l'extraction pendant la neutralisation.

De préférence, on agite la suspension aqueuse préparée à l'étape b) à température ambiante pendant au moins 30 minutes, puis on effectue une séparation par filtration pour obtenir une pâte et un extrait cytoplasmique, seule la pâte est ensuite traitée selon les étapes c) à h). Ainsi, au préalable avant l'étape mettant en œuvre la protéase, une extraction de la matière première sous forme déshydratée est effectuée par une solution aqueuse. Des algues fraîches après récolte ou congelées peuvent être utilisée. Les algues sont éventuellement broyées, mais l'utilisation des algues qui ont subi une simple découpe est préférée, les algues sont avantageusement prédécoupées en petits morceaux avant traitement. L'extraction consiste à agiter la suspension aqueuse comprenant l'algue à température ambiante pendant au moins 30 minutes. Il s'agit d'un choc osmotique en vue de faire éclater les cellules des morceaux d'algues en suspension dans le liquide. A partir de la suspension, un filtrat et une pâte qui décante après arrêt de l'agitation sont obtenus. Une filtration sur toile de nylon permet de séparer la pâte du filtrat. Le filtrat est remis en contact au moins une fois sur la pâte par rinçage afin de récupérer le maximum de substance active. Le filtrat est passé sur filtre-presse équipé de plaques permettant une filtration clarifiante puis stérilisante ayant des pores de 0.2 μηι de diamètre pour obtenir l'extrait cytoplasmique. Le filtrat obtenu est un extrait cytoplasmique utile pour la préparation de compositions cosmétiques.

La présente invention concerne également un procédé d'extraction de la fraction insoluble obtenue à la fin du procédé de traitement des résidus solides tel que décrit ci-dessus, qui est reprise, déshydraté et extraite au C0 ₂ supercritique. L'extraction au C0 ₂ supercritique peut se faire avec un mélange de triglycérides d'acide caprique et caprylique comme co-solvant et à haute pression. On obtient un extrait huileux qui est avantageusement valorisé comme ingrédient actif d'une composition cosmétique.

La présente invention concerne aussi une composition obtenue à partir d'au moins un des extraits d'algues mis en œuvre dans, ou obtenus suivant, le procédé tel que décrit précédemment, comprenant une molécule sélectionnée parmi : un glucide ou un de ses dérivés, tel que le mannitol et un oligosaccharide de fructose tel que l'oligo-fructose ; un acide aminé ou dérivé, tel que la proline et la taurine ; un acide gras ou dérivés ; un caroténoïde ; un diterpène ; et un polyphénol, tel qu'un phlorotannin ou l'acide vanillique ou un de ses dérivés.

Dans le cadre de l'invention, le terme glucide regroupe les oses (sucres simples ou monosaccharides et leurs dérivés) et les osides (sucres hydrolysables). Les oses comprennent les polyols comme le mannitol, le sorbitol, le dulcitol et le volemitol. Les osides comprennent les oligosides ou oligosaccharides, les polyosides ou polysaccharides et les hétérosides dont l'hydrolyse libère des oses et des composés non osidiques.

Avantageusement, la composition comporte un glucide sélectionné parmi un amidon floridéen de préférence hydrolysé, le mannitol, le floridoside (2-0- glycérol-a-D-galactopyranoside, tel que décrit dans l'article de We ^' ïwer M. et al, Journal of Carbohydrate Chemistry, 2008, 27, pages 420^127), le digénéaside ( oc-D-mannopyranosyl-(1→2)-D-glycérate, tel que décrit dans l'article de Ascencio

5. D. et al., Carbohydrate Research, 2006, Volume 341 , Issue 5, Pages 677 - 682), un oligo-fructose, la laminarine de préférence hydrolysée (en anglais

« laminarin »), un galactane, de préférence un galactane sulfate hydrolysé, voire un arabino-galactane sulfates hydrolysés, un fucane de préférence hydrolysé et un alginate de préférence hydrolysé. Avantageusement, la composition comporte un acide aminé ou dérivé sélectionné parmi la proline, la leucine, la valine, la taurine et l'acide glutamique,

Avantageusement, la composition comporte un acide gras polyinsaturé sélectionné parmi un acide gras de type oméga 3, de préférence l'acide eicosapentanéoique (EPA), ou sélectionné parmi les acides gras de type oméga

6, de préférence l'acide arachidonique.

L'amidon floridéen, l'arabino-galactane sulfates, les galactanes sulfates, les laminarines, les alginates et les fucanes sont avantageusement hydrolysés. L'hydrolyse des polysaccharides permet de réduire leur taille. Les inventeurs ont constatés que de tels polysaccharides hydrolysés ont des effets bénéfiques sur la synthèse du collagène par les cellules.

La présente invention concerne également au moins une utilisation cosmétique de la composition telle que décrite précédemment dans le cadre de l'invention, sélectionnée parmi : la protection des systèmes enzymatiques cellulaires, la stimulation de la synthèse du collagène et la cytostimulation des cellules. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la partie expérimentale qui va suivre, dont les exemples et les figures sont uniquement donnés à titre illustratif et ne peuvent nullement être considérés comme limitatifs. PARTIE EXPERIMENTALE

I. PREPARATION DES EXTRAITS

1.1) Préparation d'un extrait cytoplasmique à partir de Pylaiella littoralis :

Au niveau phylogénique, Pylaiella littoralis appartient à l'embranchement des Ochrophytes, à la classe des Phaeophyceae, à l'ordre des Ectocarpales, et à la famille des Acinetosporaceae.

Les algues déshydratées (4% en masse), entières, sont extraites par un mélange eau(38.4%)/glycérine(57.6%) (40/60) à température ambiante pendant 30 mn. La fraction insoluble est ensuite séparée du filtrat sur une toile de nylon. Le filtrat est conservé par exemple avec du sorbate de potassium. Le pH est ensuite ajusté à une valeur comprise entre 4 et 5 par adjonction de la quantité nécessaire d'un acide organique, tel que l'acide citrique. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur filtre presse équipé de plaques comportant des pores de 0.2 μηι pour obtenir l'extrait cytoplasmique.

Les phlorotannins et le mannitol ont été dosés dans l'extrait cytoplasmique. Les phlorotannins sont des polyphénols composées d'un mélange complexes d'oligomères et de polymères de phloroglucinol.

Le dosage des polyphénols totaux a été réalisé par la méthode de Folin associé à un dosage par la méthode au DMBA. Ceci permet de calculer un ratio (Phlorotannin (Méthode de Folin)/Phlorotannin (Méthode au DMBA)). Plus ce ratio est élevé plus le phlorotannin est polymérisé (voir le tableau 1 ) :

La teneur moyenne en phlorotannins, est de 0.28g/L (voire de 0.05 à 0.35 g/L) de l'extrait. L'extrait comporte également du mannitol à une teneur moyenne de 0.81 g/L (voire de 0.5 à 1 .5 g/L). 1.2) Préparation d'un extrait enzymatique à partir de Pylaiella littoralis : La fraction insoluble obtenue lors du traitement décrit dans la partie 1.1 ) est remise en suspension dans de l'eau afin d'obtenir une solution aqueuse de poids équivalent à celui du mélange de départ décrit au 1.1 ). On ajoute une solution d'hydroxyde de sodium à 10% et on contrôle le pH de sorte à obtenir un pH=8. On porte le mélange à 60°C, puis on ajoute une protéase, la subtilisine (Alcalase® 2.4 L FG commercialisée par la société Novozyme®) afin de réaliser la protéolyse et on maintient sous agitation à cette température et pH pendant 2 h. On abaisse la température à 40°C et on ajuste le pH à 2 avec de l'acide chlorhydrique à 10%. La fraction insoluble est séparée du filtrat sur une toile de nylon. Puis on rince la fraction insoluble (pâte) avec le filtrat. Le filtrat est réglé à un pH de 4.5 par ajout d'hydroxyde de sodium à 10% puis conservé, par exemple avec du benzoate de sodium. Le pH est ensuite ajusté à une valeur comprise entre 4 et 5 par adjonction de la quantité nécessaire d'un acide organique, tel que l'acide citrique. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur filtre presse équipé de plaques comportant des pores de 0.65 μηι pour obtenir l'extrait enzymatique.

La teneur en phlorotannins est de 0.1 1 g/L (voire de 0.05 à 0.15 g/L) de l'extrait. Les phlorotannins sont spécifiques des algues brunes et sont notamment impliqués dans les mécanismes de défense des algues contre les effets délétères des rayonnements UV en neutralisant les molécules oxydantes (espèce activée de l'oxygène, radicaux libres). Les phlorotannins présents dans les algopeptides de Pylaiella littoralis sont de faibles tailles. Le dosage des polyphénols totaux par la méthode de Folin associés à un dosage par la méthode au DMBA permet de calculer un ratio (Phlorotannin (Méthode de Folin)/Phlorotannin (Méthode au DMBA)). Plus ce ratio est élevé, plus le phlorotannin est polymérisé (voir le tableau 4.)

Tableau 4 : caractéristiques des phlorotannins des algopeptides de Pylaiella littoralis

L'analyse de l'extrait enzymatique a montré la présence d'acide glutamique à une teneur de 0.13 g/L (voire de 0.1 à 0.2 g/L), mesurée par HPLC. 1.3) Préparation d'un extrait polysaccharidique à partir de Pylaiella littoralis

La fraction insoluble obtenue à l'issue de la partie 1.2) est remise en suspension dans de l'eau afin d'obtenir une solution aqueuse de poids équivalent à celui du mélange de départ décrit au 1.2). On ajuste le pH à 2 à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique à 10% et on laisse sous agitation pendant 4 h à 80°C. La suspension obtenue est ensuite neutralisée à pH=7 par ajout d'une solution d'hydroxyde de sodium à 10%. La fraction insoluble est séparée du filtrat sur une toile de nylon. Puis on rince la fraction insoluble (pâte) avec le filtrat. Le filtrat est conservé, par exemple, avec du benzoate de sodium. Le pH est ensuite ajusté à une valeur comprise entre 4 et 5 par adjonction de la quantité nécessaire d'un acide organique, tel que l'acide citrique. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur filtre presse équipé de plaques comportant des pores de 0.65 μηι pour obtenir l'extrait polysaccharidique.

Les polysaccharides sont extraits dans des conditions douces sans excès d'acide. La catalyse de la réaction d'hydrolyse se produit grâce aux protons internes des polysaccharides anioniques. Cette réaction provoque la réduction de la taille des polymères et en facilite l'extraction pendant la neutralisation.

La fraction insoluble est déshydratée par lyophilisation.

Les polysaccharides majoritaires de l'extrait ont été caractérisés et dosés après purification par ultrafiltration avec un seuil de coupure de 1000 Da. Leur teneur dans l'extrait est de 2.6 g/L (voire une teneur de 2 à 3 g/L). Les polysaccharides sont principalement constitués d'osés neutres. Très peu d'alginates (acides uroniques) sont présents dans l'extrait.

L'ose neutre majoritaire est le glucose provenant de la laminarine. La laminarine est un béta-glucanes liés en 1 ,3 avec des ramifications en 1 ,6.

Les autres oses neutres proviennent de fucanes constitués majoritaire de xylose et de fucose.

Les fucanes sont des polysaccharides sulfatés. Le ratio molaire est de 0,88 unité sulfate par unité fucose. Les contre-ions des groupements anioniques sont majoritairement du sodium et du calcium et sont en moindre proportion du magnésium et du potassium.

L'auto-hydrolyse a réduit la masse moyenne en poids du mélange de polysaccharide à 33 000 g/mole ce qui fait un polysaccharide en moyenne de 133 unités (unité de fucose sulfaté sous forme sodium).

Le fucose a été dosé par colorimétrie. La concentration moyenne en fucose est de 0.22 g/L (la teneur en fucose est comprise entre 0.1 à 0.35 g/L). Le glucose a été dosé par dosage enzymatique. La concentration moyenne en glucose est de 0.53 g/L (la teneur en glucose est comprise entre 0.1 à 1 g/L).

I.4) Préparation d'un extrait huileux à partir de Pylaiella littoralis : La fraction insoluble obtenue à la fin du traitement de la partie 1.3) est extraite au C0 ₂ supercritique avec un mélange de triglycérides d'acide caprique et caprylique comme co-solvant et en opérant à haute pression dans un extracteur spécifique. L'extrait huileux obtenu est dilué avec cette même huile pour obtenir un rendement de 30% par rapport à la matière première.

1.5) Bilan matière Le tableau suivant récapitule les pourcentages massiques obtenus pour les différents extraits aqueux par rapport à la masse d'algue sèche traitée :

Tableau 2 : répartition de la matière

On constate que plus de 50% de la matière sèche algale a été valorisée dans les 3 extraits.

1.6) Préparation d'un extrait cvtoplasmique à partir de Calliblepharis Jubata :

Calliblepharis jubata est une algue rouge appartenant à l'ordre des Gigartinales et à la famille des Cystocloniaceae (Classification : Rhodophyta /Florideophyceae /Gigartinales /Cystocloniaceae). Elle se compose d'un thalle foliacé, épais, couleur rouge brun de 10 à 30 cm de long fixé par un ensemble de crampons ramifiés. La lame présente des proliférations épineuses latéralement. Un aspect original de ses modes de reproduction est sa capacité à se bouturer grâce à ses proliférations épineuses qui se détachent en été, dérivent sous forme de pelotes entre deux eaux et se fixent en automne. C'est une algue pérennante qui repart de ses bases. Elle se situe dans la zone infra-littoral : c'est-à-dire au bas de la zone de balancement des marées.

Les algues déshydratées (4% en masse), entières, sont extraites par de l'eau (96%) à température ambiante pendant 30 mn. La fraction insoluble est ensuite séparée du filtrat sur une toile de nylon de mailles de 500 μηι à 1 mm de diamètre interne. Le filtrat est conservé avec 0.5% de benzoate de sodium et son pH ajusté à une valeur comprise entre 4 et 5 par ajout d'acide citrique. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur filtre presse équipé de plaques comportant des pores de 0.2 μηι pour obtenir l'extrait cytoplasmique.

L'extrait cytoplasmique contient une teneur en floridoside de 0.66 g/L (voire de 0.40 à 1 g/L) déterminée par un dosage enzymatique après hydrolyse. Le floridoside qui est constitué de galactose et de glycérol a été caractérisé par RMN 1 H.

L'extrait contient également de la taurine dans une teneur de 0.34 g/L (voire de 0.25 à 0.45 g/L) déterminée par un dosage par HPLC.

I.7) Préparation d'un extrait enzymatique à partir de Calliblepharis Jubata :

La fraction insoluble obtenue lors du traitement décrit dans la partie I.6) est remise en suspension dans de l'eau afin d'obtenir une solution aqueuse de poids équivalent à celui du mélange de départ décrit au 1.6). On ajoute une solution d'hydroxyde de sodium à 10% et on ajuste le pH à une valeur de 8. On porte le mélange à 60°C, puis on ajoute une protéase, la subtilisine (Alcalase® 2.4 L FG commercialisée par la société Novozyme®) afin de réaliser la protéolyse et on maintient sous agitation à cette température et ce pH pendant 2 h. On abaisse la température à 40°C et on ajuste le pH à 2 avec de l'acide chlorhydrique à 10%. La fraction insoluble est séparée du filtrat sur une toile de nylon. Puis on rince la fraction insoluble (pâte) avec le filtrat. Le filtrat est réglé à un pH de 4.5 par ajout d'hydroxyde de sodium à 10% puis conservé par exemple avec du benzoate de sodium. Le pH est ensuite ajusté à une valeur de 4 à 5 par adjonction de la quantité nécessaire d'un acide organique, tel que l'acide citrique. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur filtre presse équipé de plaques comportant des pores de 0.65 μηι pour obtenir l'extrait enzymatique.

1.8) Préparation d'un extrait polysaccharidique à partir de Calliblepharis Jubata :

La fraction insoluble obtenue à l'issue de la partie 1.7) est remise en suspension dans de l'eau afin d'obtenir une solution aqueuse de poids équivalent à celui du mélange de départ décrit au 1.7). On ajuste le pH à 2 à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique à 10 % et on laisse sous agitation pendant 3 h à 80°C. La suspension obtenue est ensuite neutralisée à pH=7 par ajout d'une solution d'hydroxyde de sodium à 10%. La fraction insoluble est séparée du filtrat sur une toile de nylon. Puis on rince la fraction insoluble (pâte) avec le filtrat. Le filtrat est conservé par exemple avec du benzoate de sodium. Le pH est ensuite ajusté à une valeur comprise entre 4 à 5 par adjonction de la quantité nécessaire d'un acide organique, tel que l'acide citrique. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur filtre presse équipé de plaques comportant des pores de 0.65 μηι pour obtenir l'extrait polysaccharidique.

La fraction insoluble est déshydratée par lyophilisation.

L'extrait comporte un mélange de galactanes sulfatés et d'amidon floridéen qui sont hydrolysés par le procédé d'auto-hydrolyse.

L'amidon floridéen est le polysaccharide dit de réserve des algues rouges. C'est un polymère de D-glucose lié en alpha 1 ,4 avec des ramifications en alpha 1 ,6.dont la structure se situe entre celle de l'amylopectine et celle du glycogène. L'amidon floridéen a été dosé après hydrolyse des polysaccharides, réduction et méthylation, et analyse chromatographique des dérivés méthylés. Il représente 3 % du mélange de polysaccharides. Les polysaccharides représentent 65 % de la masse sèche de l'extrait (Matière moyenne de l'extrait = 1 .3 %). Ils sont principalement constitués d'osés neutres, d'anhydro-galactose et de sulfate.

Les galactanes sulfatés sont très dépolymérisés. La masse moléculaire est de 7600 g/mole ce qui correspond à un degré de polymérisation moyen de 26 unités de type galactose sulfaté et anhydro-galactose. Le nombre de sulfate étant important par rapport aux deux constituants principaux, galactose et anhydro- galactose. Le polysaccharide est fortement chargé anioniquement et contient une proportion importante de contre-ions notamment sous forme calcium et magnésium.

L'analyse enzymatique révèle une teneur de 1 .7 g/L en galactose (voire de 1 à 2.3 g/L), et une teneur de 0.4 g/L en glucose (voire de 0.5 à 1 g/L).

1.9) Préparation d'un extrait cvtoplasmique à partir de Polysiphonia elongata :

Polysiphonia elongata est une algue rouge appartenant à l'ordre des Céramiales (Rhodophyta/Florideophyceae/Ceramiales/Rhodomelaceae). Elle forme des touffes de filaments rouge vif, de 20 à 30 cm de hauteur.

Les algues déshydratées (4% en masse), entières, sont extraites par de l'eau (96%) à température ambiante pendant 30 mn. La fraction insoluble est ensuite séparée du filtrat sur une toile de nylon de mailles de 500 μηι à 1 mm de diamètre interne. Le filtrat est conservé, par exemple avec du benzoate de sodium. Le pH est ensuite ajusté à une valeur de 4 à 5 par adjonction de la quantité nécessaire d'un acide organique, tel que l'acide citrique. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur filtre presse équipé de plaques comportant des pores de 0.2 μηι pour obtenir l'extrait cytoplasmique.

Le digénéaside a été dosé par dosage enymatique du mannose après hydrolyse. La teneur en digénéaside est de 0.81 g/L - voire de 0.5 à 1 .3 g/L . Au préalable le digénéasise a été identifié dans l'extrait par RMN 1 H par rapport au spectre du digénéaside purifié.

Il a également été mesuré de proline à une teneur de 0.19 g/L - voire de 0.1 à 0.4 g/L - (HPLC) et 50 mg/L voire de 25 à 70 mg/L - d'acides aminés mycosporines-like (Spectrométrie UV).

1.10) Préparation d'un extrait polysaccharidique à partir de Polysiphonia elongata :

La fraction insoluble obtenue après traitement en I.9) suivi d'un traitement en vue de recueillir un extrait enzymatique (non décrit) est remise en suspension dans de l'eau afin d'obtenir une solution aqueuse de poids équivalent à celui du mélange de départ. On ajuste le pH à 2 à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique à 10 % et on laisse sous agitation pendant 3 h à 80°C. La suspension obtenue est ensuite neutralisée à pH=7 par ajout d'une solution d'hydroxyde de sodium à 10%. La fraction insoluble est séparée du filtrat sur une toile de nylon. Puis on rince la fraction insoluble (pâte) avec le filtrat. Le filtrat est conservé par exemple avec du benzoate de sodium. Le pH est ensuite ajusté à une valeur de 4 à 5 par adjonction de la quantité nécessaire d'un acide organique, tel que l'acide citrique. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur filtre presse équipé de plaques comportant des pores de 0.65 μηι pour obtenir l'extrait polysaccharidique.

Le procédé d'extraction est une hydrolyse douce dit par "Auto-hydrolyse". Les protons, catalysant l'hydrolyse des liaisons glycosidiques, proviennent du polysaccharide lui-même. Ce procédé favorise la solubilisation et la stabilité des polysaccharides en réduisant leur taille.

Le polysaccharide isolé dans l'extrait est un galactane sulfate. Il contient principalement des oses neutres, des sulfates et de l'anhydro-galactose. Les polysaccharides ont été purifiés puis caractérisés par RMN ¹ H. La composition en oses neutres a été déterminée après hydrolyse totale, réduction, méthylation et chromatographie en phase gazeuse des dérives méthyles. Le soufre et les cations déterminés par analyse élémentaire et l'anhydro-galactose à été dosé par colorimétrie.

L'ose neutre majoritaire est le galactose. Le glucose provient d'amidon floridéen extrait conjointement avec des galactanes sulfates.

Le cation majoritaire est le calcium. Du magnésium est également lié au polysaccharide.

Les teneurs déterminées dans l'extrait pour l'anhydro-galactose sont de 0.9 g/L (voire de 0.6 à 1 .1 g/L), et pour le galactose de 2.0 g/L (voire de 1 .4 à 2.6 g/L).

1.11) Préparation d'un extrait cytoplasmique à partir de Cladophora rupestris :

Cladophora rupestris est une algue verte de la famille des Cladophoraceae, de l'ordre des Cladophorales, de la classe des Ulvophyceae et de l'embranchement des Chlorophyta.

Cette espèce forme des touffes très ramifiées jusqu'à 30 cm de longueur. Les parois cellulaires peuvent devenir très épaisses ce qui donne de la raideur au thalle. Elle est abondante à mi-marée sur des rochers ensablés.

Les algues déshydratées (4% en masse), entières, sont extraites par de l'eau (96%) à température ambiante pendant 30 mn. La fraction insoluble est ensuite séparée du filtrat sur une toile de nylon de mailles de 500 μηι à 1 mm de diamètre interne. Le filtrat est conservé, par exemple avec du benzoate de sodium. Le pH est ensuite réglé de 4 à 5 par adjonction de la quantité nécessaire d'un acide organique, tel que l'acide citrique. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur filtre presse équipé de plaques comportant des pores de 0.2 μηι de diamètre pour obtenir l'extrait cytoplasmique.

L'extrait comporte des sucres de bas poids moléculaire, par exemple du saccharose et des oligosaccharides de fructoses (oligo-fructose). Des polyphénols ont été dosés par la méthode de FOLIN en référence à une calibration avec de l'acide vanillique.

1.12) Préparation d'un extrait enzymatique à partir de Cladophora rupestris : La fraction insoluble obtenue lors du traitement décrit dans la partie 1.1 1 ) est remise en suspension dans de l'eau afin d'obtenir une solution aqueuse de poids équivalent à celui du mélange de départ décrit au 1.1 1 ). On ajoute une solution d'hydroxyde de sodium à 10% et on contrôle le pH de sorte à obtenir un pH=8. On porte le mélange à 60°C, puis on ajoute une protéase, la subtilisine (Alcalase® 2.4 L FG commercialisée par la société Novozyme®) afin de réaliser la protéolyse et on maintient sous agitation à cette température et pH pendant 2 h. On laisse revenir à 40°C et on ajuste le pH à 2 avec de l'acide chlorhydrique à 10%. La fraction insoluble est séparée du filtrat sur une toile de nylon. Puis on rince la fraction insoluble (pâte) avec le filtrat. Le filtrat est réglé à un pH de 4.5 par ajout d'hydroxyde de sodium à 10%, puis conservé, par exemple avec du benzoate de sodium. Le pH est ensuite ajusté à une valeur de 4 à 5 par adjonction de la quantité nécessaire d'un acide organique, tel que l'acide citrique. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur filtre presse équipé de plaques comportant des pores de 0.65 μηι pour obtenir l'extrait enzymatique.

1.13) Préparation d'un extrait polvsaccharidique à partir de Cladophora rupestris :

La fraction insoluble obtenue à l'issue de la partie 1.12) est remise en suspension dans de l'eau afin d'obtenir une solution aqueuse de poids équivalent à celui du mélange de départ décrit au 1.12). On ajuste le pH à 2 à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique à 10 % et on laisse sous agitation pendant 4 h à 80°C. La suspension obtenue est ensuite neutralisée à pH=7 par ajout d'une solution d'hydroxyde de sodium à 10%. La fraction insoluble est séparée du filtrat sur une toile de nylon. Puis on rince la fraction insoluble (pâte) avec le filtrat. Le filtrat est conservé par exemple avec du benzoate de sodium. Le pH est ensuite ajusté à une valeur de 4 à 5 par adjonction de la quantité nécessaire d'un acide organique, tel que l'acide citrique. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur filtre presse équipé de plaques comportant des pores de 0.65 μηι pour obtenir l'extrait polysaccharidique.

L'extrait contient un mélange de d'arabino-galactanes sulfatés et d'amidon. Ils sont hydrolysés par un procédé original d'auto-hydrolyse.

L'auto-hydrolyse a réduit la masse moyenne en poids du mélange de polysaccharide à 28 000 g/mole ce qui fait un polysaccharide en moyenne de 173 unités (unité d'équivalent galactose).

1.14) Préparation d'un extrait cvtoplasmique à partir de Bifurcaria bifurcata :

Bifurcaria bifurcata est une algue brune appartenant à la famille des Sargassaceae, à l'ordre des Fucales, à la classe des Pheophyceae et à l'embranchement des Ochrophyta. C'est une algue pérennante. Elle peut mesurer jusqu'à 40 cm de long et se présente sous la forme de cordons cylindriques dichotomes, d'un diamètre d'environ 3 à 5 mm. Elle se situe dans la partie haute de l'étage infra- littoral et est très rarement émergée, sauf au moment des grands coefficients de marées. Elle est présente plus haut sur l'estran dans des cuvettes sur des faciès rocheux (mode battu) et caractérise une flaque à Bifurcaria (enclave écologique spécifique) située en général en dessous des fucacées. La présence de Bifurcaria bifurcata dans des cuvettes à des niveaux plus élevés sur l'estran l'expose à des amplitudes importantes de conditions physicochimiques comme la concentration saline et la température. Bifurcaria bifurcata est donc capable de réguler la pression osmotique intra-cellulaire. Confrontée à des stress oxydants forts, Bifurcaria bifurcata se défend en synthétisant des phlorotannins qui sont des anti-oxydants.

Les algues déshydratées (5% en masse), entières, sont extraites par un mélange eau(57%)/glycérine(38%) à température ambiante pendant 30 mn. La fraction insoluble est ensuite séparée du filtrat sur une toile de nylon de mailles de 500 μηι à 1 mm de diamètre interne. Le filtrat est conservé, par exemple avec du sorbate de potassium. Le pH est ensuite ajusté à une valeur de 4 à 5 par adjonction de la quantité nécessaire d'un acide organique, tel que l'acide citrique. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur filtre presse équipé de plaques comportant des pores de 0.2 μηι pour obtenir l'extrait cytoplasmique.

La présence de phlorotannins, qui sont des antioxydants, dans une teneur de 0.23 g/L (voire de 0.20 à 0.27 g/L) de l'extrait, a été identifiée. L'extrait comporte également du mannitol à une teneur de 1 .3 g/L (voire de 1 .0 à 1 .7 g/L).

1.15) Préparation d'un extrait enzymatique à partir de Bifurcaria bifurcata :

La fraction insoluble obtenue lors du traitement décrit dans la partie 1.14) est remise en suspension dans de l'eau afin d'obtenir une solution aqueuse de poids équivalent à celui du mélange de départ décrit au 1.14). On ajoute une solution d'hydroxyde de sodium à 10% et on contrôle le pH de sorte à obtenir un pH=8. On porte le mélange à 60°C, puis on ajoute une protéase, la subtilisine (Alcalase® 2.4 L FG commercialisée par la société Novozyme®) afin de réaliser la protéolyse et on maintient sous agitation à cette température et pH pendant 2 h. On laisse revenir à 40°C et on ajuste le pH à 2 avec de l'acide chlorhydrique à 10%. La fraction insoluble est séparée du filtrat sur une toile de nylon. Puis on rince la fraction insoluble (pâte) avec le filtrat. Le filtrat est réglé à un pH de 4.5 par ajout d'hydroxyde de sodium à 10%, puis conservé, par exemple, avec du benzoate de sodium. Le pH est ensuite ajusté à une valeur de 4 à 5 par adjonction de la quantité nécessaire d'un acide organique, tel que l'acide citrique. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur filtre presse équipé de plaques comportant des pores de 0.65 μηι pour obtenir l'extrait enzymatique.

1.16) Préparation d'un extrait poivsaccharidique à partir de Bifurcaria bifurcata :

La fraction insoluble obtenue à l'issue de la partie 1.15) est remise en suspension dans de l'eau afin d'obtenir une solution aqueuse de poids équivalent à celui du mélange de départ décrit au 1.15). On ajuste le pH à 2 à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique à 10 % et on laisse sous agitation pendant 4 h à 80°C. La suspension obtenue est ensuite neutralisée à pH=7 par ajout d'une solution d'hydroxyde de sodium à 10%. La fraction insoluble est séparée du filtrat sur une toile de nylon. Puis on rince la fraction insoluble (pâte) avec le filtrat. Le filtrat est conservé par exemple avec du benzoate de sodium. Le pH est ensuite réglé à une valeur de 4 à 5 par adjonction de la quantité nécessaire d'un acide organique, tel que l'acide citrique. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur filtre presse équipé de plaques comportant des pores de 0.65 μηι pour obtenir l'extrait polysaccharidique. Les polysaccharides hydrolysés majoritaires de l'extrait ont été caractérisés et dosés après purification par ultra-filtration avec un seuil de coupure de 1000 Da. Leur teneur dans l'extrait est de 13.1 g/L (voire de 10 à 17 g/L). Ces polysaccharides sont principalement constitués d'acides uroniques et d'une fraction minoritaire d'osés neutres. Les acides uroniques proviennent des alginates et sont constitués d'acides mannuronique et guluronique.

Les oses neutres majoritaires sont le xylose et le fucose qui proviennent des fucanes. Les fucanes sont des polysaccharides sulfatés. Le ratio molaire est de 1 .58 unité sulfate par unité fucose.

Les contre-ions des groupements anioniques (sulfate des fucanes et carboxylate des acides uroniques salifiés) sont majoritairement du sodium et du potassium et sont en moindre proportion du calcium et du magnésium. Il s'agit de polysaccharides très chargé négativement avec une capacité d'échange cationique de 367 meq/100 g.

II. TESTS DE L'EFFICACITE COSMETIQUES SUR LES EXTRAITS

PROTOCOLES :

Méthode au BCA :

Évaluation de la concentration de protéines à l'aide du Kit dénommé « Bicinchoninic acide Protein Assay » (vendu sous la référence BCA1 , par la société Sigma™, France). Préparation du réactif BCA en travaillant en combinant les réactifs A et B (50 : 1 ). Mélanger le réactif BCA de travail jusqu'à ce que la solution soit uniforme, et de couleur vert clair. Préparation des normes protéiques BSA afin d'obtenir les concentrations suivantes : 25 à 800 mg / ml (ou 200 à 1000 mg /ml), ajout de 25 μΙ de chaque échantillon. Ajouter 200 μ\- du réactif de travail - BCA. Faire subir une agitation rotative à la plaque doucement et laisser incuber pendant 30 min à 37° C. Mesurer l'absorbance à 570 nm avec un appareil Multiskan ® EX (Thermo Labsystems, France).

Test au WST1 :

Mise en culture sur plaque de cellules HEK001 à 32 000 cellules/puits/80 μΙ dans leur milieu de culture en plaque de 96 puits. Incubation à 37° C et 5 % de C0 ₂ . Jeter le milieu de culture. Ajout des essais de concentrations des substances d'essai, des contrôles positifs et des solvants (8 μΙ). Incubation à 37° C et 5 % de C0 ₂ pendant 24 h. Chauffage à 45° C pendant 90 min dans un four à hybridation. Incubation à 37° C et 5 % de C0 ₂ pendant 22h30. Ajout du réactif WST-1 de la prolifération cellulaire dans chaque puits (10 μΙ/puits). Incubation des cellules pendant une durée de 30 min à 4 h, à 37° C et avec 5 % de C0 ₂ . Agitation des plaques de 96 puits pendant 1 mn avec Multiskan® EX appareils (Thermo Labsystems™, France).

11.1) Test de l'efficacité cosmétique de l'extrait cvtoplasmique de Pylaiella littoralis : Protection des kératinocvtes contre un choc thermique :

Stressés par la chaleur, les kératinocytes produisent des protéines chaperonnes (en anglais "Heat Shock Protéines", ou HSP) qui s'associent aux protéines pour les protéger de la dénaturation. Les osmolytes sont des solutés compatibles ; c'est-à-dire qu'ils s'accumulent dans les cellules sans les intoxiquer et tout en contribuant au maintien des conformations protéiques. L'expérience qui suit démontre l'activité protectrice de l'extrait cytoplasmique.

Des kératinocytes HEK001 sont cultivés sur plaque jusqu'à confluence puis incubés 24 h avec 0,05 % et 0,1 % en masse (doses non cytotoxiques démontrées par la détermination de la viabilité cellulaire par le test au WST1 ) de l'extrait cytoplasmique dans le milieu de culture avant de subir un choc thermique à 45°C pendant 1 h 30 (voire 2 h 30). Après 22 h 30 d'incubation (post-traitement thermique), les protéines sont extraites, dosées par la méthode au BCA et l'HSP70 dosé par une méthode ELISA.

Les quantités d'HSP70 normalisées par rapport aux protéines sont déterminées. Les essais ont été réalisés en triplicata, soit trois plaques par concentration. Le traitement statistique appliqué est une comparaison des moyennes entre les essais en présence de l'extrait cytoplasmique et l'essai réalisé avec le milieu nutritif. Le test appliqué est le test t de Student (test statistique normalisé pour éliminer les chiffres aberrants et vérifier si les résultats sont significatifs). Les moyennes sont considérées comme significativement différentes pour un risque p<0,05.

Aux deux concentrations testées (0,05 % et 0,1 %), les quantités d'HSP70 ont été augmentées de 34 % et de 55 % par rapport au témoin stressé en présence du milieu de culture à 45°C. Les résultats sont reportés au diagramme 1 dont les chiffres en ordonnées quantifient l'HSP70 en ng par μg de protéine (les deux bâtons de droite représentent les quantités mesurées pour le milieu de culture à 37°C et 45°C).

Conclusion : on a donc pu démontrer que l'extrait cytoplasmique de Pylaiella littoralis augmente significativement la quantité d'HSP 70 produite par les kératinocytes stressés par la chaleur contribuant ainsi à la protection des systèmes enzymatiques cellulaires. Les molécules identifiées dans l'extrait cytoplasmique dont le mannitol stimulent les défenses des cellules de la peau. Ces molécules impliquées dans l'ajustement osmotique des cellules stimulent la synthèse de protéines chaperonnes impliquées dans la protection des macromolécules biologiques.

Inhibition de la synthèse de mélanine :

Des mélanocytes murins B16-F10 ont été implantés dans leur milieu de culture dans des plaques de 6 puits. Ils sont cultivés pendant 24 h avant l'ajout des différentes solutions :

- L'extrait cytoplasmique de Pylaiella littoralis à 0,1 % et 0,5 % ;

- L'acide kojique à 200 μg/ml comme témoin positif ;

- Le milieu de culture comme témoin. Les cellules sont incubées 48 h puis les protéines et la mélanine sont extraites et dosées. La mélanine est dosée par spectrophotométrie à 405 nm et la concentration en mélanine déterminée par rapport à une courbe de calibration d'une solution standard de mélanine. Les protéines, après réaction avec le BCA, sont dosées par colorimétrie à 570 nm. Les concentrations sont déterminées par rapport à une droite de calibration d'une solution d'albumine de sérum bovin. Les résultats sont exprimés en pg de mélanine/ μg de protéines et comparés au milieu et l'acide kojique. Les essais sont réalisés en triplicata. Le test appliqué est le test t de Student. Les moyennes sont considérées comme significativement différentes pour p<0,05.

Les quantités de mélanine (normalisées par rapport aux protéines) sont respectivement diminuées de 18 % et de 25 % par rapport au milieu de culture pour 0.10 % et 0.50 % d'incorporation. A 0,5 %, la diminution est égale à celle du témoin positif connu pour ses propriétés inhibitrices de la synthèse de mélanine. Les résultats sont reportés au diagramme 2 dont les chiffres en ordonnées quantifient la mélanine en ng par μg de protéine (les deux barres de droite représentent les quantités mesurées pour l'acide kojique à 200 μg/ml et le milieu de culture (=Ref.)).

Conclusion : l'extrait cytoplasmique de Pylaiella littoralis inhibe la synthèse de mélanine aux deux concentrations testées. Les phlorotanins contenus dans l'extrait sont à l'origine de cette propriété.

Propriétés anti-oxydantes :

Les espèces réactives de l'oxygène (radical superoxyde, peroxyde d'hydrogène et radical hydroxyle) sont surproduites en cas de stress oxydant. Ces composés sont responsables de nombreux dommages oxydatifs vis-à-vis de l'ADN, des protéines et des lipides. Les produits d'oxydation des lipides sont des radicaux peroxyles qui propagent les chaînes de peroxydation des lipides. Les molécules capables de capter ses radicaux peroxyles stoppent donc ces réactions en chaîne. Le test le plus pratiqué pour mesurer cette propriété est le test ORAC.

La capacité anti-oxydante de l'extrait cytoplasmique de Pylaiella littoralis a été déterminée par le test ORAC par rapport au Trolox qui est un dérivé soluble de la vitamine E (diagramme 3). La vitamine E est d'ailleurs le principal capteur de radicaux peroxyles au niveau cellulaire.

Le test mesure la protection de l'oxydation de la fluorescéine par un radical peroxyle (APPH). La fluorescéine est dosée par fluorescence. Il est donc possible de suivre dans le temps pendant 1 heure, l'oxydation de la fluorescéine avec (courbe avec les points en losange et avec les points en croix) et sans molécules anti-oxydantes (courbe avec les points en triangle).

La mesure de la surface comprise entre les deux courbes corrélée à la concentration en Trolox permet de calculer la capacité anti-oxydante de l'extrait testé.

La capacité anti-oxydante est exprimée en équivalent Trolox en (valeur ORAC), elle est reportée au tableau 3. Tableau 3 : valeur ORAC de l'extrait cvtoplasmique de Pylaiella littoralis

Des tests d'innocuité ont démontré, par ailleurs, que l'extrait est tout à fait compatible avec une utilisation cosmétique.

II.2) Test de l'efficacité cosmétique de l'extrait enzymatique de Pylaiella littoralis :

Des algopeptides sont produits par le procédé biotechnologique de protéolyse. L'enzyme solubilise des peptides en coupant les liaisons peptidiques entre deux acides aminés au sein de la protéine, et les inventeurs ont démontré qu'elle favorise l'extraction d'autres composés comme des phlorotannins. Le mélange d'actifs stimule la lipolyse.

Stimulation de la lipolyse par l'extrait enzymatique de Pylaiella littoralis :

Des pré-adipocytes 3T3-L1 sont cultivés pendant 5 jours. Leur différenciation en adipocytes est initiée 3 jours après le début de la culture par l'ajout d'un cocktail lipogénique. Les milieux de culture sont changés à J5, c'est-à-dire au cinquième jour, (post induction de la différenciation) et remplacés par des milieux frais contenant les polypeptides à différentes concentrations, de la caféine (témoin de la lipolyse), le cocktail de différentiation (témoin de la lipogenèse) et le milieu de culture sont ajoutés. Ce changement de milieu est renouvelé à J7. A J10, les cellules sont colorées à l'huile rouge et les lipides extraits par de l'isopropanol puis dosés par spectrophotométrie à 500 nm. Les densités optiques obtenues sont comparées au témoin (milieu de culture, indiqué comme Réf. au diagramme 4), à un témoin positif de la lipolyse (caféine à 0,1 mM) et à un témoin positif de la lipogenèse (cocktail de différenciation). Comme contrôle positif de la lipogenèse, la solution de mélange d'insuline, 3' isobutyle 1 méthylxanthine et dexaméthasone a été choisie, laquelle induit jusqu'à 150 à 200 % de lipogenèse par rapport à un contrôle non traité. Comme contrôle positif de la lipolyse, la caféine a été choisie, laquelle induit jusqu'à 40 % de la lipolyse par rapport à un contrôle non traité.

Deux expériences indépendantes ont été réalisées et chaque concentration a été testée en double. Le traitement statistique appliqué est une comparaison des moyennes entre les essais en présence des algopeptides et l'essai réalisé avec le milieu nutritif. Le test appliqué est le test t de Student. Les moyennes sont considérées comme significativement différentes pour p<0,05.

Comme montré sur le diagramme 4, à une concentration de 0,075 %, l'extrait enzymatique de Pylaiella littoralis réduit le taux de triglycéride des adipocytes de 29 % par rapport au milieu de culture. Cet effet est équivalent à une solution de caféine à 0,1 mM (-33 %). En parallèle, la capacité anti-oxydante de l'extrait enzymatique de Pylaiella littoralis a été déterminée par le test ORAC, comme expliqué précédemment pour l'extrait cytoplasmique. La valeur ORAC de l'extrait enzymatique de Pylaillela est de 2074 μηιοΐβ d'équivalent trolox par L.

De plus, des tests d'innocuité ont démontré que l'extrait est tout à fait compatible avec une utilisation cosmétique.

11.3) Test de l'efficacité cosmétique de l'extrait polysaccharidique de Pylaiella littoralis :

Stimulation de la croissance de kératinocvtes en culture :

Des kératinocytes humains HEK001 ont été cultivés 96 h puis incubés 48 h en présence de 0.05 % et 0.1 % de l'extrait polysaccharidique de Pylaiella littoralis préparé en I.3). La viabilité cellulaire a été déterminée par la mesure de l'activité mitochondriale par le dosage au WST1 et comparée aux cellules traitées par le milieu de culture. Le WST1 est réduit dans les mitochondries des cellules viables en dérivé soluble du formazan qui absorbe à 450 nm. Les essais sont réalisés en triplicata. Le test appliqué est le test t de Student. Les moyennes sont considérées comme significativement différentes pour p<0,05.

Le diagramme 5 montre le pourcentage de cytostimulation par rapport au milieu en ordonnée pour différents milieux comparés au milieu de référence (Réf.). La croissance des kératinocytes est respectivement augmentée de 20 % et de 41 % par rapport au milieu de culture pour 0.10 % et 0.05 % d'incorporation, par rapport au milieu de culture.

Des tests d'innocuité ont démontré, par ailleurs, que l'extrait est tout à fait compatible avec une utilisation cosmétique.

II.4) Test de l'efficacité cosmétique de l'extrait cytoplasmique de Calliblepharis Jubata :

Protection des kératinocvtes suite à un stress thermique :

Des kératinocytes sont cultivés jusqu'à confluence puis incubés 24 h avec 0,1 % et 0,25 % (doses non cytotoxiques démontrées par la détermination de la viabilité cellulaire par le test au WST1 ) de l'extrait cytoplasmique dans le milieu de culture avant de subir un choc thermique à 45°C pendant 2 h 30. Après 22 h 30 d'incubation (post-traitement thermique), les protéines sont extraites, dosées par la méthode au BCA et l'HSP70 dosée par une méthode ELISA.

Les quantités d'HSP70 normalisées par rapport aux protéines sont déterminées. Les essais ont été réalises en triplicata. Le traitement statistique appliqué est une comparaison des moyennes entre les essais en présence d'extrait cytoplasmique et l'essai réalisé avec le milieu nutritif. Le test applique est le test t de Student. Les moyennes sont considérées comme significativement différentes pour p<0,05. Les résultats sont montrés sur le diagramme 6 dont les chiffres en ordonnées quantifient l'HSP70 en ng par μg de protéine (les deux bâtons de droite représentent les quantités mesurées pour le milieu de culture à 37°C et 45°C).

Aux 2 concentrations testées, les quantités d'HSP70 ont été augmentées de 47 % et de 70 % par rapport au témoin stressé en présence du milieu de culture. L'extrait cytoplasmique de Calliblepharis jubata augmente significativement la quantité d'HSP70 produite par les kératinocytes stressés par la chaleur contribuant ainsi à la protection des systèmes enzymatiques cellulaires.

11.5) Test de l'efficacité cosmétique de l'extrait polysaccharidique de

Calliblepharis Jubata :

Réduction de l'inflammation par les polysaccharides de Calliblepharis jubata :

Des kératinocytes humains (lignée HEK001 ) sont cultivés jusqu'à 70% de confluence pendant 4 jours. Les cellules sont incubées avec des doses 0,1 %, 0,25% et 1 % de l'extrait polysaccharidique préparée en I.8) pendant 24h avant d'être traitées par un rayonnement UV B (32 mJ/cm2 à 312 nm). Après l'irradiation, les cellules sont incubées 24h. Après ces 24h de culture, Les cellules sont séparées du milieu de culture par centrifugation. L'IL-6 est dosée dans le surnageant par une méthode ELISA. Les protéines sont extraites du culot cellulaire et dosées par la méthode au BCA par rapport à une courbe de calibration de BSA. Les résultats sont exprimés en pg^g de protéines et comparés à ceux obtenus sur le milieu de culture. Un témoin positif de vitamine D3 est également testé pour valider l'étude. Les essais sont réalisés en triplicata. Le test statistique de comparaison de moyenne appliqué aux résultats est le test t de Student. Les moyennes sont considérées comme significativement différentes pour p<0,05.

Les teneurs en IL6 exprimées en ordonnée et données en pg sur le diagramme 7, (cytokine impliquée dans le processus inflammatoires) sont rapportées aux concentrations en protéines exprimée en μg, on constate qu'elles diminuent proportionnellement à la teneur en polysaccharides. Pour une teneur de 1 % de l'extrait, on constate une diminution de 74% par rapport à la référence (Réf., qui est le milieu avec UV, montré par le bâton de droite représenté en noir). Pour une teneur de 0.25% de l'extrait, on constate une diminution de 61 % par rapport à la référence, et pour une teneur de 0.1 % de l'extrait, on constate une diminution de 48% par rapport à la référence. Un témoin avec de la vitamine D3 est montré à titre comparatif, qui ne permet qu'une diminution de 37%.

Conclusion : Les teneurs en IL6, (cytokine impliquée dans le processus inflammatoires) rapportées aux concentrations en protéines diminuent proportionnellement à la teneur en extrait polysaccharidique de Calliblepharis jubata (effet dose dépendant). L'extrait de polysaccharides de Calliblepharis jubata présente donc un effet apaisant. Stimulation de la synthèse de collaqène par les poivsaccharides de Calliblepharis jubata :

Des fibroblastes humains (lignée MRC-5) sont cultivés pendant 96 h (confluence) puis incubés 48h en présence de 0,4% (dose non cytotoxique) de l'extrait préparée en 1.8). Les protéines sont extraites et dosés par la méthode au BCA. Leurs teneurs sont exprimées en μg/ml de BSA et comparées à celle du milieu témoin (duplicat). Le collagène total est extrait et dosé par la méthode au rouge sirius (colorimétrie à 500 nm). La densité optique est comparée à celle du milieu témoin (triplicata).

Le rapport des résultats des deux dosages exprimés par rapport au milieu nutritif est calculé. Un témoin positif contenant deux facteurs de croissance (TGF3 et EGF) est testé en parallèle afin de valider l'étude.

Le diagramme 8 montre les résultats obtenus, on y voit mesuré en ordonné que la quantité de collagène total (normalisée par rapport aux protéines, c'est-à-dire que l'ordonnée exprime le ratio (collagène / protéines) / milieu) est augmentée de 72% par rapport aux cellules traitées par le milieu de culture. Cette stimulation est équivalente à celle provoquée par un mélange de deux facteurs de croissance, le TGF et l'EGF (Facteur de croissance de transformation et facteur de croissance épidermique).

Conclusion : l'extrait polysaccharidique de Calliblepharis jubata stimule la production de collagène par les cellules de la peau.

Des tests d'innocuité ont démontré, par ailleurs, que l'extrait est tout à fait compatible avec une utilisation cosmétique. 11.6) Test de l'efficacité cosmétique de l'extrait cytoplasmique de Polysiphonia Elongata :

Cvtostimulation des kératinocvtes :

Des kératinocytes humains (lignée HEK001 ) ont été cultivés 24h puis incubés 96h en présence de 0.1 % de l'extrait cytoplasmique de Polysiphonia elongata préparé au I.9). La viabilité cellulaire a été déterminée par la mesure de l'activité mitochondriale par le dosage au WST1 et comparée aux cellules traitées par le milieu de culture. Le WST1 est réduit dans les mitochondries des cellules viables en dérivé soluble du formazan qui absorbe à 450 nm. Les essais sont réalisés en quadricat. Le test appliqué est le test t de Student. Les moyennes sont considérées comme significativement différentes pour p<0,05.

Le diagramme 9 montre que l'extrait préparé au I.9) stimule significativement la croissance des kératinocytes puisqu'en effet, une augmentation de 40% du nombre de cellules par rapport au témoin (Réf.) a été mesurée après 96 h de culture (l'ordonnée mesurant % cytostimulation / milieu de référence).

Conclusion : On constate donc une cytostimulation des cellules de la peau en présence de l'extrait cytoplasmique de Polysiphonia elongata. En parallèle, des tests ont montré une stimulation de la synthèse de collagène et que l'extrait est tout à fait compatible avec une utilisation cosmétique. 11.7) Test de l'efficacité cosmétique de l'extrait polvsaccharidique de Polysiphonia Elongata :

Cytostimulation des kératinocytes par les polvsaccharides de Polysiphonia elongata :

Des kératinocytes humains HEK001 ont été cultivés 96 h, puis incubés 48 h en présence de 0.1 % de l'extrait de Polysiphonia Elongata préparé au 1.1 1 ). La viabilité cellulaire a été déterminée par la mesure de l'activité mitochondriale par le dosage au WST1 et comparée aux cellules traitées par le milieu de culture. Le WST1 est réduit dans les mitochondries des cellules viables en dérive soluble du formazan qui absorbe a 450 nm. Les essais sont réalises en triplicata. Le test applique est le test t de Student. Les moyennes sont considérées comme significativement différentes pour p<0,05.

Les résultats sont reportés sur le diagramme 10 (l'ordonnée mesurant % cytostimulation / milieu de référence), on constate une augmentation de 18 % par rapport au témoin (Réf.).

Conclusion : on montre que l'extrait préparé au 1.1 1 ) de Polysiphonia elongata stimule la croissance des kératinocytes.

Effet anti-inflammatoire des polvsaccharides de Polysiphonia elongata :

Des kératinocytes humains (lignée HEK001 ) sont cultivés jusqu'à 70 % de confluence pendant 4 jours. Les cellules sont incubées avec 0,1 % de l'extrait préparé en 1.1 1 ) de Polysiphonia elongata pendant 24h, avant d'être traitées par un rayonnement UV B (32 mJ/cm ² à 312 nm). Après l'irradiation, les cellules sont incubées 24h. Après ces 24h de culture, Les cellules sont séparées du milieu de culture par centrifugation. L'IL-6 est dosée dans le surnageant par une méthode ELISA. Les protéines sont extraites du culot cellulaire et dosées par la méthode au BCA par rapport à une courbe de calibration de BSA. Les résultats sont exprimés en pg/^g de protéines et comparés à ceux obtenus sur le milieu de culture. Un témoin positif de vitamine D3 est également testé pour valider l'étude. Les essais sont réalisés en triplicata. Le test statistique de comparaison de moyenne appliqué aux résultats est le test t de Student. Les moyennes sont considérées comme significativement différentes pour p<0,05.

Les résultats sont montrés sur le diagramme 1 1 (l'ordonnée mesure NL6 en pg / mL / protéines en μg / mL), l'extrait polysaccharidique de Polysiphonia elongata réduit le ratio ll-6/protéines 39 %, par rapport au témoin (Réf.) démontrant ainsi un effet anti-inflammatoire. A titre indicatif, on voit sur le diagramme le bâton hachuré au centre correspondant à un traitement à la vitamine D3, avec une diminution de 37 %. Conclusion : l'extrait polysaccharidique de Polysiphonia elongata a un effet antiinflammatoire. Stimulation de la sécrétion de collaqène par les polysaccharides de Polysiphonia elongata :

Des fibroblastes humains (lignée MRC-5) sont cultivés pendant 96h (confluence) puis incubes 48h en présence de 0,1 % (dose non cytotoxique) de l'extrait de Polysiphonia elongata préparé au 1.1 1 ). Les protéines sont extraites et dosées par la méthode au BCA. Leurs teneurs sont exprimées en μg/ml de BSA et comparées à celle du milieu témoin (Réf. - duplicat). Le collagène total est extrait et dosé par la méthode au rouge sirius (colorimétrie a 500 nm). La densité optique est comparée à celle du milieu témoin (Réf. - triplicata). Le rapport des résultats des deux dosages exprimes par rapport au milieu nutritif est calculé. Un témoin positif contenant deux facteurs de croissance (TGF b et EGF) est teste en parallèle afin de pouvoir valider l'étude.

Le diagramme 12 reprend les résultats obtenus, on y voit mesuré en ordonnée la quantité de collagène total (normalisée par rapport aux protéines, c'est-à-dire que l'ordonnée exprime le ratio (collagène / protéines) en pourcentage), et on constate que l'extrait polysaccharidique de Polysiphonia elongata stimule l'excrétion de collagène de 41 % par rapport au témoin. A titre de comparaison, le témoin positif contenant deux facteurs de croissance (TGF β et EGF) la stimule de 65%.

Conclusion : l'extrait polysaccharidique de Polysiphonia elongata stimule l'excrétion de collagène par les cellules de la peau.

En parallèle, des tests ont montré que l'extrait est tout à fait compatible avec une utilisation cosmétique.

II.8) Test de l'efficacité cosmétique de l'extrait cytoplasmique de Cladophora rupestris :

Protection contre un choc thermique :

Stressés par la chaleur, les kératinocytes produisent des "Heat Shock Protéines" (HSP) ou protéines chaperonnes qui s'associent aux protéines pour les protéger de la dénaturation. Les osmolytes sont des solutés compatibles ; c'est-à-dire qu'ils s'accumulent dans les cellules sans les intoxiquer et tout en contribuant au maintien des conformations protéiques. Les propriétés protectrices de l'extrait cytoplasmique de cette algue ont donc été testées.

Des kératinocytes sont cultivés jusqu'à confluence puis incubés 24 h avec 0,05 % et 0,1 % et 0.25 % (doses non cytotoxiques démontrées par la détermination de la viabilité cellulaire par le test au WST1 ) de l'extrait cytoplasmique dans le milieu de culture avant de subir un choc thermique à 45°C pendant 2 h 30. Après 22 h 30 d'incubation (post-traitement thermique), les protéines sont extraites, dosées par la méthode au BCA et l'HSP70 dosée par une méthode ELISA.

Les quantités d'HSP70 normalisées par rapport aux protéines sont déterminées. Les essais ont été réalisés en triplicata. Le traitement statistique appliqué est une comparaison des moyennes entre les essais en présence de l'extrait cytoplasmique et l'essai réalisé avec le milieu nutritif. Le test appliqué est le test t de Student. Les moyennes sont considérées comme significativement différentes pour p<0,05. Les résultats sont montrés sur le diagramme 13, dont les chiffres en ordonnées quantifient l'HSP70 en ng par μg de protéine (les deux bâtons de droite représentent les quantités mesurées pour le milieu de culture à 37°C et 45°C).

Aux 3 concentrations testées de 0.05 %, 0.10 et 0.25 %, les quantités d'HSP70 ont été augmentées respectivement de 49 %, de 56 % et 58 % par rapport au témoin stressé en présence du milieu de culture.

Conclusion : l'extrait cytoplasmique de Cladophora rupestris augmente significativement la quantité d'HSP70 produite par les kératinocytes stressés par la chaleur contribuant ainsi à la protection des systèmes enzymatiques cellulaires.

Stimulation de la synthèse de mélanine :

Des mélanocytes murins B16-F10 sont implantés dans leur milieu de culture dans des plaques de 6 puits. Ils sont cultivés pendant 24 h avant l'ajout des différentes solutions :

l'extrait cytoplasmique de Cladophora rupestris à 0,25 % ;

le milieu de culture comme témoin.

Les cellules sont incubées 48 h puis les protéines et la mélanine sont extraites et dosées. La mélanine est dosée par spectrophotométrie à 405 nm et la concentration en mélanine déterminée par rapport à une courbe de calibration d'une solution standard de mélanine. Les protéines, après réaction avec le BCA, sont dosées par colorimétrie à 570 nm. Les concentrations sont déterminées par rapport à une droite de calibration d'une solution d'albumine de sérum bovin. Les résultats sont exprimés en pg de mélanine^g de protéines (ordonnée) et comparés au milieu. Les essais sont réalisés en triplicata. Le test appliqué est le test t de Student. Les moyennes sont considérées comme significativement différentes pour p <0,05. Les résultats sont montrés sur le diagramme 14.

Conclusion : La synthèse de mélanine est stimulée par l'ajout de l'extrait cytoplasmique de Cladophora rupestris dans le milieu de culture. L'extrait cytoplasmique de Cladophora rupestris, en augmentant la synthèse de mélanine contribue à la protection solaire de la peau.

En parallèle, des tests ont montré que l'extrait est tout à fait compatible avec une utilisation cosmétique. 11.9) Test de l'efficacité cosmétique de l'extrait polvsaccharidique de Cladophora rupestris :

Réduction de l'inflammation par les polvsaccharides de Cladophora rupestris :

Des kératinocytes humains (lignée HEK001 ) sont cultivés jusqu'à 70 % de confluence pendant 4 jours. Les cellules sont incubées avec des doses de 0.10 %, 0,25 % et 1 % de l'extrait polysaccharidique préparé en 1.14) pendant 24 heures avant d'être traitées par un rayonnement UV B (32 mJ/cm ² à 312 nm).

Après l'irradiation, les cellules sont incubées 24 h. Après ces 24 h de culture, les cellules sont séparées du milieu de culture par centrifugation. L'IL-6 est dosée dans le surnageant par une méthode ELISA. Les protéines sont extraites du culot cellulaire et dosées par la méthode au BCA par rapport à une courbe de calibration de BSA. Les résultats sont exprimés en pg/^g de protéines et comparés à ceux obtenus sur le milieu de culture. Un témoin positif de vitamine D3 est également testé pour valider l'étude. Les essais sont réalisés en triplicata. Le test statistique de comparaison de moyenne appliqué aux résultats est le test t de Student. Les moyennes sont considérées comme significativement différentes pour p<0,05.

Les résultats sont montrés sur le diagramme 15 (l'ordonnée mesure NL6 en pg / g protéines), l'extrait polysaccharidique de Cladophora rupestris réduit le ratio IL- 6/protéines jusqu'à 39 %, par rapport au témoin (Réf.) démontrant ainsi un effet apaisant.

Conclusion : l'extrait polysaccharidique de Cladophora rupestris montre un effet apaisant sur les cellules de la peau.

En parallèle, des tests ont montré que l'extrait est tout à fait compatible avec une utilisation cosmétique.

11.10) Test de l'efficacité cosmétique de l'extrait cvtoplasmique de Bifurcaria bifurcata :

Protection contre un choc thermique :

Stressés par la chaleur, les kératinocytes produisent des "Heat Shock Protéines" (HSP) ou protéines chaperonnes qui s'associent aux protéines pour les protéger de la dénaturation. Les osmolytes sont des solutés compatibles ; c'est-à-dire qu'ils s'accumulent dans les cellules sans les intoxiquer et tout en contribuant au maintien des conformations protéiques.

Des kératinocytes sont cultivés jusqu'à confluence puis incubés 24 h avec 0,1 % et 0,25 % (doses non cytotoxiques démontrées par la détermination de la viabilité cellulaire par le test au WST1 ) de l'extrait cytoplasmique dans le milieu de culture avant de subir un choc thermique à 45°C pendant 2 h 30. Après 22 h 30 d'incubation (post-traitement thermique), les protéines sont extraites, dosées par la méthode au BCA et l'HSP70 dosée par une méthode ELISA. Les quantités d'HSP70 normalisées par rapport aux protéines sont déterminées. Les essais ont été réalisés en triplicata. Le traitement statistique appliqué est une comparaison des moyennes entre les essais en présence de l'extrait cytoplasmique et l'essai réalisé avec le milieu nutritif. Le test appliqué est le test t de Student. Les moyennes sont considérées comme significativement différentes pour p<0,05. Les résultats sont montrés au diagramme 16 dont les chiffres en ordonnées quantifient l'HSP70 en ng par μg de protéine (les deux bâtons de droite représentent les quantités mesurées pour le milieu de culture à 37°C et 45°C).

Aux 2 concentrations testées, les quantités d'HSP70 ont été augmentées de 21 % et de 58 % par rapport au témoin stressé en présence du milieu de culture.

Conclusion : l'extrait cytoplasmique de Bifurcaria bifurcata augmente significativement la quantité d'HSP70 produite par les kératinocytes stressés par la chaleur contribuant ainsi à la protection des systèmes enzymatiques cellulaires.

Inhibition de la synthèse de mélanine :

Des mélanocytes murins B16-F10 sont implantés dans leur milieu de culture dans des plaques de 6 puits. Ils sont cultivés pendant 24 h avant l'ajout des différentes solutions :

l'extrait cytoplasmique de Bifurcaria bifurcata à 0.25 % ;

l'acide kojique à 200 μg/ml comme témoin positif ; le milieu de culture comme témoin.

Les cellules sont incubées 48 h puis les protéines et la mélanine sont extraites et dosées. La mélanine est dosée par spectrophotométrie à 405 nm et la concentration en mélanine déterminée par rapport à une courbe de calibration d'une solution standard de mélanine. Les protéines, après réaction avec le BCA, sont dosées par colorimétrie à 570 nm. Les concentrations sont déterminées par rapport à une droite de calibration d'une solution d'albumine de sérum bovin. Les résultats sont exprimés en pg de mélanine^g de protéines et comparés au milieu et l'acide kojique. Les essais sont réalisés en triplicata. Le test appliqué est le test t de Student. Les moyennes sont considérées comme significativement différentes pour p <0,05. Les résultats sont montrés au diagramme 17.

Les quantités de mélanine (normalisées par rapport aux protéines : exprimées en μg mg de protéines) sont respectivement diminuées de 17 % par rapport au milieu de culture pour un taux de 0.25 % d'incorporation. La diminution est égale à celle du témoin positif (acide kojique) connu pour ses propriétés inhibitrices de la synthèse de mélanine.

Conclusion : L'extrait cytoplasmique de Bifurcaria bifurcata inhibe la synthèse de mélanine. Cet effet est attribué à la présence de phlorotannins (0.2 à 0.27 g/L) qui sont des antioxydants. L'extrait comporte également du mannitol à une teneur de 1 à 1 .7 g/L. Propriétés anti-oxydantes

Par ailleurs, la capacité anti-oxydante de l'extrait cytoplasmique de Bifurcaria bifurcata a été déterminée par le test ORAC par rapport au Trolox qui est un dérivé soluble de la vitamine E. La vitamine E est d'ailleurs le principal capteur de radicaux pyroxylés au niveau cellulaire.

Le test mesure la protection de l'oxydation de la fluorescéine par un radical pyroxylé (APPH). La fluorescéine est dosée par fluorescence. Il est donc possible de suivre dans le temps pendant 1 heure l'oxydation de la fluorescéine avec (courbe avec les points en losange et avec les points en croix) et sans molécules anti-oxydantes (courbe avec les points en triangle).

La mesure de la surface comprise entre les deux courbes corrélée à la concentration en Trolox permet de calculer la capacité anti-oxydante de l'extrait testé (voir le diagramme 18).

(valeur

Tableau 5 valeur ORAC de l'extrait cytoplasmique de Bifurcaria bifurcata

En parallèle, des tests ont montré que l'extrait est tout à fait compatible avec une utilisation cosmétique.

11.11 ) Test de l'efficacité cosmétique de l'extrait polvsaccharidique de Bifurcaria bifurcata : Activité anti-inflammatoire de l'extrait polvsaccharidique de Bifurcaria bifurcata :

Des kératinocytes humains (lignée HEK001 ) sont cultivés jusqu'à 70 % de confluence pendant 4 jours. Les cellules sont incubées avec 0,01 % et 0.05 % de l'extrait polysaccharidique de bifurcaria bifurcata pendant 24 h avant d'être traités par un rayonnement UV B (32 mJ/cm ² à 312 nm). Après l'irradiation, les cellules sont incubées 24 h. Après ces 24 h de culture, les cellules sont séparées du milieu de culture par centrifugation.

L'IL-6 est dosée dans le surnageant par une méthode ELISA. Les protéines sont extraites du culot cellulaire et dosées par la méthode au BCA par rapport à une courbe de calibration de BSA. Les résultats sont exprimés en pg^g de protéines et comparés à ceux obtenus sur le milieu de culture. Un témoin positif de vitamine D3 est également testé pour valider l'étude. Les essais sont réalisés en triplicata. Le test statistique de comparaison de moyenne appliqué aux résultats est le test t de Student. Les moyennes sont considérées comme significativement différentes pour p<0,05. Les résultats sont montrés sur le diagramme 19.

Les teneurs en IL6, (cytokine impliquée dans le processus inflammatoires) rapportées aux concentrations en protéines diminuent pour les essais avec des milieux enrichis en extrait polysaccharidique de Bifurcaria bifurcata et en vitamine D3 par rapport à ceux avec le milieu nutritif seul.

Conclusion : L'extrait polysaccharidique de Bifurcaria bifurcata présente donc un effet apaisant. Cet effet bénéfique s'explique par le fait que les polysaccharides identifiés dans l'extrait présentent un effet protecteur en limitant l'inflammation.

De plus l'enrichissement du milieu nutritif avec un extrait polysaccharidique de Bifurcaria bifurcata ou de la vitamine D3 protège les kératinocytes contre les rayonnements UV-B (voir le diagramme 20). La viabilité cellulaire (test au WST1 ) est supérieure pour les essais avec l'extrait polysaccharidique de Bifurcaria bifurcata ou la vitamine D3 par rapport au milieu nutritif seul.